KR20160078934A - An Apparatus for Diagnosing Cancer and an Method for The Same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 암의 신규한 진단 장치 및 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel device and method for diagnosing cancer.
세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구소(IARC)의 보고서에 의하면 전세계 184개 국가의 신규 암 발생 건수가 2008년 1270만건이며, 2030년에는 2220만건으로 늘어날 것이라고 전망되고 있다. 현재 임상에서 암의 진단은 문진과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경 검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현재 사용되고 있는 임상검사법으로는 암의 세포 수가 10억 개, 암의 직경이 1 cm 이상이 되어야 진단이 가능하고, 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상의 암이 이미 전이되어 있는 경우가 많아 정확하면서도 조기 진단하는 방법에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.According to a report by the International Cancer Institute (IARC) under the World Health Organization (WHO), the number of new cancer cases in 184 countries around the world is 12.7 million in 2008, and it is expected to increase to 22.2 million in 2030. Currently, cancer diagnosis in clinical practice is carried out through an interview, physical examination, and clinical pathology examination, and once suspected, it is proceeded with radiographic examination and endoscopy, and finally, it is confirmed by a biopsy. However, with the currently used clinical test method, diagnosis is possible only when the number of cancer cells is 1 billion cells and the diameter of the cancer is 1 cm or more. In many cases, research on an accurate and early diagnosis method is being actively conducted.
특히, 최근 10년 동안 갑상선암은 매우 빠른 속도로 그 수가 증가하고 있는데, 1999년부터 2005년까지 발표된 국가암등록 사업 연례보고서에 의하면 전체 암 중 갑상선암의 발생률은 1999년 3.3%(7위)에서 2005년 8.9%(5위)로 증가하였으며, 특히 여성에서는 1999년 6.5%(7위)에서 2005년 16.7%(1위)로 유방암을 제치고 여성 암 중 가장 흔한 암이 되었다.In particular, the number of thyroid cancers has been increasing at a very rapid rate in the last 10 years. According to the annual report of the National Cancer Registration Project published from 1999 to 2005, the incidence of thyroid cancer among all cancers was 3.3% (7th place) in 1999. In 2005, it increased to 8.9% (5th place), and especially in women, it became the most common cancer among female cancers, surpassing breast cancer from 6.5% (7th) in 1999 to 16.7% (1st) in 2005.
갑상선암은 다른 암에 비해 발병률이 높기는 하지만 진단이 조기에 이루어져 조기에 수술을 할 수 있다면 생존률이 높은 편에 속하는바, 조기에 정확하게 진단하는 방법을 구축하는 것 또한 매우 중요하다.Thyroid cancer has a higher incidence than other cancers, but if the diagnosis is made early and surgery can be performed early, the survival rate is high. Therefore, it is also very important to establish an early and accurate diagnosis method.
종래 갑상선암을 진단하는 방법은 초음파 판독 또는 갑상선 세포나 갑상선 조직의 병리조직학적 판독이 이용되었으나, 판독이 어렵거나 불분명한 경우가 많은 문제점이 있었다.In the conventional method for diagnosing thyroid cancer, ultrasound reading or histopathological reading of thyroid cells or thyroid tissue has been used, but there are many problems in cases where reading is difficult or unclear.
또한, 암과 관련된 유전자 돌연변이를 검출하여 진단하는 방법은 암 세포 또는 조직으로부터 DNA를 분리하여 BRAF(갑상선암, 흑색종, 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병에서 돌연변이가 나타남), KRAS(갑상선암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 전립선암에서 돌연변이가 나타남), NRAS(갑상선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양에서 돌연변이가 나타남) 또는 HRAS(갑상선암, 위암, 방광암, 전립선암에서 돌연변이가 나타남) 유전자 돌연변이 여부를 확인하고, DNA를 이용하여 검사가 불가능한 RET/PTC 또는 PAX8/PPARγ 유전자 재배열 돌연변이(갑상선암 특이적 돌연변이임)는 따로 RNA를 분리하여 검사를 진행하여야 하므로 DNA와 RNA를 각각 분리해야하는 불편함이 따르고, 진단에 장시간이 소요되며, 상기 유전자 중 하나의 유전자의 돌연변이만 검출할 경우 암진단에 정확도가 낮아지는 문제점이 있다.In addition, the method of detecting and diagnosing a gene mutation related to cancer is BRAF (mutation appears in thyroid cancer, melanoma, colorectal cancer, ovarian cancer, hairy cell leukemia), KRAS (thyroid cancer, Mutations appear in pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, and prostate cancer), NRAS (mutations appear in thyroid cancer, acute leukemia, chronic leukemia, brain tumors), or HRAS (mutations appear in thyroid cancer, gastric cancer, bladder cancer, and prostate cancer) genes RET/PTC or PAX8/PPARγ gene rearrangement mutations (which are thyroid cancer specific mutations), which cannot be checked for mutations and tested using DNA, require separate RNA to be tested, so it is inconvenient to separate DNA and RNA separately. There is a problem in that it takes a long time to diagnose, and when only a mutation of one of the genes is detected, the accuracy of cancer diagnosis is lowered.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, a number of papers and patent documents are referenced and citations are indicated. The disclosure contents of the cited papers and patent documents are incorporated by reference in this specification as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.
본 발명자들은 암 진단을 정확하고 편리하게 하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 특정 서열을 가진 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하는 경우 암 세포 또는 조직으로부터 추출한 RNA 또는 이를 역전사시킨 cDNA를 주형으로 하여 BRAF, KRAS, NRAS 및 HRAS 유전자의 돌연변이 검출 뿐만 아니라 RET/PTC 및 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출까지 모두 가능하여 암의 진단을 정확하고 편리하게 할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have made intensive research efforts to develop a method for accurately and conveniently diagnosing cancer. As a result, when using the oligonucleotide group of primers and probes having a specific sequence of the present invention, RNA extracted from cancer cells or tissues or cDNA obtained by reverse transcription thereof is used as a template to detect mutations of BRAF, KRAS, NRAS and HRAS genes as well as RET The present invention was completed by confirming that both the rearrangement detection of /PTC and PAX8/PPARγ genes are possible, so that the diagnosis of cancer can be accurately and conveniently.
따라서 본 발명의 목적은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군을 제공하는데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a group of oligonucleotides for detection of cancer that hybridizes with a nucleic acid of a cancer cell.
본 발명의 다른 목적은 특정 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a cancer diagnostic kit comprising a specific group of oligonucleotides.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of cancer.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅲ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅳ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅴ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅵ) 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅶ) 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고 (ⅷ) 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군으로, 상기 올리고뉴클레오타이드 군은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides (i) an oligonucleotide group consisting of primers of the first and second sequences of the sequence listing; (Ii) a group of oligonucleotides consisting of a primer selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 4 to 7 and a primer of SEQ ID NO: 8; (Iii) a group of oligonucleotides consisting of primers selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOs: 10 to 12 of Sequence Listing and primers of SEQ ID NO: 13; (Iv) a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 15, 16, and 17 of the Sequence Listing; (V) an oligonucleotide group consisting of a primer of SEQ ID NO: 18 and a primer of SEQ ID NO: 19 or 20; (Vi) a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 23 and 25; (Vii) a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 24 and 25; And (viii) an oligonucleotide group selected from the group consisting of an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NOs: 28, 29, and 30 of the Sequence Listing, wherein the oligonucleotide group is used for detection of cancer hybridizing to nucleic acids of cancer cells. Provides a group of oligonucleotides.
본 발명자들은 암 진단을 정확하고 편리하게 하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 특정 서열을 가진 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하는 경우 암 세포 또는 조직으로부터 추출한 RNA 또는 이를 역전사시킨 cDNA를 주형으로 하여 BRAF, KRAS, NRAS 및 HRAS 유전자의 돌연변이 검출 뿐만 아니라 RET/PTC 및 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출까지 모두 가능하여 암의 진단을 정확하고 편리하게 할 수 있음을 확인하였다.The present inventors have made intensive research efforts to develop a method for accurately and conveniently diagnosing cancer. As a result, when using the oligonucleotide group of primers and probes having a specific sequence of the present invention, RNA extracted from cancer cells or tissues or cDNA obtained by reverse transcription thereof is used as a template to detect mutations of BRAF, KRAS, NRAS and HRAS genes as well as RET It was confirmed that both the rearrangement detection of /PTC and PAX8/PPARγ genes are possible, so that the diagnosis of cancer can be accurately and conveniently.
