KR20160085969A

KR20160085969A - 미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 면역증강 기능성 애완동물 사료 조성물

Info

Publication number: KR20160085969A
Application number: KR1020150002719A
Authority: KR
Inventors: 박상철; 이영욱; 최준영
Original assignee: (주)그린웰
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2016-07-19

Abstract

본 발명은 미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 면역 증강 기능성 애완동물 사료 조성물을 제공하는 것으로 미나리 추출물의 일반 영양 성분을 분석하고 미나리 추출물의 세포독성을 확인하였으며 NO 생성 및 cytokine 분비 억제능을 평가하여 항염 및 면역 증강 기능을 확인한 결과 iNOS와 COX-2 발현은 억제시키지 않았으나 IL-1β와 TNF-α 및 NF-κB 발현은 억제함으로써 항염 및 면역 활성을 나타내는 애완동물 사료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 면역증강 기능성 애완동물 사료 조성물 {Anti-inflammatory and immuno-stimulatory feed composition for pet animal consisting of dropwort extract as an efficient component}

본 발명은 미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 면역 증강 기능성 애완동물 사료 조성물을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 미나리 추출물의 일반 영양 성분 측정 및 관련 생리활성을 평가하여 항염 및 면역 증강 기능성이 있는 애완동물 사료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명에 사용된 미나리(Oenanthe javanica (Blume) DC.)는 베트남, 말레이시아, 필리핀, 인도네시아, 및 타이완 등의 동남아 지역과 한국, 중국, 시베리아 등의 일부 온대 북부 지역에 널리 분포되어 있는 미나리과에 속하는 식물이다(Rhee HJ, Jung HS, Kim YD. Componential specification of the water dropwort (Oenanthe javanica D.C.), J Sci Edu 2: 17-31, 1993). 식품공전에서 잎과 줄기를 식용으로 구분하고 있으며 비타민 A, B1, B2, C가 풍부한 알칼리성 식품으로 무기질은 Ca, P, Fe가 많이 들어 있다고 알려져 있다(서화중, 이명렬, 미나리 추출물이 가축의 간장 기능에 미치는 영향, 한국영양식량학회지 14(1), 72, 1985.).

미나리는 예로부터 혈압을 낮추어 주는 혈압강하작용이 있고 장의 활동을 좋게 하여 변비, 치질, 대장 및 소장질환을 완화시켜 주며 체내 열을 내려 독을 제거하는 해열 및 해독작용이 있다. 뿐만 아니라 미나리는 지사작용이 있으며 중금속을 해독해주는 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 미나리의 주요 기능으로 인해 예로부터 미나리를 주로 생식으로 섭취하거나 상온에 데쳐 섭취하였으며 해독기능을 가지고 있어 독성을 가지는 복어요리에는 반드시 수반되는 재료로 알려져 있다. 미나리는 비타민 A로 변환되는 베타카로틴과 비타민 B1 및 B2 등의 엽산과 비타민 C 등을 다량 함유하고 단백질, 철분, 칼슘, 칼륨, 인 및 당질 등을 포함한다. 특히 다량의 칼륨을 포함하고 인체의 나트륨의 배설에 도움을 줄 수 있어 고혈압 환자에게는 좋은 식품으로 알려져 있다. 또한 엽산은 임산부의 조산 및 기형아출산 예방에 필수적이다. 미나리는 식물성 폴리페놀인 플라보노이드 성분을 다량 함유하는데 그 플라보노이드 성분은 이소람네틴(Isorhamnetin), 히페로사이드(Hyperoside), 페르시카린(Persicarin), 알파피넨(Alpha -pinene) 및 미르센(Myrcene)과 그리고 색소성분인 캄페롤(Kaempferol)과 퀘르세틴(Quercetin) 등이다. 이소람네틴과 알파피넨은 우수한 염증과 관련된 면역관련 반응을 억제하는 효과와 자유라디칼 제거효과로 항산화 효과 및 비만억제 효과를 가지는 것으로 알려져 있고 페르시카린은 최근 연구에 의하면 간에서 알코올대사에 관여하는 효소를 활성화시켜 해독작용이 탁월하여 간 보호에 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 또한 상기 플라보노이드 성분들이 인체 발암성 물질인 아플라톡신 B1에 대하여 항돌연변이 활성도 가진 것으로 보고되고 있다. 한편 폴리페놀의 일종으로서 색소성분인 캄페롤과 퀘르세틴은 혈전 생성 억제 효과가 뛰어나며 아울러 항산화 및 염증치료성질을 갖는 것으로 알려져 있다.

인체는 산소호흡을 통해 에너지와 생체구성성분을 얻게 되며 이 과정 중에 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)이 생성되며 이로 인해 끊임없는 산화적 스트레스를 받게 되어 세포 노화, 파킨슨씨병과 같은 대사질환 및 암세포 형성 등의 다양한 문제를 일으키게 된다. 그러므로 활성산소종을 제거(소거)할 수 있는 항산화제들은 세포를 건강하게 유지하는 데 매우 중요한 역할을 하게 된다.

생체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분 및 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절 그리고 생체방어 등 다양한 중요 기능을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착 및 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.

