KR20160081772A

KR20160081772A - miRNA 발현 생체 영상용 벡터 및 이를 포함하는 형질전환 마우스

Info

Publication number: KR20160081772A
Application number: KR1020150126274A
Authority: KR
Inventors: 황도원; 이동수; 최유리; 김미영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2016-07-08

Abstract

본원은 인비보, 인비트로 또는 엑스비보 영상 촬영이 가능한 하나 이상의 리포터 유전자 및 하나 이상의 목적하는 표적 마이크로RNA의 표적서열 및 상기 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 생체네 마이크로RNA 발현 분석용 벡터 및 이로 형질전환된 동물모델을 개시한다. 본원에 따른 벡터 및 동물모델은 마이크로RNA의 변화를 인비보 상태에서 영상화가 가능하며, 발생과정 동안 특정 마이크로RNA 발현 변화를 한 개체에서 시간별로 추적이 가능하며, 또한 특정질환 모델에서 마이크로RNA의 발현 여부를 영상으로 관찰함으로써 질환 진단 및 질병특이적 마이크로RNA를 표적으로 한 안티센스 마이크로RNA의 치료 효능 평가, 마이크로RNA의 기능 연구 및 마이크로RNA를 이용한 약물 개발, 마이크로RNA 전달 기술 개발 분야에 폭넓게 응용될 수 있다.

Description

miRNA 발현 생체 영상용 벡터 및 이를 포함하는 형질전환 마우스 {Vector for in vivo imaging for miRNA expression and transgenic mouse containing the same}

본원은 마이크로RNA 발현을 분석할 수 있는 생체 영상 기술과 관련된 것이다.

마이크로RNA는 약 22뉴클레오타이드 크기의 코딩하지 않는 작은 RNA 분자로 거의 모든 세포에서 전사 후 단계에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Lee Y, et al.. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23(20):4051-60 (2004)). 이러한 기능을 통해 세포의 분화, 증식, 사멸 및 면역, 대사 등 다양한 기능을 수행하고 있다. 특히 마이크로RNA는 암, 신경질환, 근질환, 심장질환, 비만, 염증 등 많은 질병에 관여하고 있다는 결과들이 밝혀져 있고, 이의 마이크로RNA 발현을 특히 생체 또는 세포수준에서 영상으로 평가하는 것이 중요하다.

현재까지 마이크로RNA를 관찰하기 위해서는 조직을 적출하여 노던블랏, 실시간 PCR, 마이크로어레이, 인시츄교잡분석과 같은 방법을 사용하였는데, 이들은 많은 시간이 소요되며, in vivo 상태에서의 변화를 관찰하기 어려운 단점이 있다. 유사기술로 GFP (Green fluoresecent protein)를 리포터로 사용한 기술이 보고된 바 있으나, 이는 적출된 조직에서 세포 내에 변화된 마이크로RNA를 GFP 발현으로 확인한 것이다.

미국 공개특허공보 2012-0202209는 세포내에서 마이크로RNA 생성을 관찰하기 위한 이미징 방법에 관한 것으로 마커와 연결된 DGCR8 단백질을 발현하는 벡터를 세포내에서 전달이입을 통해 생성되는 마이크로RNA를 관찰할 수 있는 기술을 개시하고 있다.

하지만 살아있는 생체내 상태에서의 변화를 관찰할 뿐만 아니라 전체적인 변화를 지속적으로 관찰할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

본원은 마이크로RNA의 발현 및 분포를 생체내에서 광학 영상으로 관찰 가능한 리포터를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 인비보 영상 촬영이 가능한 형질전환 동물모델을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 생체 영상 촬영이 가능한 리포터 유전자 및 목적하는 표적 마이크로RNA의 표적서열과 상기 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 생체내 마이크로RNA 발현 분석용 벡터, 및 이를 포함하는 형질전환 동물모델을 제공한다.

본원에 따른 벡터 및 이로 형질전환된 동물은 마이크로RNA의 변화를 in vivo 상태에서 영상화하므로 한 개체에서 시간에 따른 변화를 추적 관찰 가능하다. 전신에서 리포터를 발현시킨 동물은 전신 분포된 마이크로RNA의 변화를 관찰할 수 있으며, 대조 동물을 통한 개체 별 변화 또한 추적 관찰이 가능하다. 특히, 발생과정 동안 특정 마이크로RNA발현 변화를 한 개체에서 시간별로 추적이 가능하며, 특정질환 모델에서 마이크로RNA의 발현 여부를 영상으로 관찰함으로써 질환 진단 및 질병특이적 마이크로RNA를 표적으로 한 안티센스 마이크로RNA의 치료 효능을 광학 영상을 통해 쉽고 빠르게 평가할 수 있다. 또한 본 발명은 마이크로RNA의 기능 연구 및 마이크로RNA를 이용한 약물 개발, 마이크로RNA 전달 기술 개발 분야에 폭넓게 응용 될 수 있다.