본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'말단 서열 또는 3'말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.In the specification of the present invention, the term "primer" is complementary to the 5'-end sequence or the 3'-end sequence of the target nucleic acid site to be amplified during the nucleic acid amplification reaction, and in suitable conditions (ie, It refers to a single-stranded oligonucleotide capable of serving as an initiation point of a polymerase reaction of a template-indicating nucleic acid under four different nucleoside triphosphates and polymerase). Suitable lengths of primers are typically 15-30 nucleotides, although varying depending on various factors such as temperature and application of the primer. Short primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybridization complexes with the template. The primer used in the present invention is hybridized or annealed at one site of the template to form a double-chain structure. Conditions for nucleic acid hybridization suitable for forming such a double-stranded structure are Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization. , A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
본 명세서에서 용어 “핵산”은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).In the present specification, the term “nucleic acid” has a meaning that comprehensively includes DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are basic structural units in nucleic acid molecules, are not only natural nucleotides, but also analogs with modified sugar or base sites. (analogue) (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90:543-584 (1990)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열, 제4서열 내지 제7서열, 제10서열 내지 제12서열, 제15서열, 제16서열, 제18서열, 제23서열, 제24서열, 제28서열 및 제29서열은 포워드 프라이머(forward primer)이다.According to an embodiment of the present invention, the sequence list of the present invention is the first sequence, the fourth to the seventh sequence, the 10th to the 12th sequence, the 15th sequence, the 16th sequence, the 18th sequence, the 23rd sequence, SEQ ID NOs: 24, 28, and 29 are forward primers.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제2서열, 제8서열, 제13서열, 제17서열, 제19서열, 제20서열, 제25서열 및 제30서열은 리버스 프라이머(reverse primer)이다.According to an embodiment of the present invention, the second sequence, the 8th sequence, the 13th sequence, the 17th sequence, the 19th sequence, the 20th sequence, the 25th sequence, and the 30th sequence of the present invention are reverse primers (reverse primers). primer).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암이다.According to one embodiment of the present invention, the cancer of the present invention is thyroid cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer, hairy cell leukemia, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, acute leukemia, Chronic leukemia, brain tumor, gastric or bladder cancer. According to a specific embodiment of the present invention, the cancer of the present invention is thyroid cancer.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암 또는 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia) 세포의 핵산과 혼성화된다.According to one embodiment of the present invention, the oligonucleotide group (i) of the present invention is hybridized with nucleic acids of thyroid cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer or hairy cell leukemia cells.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)는 갑상선암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암 또는 전립선암 세포의 핵산과 혼성화된다.According to one embodiment of the present invention, the oligonucleotide group (ii) of the present invention is hybridized with nucleic acids of thyroid cancer, pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer or prostate cancer cells.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)은 갑상선암, 급성백혈병, 만성백혈병 또는 뇌종양 세포의 핵산과 혼성화된다.According to one embodiment of the present invention, the oligonucleotide group (iii) of the present invention is hybridized with nucleic acids of thyroid cancer, acute leukemia, chronic leukemia or brain tumor cells.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ) 또는 (ⅴ)는 갑상선암, 위암, 방광암 또는 전립선암의 핵산과 혼성화된다.According to one embodiment of the present invention, the oligonucleotide group (iv) or (v) of the present invention is hybridized with a nucleic acid of thyroid cancer, gastric cancer, bladder cancer or prostate cancer.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 또는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.According to an embodiment of the present invention, the oligonucleotide group of the present invention further comprises a probe having the oligonucleotide group (i) of the present invention having the third sequence of the sequence listing; The oligonucleotide group (ii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 9; Or the oligonucleotide group (iii) of the present invention further comprises a probe having the 14th sequence of the sequence listing; Or the oligonucleotide group (iv) of the present invention further comprises a probe having the 21st sequence of sequence listing; The oligonucleotide group (v) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 22; The oligonucleotide group (vi) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 26; The oligonucleotide group (vii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 27; Alternatively, the oligonucleotide group (viii) of the present invention further includes a probe having the 31st sequence of SEQ ID NO.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 그리고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.According to another embodiment of the present invention, the group of oligonucleotides of the present invention further comprises a probe having the third sequence of the oligonucleotide group (i) of the present invention; The oligonucleotide group (ii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 9; The oligonucleotide group (iii) of the present invention further comprises a probe having the 14th sequence of the sequence listing; The oligonucleotide group (iv) of the present invention further comprises a probe having the 21st sequence of Sequence Listing; The oligonucleotide group (v) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 22; The group of oligonucleotides of the present invention (vi) further comprises a probe having the 26th sequence of Sequence Listing; The oligonucleotide group (vii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 27; And the oligonucleotide group (viii) of the present invention additionally includes a probe having the 31st sequence in the sequence listing.
본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging)되어 프로브 표지로 사용될 수 있다. 본 발명의 프로브 서열에서 프로브의 표지는 당업계에서 사용하는 다양한 표지로 변경될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.In the present specification, the term "probe" is a single-stranded nucleic acid molecule, and includes a sequence complementary to a target nucleotide sequence. According to an embodiment of the present invention, the probe of the present invention can be modified within a range in which the advantages of the probe of the present invention, that is, hybridization specificity, are not impaired. For example, a reporter fluorescent substance or a fluorescent inhibitor (quencher) may be tagged at the end of the probe oligonucleotide to be used as a probe label. In the probe sequence of the present invention, the label of the probe may be changed to a variety of labels used in the art. Suitable labels are fluorophores (e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)), chromophores, chemiluminescent groups, magnetic particles, radioactive isotopes. Elements (P 32 and S 35 ), mass labels, electron congesting particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (e.g. gold) and antibodies, streptavidin , Biotin, digoxigenin, and hapten having a specific binding partner such as a chelating group, but are not limited thereto. Labeling can be carried out by various methods commonly practiced in the art, such as nick translation method, random priming method (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham" (1989)) and kineation method (Maxam & Gilbert, Methods. in Enzymology , 65:499 (1986)). The label provides a signal that can be detected by fluorescence, radioactivity, colorimetric measurement, gravimetric measurement, X-ray diffraction or absorption, magnetic, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, high frequency hybridization, and nanocrystals.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅲ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅳ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅴ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅵ) 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; (ⅶ) 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고 (ⅷ) 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides (i) an oligonucleotide group consisting of primers of the first and second sequences of the sequence listing; (Ii) a group of oligonucleotides consisting of a primer selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 4 to 7 and a primer of SEQ ID NO: 8; (Iii) a group of oligonucleotides consisting of primers selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOs: 10 to 12 of Sequence Listing and primers of SEQ ID NO: 13; (Iv) a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 15, 16, and 17 of the Sequence Listing; (V) an oligonucleotide group consisting of a primer of SEQ ID NO: 18 and a primer of SEQ ID NO: 19 or 20; (Vi) a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 23 and 25; (Vii) a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 24 and 25; And (viii) provides a cancer diagnostic kit comprising an oligonucleotide group selected from the group consisting of the oligonucleotide group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 28, 29, and 30 of the Sequence Listing.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암이다.According to one embodiment of the present invention, the cancer of the present invention is thyroid cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer, hairy cell leukemia, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, acute leukemia, Chronic leukemia, brain tumor, gastric or bladder cancer. According to a specific embodiment of the present invention, the cancer of the present invention is thyroid cancer.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암 또는 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia) 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (i)을 포함한다.According to another embodiment of the present invention, the diagnostic kit for thyroid cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer or hairy cell leukemia of the present invention comprises an oligonucleotide group (i).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암 또는 전립선암 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)를 포함한다.According to another embodiment of the present invention, the diagnostic kit for thyroid cancer, pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer or prostate cancer of the present invention includes an oligonucleotide group (ii).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 급성백혈병, 만성백혈병 또는 뇌종양 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)을 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the diagnostic kit for thyroid cancer, acute leukemia, chronic leukemia or brain tumor of the present invention includes an oligonucleotide group (iii).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 갑상선암, 위암, 방광암 또는 전립선암 진단 키트는 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ) 및/또는 (ⅴ)를 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the diagnostic kit for thyroid cancer, gastric cancer, bladder cancer or prostate cancer of the present invention includes an oligonucleotide group (iv) and/or (v).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 또는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the diagnostic kit of the present invention further comprises a probe having the oligonucleotide group (i) of the present invention having the third sequence of the sequence listing; The oligonucleotide group (ii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 9; Or the oligonucleotide group (iii) of the present invention further comprises a probe having the 14th sequence of the sequence listing; Or the oligonucleotide group (iv) of the present invention further comprises a probe having the 21st sequence of sequence listing; The oligonucleotide group (v) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 22; The oligonucleotide group (vi) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 26; The oligonucleotide group (vii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 27; Alternatively, the oligonucleotide group (viii) of the present invention further includes a probe having the 31st sequence of SEQ ID NO.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (i)이 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅴ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅵ)이 서열목록 제26서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅶ)이 서열목록 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하고; 그리고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅷ)이 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함한다.According to another embodiment of the present invention, the diagnostic kit of the present invention further comprises a probe in which the oligonucleotide group (i) of the present invention has the third sequence of Sequence Listing; The oligonucleotide group (ii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 9; The oligonucleotide group (iii) of the present invention further comprises a probe having the 14th sequence of the sequence listing; The oligonucleotide group (iv) of the present invention further comprises a probe having the 21st sequence of Sequence Listing; The oligonucleotide group (v) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 22; The group of oligonucleotides of the present invention (vi) further comprises a probe having the 26th sequence of Sequence Listing; The oligonucleotide group (vii) of the present invention further comprises a probe having SEQ ID NO: 27; And the oligonucleotide group (viii) of the present invention additionally includes a probe having the 31st sequence in the sequence listing.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 추가적으로 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the diagnostic kit of the present invention additionally includes a reverse transcriptase.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 핵산의 (ⅰ) BRAF 유전자의 돌연변이 검출, (ⅱ) KRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅲ) NRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅳ) HRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅴ) RET/PTC 유전자의 재배열 검출 및 (ⅵ) PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출을 실시하는 단계를 포함하는 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of: (a) obtaining a nucleic acid from a biological sample isolated from a human; And (b) the nucleic acid of step (a) (i) detection of a mutation of the BRAF gene, (ii) detection of a mutation of the KRAS gene, (iii) detection of a mutation of the NRAS gene, (iv) detection of a mutation of the HRAS gene, (v) It provides a method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of cancer comprising the step of performing a detection selected from the group consisting of) rearrangement detection of RET/PTC gene and (vi) rearrangement detection of PAX8/PPARγ gene. .