피브린 혈전의 생성은 수많은 인자들의 여러 단계반응을 거쳐 피브린 응고에 직접 관여하는 트롬빈이 활성화 되고 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어 혈소판과 내피세포에 결합함으로 Factor XIII에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성한다. 또한 트롬빈은 혈소판, V 인자 및 VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 한다. 따라서 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있어 전 세계적으로 트롬빈 직접저해제 개발을 목표로 하고 있다.

특히 사회의 발달과 인구의 고령화에 따라 혈전성 질환 즉 과다한 혈전생성과 관련된 뇌혈관 질환이나 심장질환이 최근 급속히 증가되고 있어 안전한 항혈전제 개발이 절실한 상태이다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린 및 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편 중국에서 멜라민과 그 오염물질에 의해 많은 애완동물들이 질병과 사망을 야기한 적이 있다. 이는 애완동물 사료를 조제하는 과정중에 멜라민의 부산 화합물에 의한 독성이 나타난 것으로 확인되었다(김영민, Renal Toxicity Induced by the Treatment of Melamine and Cyanuric Acid in F344 Rats, 학위논문, 2010).

또한 곰팡이가 핀 애완견 사료를 먹은 강아지들이 집단 폐사하여 애견인들이 집단 소송을 제기했던 일이나 미국 다이아몬드사의 강아지 사료에서 독극물이 검출되어 100여 마리 이상의 개와 고양이가 죽자 은폐하려던 회사를 코넬 대학 수의과가 임상데이터를 근거로 증명한 일 등은 애완동물 사료의 중요성과 애완동물 사료의 선택이 그들의 생명과 직결되어 있음을 잘 나타내는 예라고 할 수 있다(이미자, 기능성 애완동물사료를 찾는 소비자가 늘고 있다. 피드저널(학술논문), 2006).

애완동물산업 시장은 저출산, 고령화 및 독신인구의 증가로 인해 꾸준히 증가하는 추세이며 그만큼 우리나라의 애완동물 시장이 잠재력이 높다는 것을 의미한다. 뿐만 아니라 이러한 시장의 확대에 맞추어 수입에만 의존하고 있던 애완동물 사료시장 또한 증가할 것으로 전망된다.

현재 건강을 위해 섭취하는 미나리음료는 생미나리를 착즙한 것만이 시판되고 있지만 맛이 떨어지고 미나리 특유의 강한 향으로 인하여 거부감을 주며 저장성의 문제 등으로 대중화되기는 곤란하다는 문제점이 있다. 뿐만 아니라 현재 미나리 생산 농가에서 미나리를 재배하여 판매할 시에 미나리 선별과정에서 많은 부분들이 폐기되어 버려지고 있다. 따라서 미나리의 영양소와 고유 성분으로 특히 폴리페놀을 대부분 포함하고 특유의 맛과 향을 거부감 없이 부드럽게 살린 제품이 제조된다면 애완동물 식품산업시장에서의 상품성이 증대될 것으로 판단된다.

본 발명의 발명자에 의해 미나리액 추출방법 및 이를 이용한 음료가 대한민국 등록특허 제10-1077818호에 개시된 바 있으나 이는 유기산을 이용하여 미나리 고유의 영양분과 폴리페놀 성분을 추출하는 방법 및 이를 이용한 음료 및 이온음료에 관한 것이다. 미나리 열수 추출물 및 매생이 열수 추출물을 함유하는 항산화능이 증진된 혼합음료의 제조방법이 대한민국 등록특허 제10-1404457호에 개시되어 있으나 이는 세포독성이 없고 다양한 산화적 스트레스로부터 신체를 보호할 수 있는 항산화 효과가 증진되며 식감 및 기호도까지 만족시킬 수 있는 음료의 제공에 관한 것이다. 미나리 발효초를 이용한 기능성 건강음료라 대한민국 등록특허 제10-1429828에 개시되어 있으나 이는 미나리 발효초를 이용하여 산화적 손상으로부터 신경세포를 보호하는 효과 뿐 아니라 노화의 진행과 동시에 증가하는 염증성 질환을 개선하는 방법에 관한 것이다.