도 1a은 렌티바이러스 벡터를 사용한 miR-124 리포터 벡터에 포함된 유전자 조합 effluc-eGFP-miR-124 3xPT 의 구성을 도식적으로 나타낸 것으로, 전사를 위한 CMV 프로모터, 향상된 초파리 루시퍼라제 (effluc) 유전자, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 miR-124의 표적서열에 완벽하게 상보적인 3개의 반복서열 3xPT를 포함한다.
도 1b는 miR-124를 통한 루시퍼라제 활성 변화를 세포에서 관찰한 것이다. effluc-eGFP-miR-124 3xPT를 발현하는 벡터를 Hela 세포 전달이입 하고 24시간 경과 후 생산된 루미네슨스 신호를 영상으로 촬영한 사진 (위)과 루시퍼라제 활성을 그래프로 나타낸 것이다 (아래). 루시퍼라제 활성은 루미노미터를 사용하여 정량하였으며, 통계는 Studnet t-test를 사용하였으며, 결과는 Mean ±SEM (n=x)로 나타냈다. 대조군으로는 Hela 세포에 스크램블드 miRNA로 전달이입하여 사용하였다.
도 2a는 miR-124 리포터 Tg (Transgenic) 마우스를 D-루시페린으로 처리 후 바이오루미네슨스를 in vivo에서 관찰한 결과로 라인 67 (왼편) 및 라인 18 (오른편)의 획득 시간은 각각 10초 및 600초를 사용하였다.
도 2b는 야생형 대조군 Wt 및 Tg (라인 67)의 E16 (16일 태아)의 effluc 리포터 유전자 활성을 나타낸다.
도 2c는 야생형 대조군 Wt 및 Tg (라인 67)에서 적출된 주요 장기의 바이오루미네슨스 신호를 나타낸다.
도 3a는 miR-124 리포터 Tg 마우스의 주 장기에서 발현되는 miRNA-124의 정량 PCR 결과로 U6로 보정하였다. 뇌에서의 수치를 1로 하고 이에 대한 상대적 증가 값을 계산하였다. 결과는 Mean ±SD (n=3)로 나타냈다.
도 3b는 Tg의 E16를 DAPI (청색) 및 항 루시퍼라제 염색 (적색)하여 주요 장기에서 상대적 루시퍼라제 유전자 발현을 관찰한 결과이다.
도 3c는 Wt 및 Tg 마우스의 조직 절편에 대하여 DAPI (청색), 항 루시퍼라제 염색 (적색) 및 항 GFP (초록) 항체로 면역 염색한 후 형광현미경으로 400배 확대하여 관찰한 결과이며, 스케일바는 50마이크로미터이다.
도 4는 miR-124가 Tg 마우스의 피질 뉴론 및 뇌에서 루시퍼라제 발현을 감소시킨다는 것을 나타내는 결과로, 도 4a는 Tg 마우스의 E16 유래의 피질 뉴론 및 바이러스 입자를 인비트로에서 10일간 배양한 후, 4배 및 100배 대물렌즈를 이용하여 현미경으로 관찰한 결과로 스케일바는 200 마이크로미터 (low scaled panel) 및 50 마이크로미터 (확대 패널)이다.
도 4b는 세포면역염색결과로 DAPI, 항 MAP2 (microtuble associated protein 2, 적색) 뉴론 염색 항체, 항 GFAP (Glial fibrillary acid protein, 초록) 아스트로사이트 염색 항체를 이용하였다. 영상은 10 배 대물렌즈 콘포칼 현미경을 이용하여 수득하였으며, 스케일바는 100 마이크로미터이다.
도 4c는 스크램블 RNA, miR-124 또는 miR-124 억제제로 전달이입된 일차 배양된 피질 뉴론에 대한 루시퍼라제 분석 결과로 데이터는 스크램블드 RNA로 처리된 세포에서 수득한 결과에 대하여 노말라이즈 하였다. 통계는 ANOVA로 처리하였으며, 결과는 Mean ±SD 로 나타냈다 (n=6, **p<0.01).
도 5는 발생단계 의존적인 miR-124 발현에 따른 루시퍼라제 활성 변화를 관찰한 결과로, 도 5a는 발달단계 (E13, E16, P10, young 및 old); 3~5 month old (young), 16~24 month old (old)에 따른 뇌 및 간의 바이오루미네슨스 이미지 촬영 결과이다.
도 5b는 배아단계부터 성체단계에 걸쳐 뇌의 바이오루미네슨스를 간에 대한 상대적 비로 나타낸 것이다.
도 5c는 각 발생 단계별 뇌 조직 융해물을 이용하여 루시퍼라제 활성을 관찰한 결과로 루시퍼라제 활성 수치는 RLU (relative light unit)으로 나타냈으며, 결과는 사용된 총 단백질 양에 대하여 노말라이즈 하였다.
도 5d는 발생 단계별로 miR-124의 농도를 실시간 PCR을 이용하여 측정한 결과이다. 그래프는 U6에 대한 miR-124 발현 비를 나타낸다. 결과는 Mean ±SD 로 나타냈다.