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암, 흑색종(melanoma), 대장암, 난소암, 모발상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 급성백혈병, 만성백혈병, 뇌종양, 위암 또는 방광암이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 갑상선암이다.According to one embodiment of the present invention, the cancer of the present invention is thyroid cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer, hairy cell leukemia, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, acute leukemia, Chronic leukemia, brain tumor, gastric or bladder cancer. According to a specific embodiment of the present invention, the cancer of the present invention is thyroid cancer.
본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:The method of the present invention will be described in detail for each step as follows:
단계 (a) : 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 획득 Step (a): Acquisition of nucleic acids from biological samples isolated from humans
본 발명에 따르면, 우선 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는다.According to the present invention, a nucleic acid is first obtained from a biological sample isolated from humans.
본 명세서에서 용어 “생물학적 시료”는 체외로 분리된 동물의 생체 시료로서, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 골수, 세포, 모발 또는 조직 시료를 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 특정 세포 또는 조직 시료이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 갑상선 세포 또는 조직 시료이다.In the present specification, the term “biological sample” refers to a biological sample of an animal separated from the body, and refers to a sample of blood, plasma, serum, urine, bone marrow, cells, hair, or tissue, and according to one embodiment of the present invention, the present invention The biological sample of is a specific cell or tissue sample. According to another embodiment of the present invention, the biological sample of the present invention is a thyroid cell or tissue sample.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산은 RNA이다.According to one embodiment of the present invention, the nucleic acid of the present invention is RNA.
단계 (b) : 특정 유전자 돌연변이 및/또는 유전자 재배열 검출 Step (b): detection of specific gene mutation and/or gene rearrangement
단계 (a) 실시 후, 상기 단계 (a)에서 획득한 핵산의 (ⅰ) BRAF 유전자의 돌연변이, (ⅱ) KRAS 유전자의 돌연변이, (ⅲ) NRAS 유전자의 돌연변이, (ⅳ) HRAS 유전자의 돌연변이, (ⅴ) RET/PTC 유전자의 재배열 및/또는 (ⅵ) PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출을 실시한다.After performing step (a), (i) mutation of BRAF gene, (ii) mutation of KRAS gene, (iii) mutation of NRAS gene, (iv) mutation of HRAS gene of nucleic acid obtained in step (a), ( V) Rearrangement of the RET/PTC gene and/or (vi) rearrangement of the PAX8/PPARγ gene is detected.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출은 증폭반응을 이용하여 실시한다.According to one embodiment of the present invention, the detection of the present invention is carried out using an amplification reaction.
본 명세서에서 용어 “증폭반응”이란 유전자(gene) 또는 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.In the present specification, the term “amplification reaction” refers to a reaction to amplify a gene or nucleic acid molecule. Various amplification reactions have been reported in the art, which are polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) (U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcription-polymerase chain reaction (hereinafter referred to as RT-PCR). (Sambrook et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al. (EP 329,822), ligase chain reaction ( ligase chain reaction; LCR) (17, 18), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) (19) ( WO 88/10315), self sustained sequence replication (20) (WO 90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences (US Patent No. 6,410,276) , Consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR) (U.S. Patent No. 4,437,975), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) (U.S. Patent No. 5,413,909) And 5,861,245), nucleic acid sequence based amplification (NASBA) (U.S. Patent Nos. 5,130,238, 5,409,818, 5,554,517, and 6,063,603), strand displacem ent amplification (21, 22) and loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 23, but is not limited thereto. Other amplification methods that can be used are described in U.S. Patent Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and U.S. Patent No. 09/854,317.
중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 유전자 또는 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 본 발명의 진단방법에는 전통적인 PCR 방법 뿐 아니라, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시킨, 터치다운(touchdown) PCR(24), 핫 스타트(hot start) PCR(25, 26), 네스티드(nested) PCR(2) 및 부스터(booster) PCR(27)을 이용할 수 있다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR을 사용할 수도 있다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.Polymerase chain reaction (PCR) is the most well-known gene or nucleic acid amplification method, and its many modifications and applications have been developed. In the diagnostic method of the present invention, not only the traditional PCR method, but also the touchdown PCR 24 and the hot start PCR 25 and 26, which have modified the traditional PCR procedure to improve the specificity or sensitivity of PCR. , Nested PCR (2) and booster PCR (27) can be used. In addition, real-time PCR, differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), multiplex PCR, inverse polymerase chain reaction chain reaction: IPCR), vectorette PCR, TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR), and multiplex PCR may also be used. For more information on PCR, see McPherson, MJ, and Moller, SG PCR . BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY (2000), the teachings of which are incorporated herein by reference.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 검출은 실-시간 PCR을 이용하여 실시한다. 실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.According to a specific embodiment of the present invention, the detection of the present invention is carried out using real-time PCR. Real-time PCR is a technique that monitors and analyzes the increase of PCR amplification products in real-time (Levak KJ, et al., PCR Methods Appl. , 4(6): 357-62(1995)). The PCR reaction can be monitored by recording the amount of fluorescence emission in each cycle during the exponential phase where the increase in PCR product is proportional to the initial amount of the target template. The higher the starting copy number of the nucleic acid target, the faster the increase in fluorescence is observed and has a lower Ct value (threshold cycle). A distinct increase in fluorescence above the baseline measured between 3-15 cycles indicates the detection of accumulated PCR products. Compared to conventional PCR methods, real-time PCR has the following advantages: (a) Conventional PCR is measured in a plateau, whereas real-time PCR is performed during the exponential growth phase. Data can be obtained; (b) the increase in reporter fluorescence signal is directly proportional to the number of amplicons generated; (c) the disassembled probe provides permanent record amplification of the amplicon; (d) an increase in detection range; (e) requires at least 1,000 times less nucleic acid than conventional PCR methods; (f) detection of amplified DNA is possible without separation through electrophoresis; (g) it is possible to obtain increased amplification efficiency by using a small amplicon size; And (h) the risk of contamination is low.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다. 실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.When the amount of PCR amplification product reaches the amount detectable by fluorescence, an amplification curve starts to occur, the signal rises exponentially, and then reaches a stagnation state. As the initial amount of DNA increases, the number of cycles to reach the detectable amount of amplification product decreases, so the amplification curve appears faster. Therefore, when a real-time PCR reaction is performed using a stepwise diluted standard sample, amplification curves arranged at equal intervals in the order of a large amount of initial DNA are obtained. Here, if a threshold is set at an appropriate point, the point Ct value where the threshold and the amplification curve intersect is calculated. In real-time PCR, PCR amplification products are detected through fluorescence. Detection methods are largely an interchelating method (SYBR Green I method), a method using a fluorescently labeled probe (TaqMan probe method), and the like. Since the interchelating method detects all double-stranded DNA, there is no need to prepare a probe for each gene, so it is possible to construct a reaction system at low cost. While the method using a fluorescently labeled probe is expensive, it has high detection specificity, so that even similar sequences can be distinguished and detected. According to certain embodiments of the present invention, the methods and kits of the present invention utilize the TaqMan probe method.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).First, the interchelating method is a method using a double-stranded DNA binding die, and non-specific amplification using a non-sequence-specific fluorescent intercalating reagent (SYBR Green I or ethidium bromide) and amplicon production including a primer-dimer complex Is to quantify. This reagent does not bind to ssDNA. SYBR Green I is a fluorescent die that binds to the minor groove of double-stranded DNA. It hardly shows fluorescence in solution, but is an interchelator that shows strong fluorescence when bound to double-stranded DNA (Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). Therefore, since fluorescence is emitted through the binding between SYBR Green I and double-stranded DNA, the amount of amplification product produced can be measured. SYBR Green real-time PCR is accompanied by an optimization process such as melting point or dissociation curve analysis for amplicon identification. Normally, SYBR green is used for a singleplex reaction, but can be used for a multiplex reaction when accompanied by a melting curve analysis (Siraj AK, et al., Clin Cancer Res. , 8( 12): 3832-40 (2002); And Vrettou C., et al., Hum Mutat. , Vol 23 (5): 513-521 (2004)).