한편 미나리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 또는 항비만용 약학적 조성물 또는 건강식품 조성물이 대한민국 등록특허 제10-1453455에 개시되어 있으나 이는 생체 내 지방흡수와 관련이 있는 췌장 리파아제에 대한 저해 활성을 나타내는 항비만 효과 및 라디칼 소거 활성을 나타내는 항산화 효과가 우수한 약학적 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 상기 특허문헌 어디에도 미나리 추출물의 항염 및 특히 면역 증강 기능을 가지는 애완동물 사료 용도의 적합성 여부를 검증하거나 개시된 바는 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 미나리 추출물의 성분 및 유용 생리활성을 측정평가하여 항염 및 면역 증강 기능성 애완동물 사료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 미나리 추출물을 사용하여 pH, Brix, 산도, 고형분 함량, 색도를 다른 시료와 비교 측정하고 일반영양성분을 분석하는 단계와; 상기 결과를 토대로 미나리 추출물의 미량원소 분석, 항혈전 활성, 항균 활성, 항당뇨 활성을 측정하여 미나리 추출물의 기능성을 평가하는 단계와; 상기 단계의 미나리 추출물의 TPC 함량을 조사하고 ABTS 및 DPPH법을 이용한 라디칼 소거능을 측정하여 생리활성 효능을 평가하는 단계와; 상기 단계의 미나리 추출물의 세포독성을 확인하여 NO 생성 억제능 및 cytokine 분비 저해능을 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 미나리 추출물의 면역 증진 효과를 평가하고 애완동물 시장의 기능성 식이소재 개발과 특히 항염 및 면역 증강 기능을 제고하는 효과가 있으며 수입에만 의존하던 애완동물 사료 시장를 대체할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 α-amylase, β-amylase 및 α-glucosidase 에 대한 효소활성 평가를 위한 표준곡선을 나타낸 그래프이다(Starch std는 α-amylase 활성평가를 위한 Starch 표준곡선이고 maltose std는 β-amylase 활성평가를 위한 maltose 표준곡선이며 pNP std는 α-glucosidase 활성평가를 위한 p-nitrophenyl 표준곡선이다.).
도 2는 본 발명 미나리 추출물의 TPC 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 ABTS 소거능 측정에 대한 표준곡선을 나타낸 그래프이다.
도 4는 ABTS법을 이용한 본 발명 미나리 추출물의 라디칼 소거능을 측정한 그래프이다.
도 5는 DPPH 소거능 측정에 대한 표준곡선을 나타낸 그래프이다.
도 6은 DPPH법을 이용한 본 발명 미나리 추출물의 라디칼 소거능을 측정한 그래프이다.
도 7은 RAW264.7 macrophage에 대한 본 발명 미나리 추출물의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 미나리 추출물의 NO를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 LPS 처리군과 비처리군의 미나리 추출물 NO를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 LPS에 의한 target gene의 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
도 11은 realtime PCR에 의한 본 발명 미나리 추출물의 면역관련 cytokine 발현 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 12은 본 발명 미나리 추출물을 이용해 제조한 항염 및 면역 기능성 애완동물 사료용 조성물을 보인 도이다.

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 실시예를 들어 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미나리, 미나리 추출물 및 시판 과일, 야채 주스

본 발명에 사용한 미나리, 미나리 추출물 및 시판 과일과 야채 주스는 새얼바이오푸드(주)의 미나리 추출물인 Saeeul Extract(SE)를 공시재료로 사용하였다. 미나리를 자체 구입하여 열수 추출한 미나리 열수 추출 베이스인 Water Extract(WE)를 대상으로 하였다(표 1). 특히 SE에서 활성이 나타나는 경우 ethylacetate를 이용하여 SE를 분획하여 ethylacetate 용매 분획물(SE-EA)을 제조하고 이를 감압회전농축기를 이용하여 60℃에서 감압 농축하여 분획물 분말을 제조하였다.

본 발명 분석에 사용된 각 미나리 추출물 및 펙티넥스 추출 조건에 따른 시료

시료	기관	처리조건	비고
Pt-01¹⁾	SEB² ⁾	펙티넥스 0.01%	함량의 변화
Pt-02	SEB	펙티넥스 0.02%	함량의 변화
Pt-03	SEB	펙티넥스 0.03%	함량의 변화
Pt-04	SEB	펙티넥스 0.04%	함량의 변화
Pt-05	SEB	펙티넥스 0.05%	함량의 변화
Pt-06	SEB	펙티넥스 0.06%	함량의 변화
Pt-07	SEB	펙티넥스 0.07%	함량의 변화
Pt-08	SEB	펙티넥스 0.08%	함량의 변화
SE	SEB	미나리 추출물	분석품
SE - EA	SEB	SE 의 ethylacetate 분획물	분석품 (생리활성 평가용)
WE	SEB	미나리 열수 추출물	분석품

[주] 1) Pt-01~Pt-08 : 시판 중인 8종의 과일 및 야채주스 시료

2) SEB : 새얼바이오푸드

실험예 1. 본 발명 각 미나리 추출물의 일반성분 평가

1-1. 다양한 추출조건에 따른 SE 및 WE 의 특성

본 발명에 따른 SE 및 WE의 pH, Brix, 산도 및 고형분 함량을 시판 8종의 과일 및 야채주스와 비교하여 측정하였으며 그 결과는 표 2에 나타내었다.

본 발명 SE 및 WE의 pH, Brix, 산도 및 고형분 함량

시료	pH	Brix (%)	Acidity(%)	Suspended Solid(%)
Pt-01	3.80	12.2	0.397	13.72
Pt-02	3.05	17.6	0.759	21.16
Pt-03	3.27	13.4	0.440	16.15
Pt-04	3.57	15.2	0.227	16.81
Pt-05	3.98	11.2	0.761	12.87
Pt-06	3.97	11.6	0.391	18.29
Pt-07	4.89	1.80	0.415	1.64
Pt-08	4.68	14.5	0.542	14.63
SE	2.76	1.2	0.363	1.44
WE	6.58	0	0.002	0.14

본 발명에 따른 미나리 추출물 SE의 경우 미나리 열수 추출물 WE에 비해 pH는 매우 낮고 brix와 산도는 높았으며 WE의 경우에는 거의 중성을 유지하며 무시할 만한 산도와 당도를 나타내었다. 또한 고형분 함량에서도 SE의 경우 1.44%를 나타내었으나 WE의 경우에는 0.14%를 나타내었고 따라서 SE의 경우 상당량의 유기산을 가지고 있으며 당류도 일부 포함된 것으로 판단되었다.