본원은 miRNA의 발현 및 분포를 생체내에서 광학영상으로 관찰 가능한 리포터 벡터 및 이로 형질전환된 동물의 개발에 근거한 것이다.

본원에 사용된 용어 "miR" 또는 "마이크로RNA"는 표적 RNA의 분해(degradation)을 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 2012년 8월 현재 miRNA 데이터베이스 (19판, miRBase)에 의하면 193개 종에서 유래한 25,141 개의 성숙 miRNA가 등록되어 있다. 일반적으로 마이크로RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 성숙 miRNA가 형성된다.

마이크로RNA는 전사된 mRNA의 특정 부위에 결합하여 분해를 유도하거나 번역을 억제하는 기능을 통해 세포의 분화, 증식, 사멸 및 면역, 대사 등 다양한 기능을 수행하고 있다. 특히 마이크로RNA가 암, 신경질환, 근질환, 심장질환, 비만, 염증 등 많은 질병에 관여하고 있다는 결과들이 밝혀져 있으므로 생체내에서 마이크로RNA발현을 영상으로 평가하는 것이 중요하다.

따라서 한 양태에서 본원은 마이크로RNA 발현 여부를 리포터 유전자의 활성을 통해 분석할 수 있는 벡터에 관한 것으로, 리포터 유전자, 목적하는 마이크로RNA 표적 서열 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며,

본원에 따른 벡터는 리포터 유전자로서 생체내(in vivo) 또는 생체외(ex vivo, in vitro) 영상 촬영을 가능할 수 있는 단백질을 코딩하는 것이 사용되며, 하나 이상의 다양한 유래의 생물발광 유전자, 화학발광 유전자, 형광유전자를 포함하며, 두 개이상 포함하는 경우, 동일 또는 유사한 유전자가 사용될 수 있다. 일 구현예에서 두 개의 리포터는 영상 촬영 측면에서 상호 보완이 가능하도록 상이한 유전자가 포함되며, 예를 들면 제1 리포터는 바이오루미네슨스가 가능한 발광 유전자이고, 제2 리포터는 형광 유전자가 사용된다. 상기 발광 유전자는 원핵 또는 진핵세포 유래의 루시퍼라제 유전자를 포함하나, 이로 제한 하는 것은 아니며, 일 구현예에서, 상기 발광유전자는 박테리아 유래의 루시퍼라제 유전자이고, 다른 구현예에서 상기 발광 유전자는 파이어플라이 유래의 루시퍼라제 유전자 (Fluc 또는 efluc)이다. 상기 형광유전자는 한 구현예에서 형광 유전자는 GFP 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 본원 실시예에 기재된 프라이머 및 조건을 사용하여 증폭, 클로닝하여 사용될 수 있다. 상기 유전자에 의해 발현되는 발광현상의 촬영장비는 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 이를 적절하게 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 본원의 실시예에 기재된 것과 같은 장비가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 프로모터는 당업계에 널리 알려진 용어로서 일반적으로 이의 3'쪽에 연결된 유전자(코딩서열)의 발현(전사)을 조절/제어하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 프로모터를 이루는 뉴클레오타이드 서열은 원핵 또는 진핵세포의 특성에 따라 이에 특이적인 오퍼레이터, 인핸서, 전사개시서열, 및/또는 번역개시서열을 포함한다. 본원에서 사용된 용어작동가능하게 연결된은 하나의 뉴클레오타이드 단편이 다른 뉴클레오타이드 단편에 영향을 미치도록 두 개 이상의 뉴클레오타이드 단편이 하나로 연결된 것을 의미한다. 예를 들면 프로모터는 코딩서열에 작동가능하게 연결되면 코딩서열의 발현(전사)를 조절하게 된다.