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).The Ct (cycle threshold) value refers to the number of cycles in which the fluorescence generated in the reaction exceeds the threshold, which is inversely proportional to the logarithm of the initial copy number. Therefore, the Ct value assigned to a particular well reflects the number of cycles in which a sufficient number of amplicons have accumulated in the reaction. The Ct value is the cycle in which an increase in ΔRn is first detected. Rn refers to the size of the fluorescence signal generated during PCR at each time point, and ΔRn refers to the fluorescence emission intensity (normalized reporter signal) of the reporter die divided by the fluorescence emission intensity of the reference die. The Ct value is also called Cp (crossing point) in LightCycler. The Ct value represents the point at which the system begins to detect an increase in the fluorescence signal associated with the exponential growth of the PCR product in the log-linear phase. This period provides the most useful information about the reaction. The slope of the log-linear step represents the amplification efficiency (Eff) (http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 TaqMan 프로브는 서열목록 제3서열, 서열목록 제9서열, 서열목록 제14서열, 서열목록 제21서열, 서열목록 제22서열, 서열목록 제26서열, 서열목록 제27서열 또는 서열목록 제31서열을 포함하는 서열로 고안될 수 있다.On the other hand, the TaqMan probe is typically a primer (e.g., 20-30 nucleotides) comprising a fluorophore at the 5'-end and a quencher at the 3'-end (e.g., TAMRA or non-fluorescent quencher (NFQ)). ) Is a longer oligonucleotide. Excited fluorescent material transfers energy to a nearby quencher rather than emitting fluorescence (FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc. Natl Acad Sci USA , 94(20): 10756-61(1997)). Therefore, when the probe is normal, no fluorescence is generated. TaqMan probes are designed to anneal to the internal sites of PCR products. According to a specific embodiment of the present invention, the TaqMan probe of the present invention is SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 , Sequence listing may be designed as a sequence comprising the 27th sequence or the sequence listing 31st sequence.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.The TaqMan probe specifically hybridizes to the template DNA in the annealing step, but fluorescence is inhibited by quencher on the probe. During the extension reaction, the TaqMan probe hybridized to the template is decomposed by the 5'to 3'nuclease activity of the Taq DNA polymerase, and the fluorescent dye is released from the probe, and inhibition by the quencher is released, resulting in fluorescence. At this time, the 5'-end of the TaqMan probe should be located downstream of the 3'-end of the extension primer. That is, when the 3'-end of the extension primer is extended by a template-dependent nucleic acid polymerase, the 5'-end of the TaqMan probe is cleaved by the 5'to 3'nuclease activity of this polymerase, A fluorescent signal is generated.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM(506), YOPROTM-1(509), YOYOTM-1(509), Calcein(517), FITC(518), FluorXTM(519), AlexaTM(520), Rhodamine 110(520), 5-FAM (522), Oregon GreenTM500 (522), Oregon GreenTM488 (524), RiboGreenTM(525), RhodamineGreenTM(527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM(531), Calcium GreenTM(533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM(570), AlexaTM546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM(575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM(576), Pyronin Y (580), RhodamineB (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM(590), Cy3.5TM(596), ROX (608), Calcium CrimsonTM(615), AlexaTM594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), BiosearchBlue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL FluorRed 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM(520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 VIC 및 FAM 표지를 포함한다.The reporter molecule and quencher molecule bound to the TaqMan probe include a fluorescent substance and a non-fluorescent substance. Fluorescent reporter molecules and quencher molecules that can be used in the present invention may be any known in the art, and examples thereof are as follows (the number in parentheses is the maximum emission wavelength expressed in nanometers): Cy2 TM (506), YOPRO TM -1 (509), YOYO TM -1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), Alexa TM (520), Rhodamine 110 (520), 5 -FAM (522), Oregon Green TM 500 (522), Oregon Green TM 488 (524), RiboGreen TM (525), RhodamineGreen TM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green TM (531), Calcium Green TM (533), TO-PRO TM -1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TM R (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3 TM (570), Alexa TM 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange TM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange TM (576) , Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red TM (590), Cy3.5 TM (596), ROX (608), Calcium Crimson TM (615), Alexa TM 594 (615) , Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO TM -3 (631), YOYO TM -3 (631), R-phycocyanin (642), CPhycocyanin (648), TO-PRO TM -3 ( 660), TOTO3 (660), D iD DilC(5) (665), Cy5 TM (670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ -2 (579), BHQ-3 (672), BiosearchBlue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL FluorRed 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) and Quasar 705 (610). According to certain embodiments of the present invention, the reporter molecule and the quencher molecule comprise VIC and FAM labels.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.Suitable reporter-quencher pairs are disclosed in many literatures: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2 nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, RP, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; US Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 프로브를 의미한다. MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, 네트롭신(netropsin), 디스타마이신(distamycin), 렉시트롭신(lexitropsin), 미트라마이신(mithramycin), 크로모마이신(chromomycin) A3, 올리보마이신(olivomycin), 안트라마이신(anthramycin), 시비로마이신(sibiromycin), 펜타미딘(pentamidine), 스틸바미딘(stilbamidine), 베레닐(berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI(4-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC(N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the non-fluorescent material used for the reporter molecule and the quencher molecule bound to the TaqMan probe may include a minor groove binding (MGB) moiety. The term "MGB-conjugate probe" as used herein refers to a probe conjugated with MGB at the 3'-end of the probe. MGB is a substance that binds to the minor grooves of DNA with high affinity.Netropsin, distamicin, lexitropsin, mithramycin, chromomycin A3, olivo Mycin, anthramycin, sibiromycin, pentamidine, stilbamidine, berenil, CC-1065, Hoechst 33258, DAPI (4-6- diamidino-2-phenylindole), dimers, trimers, tetramers and pentamers of CDPI, N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide (MPC) and dimers, trimers, tetramers and pentamers thereof. It does not become.
프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실-시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오타이드)의 이용을 가능하게 해 준다.Conjugation of the probe and MGB significantly increases the stability of the hybrid formed between the probe and its target. More specifically, the increased stability (ie, increased degree of hybridization) results in an increased melting temperature (Tm) of the hybrid duplex formed by the MGB-conjugate probe compared to the normal probe. Therefore, MGB stabilizes the Van der Waals force to increase the melting temperature (Tm) of the MGB-conjugate probe without increasing the probe length, thereby allowing shorter probes (e.g., 21 or less) in Taqman real-time PCR under more stringent conditions. Nucleotides).
또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다.In addition, the MGB-conjugate probe removes the background fluorescence more efficiently.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 VIC 또는 FAM의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3'-말단은 MGBNFQ 및 IntZEN-3IABIK로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있다.According to certain embodiments of the present invention, the 5'-end of the probe of the present invention is labeled with a fluorophore of VIC or FAM, and the 3'-end is one selected from the group consisting of MGBNFQ and IntZEN-3IABIK. It can be transformed into a quencher.
보다 구체적으로는, 본 발명의 서열목록 제3서열, 제14서열, 제27서열, 제31서열 및 제37서열은 5'-말단의 형광물질로 VIC 및 3'-말단에 퀀처로 MGBNFQ를 이용하고, 본 발명의 서열목록 제9서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 3'-말단에 퀀처로 MGBNFQ를 이용하며, 본 발명의 서열목록 제21서열, 제22서열, 제26서열 및 제34서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 3'-말단에 퀀처로 IntZEN-3IABIK를 이용한다.More specifically, the 3rd, 14th, 27th, 31st and 37th sequences of the sequence listing of the present invention use VIC as a 5'-end fluorescent material and MGBNFQ as a quencher at the 3'-end And, SEQ ID NO: 9 of the present invention uses FAM as a fluorescent substance at the 5'-end and MGBNFQ as a quencher at the 3'-end, and SEQ ID NO: 21, 22, 26 and Sequence 34 uses FAM as a fluorescent material at the 5'-end and IntZEN-3IABIK as a quencher at the 3'-end.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산이 RNA인 경우 본 발명의 단계 (b)는 상기 RNA를 cDNA로 전사시키는 역전사 단계 (pre-b)를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (pre-b)는 45-55℃에서 20-40분 동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명이 단계 (pre-b)를 추가적으로 포함하는 경우 본 발명의 검출은 중합효소연쇄반응을 이용하여 실시한다. 본 발명의 검출은 역전사 중합효소연쇄반응에 의하여서도 실시할 수 있는데, 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 상기 단계 (pre-b)와 중합효소연쇄반응을 결합한 반응과 동일하다.According to another embodiment of the present invention, when the nucleic acid of the present invention is RNA, step (b) of the present invention further includes a reverse transcription step (pre-b) of transcribing the RNA to cDNA. According to certain embodiments of the present invention, step (pre-b) of the present invention is carried out at 45-55° C. for 20-40 minutes. According to certain embodiments of the present invention, when the present invention additionally includes a step (pre-b), the detection of the present invention is carried out using a polymerase chain reaction. The detection of the present invention can also be carried out by reverse transcription polymerase chain reaction, and the reverse transcription polymerase chain reaction is the same as the reaction in which the step (pre-b) and the polymerase chain reaction are combined.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 중합효소연쇄반응은 (a') 90-100℃에서 5분-15분 동안 지속시키는 단계; (b') 90-100℃에서 10-20초 및 55-65℃에서 40-50초 동안 지속시키는 단계; 및 (c') 상기 단계 (b')를 40-50회 반복하는 단계를 포함한다.According to a specific embodiment of the present invention, the polymerase chain reaction of the present invention comprises the steps of (a') sustaining at 90-100° C. for 5 minutes to 15 minutes; (b') sustaining for 10-20 seconds at 90-100° C. and 40-50 seconds at 55-65° C.; And (c') repeating the step (b') 40-50 times.
본 발명의 검출은 상술한 유전자 증폭방법 이외에 혼성화법(hybridization), 면역분석법(immunoassay) 또는 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 실시할 수 있다.In addition to the above-described gene amplification method, the detection of the present invention may be performed using hybridization, immunoassay, or microarray.