1-2. 색도 측정

본 발명에 따른 SE 및 WE의 색도는 제공되어진 시료 상태 그대로를 Hunter Color Difference meter (Super color SP-80 Colormeter)로 측정하였다(표 3).

본 발명 SE 및 WE의 명도, 적색도, 황색도 및 색차

시료	색도
시료	L ¹	a ²	b ³	E ⁴
Pt-01	22.40	-11.16	-6.25	71.25
Pt-02	20.92	-9.33	-4.04	72.24
Pt-03	11.22	-0.87	-1.86	81.21
Pt-04	18.05	-9.15	-0.52	74.89
Pt-05	28.61	-6.91	5.17	64.23
Pt-06	21.30	3.76	7.42	71.41
Pt-07	20.95	-9.31	-2.11	72.09
Pt-08	13.71	-8.63	7.47	79.40
SE	50.24	1.36	0.82	42.15
WE	14.21	-1.13	-2.56	78.20

[주] L ¹: 명도 (흰색 1000 흑색), a ²: 적색도 (적색 10080 녹색), b ³: 황색 (황색 7080 흑색), E ⁴: 색차

측정 결과 SE은 기존에 시판되는 과일 및 야채주스에 비해 상대적으로 적색도가 높고 명도가 높으며 황색도가 낮아 옅은 분홍색을 띄어 관능적으로 뛰어난 색상 선호도를 나타내었다.

1-3. 영양성분 분석

본 발명에 따른 SE 및 WE의 영양성분 분석 결과는 표 4에 표시하였다. 미나리 추출물 SE의 경우 1.44%의 총탄수화물과 회분을 주성분으로하여 100 g 당 5.8 kcal의 열량을 나타내었고 미나리 열수 추출물 WE은 매우 소량의 탄수화물과 회분을 포함하여 100 g 당 0.9 kcal의 열량을 나타내었다. 따라서 영양학적인 측면에서는 WE 보다 SE의 추출 및 조제방법이 우수함을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 SE 및 WE 수분함량 및 영양성분 함량 분석

	수분함량 (%)	조단백질 (%)	조지질 (%)	총탄수화물(%)	회분(%)	칼로리 (㎉/100g)
SE	98.56±0.06	< 0.01	0.0001	1.44±0.06	0.001	5.8
WE	99.86±0.01	< 0.01	0.0607	0.08±0.06	0.001	0.9
미나리	93	1.5	0.1	4.3	1.1	16

실시예 2. 본 발명에 따른 각 미나리 추출물의 기능성 평가 및 생리활성 측정

본 발명에 따른 SE 및 WE의 유용 생리활성 평가를 위해 원액 및 펙티넥스 함량을 변화시켜 추출 조건을 달리한 시료를 이용하여 생리활성을 평가하였다(표 1). ethylacetate 용매 분획물은 DMSO에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항산화, 항균, 항혈전 활성 및 대장암 세포 생육억제 등의 평가에 사용하였다.

실험예 2. 본 발명에 따른 미나리 추출물의 유용 생리활성 평가

2-1. 미량 원소(미네랄) 분석

본 발명에 따라 시판되는 미나리와 비교하여 SE의 미네랄 성분 분석 및 함량을 분석하였다(표 5). 분석 결과 SE은 미나리에 비해 상대적으로 높은 Mg, Fe, Zn, Mo 함량을 나타내었고 Ca, Na 및 K 함량은 낮게 나타났다. 따라서 SE에서의 Ca를 제외한 Mg, Fe, Zn, Mo의 높은 함량은 생리적으로 유용한 여러 생체반응을 촉매함을 확인하였다.

본 발명에 따른 미나리 추출물의 미네랄 성분 분석 및 함량

시료	B	Mg	Ca	Cr	Fe	Zn	Mo	Na	K
SE	3.513	115.6	99.1	1.457	4.183	1.746	3.294	49.17	253.9
미나리	NA	NA	240	NA	20	NA	NA	180	4120

2-2. 항혈전 활성

본 발명에 따른 SE, SE-EA 및 WE의 항혈전 활성은 트롬빈 타임을 측정하여 평가하였다(표 6).

본 발명에 따른 추출 조건별 시료, SE 및 WE의 트롬빈 저해 활성

시료	트롬빈 타임 ( control)
Pt-01	0.95±0.12
Pt-02	2.71±0.26
Pt-03	0.94±0.01
Pt-04	0.92±0.01
Pt-05	0.97±0.01
Pt-06	0.97±0.01
Pt-07	0.88±0.04
Pt-08	1.10±0.01
SE	1.17±0.04
WE	1.13±0.10
Aspirin (1.5 mg/mL)	2.53±0.17
Heparin (1.5 g/mL)	> 14.0

임상에서 혈전치료제로 사용되고 있는 헤파린은 1.5 ug/mL 농도에서 혈전 생성 억제에 탁월한 효과를 나타내었으며 혈전생성 방지제로 이용되고 있는 아스피린은 1.5 mg/mL 농도에서 2.53배의 연장된 트롬빈 타임을 나타내어 그 효과를 알 수 있었다. 실험 결과 SE과 WE가 항혈전 활성에 효과가 있는 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 미나리 추출물 원액을 사용하여 얻은 결과이므로 관련 활성성분을 농축하고 유기용매를 이용하여 분획하는 경우에는 더욱 높은 활성을 얻을 수 있을 것으로 보여졌다.