본원에 따른 벡터는 목적하는 마이크로RNA의 표적서열을 포함하며, 이는 리포터 유전자의 3' 방향에 1개 내지 3개가 링커를 통해 연결된다. 일 구현예에서는 도 1a에 개시된 벡터를 예로 들 수 있으며, 목적 miRNA로서 miR-124-1 (또는 miR-124a)를 사용하였으며, 이의 표적서열 (5'-TTAAGGCACGCGGTGAATGCC-3')에 리포터 유전자로서 effluc 및 GFP와 함께 사용하였으며, 그 사이에 IRES를 포함하고 CMV 프로모터하에서 조절되는 effluc-eGFP-miR-124 3xPT 벡터를 구축하였다. 이러한 벡터는 miR-124의 존재하에 eGFP 및 effluc의 번역을 억제한다.

본원에 따른 벡터는 리포터 유전자의 3' 방향에 마이크로RNA 표적서열을 연결하였다. 그 결과 특정 마이크로RNA가 존재하면 전사된 리포터 mRNA가 분해되어 리포터인 예를 들면 루시퍼라제의 신호가 감소된다. 이러한 유전자를 가진 형질전환 마우스는 miRNA가 없는 부위에서는 리포터 신호 관찰이 가능하며, 마이크로RNA가 있는 부위에는 신호가 감소되는 것을 관찰할 수 있어, 다양한 분야에 응용될 수 있다.

즉, 시험관내에서 수행하던 리포터 기술을 동물에 도입하므로 in vivo 상에서 마이크로RNA의 발현을 관찰할 수 있으며, 리포터 조작을 통해 특정 조직이나 특정 세포에서 리포터 유전자를 발현시켜 마이크로RNA의 발현을 관찰할 수 있으며, 리포터 유전자로서 루시퍼라제뿐만 아니라, 분석하고자 하는 miRNA를 고려하여 in vivo에서 활용 가능한 다양한 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 또한 대조군으로서 RNA 특정 결합부위가 없는 세포 또는 동물을 함께 사용할 경우, 특정 반응에 대한 마이크로RNA의 변화를 개체 별로 비교 가능하다. 나아가 이를 포함하는 형질전환 동물은 루시페린이 주입되면 마이크로RNA 발현을 통해 루미네슨스 변화를 관찰할 수 있고, 이를 통해 목적하는 miRNA 발현 변화를 영상으로 관찰 가능하다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 벡터를 포함하는 형질전환마우스에 관한 것이다.

형질전환 마우스동물모델에 사용되는 동물은 인간을 제외한 다양한 포유류를 포함하며, 이로 제한하는 것은 아니나, 소, 돼지, 양, 토끼, 설취류가 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 상기 동물은 쥣과 (murine)동물, 예를 들면 레트 (Mus musculus), 마우스이다. 다른 구현예에서는 마우스 (Mus musculus)이다. 또 다른 다른 구현예에서 마우스는 C57BL/6이다.

특정 유전자를 발현하는 형질전환 동물모델을 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로 상기 형질전환 동물은 외인성 유전자를 포함하는 표적벡터를 수정난 또는 배아줄기세포 (Embryonic Stem Cell, ES 세포)에 미세주입법, 전기천공법, 리포펙션 또는 유전자총(Biolistics)을 이용해 전달한다. 예를 들면 WO 2005/089539; Nagy et al., Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1986, 1994, 2002); 및 Wang et al.,(2005) Journal of Hepatology 43:836844에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 형질전환동물은, 본원에 따른 벡터를 수정란 또는 배아줄기세포에 전달하는 단계, 가임신된 동물을 준비하는 단계, 상기 수정란을 상기 가임신된 동물의 자궁에 이식하는 단계, 상기 수정란이 새끼로 태어나도록 동물을 기르는 단계, 자손을 수득하여 본원에 따른 벡터에 포함딘 유전자 발현여부를 선별 하는 단계를 수행하여 수득할 수 있다. 상기 수정란 또는 배아줄기세포에 외인성 유전자를 전달하는 단계는 상기 문헌 등에 공지되어 있으며, 선별 방법 또한 당업계에 공지된 RT-PCR 및 면역학적 방법으로 수행될 수 있다. 외인성 유전자를 과발현하는 마우스는 통상적으로 반접합성 (hemizygous)이다.