본 발명의 일 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅴ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; 또는 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시한다.According to an embodiment of the present invention, (i) detection of mutations in the BRAF gene of the present invention is performed using a group of oligonucleotides consisting of primers of the first and second sequences of the sequence list; (Ii) Mutation detection of the KRAS gene of the present invention is carried out using a group of oligonucleotides consisting of a primer selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 4 to 7 and the primers of SEQ ID NO: 8; (Iii) Mutation detection of the NRAS gene of the present invention is carried out by using a group of oligonucleotides consisting of a primer selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 10 to 12 and the primers of SEQ ID NO: 13; (Iv) The detection of mutations in the HRAS gene of the present invention includes an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NOs: 15, 16 and 17; Or using a group of oligonucleotides comprising a primer of SEQ ID NO: 18 and a primer of SEQ ID NO: 19 or 20; (V) The detection of rearrangement of the RET/PTC gene of the present invention includes an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NOs: 23 and 25; Or by using a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 24 and 25; Or (vi) the rearrangement detection of the PAX8/PPARγ gene of the present invention is carried out using a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 28, 29, and 30 of the Sequence Listing.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; (ⅴ) 본 발명의 RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제23서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제24서열 및 제25서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시하거나; 그리고 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제28서열, 제29서열 및 제30서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군를 이용하여 실시한다.According to another embodiment of the present invention, (i) detection of mutations in the BRAF gene of the present invention is carried out using an oligonucleotide group consisting of primers of the first and second sequences of the sequence list; (Ii) Mutation detection of the KRAS gene of the present invention is carried out using a group of oligonucleotides consisting of a primer selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 4 to 7 and the primers of SEQ ID NO: 8; (Iii) Mutation detection of the NRAS gene of the present invention is carried out by using a group of oligonucleotides consisting of a primer selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NOs: 10 to 12 and the primers of SEQ ID NO: 13; (Iv) The detection of mutations in the HRAS gene of the present invention includes an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NOs: 15, 16 and 17; Or using a group of oligonucleotides comprising a primer of SEQ ID NO: 18 and a primer of SEQ ID NO: 19 or 20; (V) The detection of rearrangement of the RET/PTC gene of the present invention includes an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NOs: 23 and 25; Or by using a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 24 and 25; And (vi) rearrangement detection of the PAX8/PPARγ gene of the present invention is carried out using a group of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NOs: 28, 29, and 30 of the Sequence Listing.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제21서열 또는 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅴ) 본 발명의RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제26서열 또는 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 또는 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용한다.According to another embodiment of the present invention, (i) the detection of mutations in the BRAF gene of the present invention additionally uses a probe having the third sequence of the sequence listing; (Ii) The detection of mutations in the KRAS gene of the present invention additionally uses a probe having SEQ ID NO: 9; (Iii) The detection of mutations in the NRAS gene of the present invention additionally uses a probe having SEQ ID NO: 14; (Iv) The detection of mutations in the HRAS gene of the present invention additionally uses a probe having a sequence listing of 21 or 22; (V) The detection of rearrangement of the RET/PTC gene of the present invention additionally uses a probe having the 26th sequence or the 27th sequence of the sequence listing; Or (vi) the detection of rearrangement of the PAX8/PPARγ gene of the present invention additionally uses a probe having the 31st sequence of the sequence listing.
본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅱ) 본 발명의 KRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅲ) 본 발명의 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅳ) 본 발명의 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제21서열 또는 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; (ⅴ) 본 발명의RET/PTC 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제26서열 또는 제27서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 그리고 (ⅵ) 본 발명의 PAX8/PPARγ 유전자의 재배열 검출은 서열목록 제31서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용한다.According to certain embodiments of the present invention, (i) the detection of mutations in the BRAF gene of the present invention additionally uses a probe having the third sequence of sequence listing; (Ii) The detection of mutations in the KRAS gene of the present invention additionally uses a probe having SEQ ID NO: 9; (Iii) The detection of mutations in the NRAS gene of the present invention additionally uses a probe having SEQ ID NO: 14; (Iv) The detection of mutations in the HRAS gene of the present invention additionally uses a probe having a sequence listing of 21 or 22; (V) The detection of rearrangement of the RET/PTC gene of the present invention additionally uses a probe having the 26th sequence or the 27th sequence of the sequence listing; And (vi) the rearrangement detection of the PAX8/PPARγ gene of the present invention additionally uses a probe having the 31st sequence in the sequence list.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 특정 서열의 암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군, 특정 서열의 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 암 진단 키트 및 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.(a) The present invention provides a cancer diagnostic kit comprising a group of oligonucleotides for detection of cancer of a specific sequence hybridized with a nucleic acid of a cancer cell, a group of oligonucleotides of a specific sequence, and a method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of cancer do.
(b) 본 발명의 방법은 기존의 gDNA를 이용하여 체세포 돌연변이(somatic mutation)를 검사하던 것과는 달리, RNA를 이용하여 특정 유전자의 돌연변이 여부에 따른 특정 암에 대한 조기 진단을 가능하게 한다.(b) The method of the present invention enables early diagnosis of a specific cancer according to the mutation of a specific gene using RNA, unlike the conventional gDNA test for somatic mutation.
(c) 본 발명의 방법에 따르면, gDNA로는 검출되지 않았던 돌연변이의 검출이 가능한 바 한번의 RNA 추출로 모든 암 관련 유전자 돌연변이 검사가 가능하여 정확하고 신속하게 진단을 할 수 있는 이점이 있다.(c) According to the method of the present invention, since it is possible to detect mutations that have not been detected with gDNA, it is possible to test all cancer-related gene mutations with a single RNA extraction, and thus, there is an advantage of enabling accurate and rapid diagnosis.
(d) 특히, 본 발명의 방법은 갑상선암과 관련된 모든 돌연변이를 동시에 검사가 가능한바, 갑상선암의 진단을 신속하고 정확히 할 수 있는 효과가 있다.(d) In particular, since the method of the present invention can simultaneously test all mutations related to thyroid cancer, it is effective to quickly and accurately diagnose thyroid cancer.
도 1은 암(예컨대, 갑상선암)의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 신규한 방법에 대한 개요이다.
도 2는 BRAF V600E 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 3은 KRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 4는 NRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 5는 HRAS 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 6은 RET/PTC1 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 7은 RET/PTC3 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.
도 8은 PAX8/PPARγ 돌연변이 검출을 위한 프라이머 및 프로브 고안방법을 나타낸다.1 is an overview of a novel method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of cancer (eg, thyroid cancer).
2 shows a method of designing primers and probes for detecting BRAF V600E mutations.
3 shows a method of designing primers and probes for KRAS mutation detection.
4 shows a method of designing primers and probes for detecting NRAS mutations.
5 shows a method of designing primers and probes for detecting HRAS mutations.
6 shows a method of designing primers and probes for RET/PTC1 mutation detection.
7 shows a method of designing primers and probes for RET/PTC3 mutation detection.
8 shows a method of designing primers and probes for detecting PAX8/PPARγ mutations.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
실시예Example 1: RNA 시료 준비 1: RNA sample preparation
KRAS G12S/G12C/G12D/G12A/G12V/G13D, NRAS Q61R/Q61K/Q61L, HRAS G12V/Q61R, BRAF V600E 돌연변이를 포함하고 있는 각각의 양성 세포주로부터 HighPure RNA Isolation Kit(Roche사, 스위스)를 사용하여 RNA를 분리 후 사용하였다. 상기 양성 세포주의 출처는 하기 표 1에 기재하였다.Using HighPure RNA Isolation Kit (Roche, Switzerland) from each positive cell line containing KRAS G12S/G12C/G12D/G12A/G12V/G13D, NRAS Q61R/Q61K/Q61L, HRAS G12V/Q61R, and BRAF V600E mutations. RNA was used after isolation. Sources of the positive cell line are listed in Table 1 below.
양성 세포주를 획득하지 못한 RET/PTC1, RET/PTC3, PAX8/PPARg, KRAS G12R, HRAS G13R/Q61K 돌연변이의 경우 상기 돌연변이의 일부를 포함하도록 Integrated DNA Technologies사를 통해 인공적으로 유전자를 합성(gBlock Gene Fragment)한 후 이를 pGEM®easy Vector(Promega, Madison, 미국)에 도입한 플라스미드 DNA를 사용하였다. 상기 합성한 유전자 서열은 서열목록 제38서열(RET/PTC1 돌연변이), 서열목록 제39서열(RET/PTC3 돌연변이), 서열목록 제40서열(PAX8/PPARg exon 7 돌연변이), 서열목록 제41서열(PAX8/PPARg exon 9 돌연변이), 서열목록 제42서열(KRAS G12R 돌연변이) 및 서열목록 제43서열(HRAS G13R/Q61K 돌연변이)이다.In the case of RET/PTC1, RET/PTC3, PAX8/PPARg, KRAS G12R, HRAS G13R/Q61K mutations that did not obtain a positive cell line, genes were artificially synthesized through Integrated DNA Technologies to include some of the mutations (gBlock Gene Fragment ), and then the plasmid DNA introduced into pGEM®easy Vector (Promega, Madison, USA) was used. The synthesized gene sequence is SEQ ID NO: 38 (RET/PTC1 mutation), SEQ ID NO: 39 (RET/PTC3 mutation), SEQ ID NO: 40 (PAX8/
* KCLB(Korean Cell Line Bank, 한국세포주은행, 대한민국)* KCLB (Korean Cell Line Bank, Korea Cell Line Bank, Korea)
* ATCC(American Type Culture Collection, 미국)* ATCC (American Type Culture Collection, USA)
실시예Example 2: cDNA 시료 준비 2: cDNA sample preparation
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche사, 스위스)을 이용하여 실시예 1에서 분리한 세포주의 RNA를 cDNA로 합성하였다.RNA of the cell line isolated in Example 1 was synthesized as cDNA using the Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Switzerland).