실험 결과를 토대로 SE의 10배 농축물과 SE으로부터 ethylacetate를 이용하여 지용성 물질을 용매분획한 SE-EA 및 WE를 대상으로 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임(외인성 혈전생성) 및 에이피티티 타임(내인성 혈전 생성)을 측정하였다(표 7).

항혈전 활성 평가를 위한 트롬빈 타임 측정 시 혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈을 사용하여 조제하였으며 채혈 후 즉시 4℃에서 5,000 g로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장) 필요 시 상온에서 해동하여 사용하였다. 항혈전 활성은 이미 보고된 Amelung coagulometer KC-1A를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였으며 트롬빈 타임(혈액응고의 중심효소 저해시간), 프로트롬빈 타임(외인성 혈전생성) 및 에이피티티 타임(내인성 혈전 생성)을 측정하였다.

트롬빈 타임(Thrombin Time)은 37℃에서 0.5 U 트롬빈 50 ㎕와 20 mM CaCl₂ 50 ㎕ 및 다양한 농도의 시료 추출액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후 혈장 100 ㎕를 첨가하여 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조구로는 아스피린과 헤파린(heparin)을 사용하였으며 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1 초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100℃에서 30 분간 열처리하고 실온에서 1시간 방냉한 후 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.

프로트롬빈 타임(prothrombin time)은 표준혈장(MD) 70 ㎕와 다양한 농도의 시료액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3분간 가온한 후 130 ㎕의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조구로는 아스피린을 사용하였으며 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다.

에이피티티 타임(activated Partial Thromboplastin Time)은 혈장 100 ㎕와 다양한 농도의 시료 추출액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후 50 ㎕의 aPTT reagent(ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3 분간 배양하였다. 이후 50 ㎕ CaCl₂(35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며 이 경우 55.1 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.

혈소판 응집저해 활성(Platelet aggregation inhibition activity)은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 혈소판을 1:9의 비율로 혼합한 후 1.100 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고 이를 washing buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM Glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후 suspending buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM Glucose, 0.49 mM MgCl₂, 025% gelatin, pH 7.4)에 재현탁한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁하였으며 이때 혈소판 수는 4x10⁹/mL 되도록 조정하였다. 이후 1 mL 현탁액에 2.5 ul collagen을 가해 5분간 반응시키고 whole-blood aggregometer를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

측정 결과 WE는 추출원액 및 10배 농축액에서도 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임에서 큰 증가가 나타나지 않았지만 SE의 경우 추출물 원액(x1.0)에서 에이피티티 타임과 대조구와 비교하여 15배 이상 매우 연장된 에이피티티 타임을 나타내었다. 또한 1.25배 농축액에서도 15배 이상 매우 연장된 프로트롬빈 타임이 나타났으며 5배 농축액 및 10배 농축에서부터는 15배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임이 나타났다.

또한 SE-EA 분획물을 감압 건조하여 분말을 얻고 이를 DMSO를 이용하여 각각의 농도로 희석한 후 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임을 측정하였다. 그 결과 SE의 경우보다 강력한 항혈전 활성을 나타냈으며 1 mg/mL 농도에서 대조구와 비교하여 15배 이상 매우 연장된 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임을 나타냈다. 또한 1.25 mg/mL 농도에서 아스피린에 필적하는 트롬빈 타임 연장 효과와 15배 이상 연장된 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임을 나타냈다. 2.5 mg/mL 농도에서부터는 용매 대조구인 DMSO 처리구에 비해 15배 이상 매우 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임을 나타내어 매우 강력한 항혈전 효과를 확인하였다.

본 발명에 따른 SE, SE-EA 및 WE의 항혈전 활성

Sample	Fold	Conc. (mg/mL)	TT	PT	aPTT
Water	-	-	1.00±0.09	1.00±0.01	1.00±0.03
DMSO	-	-	1.00±0.02	1.00±0.01	1.00±0.08
Aspirin	-	1.5	2.46±0.12	1.25±0.03	1.42±0.09
WE	x10.0	0.7	1.13±0.04	0.98±0.01	1.03±0.03
WE	x1.0	0.07	1.11±0.02	0.99±0.01	1.01±0.04
SE	x10.0	7.19	>15	>15	>15
	x5.0	3.60	>15	>15	>15
	x2.5	1.80	1.17±0.04	>15	>15
	x1.25	0.90	-	>15	>15
	x1.0	0.7	1.17±0.04	1.19±0.00	>15
	x0.5	0.45	-	-	1.97±0.05
	x0.25	0.22	-	-	1.35±0.14
SE-EA	-	5	>15	>15	>15
	-	2.5	>15	>15	>15
	-	1.25	3.19±0.21	>15	>15
	-	1.0	0.97±0.17	>15	>15
	-	0.5	0.97±0.17	1.13±0.02	1.20±0.02

본 발명에 따른 SE, SE-EA 및 WE의 혈소판 응집저해 활성 측정결과는 다음과 같다. DMSO(용매대조구)를 사용한 경우 정상적인 혈액응고가 나타났으며 Lag time(혈소판 응집이 시작될 때까지 소요되는 시간)도 4 sec이며 area under도 164-177의 범위를 나타내었다. 혈전증 질환 예방 치료제롤 사용되고 있는 아스피린(상품명 프로텍트)의 경우 우수한 혈소판 응집저해능을 나타내었다. 정상적인 혈액응고는 지체되었으며 Lag time도 12-15 sec로 연장되었다. 또한 전체적인 혈소판 응집을 평가하는 area under도 63.1-68.7로 감소되어 혈소판 응집이 강력하게 저해되었다.