본원에 따른 형질전환 마우스모델은 마이크로RNA에 대한 생체내에서의 기능 및 역할을 추적하는 기초연구를 포함하여 응용연구로서 다양한 질환 모델에 대한 관련 마이크로RNA를 영상으로 평가하여 마이크로RNA와 질환과의 상관 관계 등을 관찰할 수 있을 것이다. 또한 마이크로RNA를 이용한 약물 개발 시 약물의 분포 등을 관찰할 수 있으며, 마이크로RNA를 표적으로 한 antisense 마이크로RNA 치료제 등의 치료제 효능을 빠르고 쉽게 민감성이 좋은 광학영상기술로 평가할 수 있을 것이다.

실시예

본원의 실시예에 사용한 실험 방법은 다음과 같다.

miRNA 발현 생체 영상용 벡터 제조

렌티바이러스 벡터 pMSCV-ffLuc-pIRES2-Thy1.1(Rabinovich BA, et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proc Natl Acad Sci. 105(38):14342-6. (2008))을 이용하여 Thy1.1 대신 eGFP (Clontech, USA) 및 miR-124의 표적 서열에 완벽하게 상보적인 3개의 5‘- TTAAGGCACGCGGTGAATGCC-3’서열 (3xPT)를 삽입하였으며, pMSCV-effLuc-IRES-eGFP-miR124aPT 벡터를 구축하였다. 상기 해당 영역은 도 1a에 기재되어 있다.

miRNA 발현 생체 영상 형질전환 마우스의 제조

미세주입에 사용된 DNA는 상기 구축된 벡터 내의 5’ LTR 영역, effluc-IRES-eGFP-miR124aPT 영역 및 3’ LTR 영역이 포함된 단편 (~4.9kb)을 사용하였으며, 단편은 상기 벡터를 5’ LTR 시작부위 상방에 위치한 NdeI 과 3’ LTR 바깥쪽 하방에 위치한 SalI으로 처리하여 전기영동을 한 후 2.4kb 백본 단편과 4.9kb 단편을 분리하여, 4.9kb 단편을 정제하여 사용하였다.

형질전환 마우스 제작에는 5-8 주령, 암컷 C57BL/6N (마크로젠, 대한민국) 마우스를 사용하였다. 과배란을 위하여 마우스에 PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin, 대성미생물, 대한민국 )(5IU)와 hCG(human chorionic gonadotropin, 대성미생물, 대한민국 )(5IU)를 48시간 간격으로 2회 복강주사하였다. hCG 주사 후 수컷과 교배한 후, 다음날 질 전정에 plug이 관찰되는 마우스를 선별하여 hCG 후 18~20시간 이후 난관으로부터 수정란(zygote)을 채란하였다.

채란된 수정란(zygote)를 입체현미경 하에서, 수정란의 수컷 전핵(pronucleus)에 미세조작기를 사용하여 상기 준비된 DNA를 주입하였으며, 주입된 난자는 같은 날 0.5 dpc (days post copulation)의 가임신된 대리모에 외과적인 방법으로 난관 이식하였다. 이식 후 19일 후 분만하였다.

이어 대리모를 통해 분만한 파운더마우스는 14일 후에 꼬리조직으로부터 유전체 DNA를 추출하고 PCR을 이용하여 effluc-GFP-miR124aPT TG 파운더마우스 (F0)를 확인하였다. 유전자형 결정에 사용한 프라이머는 다음과 같다: forward 5’- GTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA-3’ 및 reverse 5’- CCGCTGGTTCACGCCCAGGGTC-3‘. 확인된 파운더마우스는 C57BL/6N 정상마우스와 교배하였다. 실험에 사용된 마우스는 F1 마우스와 정상 마우스와 교배하여 만들어진 형질전환 마우스이다.

세포 배양

HeLa 세포는 10% FBS (fetal bovine serum Invitrogen)과 1% 항생제 진균제 (Antibiotics-antimycotics, Invitrogen)를 포함하는 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Welgene, Korea) 배양액을 사용하여 습윤된 37℃ 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 형질전환 마우스 (Tg)의 16일된 태아를 분리하여 대뇌피질을 분리하여 0.25% 트립신으로 세포를 추출하였다. 1 mg/mL poly-L-lysine(Sigma,USA)이 처리된 플레이트에 N2(Invitrogen), 0.3% Antibiotics-antimycotics, 0.3% FBS를 포함하는 DMEM (Welgene,)에서 10일간 배양하였다. 이어 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)을 제조자의 방법대로 사용하여 각각 50nM scramble, precursor miR-124 (Ambion, USA)또는 miR-124 inhibitor (Ambion)를 세포에 전달이입하였다.