실시예Example 3: 돌연변이 검출을 위한 3: for mutation detection 프라이머primer 및 And 프로브Probe 고안 device
BRAFBRAF 유전자 돌연변이 검출 Gene mutation detection
BRAF 유전자 엑손(exon) 15 내 V600E 돌연변이를 확인을 위하여 엑손 15 내에 포워드 프라이머(BRAF-PF3), 리버스 프라이머(BRAF-PR3-1) 및 형광 프로브(BRAF-PP1)가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 2과 같다.In order to identify the V600E mutation in the
KRASKRAS 유전자 돌연변이 검출 Gene mutation detection
KRAS 유전자 엑손 2 내에 포워드 프라이머(KRAS-c34-F10, KRAS-C34T-F1, KRAS-c35-F11 또는 KRAS-c38-F2), 리버스 프라이머(KRAS-1R) 및 형광 프로브(MGB3(FAM))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 3와 같다.Forward primers (KRAS-c34-F10, KRAS-C34T-F1, KRAS-c35-F11 or KRAS-c38-F2), reverse primers (KRAS-1R) and fluorescent probes (MGB3 (FAM)) in the KRAS gene exon 2 It was designed to exist so that RNA could be tested as a template. Primer and probe sequences are shown in Table 3.
NRASNRAS 유전자 돌연변이 검출 Gene mutation detection
NRAS 유전자 엑손 3 내에 포워드 프라이머(NRAS Q61L-F6, NRAS Q61K-F6 또는 NRAS Q61R-F8), 리버스 프라이머(NRAS R1) 및 형광 프로브(NRAS Probe(VIC))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 4과 같다.RNA was tested as a template by designing the presence of forward primers (NRAS Q61L-F6, NRAS Q61K-F6 or NRAS Q61R-F8), reverse primers (NRAS R1) and fluorescent probes (NRAS Probe (VIC)) in the NRAS gene exon 3 Was made possible. Primer and probe sequences are shown in Table 4.
HRASHRAS 유전자 돌연변이 검출 Gene mutation detection
HRAS 유전자 엑손 2 내에 포워드 프라이머(HRAS G12V-F5 또는 HRAS G13R-F4), 리버스 프라이머(HRAS 12,13-R1) 및 형광 프로브(HRAS 12,13_ZEN probe(FAM))가 존재하도록 고안하고, 엑손 3 내에 포워드 프라이머(HRAS 61-F1), 리버스 프라이머(HRAS Q61K-R3 또는 HRAS Q61R-R10) 및 형광 프로브(HRAS 61_ZEN probe(FAM))가 존재하도록 고안하여 RNA를 주형으로 검사가 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 5와 같다.In the HRAS gene exon 2, a forward primer (HRAS G12V-F5 or HRAS G13R-F4), a reverse primer (
RET/PTC 재배열 돌연변이 유전자 돌연변이 검출RET/PTC rearrangement mutation gene mutation detection
RET/PTC 재배열 돌연변이의 경우 RET/PTC1 형과 RET/PTC3 형으로 구분할 수 있는데, RET/PTC1 재배열 돌연변이는 CCDC6 유전자의 엑손 1에 포워드 프라이머(R/P1-F1) 및 형광 프로브(ZEN(P1))가 위치하게 하고, 리버스 프라이머(R/P1,P3-R2)는 RET 유전자의 엑손 12에 위치하도록 고안하여 CCDC6/RET 재배열 돌연변이 검사가 가능하도록 하였다.RET/PTC rearrangement mutations can be classified into RET/PTC1 type and RET/PTC3 type.RET/PTC1 rearrangement mutations are forward primers (R/P1-F1) and fluorescent probes (ZEN( P1)) was located, and reverse primers (R/P1,P3-R2) were designed to be located at
RET/PTC3 재배열 돌연변이는 NCOA4 유전자의 엑손 11에 포워드 프라이머(R/R3-F1) 및 형광 프로브(MGB-P3)가 위치하게 하고, 리버스 프라이머(R/P1,P3-R2)는 RET 유전자의 엑손 12에 위치하도록 고안하여 NCOA4/RET 재배열 돌연변이 검사가 가능하도록 하였다.The RET/PTC3 rearrangement mutation causes the forward primer (R/R3-F1) and the fluorescent probe (MGB-P3) to be located in
프라이머 및 프로브 서열은 표 6과 같다.Primer and probe sequences are shown in Table 6.
PAX8PAX8 // PPARγPPARγ 재배열 돌연변이 유전자 돌연변이 검출 Rearrangement mutant gene mutation detection
RET/PTC 재배열 돌연변이의 경우 PAX8 유전자의 엑손 9와 PPARγ의 엑손 1이 재배열된 것과 PAX8 유전자의 엑손 7과 PPARγ의 엑손 1이 재배열된 것으로 구분할 수 있는데, 포워드 프라이머를 PAX8 유전자의 엑손 7(PASX8-7-F2)과 엑손 9(PAX8-9-F3-3(KIS))의 두 군데 위치에 위치시키고 형광 프로브(PAX8 MGB(VIC))와 리버스 프라이머(PPARg-1R)를 PPARγ 유전자의 엑손 1에 위치하도록 고안함으로써, 한번에 두 가지의 PAX8/PPARγ 재배열 돌연변이 검출이 가능하도록 하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 7과 같다.In the case of RET/PTC rearrangement mutations,
실시예Example 4: 실시간 4: real time 역전사Reverse transcription 중합효소연쇄반응Polymerase chain reaction (Real time reverse transcription polymerase chain reaction) 또는 실시간 (Real time reverse transcription polymerase chain reaction) or real time 중합효소연쇄반응Polymerase chain reaction (Real time polymerase chain reaction)(Real time polymerase chain reaction)
상기 실시예 3 유전자의 주요 돌연변이를 확인하기 위하여, 상기 대상집단으로부터 분리한 RNA를 이용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(one-step real-time reverse transcription PCR) 또는 상기 RNA를 cDNA로 합성한 후 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 실시하였다. 상기 RNA의 cDNA로의 합성은 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche사, 스위스)를 이용하였다.In order to identify the major mutations in the gene of Example 3, real-time reverse transcription polymerase chain reaction (one-step real-time reverse transcription PCR) using RNA isolated from the target group or after synthesizing the RNA into cDNA in real time Polymerase chain reaction (real-time PCR) was performed. The RNA was synthesized into cDNA using the Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Switzerland).
실시간 역전사 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머 및 프로브 서열은 실시예 3과 같다.The primer and probe sequences used in the real-time reverse transcription polymerase chain reaction or the real-time polymerase chain reaction are the same as in Example 3.
세포에서 RNA가 잘 추출되어 검사에 적당한 양으로 포함되어 있는지 및 중합효소연쇄반응에 문제가 없는지를 확인하기 위하여 KRT7 또는 GAPDH 유전자의 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 대조군으로 수행하였다. 상기 KRT7 또는 GAPDH 유전자에 대한 프라이머 및 프로브 서열은 표 8과 같다.Real-time reverse transcription polymerase chain reaction of KRT7 or GAPDH gene was performed as a control in order to confirm whether RNA was well extracted from the cells and contained in an appropriate amount for the test and there was no problem in the polymerase chain reaction. The primers and probe sequences for the KRT7 or GAPDH gene are shown in Table 8.
상기 프포브에는 증폭산물의 크기를 확인할 수 있도록 형광물질인 플로레신(Fluorescein, FAM) 또는 VIC(Applied Biosystems)를 부착하였다.A fluorescent material such as Fluorescein (FAM) or VIC (Applied Biosystems) was attached to the probe so as to confirm the size of the amplified product.
상기 정방향 프라이머 1 μL, 역방향 프라이머 1 μL, RNA 시료 5 μL, 증류수 3.5 μL, 2X RT-PCR 프리믹스(Nanohelix, 대한민국) 12.5 μL, RT-PCR 효소 혼합물(Nanohelix, 대한민국) 1 μL를 혼합하여, ① 50℃(30분, 1 회); ② 95℃(10분, 1회); ③ 95℃(15초)-60℃(45초)(45회)의 조건으로 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. RNA 시료 대신 cDNA 시료를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 경우 상기 단계 ①을 수행하지 않고 단계 ② 및 단계 ③만을 수행하였다.1 μL of the forward primer, 1 μL of the reverse primer, 5 μL of RNA sample, 3.5 μL of distilled water, 12.5 μL of 2X RT-PCR premix (Nanohelix, Korea), 1 μL of RT-PCR enzyme mixture (Nanohelix, Korea) are mixed, ① 50° C. (30 minutes, once); ② 95°C (10 minutes, 1 time); ③ Real-time reverse transcription polymerase chain reaction was performed under the conditions of 95°C (15 seconds) -60°C (45 seconds) (45 times). When performing real-time polymerase chain reaction using a cDNA sample instead of an RNA sample, only steps ② and ③ were performed without performing the above step ①.
실시예Example 5: 돌연변이 확인 5: mutation identification
양성 세포주를 사용한 결과에서 KRT7과 GAPDH가 모두 Ct(Threshold cycle, Threshold와 접점을 나타내는 형광신호의 사이클 수를 의미함) 11.3-27.4의 범위 내 증폭하여 RNA 추출 및 cDNA 합성에 문제 없음을 확인하였으며, Ct 38 미만인 경우 양성 돌연변이로 판단할 수 있다. KRAS 돌연변이 세포주의 경우 KRAS Ct가 22.7-26.2의 범위 내 증폭하여 KRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. NRAS 돌연변이 세포주의 경우 NRAS Ct가 25.8-30.5 의 범위 내 증폭하여 NRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. HRAS 돌연변이 세포주의 경우 HRAS Ct가 23.3-31.5 의 범위 내 증폭하여 HRAS 돌연변이 양성을 확인하였다. 양성 플라스미드 DNA를 사용한 경우 KRT7과 GAPDH Ct는 확인할 수 없고, 각 돌연변이별로 Ct 20.7-22.7 로 확인되어 각 돌연변이 양성을 확인하였다.From the results of using the positive cell line, it was confirmed that both KRT7 and GAPDH were amplified within the range of 11.3-27.4 Ct (threshold cycle, meaning the number of cycles of the fluorescent signal indicating the contact point), and there was no problem in RNA extraction and cDNA synthesis. If it is less than Ct 38, it can be determined as a positive mutation. In the case of the KRAS mutant cell line, KRAS Ct was amplified within the range of 22.7-26.2, confirming the positive KRAS mutation. In the case of the NRAS mutant cell line, NRAS Ct was amplified within the range of 25.8-30.5, confirming the positive NRAS mutation. In the case of the HRAS mutant cell line, HRAS Ct was amplified within the range of 23.3-31.5, confirming the positive HRAS mutation. When the positive plasmid DNA was used, KRT7 and GAPDH Ct could not be identified, and Ct 20.7-22.7 for each mutation was confirmed to be positive for each mutation.