본 발명의 SE과 WE의 혈소판 응집저해능을 평가한 결과 WE에서는 혈소판 응집 저해능이 나타나지 않았으며 SE에서는 강력한 혈소판 응집이 나타났다. 즉 혈소판 응집에 의한 혈액응고는 거의 저해되었으며 Lag time은 72초로 아스피린보다 크게 증가되었으며 area under도 18.3을 나타내어 매우 강력한 혈소판 응집저해능을 확인하였다(표 8).

본 발명에 따른 SE, WE의 혈소판 응집 저해 활성

Control	Amplitude (ohm)	Slope	Lag time (sec)	Area under
DMSO	19	9	4	177.8
DMSO	18	6	4	164.8
Aspirin (0.5mg/mL)	7	1	12	68.7
Aspirin (0.25mg/mL)	8	1	15	63.1
SE	3	0	72	18.3
WE	23	7	6	188.1

2-3. 항균 활성

본 발명에 따른 SE, SE-EA 및 WE의 항균 활성을 평가한 결과는 표 9에 나타내었다. 그람 음성균으로 Escherichia coli KCTC 1682, Pseudomonas aeruginosa KACC 10186, Proteus vulgaris KCTC 2433 및 Salmonella typhimurium KCTC 1926, 그람 양성균으로는 Bacillus subtilis KCTC 1924, Listeria monocytogenes KACC 10550, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 및 Staphylococcus aureus KCTC 1916을 사용하였다. 한편 항진균 활성 평가를 위해서는 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233 및 캔디다증 진균감염증 원인균 Candida albicans KCTC 1940를 사용하였다. 항세균 활성 평가의 경우 Nutrient broth에 각각의 세균을 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 각 균주를 OD값이 0.1이 되도록 조정하여 Nutrient agar 배지를 포함하는 멸균 petri dish(90×15 mm)에 100 μL 도말하고 각각의 시료 5 μL를 지름 6.5 mm의 멸균 disc-paper에 가하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며 진균의 경우에는 Sabouraud dextrose 배지를 이용하여 동일한 방법으로 30℃에서 24시간 동안 배양 후 생육저지환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다. 대조구로는 항세균제인 ampicillin과 항진균제인 miconazole을 각각 1 μg/disc 농도로 사용하였으며 생육저지환의 크기는 육안으로 생육이 나타나지 않는 부분의 지름을 mm 단위로 측정하였고 3회 이상 평가 후 대표 결과로 나타내었다. 실험 결과 SE의 경우에는 Candida albicans와 Saccharomyces cerevisiae의 진균 및 Escherichia coli 와 Pseudomonas aeruginosa를 제외한 거의 모든 세균에서 우수한 항세균 활성을 나타내었으며 SE-EA의 경우에는 유사한 항균 spectrum을 나타내었으나 오히려 다소 약한 활성을 나타내었다. 이는 항세균 활성 물질이 ethylacetate 추출성 물질과 비추출물성 물질이 같이 존재함을 의미하며 항균 활성을 목적으로 하는 경우에는 미나리 음료베이스 그 자체를 사용하는 것이 더욱 효율적임을 알 수 있었다. 한편 미나리 열수 추출물인 WE의 경우에는 사용한 세균 및 진균 모두에 항균 활성을 나타내지 않았다.

본 발명에 따른 SE, SE-EA 및 WE의 항균 활성

Sample¹ ⁾	Gram positive				Gram negative				Yeast
Sample¹ ⁾	SA	LM	BS	SP	EC	PA	PV	ST	CA	SC
SE (700 ug/disc)	12	15	12	15	-	-	34	11	-	-
SE-EA (500ug/disc)	10	-	11	11	-	-	26	10	-	-
WE (70 ug/disc)	-²⁾	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Amp (1ug/disc)³⁾	23	25	28	18	12	10	46	19	-	-
Mic (1ug/disc)	-	-	-	-	-	-	-	-	20	28

[주] 1)SA: Staphylococcus aureus, LM: Listeria monocytogenes, BS: Bacillus subtilis, SP: Staphylococcus epidermidis, EC: Escherichia coli, PA: Pseudomonas aeruginosa, PV: Proteus vulgaris, ST: Salmonella typhimurium, CA: Candida albicans, and SC: Scharomyces cerevisiae.

2)-: No activity.

3)Amp/Mic: ampicillin/miconazole.