루시퍼라제 활성 측정

배양액이 제거된 세포를 PBS(phosphate-buffered saline pH 7.4)로 씻은 후, 리포터 융해 완충액 (reporter lysis buffer, Promega, USA)를 넣어 단백질을 추출하였다. 루시퍼라제 활성은 추출된 단백질에 D-루시페린을 30mg/1mL(Caliper,USA) 농도로 넣어 GloMax® 96 Microplate Luminometer (Promega, USA)로 측정하였다. 측정된 루시퍼라제 활성은 사용된 총 단백질양으로 보정하였다.

바이오루미네슨스 영상

실험동물에 3mg/0.1mL/mouse luciferin (Caliper) 복강 투여하고 15분 후, 2.5% isoflurane(Sigma)으로 호흡 마취하였다. 마취 후 IVIS (In vivo Imagaing System) 장비 (Xenogen, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 바이오루미네슨스 영상을 획득하였다. 영상 결과 분석은 Living image software (Xenogen,USA)를 이용하였다.

실시간 PCR 분석

분석에 사용한 조직을 TRIzol (Invitrogen,USA)을 제조자의 방법대로 이용하여 총 RNA를 수득하였다. 이어 10ng RNA와 Taqman primer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어 cDNA는 TaqMan MicroRNA Assay인 miR-124 (001182, Life technologies, USA), U6 (001973, Life technologies, USA)을 이용하여 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, CA, USA)에서 증폭시켜 상대적인 발현을 비교하였다.

조직염색

적출한 조직은 4% paraformaldehyde(PFA)에서 48시간 고정시킨 후 파라핀 블록을 제작하였다. 4μm 졀편을 만든 후 슬라이드에서 파라핀을 제거 후, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0)에서 10분간 끓여주었다. 이어 1% H₂O₂가 든 메탄올에 30분간 담근 후, 0.5% TritonX-100이 든 TBS에 담가 세포막의 투과성을 높여주었다. 이후 5% BSA가 든 TBS에 1시간 담근 후, 4℃에서 1차 항체와 밤새 반응하였다. 다음 날 1차 항체를 제거 후 형광이 있는 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 1 μM 1 μM 4’.6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Invitrogen) 를 10분간 염색 후 봉입하였다. 염색된 조직은 공초점현미경 (Carl Zeiss LSM510, Jena, Germany)으로 관찰하였다.

세포염색

세포는 PBS로 2회 수세 후, 4% PFA로 20분간 고정하였다. 고정된 세포는 0.1% Triton X-100이 든 PBS에 30분간 담근 후, 3% normal goat serum, 2% BSA 및 3% Triton-X 100이 든 PBS로 1시간 블로킹하였다. 세포에 1차 항체 (rabbit anti-MAP2 (Sigma), mouse anti-GFAP (Cell Signaling Technology, USA))를 밤새 4℃에서 붙이고, 다음 날 PBS 수세 후 Alexa Flour 488-/555-가 붙은 2차 항체 (Invitrogen) 를 상온에서 1시간동안 붙었다. 이후 1μM DAPI를 10분간 염색 후 봉입하였다. 염색된 조직은 Carl Zeiss LSM510 공초점현미경으로 관찰하였다.

실시예 1. miR-124 3xPT 리포터 시스템에서 miR-124에 의한 루시퍼라제 활성 감소

세포 또는 생체내에서 발현되는 miRNA의 발현 또는 생성 정도 또는 여부를 검출하기 위해 miR-124 3xPT 리포터 시스템을 상술한 실험방법에서와 같이 구축하였다. 본원의 실시예에서 구축된 벡터는 두 개의 리포터 즉 파이어플라이 루시퍼라제 (effluc) 및 GFP (녹색형광단백질)를 포함하며 하나의 RNA로 전사체로 전사된다. 루시퍼라제는 생체 내 영상을 용이하게 하며, GFP는 실험실 내 실험을 형광 관찰만으로 가능하게 하므로 두 개의 리포터 사용시 서로의 단점을 보완할 수 있는 장점이 있다. miR-124가 발현되는 경우 상기 두 개의 리포터 유전자의 발현이 억제된다. 본원에 따른 벡터 시스템을 Hela 세포에 도입하고, miR-124 또는 대조군으로 스크랩블 RNA를 과발현시킨 경우, 루시퍼라제 활성이 현저하게 감소된 것으로 나타났다(도 1b). 이러한 결과는 본원에 따른 벡터 시스템이 miRNA의 생성 (biogenesis)을 모니터링 하는데 효과적인 것임을 나타낸다.