결과적으로 본 발명의 프라이머 및 실시간 중합효소 연쇄반응 조건을 이용하여 상기 유전자의 돌연변이의 양성을 모두 확인할 수 있는바, 각 프라이머 또는 이들의 조합을 이용하여 상기 유전자에 대한 돌연변이를 가지는 암에 대한 진단이 가능함을 확인할 수 있었다.As a result, it is possible to confirm all the positive mutations of the gene using the primers and real-time polymerase chain reaction conditions of the present invention. Diagnosis of cancer having a mutation for the gene is possible using each primer or a combination thereof. I could confirm that it is possible
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and for those of ordinary skill in the art, it is clear that these specific techniques are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, it will be said that the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION BIOSEWOOM, INC. <120> An Apparatus for Diagnosing Cancer and an Apparatus for The Same <130> PN140031 <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PF3 <400> 1 atatatttct tcatgaagac ctcacagtaa aa 32 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PR3-1 <400> 2 ggacccactc catcgagata cctc 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PP1 <400> 3 taggtgattt tggtctagct aca 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c34-F10 <400> 4 cttgtggtag ttggaggth 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-C34T-F1 <400> 5 cttgtggtag ttggaggtt 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c35-F11 <400> 6 ttgtggtagt tggagctch 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c38-F2 <400> 7 gtggtagttg gagctggtca 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-1R <400> 8 ttgttggatc atattcgtcc ac 22 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGB3(FAM) <400> 9 acgatacagc taattca 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61L-F6 <400> 10 actggataca gctggagt 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61K-F6 <400> 11 catactggat acagctgtaa 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61R-F8 <400> 12 ctggatacag ctggtcg 17 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS R1 <400> 13 ccttcgcctg tcctcatgta tt 22 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Probe(VIC) <400> 14 cagtgccatg agagac 16 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G12V-F5 <400> 15 ggtggtgggc gcctt 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G13R-F4 <400> 16 tagtgggcgc cgtcc 15 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 12,13-R1 <400> 17 gggtcgtatt cgtccacaaa a 21 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 61-F1 <400> 18 cggaagcagg tggtcattg 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS Q61K-R3 <400> 19 ggcgctgtac tcctcatt 18 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS Q61R-R10 <400> 20 gcgctgtact cctcgc 16 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 12,13_ZEN probe(FAM) <400> 21 tgcgctgacc atccagctga tcc 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 61_ZEN probe(FAM) <400> 22 tgtccaacag gcacgtctcc cca 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/P1-F1 <400> 23 ggagacctac aaactgaagt gcaa 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/R3-F1 <400> 24 ccagtggtta tcaagctcct taca 24 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/P1,P3-R2 <400> 25 aaccaagttc ttccgaggga a 21 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20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F1(020713) <400> 35 ccacccatgg caaattcc 18 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R1(020713) <400> 36 tgacaagctt cccgttctca 20 <210> 37 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-Probe(020713) <400> 37 tggcaccgtc aagg 14 <210> 38 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET/PTC1 <400> 38 catctcgccg ttccgcctgg aggagctcac caaccgcctg gcctcgctgc agcaagagaa 60 caaggtgctg aagatagagc tggagaccta caaactgaag tgcaaggcac tgcaggagga 120 gaaccgcgac ctgcgcaaag ccagcgttac catcgaggat ccaaagtggg aattccctcg 180 gaagaacttg gttcttggaa aaactctagg agaaggggaa tttggaaaag tggtcaaggc 240 aacggccttc catctgaaag gcagaggagg gtacaccacg gtggccgtga agatgctgaa 300 agagaacgcc tccccgagtg agcttcgaga cctgctgtca gagttcaacg tcctgaagca 360 ggtcaaccac cctcatgtca tcaaattgta tggggcctgc 400 <210> 39 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET/PTC3 <400> 39 accattcaaa 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gcccaccaac tttgggatca gctccgtgga tctctccgta atggaagacc actcccactc 360 ctttgatatc aagcccttca ctactgttga cttctccagc atttctactc cacattacga 420 agacattcca ttcacaagaa cagatccagt ggttgcagat tacaagtatg acctgaaact 480 tcaagagtac caaa 494 <210> 41 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8/PPARg exon9 <400> 41 aaagcaggaa acccccgagg tgtccagttc tagctccacc ccttgctctt tatctagctc 60 cgcccttttg gatctgcagc aagtcggctc cggggtcccg cccttcaatg cctttcccca 120 tgctgcctcc gtgtacgggc agttcacggg ccaggccctc ctctcagggc gagagatggt 180 ggggcccacg ctgcccggat acccacccca catccccacc agcggacagg gcagctatgc 240 ctcctctgcc atcgcaggca tggtggcaga tgaccatggt tgacacagag atgccattct 300 ggcccaccaa ctttgggatc agctccgtgg atctctccgt aatggaagac cactcccact 360 cctttgatat caagcccttc actactgttg acttctccag catttctact ccacattacg 420 aagacattcc attcacaaga acagatccag tggttgcaga ttacaagtat gacctgaaac 480 ttcaagagta ccaaa 495 <210> 42 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS G12R <400> 42 ataaggcctg 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for The Same <130> PN140031 <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PF3 <400> 1 atatatttct tcatgaagac ctcacagtaa aa 32 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PR3-1 <400> 2 ggacccactc catcgagata cctc 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-PP1 <400> 3 taggtgattt tggtctagct aca 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c34-F10 <400> 4 cttgtggtag ttggaggth 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-C34T-F1 <400> 5 cttgtggtag ttggaggtt 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c35-F11 <400> 6 ttgtggtagt tggagctch 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-c38-F2 <400> 7 gtggtagttg gagctggtca 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-1R <400> 8 ttgttggatc atattcgtcc ac 22 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGB3 (FAM) <400> 9 acgatacagc taattca 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61L-F6 <400> 10 actggataca gctggagt 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61K-F6 <400> 11 catactggat acagctgtaa 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Q61R-F8 <400> 12 ctggatacag ctggtcg 17 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS R1 <400> 13 ccttcgcctg tcctcatgta tt 22 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS Probe (VIC) <400> 14 cagtgccatg agagac 16 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G12V-F5 <400> 15 ggtggtgggc gcctt 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G13R-F4 <400> 16 tagtgggcgc cgtcc 15 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 12,13-R1 <400> 17 gggtcgtatt cgtccacaaa a 21 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 61-F1 <400> 18 cggaagcagg tggtcattg 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS Q61K-R3 <400> 19 ggcgctgtac tcctcatt 18 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS Q61R-R10 <400> 20 gcgctgtact cctcgc 16 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 12,13_ZEN probe (FAM) <400> 21 tgcgctgacc atccagctga tcc 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS 61_ZEN probe (FAM) <400> 22 tgtccaacag gcacgtctcc cca 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/P1-F1 <400> 23 ggagacctac aaactgaagt gcaa 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/R3-F1 <400> 24 ccagtggtta tcaagctcct taca 24 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R/P1,P3-R2 <400> 25 aaccaagttc ttccgaggga a 21 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEN(P1) <400> 26 tggctttgcg caggtcgcg 19 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGB-P3 <400> 27 ttggataagc cagtcct 17 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PASX8-7-F2 <400> 28 aacctctcga ctcaccagac cta 23 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8-9-F3-3 (KIS) <400> 29 caccagcgga cagggc 16 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARg-1R <400> 30 caaagttggt gggccagaa 19 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8 MGB (VIC) <400> 31 ttgacacaga gatgcc 16 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT7-F1 <400> 32 ccacccacaa tcacaagaag att 23 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT7-R1 <400> 33 tcactttcca gactgtctca ctgtct 26 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT7-ZEN probe (FAM) <400> 34 ccacccctgc ctcccatgcc 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F1(020713) <400> 35 ccacccatgg caaattcc 18 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R1(020713) <400> 36 tgacaagctt cccgttctca 20 <210> 37 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-Probe (020713) <400> 37 tggcaccgtc aagg 14 <210> 38 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET/PTC1 <400> 38 catctcgccg ttccgcctgg aggagctcac caaccgcctg gcctcgctgc agcaagagaa 60 caaggtgctg aagatagagc tggagaccta caaactgaag tgcaaggcac tgcaggagga 120 gaaccgcgac ctgcgcaaag