한편 각각의 세균 및 진균에 대한 MIC 및 MBC를 평가한 결과는 표 10에 나타내었으며 기존 과일 및 야채주스와 유사한 항균 활성을 나타내었다. 그러나 SE이 항진균 활성이 거의 없음을 고려할 때 보관, 저장 및 유통 과정 중 효모에 의한 제품오염, 관능성 및 생성 손상은 나타날 가능성이 있으며 이를 막기 위한 방법으로는 비열처리공정 UF (Ultrafiltration) 또는 가열처리 공정이 포함되어야 한다고 판단되었다.

본 발명에 따른 SE의 다양한 세균 및 진균에 대한 MIC 및 MBC 측정

Juice

Gram positive

Gram negaitive

Yeast

SA

LM

BS

SP

EC

PA

PV

ST

CA

SC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MFC

MIC

MFC

Pt-01

40

>50

30

>50

30

>50

50

>50

50

>50

50

>50

30

>50

30

>50

Pt-02

20

>50

20

>50

20

40

10

>50

20

>50

10

>50

10

30

>50

Pt-03

30

>50

20

>50

20

>50

20

30

>50

40

>50

20

>50

30

>50

Pt-04

50

>50

30

>50

30

>50

30

40

30

>50

40

>50

20

>50

40

>50

Pt-05

30

50

>50

20

10

>50

50

>50

20

>50

20

30

>50

Pt-06

50

>50

30

>50

30

50

20

>50

50

>50

30

>50

30

>50

Pt-07

>50

50

>50

40

30

>50

30

>50

30

>50

40

>50

Pt-08

>50

50

>50

50

>50

50

>50

30

>50

50

>50

40

50

>50

SE

30

50

>50

20

10

>50

50

>50

20

>50

20

30

>50

[주] MIC : minimal inhibitory concentration (최소 생육억제농도)

MBC : minimal bactericidal concentration (세균에 대한 최소 사멸농도)

MFC : minimal fungicidal concentration (진균에 대한 최소 사멸농도)

2-4 . 본 발명에 따른 미나리 추출물의 항당뇨 활성

본 발명에 따른 SE의 항당뇨 활성은 α-amylase 저해능, β-amylase 저해능 및 α-glucosidase 저해능을 측정하여 평가하였다. α-amylase 저해활성은 전분이 요오드 염색용액(I₂ +KI)에 청색으로 발색하는 원리를 이용하여 미분해 전분의 양을 정량하여 평가하였다. 먼저 다양한 농도의 시료 2.5 μL와 50 mM phosphate buffer(pH 6.8)로 희석한 α-amylase (0.25 U/mL) 25 μL를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation 한 후 0.5% soluble starch 25 μL 를 가하여 37℃에서 10분간 반응하였다. 이후 1N acetic acid 10 μL를 가하여 반응을 정지시켰으며 반응액에 25 μL의 요오드 염색용액(I₂ +KI)을 용액을 가하여 상온에서 발색하였다. 발색액은 96 well microplate reader를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였으며 각각의 실험은 3번 반복한 후 평균값을 구하여 저해율을 계산하였다. 각각의 효소활성은 unit로 환산하여 나타내었으며 α-amylase 활성을 50% 저해하는 농도를 IC50으로 계산하였다.

β-amylase 저해활성은 다양한 농도의 시료 2.5 μL와 50 mM phosphate buffer(pH 6.8)로 희석한 β-amylase(0.25 U/mL) 25 μL를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation 한 후 0.5% soluble starch 25 μL 를 가하여 37℃에서 10분간 반응하였다. 이후 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰으며 반응액에 150 μL의 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 용액을 가하여 100℃에서 5분간 가열하여 발색한 후 상온에서 방랭해주었다. 발색액은 96 well microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며 각각의 실험은 3회 반복한 후 평균값을 구하여 저해율을 계산하였다.

α-glucosidase 저해 활성은 다양한 농도의 시료 2.5 μL와 50 mM Sodium acetate buffer(pH 5.6)로 희석한 α-glucosidase(0.68 U/mL) 25 μL를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation 한 후 1 mM pNPG(p-nitrophenol glucoside) 용액 25 μL를 가하여 60℃에서 10분간 반응하였다. 이후 1M NaOH 25 μL를 가하여 반응을 정지시키고405 nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다.

α-amylase 저해 활성, β-amylase 저해활성 및 α-glucosidase 저해 활성은 수학식 1의 방법으로 계산하였다.

대조구로는 임상에서 당뇨 치료제롤 사용되고 있는 acarbose를 사용하였다. 평가 결과 미나리 추출물 SE은 양호한 α-amylase 저해능과 우수한 β-amylase 저해능을 나타내어 type Ⅱ 당뇨질환자에 대한 항당뇨 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다. 도 1은 α-amylase, β-amylase 및 α-glucosidase 에 대한 효소활성 평가를 위한 표준곡선을 나타내었으며 SE의 각각의 효소에 대한 저해도는 표 11에 나타내었다.