실시예 2. 본원에 따른 벡터로 형질전환된 형질전환 마우스

본원에 따른 형질전환 마우스는 본원에 따른 벡터가 유전체에 삽입되어 안정적으로 유전되는 것을 확인 하였다. 이를 위해 D-루시페린을 주사하여 11 마리의 파운더 마우스 중에서 바이오루미네슨스를 나타내는 두 마리의 양성 마우스 (라인 18 및 라인 67)을 선별하였다 (도 2a 참조). 강한 신호는 털이 없는 부위에서 관찰되었으며, 전신 촬영에서는 라인 67이 18보다 강한 신호를 나타냈다. 또한 도 2b에 나타난 바와 같이 리포터 활성은 E16 전신에 걸쳐 관찰되었다. 형질전환 마우스에서 장기를 분리하여 바이오루미네슨스를 관찰한 결과 다양한 장기에서 신호가 관찰되었다 (도 2c). 라인 67 마우스를 사용하여 miR-124 생성에 대한 영상 촬영을 수행한 결과, 바이오루미네슨스 활성이 거의 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본원에 따른 형질전환마우스가 effluc-eGFP-miR-124 3xPT transgene을 포함하고 있는 것을 나타낸다.

실시예 3. 형질전환마우스의 뇌 및 장기에서 miR-124 및 루시퍼라제 발현 확인

형질전환마우스의 뇌 및 장기에서 miR-124 및 루시퍼라제 발현 확인하기 위해, 해당 장기에서 총 RNA를 추출하고 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 그 결과 miR-124는 뇌에서 가장 강한 발현을 하는 것으로 나타났으며, 다른 장기와 비교하여 100배 정도 강하였다 (도 3a 참조). 이어 형질전환 마우스의 배아 및 뇌의 절편에 대하여 miR-124와 루시퍼라제를 검출하였다. 그 결과 E13과 비교하여 E16에서 뇌 및 척추에서 miR-124의 발현이 증가하고, 루시퍼라제 발현은 감소한 것으로 나타났다 (도 3b 참조). 또한 본원에 따른 형질전환 마우스를 이용하여 발달 단계에서 따른 발현 패턴을 검출할 수 있으며, 출생 후 10일 및 12개월령의 마우스에서 상이한 발현 패턴을 나타냈다 (도 3b).

루시퍼라제 발현 정도를 주요 장기에서 실시간 PCR로 분석한 결과, 특히 심장 및 피부에서 높은 루시퍼라제 활성이 나타났다 (도 3c). 또한 조직면역염색을 통해 녹색형광단백질 및 루시퍼라제 항체를 이용해서 장기에서 리포터의 발현을 분석한 결과 대조군과 비교하여 뇌를 제외하고 각 장기에서 리포터의 발현이 높은 것으로 나타났다 (도 3d).

실시예 4. 형질전환마우스의 뇌 및 코티칼 뉴론에서 miR-124에 의해 감소된 루시퍼라제 신호

miR-124의 억제 또는 과발현에 의한 리포터 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석하였다. miR-124의 발현은 실험방법에 기재된 바와 같이 스폰지 바이러스 입자를 이용하여 수행되었다.

바이러스를 형질전환 마우스의 코텍스에 주입하고 24시간 후에 관찰한 결과 주입 부위에서 즉 miR-124 과발현시 바이오루미네슨스가 감소된 것으로 나타났다. 반면 miR-124 스폰지 바이러스로 처리된 마우스의 경우는 강한 바이오루미네슨스를 갖는 것으로 나타났다 (도 4a 참조).

나아가 뉴론에서도 영향도 분석하였다. E16 Tg 마우스에서 추출한 코티칼 뉴론을 배양하고 유전자 형을 확인하였고, 위상차 현미경으로 관찰하였다 (도 4b). 일차 배양된 뉴론의 순도를 확인하기 위하여 뉴론 및 아스트로사이트의 마커인 MAP2 and GFAP에 특이적 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행한 결과 95% 인 것으로 나타났다 (도 4c).

이어 세포를 scramble, miR124 or miR-124 inhibitor로 24시간 처리한 후에, 루시퍼라제 활성을 조사하였다. 그 결과 miR-124 전달이입으로 인해 루시퍼라제의 활성이 대조군과 비교하여 55.3% 감소한 것으로 나타났다. miR-124 억제제 및 스크램블 전달이입된 세포에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다 (108.9 ± 10.9%, ANOVA, **p < 0.01, Fig. 4D). 이러한 결과는 형질전환 마우스의 뇌에서 miR-124의 생성 결과와 일치하는 것이며, 뇌에서의 바이오루미네슨스의 레벨로 miR-124 발현의 변화를 관찰 할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 5. 발달단계에서 뇌에서 miR-124의 발현 레벨을 반영하는 바이오루미네슨스

MiR-124 발현은 래트에서 E13에서 증가하기 시작하고, 마우스에서는 E10에 증가하기 시작한다. miR-124 레벨은 출생 후에 성숙한 뉴론에서 유지 증가된 상태로 유지된다 (Krichevsky AM, et al. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9(10):1274-81 (2003)).