본 발명에 따른 SE의 각각의 당분해 효소에 대한 저해정도

Enzyme	Inhibition (%)
Enzyme	SE(7,200 ug/mL)	Acarbose (500 ug/mL)
a-amylase	31.0±1.0	36.8
b-amylase	55.6±0.8	62.8
a-glucosidase	7.8±1.2	95.0

실험예 3. 미나리 추출물의 In vitro 생리활성 효능평가

3-1. 본 발명에 따른 TPC ( Total Polyphenol Contents ) 함량 측정

본 발명에 따라 제조된 SE 및 WE의 유용성분 분석을 위해 추출액을 이용하여 TPC 함량을 측정하였다. 다양한 생리활성과 관련된 총 폴리페놀 함량을 측정하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 미나리 추출물의 총 페놀함량(TPC, Total Polyphenol Contents)을 농도별로 측정한 결과 EtOH 50% 추출물과 EtOH 80% 추출물에서 가장 높은 TPC 수치를 보였다. 그 중 가장 높은 TPC 수치를 보이는 EtOH 50% 추출물의 경우 1 mg/mL당 Galic acid 13 ug/mL 수준의 TPC 수치를 나타내었다.

3-2. 본 발명에 따른 ABTS 및 DPPH 법을 이용한 라디칼 소거능 확인

본 발명에 따른 SE의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH radical 소거능 측정 및 ABTS radical 소거능을 측정하여 평가하였다. DPPH 음이온 소거능 측정의 경우 다양한 농도로 희석한 시료 20 ㎕에 99.5% 에탄올에 용해시킨 2×10^-4M DPPH용액 380 ㎕를 넣고 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 516 nm에서 microplate reader(Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 butyl hydroxytoluene(BHT), vitamin C 및 vitamin E를 사용하였다. DPPH free radical 소거능은 시료첨가구와 비첨가구의 백분율로 표시하였다.

한편 ABTS 양이온 소거능 측정의 경우 7 mM ABTS 5 mL과 140 mM potassium persulfate 88 mL를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰으며 이후 이 용액을 414 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 에탄올로 희석하였다. 제조된 희석용액 190 mL와 추출물 시료 10 mL를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하고 다음의 수학식 2에 의해 ASA를 결정하였다.

본 발명에 따른 ABTS 법을 이용한 라디칼 소거능 확인 실험에서 SE과 80% EtOH을 이용한 추출물에서 가장 큰 라디칼 소거능을 보였다(도 3-4). DPPH 법을 이용한 라디칼 소거능 확인 실험에서는 EtOH 50% 추출물에서 가장 높은 VCEAC값을 보였으나 그 효과는 거의 나타나지 않았다(도 5-6).

3-3. In vitro 상의 본 발명 미나리 추출물의 세포 독성 확인 및 NO 생성 억제능 확인

본 발명에 따른 NO 실험에 적용할 수 있는 각 미나리 추출물의 적정 농도 설정을 위해 MTT assay를 이용하여 각 Sample별로 Raw 264.7 macrophage 세포에 대한 세포 독성 확인을 실시하였다(도 7). 실험군 모두가 500 ug/mL의 농도에서 100%에 근접한 Cell Viability를 나타냈다. 상기 결과를 통하여 이후에 진행된 In vitro 실험은 500 ug/mL의 농도에서 진행하였다.

본 발명에 따른 각 미나리 추출물의 NO 저해능을 비교한 결과 WE과 80% EtOH추출물에서 NO를 유의적으로 억제하였다(도 8).

3-4. In vitro 상의 본 발명 미나리 추출물의 cytokine 분비 저해능

본 발명에 따른 LPS에 의해 면역반응이 유도된 대식세포에서 각 미나리 추출물의 항염 및 면역 증강 기능을 확인하기 위하여 LPS에 의한 target gene의 과발현 수준을 확인한 결과 COX2에서는 발현수준이 크게 증가함을 볼 수 있었지만 iNOS에서는 증가한 정도의 차이가 나타나지 않았다(도 9). 이에 Realtime PCR을 통하여 보다 정확한 mRNA 발현수준을 확인하였다(도 10).

본 발명에 따라 LPS에 의해 면역반응이 유도된 대식세포에서 각 미나리 추출물의 항염 및 면역 증강 기능을 확인하기 위해 염증과 관련된 target gene의 발현수준을 확인한 결과 WE가 TNF-α와 IL-1β의 발현을 가장 크게 억제하는 것으로 나타났다(도 11). 반면 COX2와 iNOS에서 발현양의 억제효능은 없는 것으로 나타났으며 이는 여러 항염 및 면역 기작 중 IL-1β와 TNF-α가 관여된 기작에서 억제 효능을 보이는 것으로 보여진다.

또한 IL-1β와 TNF-α의 억제능이 확인된 미나리 추출물에 의한 다른 염증관련 target gene의 발현 정도를 확인하기 위해 IL-6와 NF-κB의 발현정도를 확인한 결과 자가면역 인자의 하나인 IL-6에서는 발현 억제능이 나타나지 않았으나 NF-κB 발현의 경우 WE에 의해 억제되는 결과가 나타났다.

따라서 본 발명의 적용예로서 상기 실시예 1 내지 3에서 측정한 미나리 추출물을 이용하여 애완동물 사료용 미나리 음료제품을 제조할 수 있었다(도 12).

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 미나리 추출물의 성분 측정 및 유용 생리활성을 평가하여 항염 및 면역 증강 기능성 애완동물 사료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 애완동물 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

IL-1β, TNF-α 및 NF-κB 발현 억제 기전을 갖는 것이 특징인 미나리 열수 추출물(WE)을 유효성분으로 함유하는 항염 및 면역 증강 기능성 애완동물 사료 조성물