도 3b에 나타난 바와 같이, 인시츄분석에서 miR-124 레벨이 E13부터 E16까지 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 레벨의 변화가 miR-124 발현 변화와 연관된 것인지를 확인하기 위해, 배아단계부터 성체까지 장기에서 바이오루미네슨스를 조사하였다. E13에서 E16와 비교하여 뇌 대 간에서의 바이오루미네슨스는 50.2 ± 11.1%인 것으로 나타났으며, P10과 비교해서는 47.7 ± 4.5% 인 것으로 나타났다 (도 5a 및 5b). 뇌에서 루시퍼라제 활성은 3-5개월령 (젊은 마우스) 마우스에서는 34.0± 11.5% 감소된 상태이고, 16-24개월령(늙은 마우스) 마우스에서는 45.6± 20.1% 로 감소된 것으로 나타났다 (도 5a, 5b). 루시퍼라제 활성은 각 발달 단계의 뇌 조직의 융해물에서 검출하였다. E13의 루시퍼라제 활성은 E16과 비교하여 17.1 ± 1.2% 로 상당히 감소하였다 (도 5c). 이러한 루시퍼라제 활성이 뇌에서 miR-124 레벨을 반영하는 것을 확인하기 위해, 실시간 PCR를 수행하였다. 그 결과 도 5d에 기재된 바와 같이 E13 과 E 16에서 상당한 차이가 발견되었다. 이러한 결과는 바이오루미네슨스가 ex vivo에서 miR-124 발현의 표지자로서 작용할 수 있음을 나타내는 것이다. 즉 본원에 따른 벡터 및 이를 포함하는 형질전환마우스는 miR-124의 발현 변화를 정확하게 검출하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.

Claims

프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 인비보, 인비트로 또는 엑스비보 영상 촬영이 가능한 제 1 리포터; 리보솜진입부위 (IRES); 제 2 리포터와 동일 또는 상이하며, 인비보, 인비트로 또는 엑스비보 영상 촬영이 가능한 제 2 리포터; 및 적어도 한 개의 목적하는 표적 마이크로RNA의 서열을 순서대로 포함하는 생체내 마이크로 RNA 발현 분석용 벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 제 1 리포터 유전자는 루시퍼라제 유전자 또는 초록형광단백질 (GFP) 인, 벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 목적하는 표적 마이크로RNA 서열은 3개 포함되는 것인, 벡터.
제 3 항에 있어서, 상기 표적 마이크로RNA 서열은 5'-TTAAGGCACGCGGTGAATGCC-3' 로 표시되는 miR-124의 표적서열인, 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 상기 벡터 중 백본을 제외한 프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 제 1 리포터; 리보솜진입부위 (IRES); 제 2 리포터; 및 적어도 한 개의 목적하는 표적 마이크로RNA의 서열로 구성되는 단편으로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환 동물.
제 5 항에 있어서, 상기 동물은 설취류 유래인, 인간을 제외한 형질전환 동물.
제 6 항에 있어서, 상기 동물 모델은 마우스 (Mus musculus)인, 인간을 제외한 형질전환 동물모델.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포 또는 상기 벡터를 포함하는 형질전환동물을 제공하는 단계;
상기 세포 또는 형질전환 동물에서 리포터의 신호를 검출하는 단계; 및
상기 리포터 신호의 검출은 상기 벡터에 포함된 표적 miRNA의 발현 또는 발현의 변화를 나타내는 것인, 세포 또는 형질전환동물에서 마이크로RNA 발현 측정 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 검출은 IVIS (In Vivo Imaging System)을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포 또는 상기 벡터를 포함하는 형질전환동물을 제공하는 단계;
상기 세포 또는 동물과 상기 벡터에 포함된 마이크로RNA 발현을 조절할 것으로 기대되는 시험물질과 접촉하는 단계;
상기 접촉된 세포 또는 형질전환 동물에서 리포터의 신호를 검출하는 단계; 및
대조군과 비교하여 상기 리포터 신호의 변화가 있는 경우, 상기 시험물질을 상기 벡터에 포함된 표적 miRNA의 조절 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 마이크로 RNA 조절 물질의 스크리닝 방법.