ccagcgttac catcgaggat ccaaagtggg aattccctcg 180 gaagaacttg gttcttggaa aaactctagg agaaggggaa tttggaaaag tggtcaaggc 240 aacggccttc catctgaaag gcagaggagg gtacaccacg gtggccgtga agatgctgaa 300 agagaacgcc tccccgagtg agcttcgaga cctgctgtca gagttcaacg tcctgaagca 360 ggtcaaccac cctcatgtca tcaaattgta tggggcctgc 400 <210> 39 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RET/PTC3 <400> 39 accattcaaa ttcctgagca cttgatggct catgctagtt cagcaaatat tgggcccttc 60 ctggagaaga gaggctgtat ctccatgcca gagcagaagt cagcatccgg tattgtagct 120 gtccctttca gcgaatggct ccttggaagc aaacctgcca gtggttatca agctccttac 180 atacccagca ccgaccccca ggactggctt atccaaaagc agaccttgga gaacagtcag 240 gaggatccaa agtgggaatt ccctcggaag aacttggttc ttggaaaaac tctaggagaa 300 ggggaatttg gaaaagtggt caaggcaacg gccttccatc tgaaaggcag aggagggtac 360 accacggtgg ccgtgaagat gctgaaagag aacgcctccc cgagtgagct tcgagacctg 420 ctgtcagagt tcaacgtcct gaagcaggtc aaccaccctc atgtcatcaa attgtatggg 480 480 <210> 40 <211> 494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8/PPARg exon7 <400> 40 gactcacaga gcagcagcag cggaccccga aagcaccttc gcacggatgc cttcagccag 60 caccacctcg agccgctcga gtgcccattt gagcggcagc actacccaga ggcctatgcc 120 tcccccagcc acaccaaagg cgagcagggc ctctacccgc tgcccttgct caacagcacc 180 ctggacgacg ggaaggccac cctgacccct tccaacacgc cactggggcg caacctctcg 240 actcaccaga cctaccccgt ggtggcagat gaccatggtt gacacagaga tgccattctg 300 gcccaccaac tttgggatca gctccgtgga tctctccgta atggaagacc actcccactc 360 ctttgatatc aagcccttca ctactgttga cttctccagc atttctactc cacattacga 420 agacattcca ttcacaagaa cagatccagt ggttgcagat tacaagtatg acctgaaact 480 tcaagagtac caaa 494 <210> 41 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8/PPARg exon9 <400> 41 aaagcaggaa acccccgagg tgtccagttc tagctccacc ccttgctctt tatctagctc 60 cgcccttttg gatctgcagc aagtcggctc cggggtcccg cccttcaatg cctttcccca 120 tgctgcctcc gtgtacgggc agttcacggg ccaggccctc ctctcagggc gagagatggt 180 ggggcccacg ctgcccggat acccacccca catccccacc agcggacagg gcagctatgc 240 ctcctctgcc atcgcaggca tggtggcaga tgaccatggt tgacacagag atgccattct 300 ggcccaccaa ctttgggatc agctccgtgg atctctccgt aatggaagac cactcccact 360 cctttgatat caagcccttc actactgttg acttctccag catttctact ccacattacg 420 aagacattcc attcacaaga acagatccag tggttgcaga ttacaagtat gacctgaaac 480 ttcaagagta ccaaa 495 <210> 42 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS G12R <400> 42 ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta gttggagctc gtggcgtagg 60 caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac 120 aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg caggaccatt ctttgataca 180 gataaaggtt tctctgacca 200 <210> 43 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS G13R, Q61K <400> 43 tcgcgcctgt gaacggtggg gcaggagacc ctgtaggagg accccgggcc gcaggcccct 60 gaggagcgat gacggaatat aagctggtgg tggtgggcgc cggccgtgtg ggcaagagtg 120 cgctgaccat ccagctgatc cagaaccatt ttgtggacga atacgacccc actatagagg 180 attcctaccg gaagcaggtg gtcattgatg gggagacgtg cctgttggac atcctggata 240 ccgccggcaa ggaggagtac agcgccatgc gggaccagta catgcgcacc ggggagggct 300 tcctgtgtgt gtttgccatc aacaacacca agtcttttga ggacatccac cagtacaggg 360 agcagatcaa acgggtgaag gactcggatg acgtgcccat ggtgctggtg gggaacaagt 420 gtgacctggc tgcacgcact gtggaatctc ggcaggctca ggacctcgcc cgaagctacg 480 480
Claims (11)
(ⅱ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅲ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고
(ⅳ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군으로,
상기 올리고뉴클레오타이드 군은 암 세포의 핵산과 혼성화되는 갑상선암 검출용 올리고뉴클레오타이드 군.
(i) an oligonucleotide group consisting of a primer selected from the group consisting of primers of Sequence Listing 4 to 7 sequence and a primer of Sequence Listing 8 sequence;
(Ii) a primer selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOS: 10 to 12, and an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NO: 13;
(Iii) oligonucleotide group consisting of primers of Sequence Listing 15, Sequence 16 and Sequence 17; And
(Iv) a primer of SEQ ID NO: 18, and an oligonucleotide group selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of primers of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20,
Wherein the oligonucleotide group is hybridized with a nucleic acid of a cancer cell.
(ⅱ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군;
(ⅲ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 그리고
(ⅳ) 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드 군을 포함하는 갑상선암 진단 키트.
(i) an oligonucleotide group consisting of a primer selected from the group consisting of primers of Sequence Listing 4 to 7 sequence and a primer of Sequence Listing 8 sequence;
(Ii) a primer selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOS: 10 to 12, and an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NO: 13;
(Iii) oligonucleotide group consisting of primers of Sequence Listing 15, Sequence 16 and Sequence 17; And
(Iv) an oligonucleotide group selected from the group consisting of a primer of SEQ ID NO: 18, and an oligonucleotide group consisting of primers of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅰ)이 서열목록 제9서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅱ)가 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나;
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅲ)이 서열목록 제21서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하거나; 또는
상기 올리고뉴클레오타이드 군 (ⅳ)가 서열목록 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 갑상선암 진단 키트.
The diagnostic kit according to claim 2, wherein the thyroid cancer diagnostic kit
Wherein the oligonucleotide group (i) further comprises a probe having the sequence of SEQ ID NO: 9;
Said oligonucleotide group (ii) further comprises a probe having the sequence of SEQ ID NO: 14;
Said oligonucleotide group (iii) additionally comprising a probe having the sequence of SEQ ID NO: 21; or
Wherein the oligonucleotide group (iv) further comprises a probe having the sequence of SEQ ID NO: 22.
[Claim 3] The kit for diagnosing thyroid cancer according to claim 2, wherein the diagnostic kit further comprises a reverse transcriptase.
(a) 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 핵산으로부터 (ⅰ) 서열목록 제4서열 내지 제7서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하여 KRAS 유전자의 돌연변이 검출, (ⅱ) 서열목록 제10서열 내지 제12서열의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 및 서열목록 제13서열의 의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하여 NRAS 유전자의 돌연변이 검출 및 (ⅲ) 서열목록 제15서열, 제16서열 및 제17서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군; 또는 서열목록 제18서열의 프라이머, 및 서열목록 제19서열 또는 제20서열의 프라이머로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 군을 이용하여 HRAS 유전자의 돌연변이 검출로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출을 실시하는 단계.
A method for providing information necessary for diagnosis or prognosis of thyroid cancer including the following steps:
(a) obtaining a nucleic acid from a biological sample separated from a human; And
(b) an oligonucleotide group consisting of a primer selected from the group consisting of primers of the sequence of the forth sequence to the seventh sequence and a primer of the sequence of the sequence listing from the nucleic acid of the step (a) (Ii) a primer selected from the group consisting of primers of the 10th to 12th sequences and an oligonucleotide group consisting of a primer of the 13th sequence of SEQ ID NO: 1, and mutation detection of the NRAS gene and (Iii) oligonucleotide group consisting of primers of Sequence Listing 15, Sequence 16 and Sequence 17; Or detecting the mutation of the HRAS gene using the oligonucleotide group consisting of the primer of SEQ ID NO: 18 and the primer of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.
6. The method of claim 5, wherein the nucleic acid is RNA.
6. The method of claim 5, wherein the step (b) further comprises a reverse transcription step (pre-b) of transcribing the RNA into cDNA.
8. The method according to claim 7, wherein said step (pre-b) is carried out at 45-55 DEG C for 20-40 minutes.
6. The method of claim 5, wherein the detection is performed using a polymerase chain reaction.
(a') 90-100℃에서 5분-15분 동안 지속시키는 단계;
(b') 90-100℃에서 10-20초 및 55-65℃에서 40-50초 동안 지속시키는 단계; 및
(c') 상기 단계 (b')를 40-50회 반복하는 단계.
10. The method of claim 9, wherein the polymerase chain reaction comprises the steps of:
(a ') at 90-100 < 0 > C for 5 minutes to 15 minutes;
(b ') at 90-100 < 0 > C for 10-20 seconds and at 55-65 [deg.] C for 40-50 seconds; And
(c ') repeating the step (b') 40-50 times.
(ⅱ) 상기 NRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제14서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하거나; 또는
(ⅲ) 상기 HRAS 유전자의 돌연변이 검출은 서열목록 제21서열 또는 제22서열을 갖는 프로브를 추가적으로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 5, wherein (i) the mutation detection of the KRAS gene further comprises using a probe having the sequence of SEQ ID NO: 9;
(Ii) detecting the mutation of the NRAS gene further comprises using a probe having the sequence of SEQ ID NO: 14; or
(Iii) the mutation detection of the HRAS gene additionally utilizes a probe having the sequence of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22.
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Am J Surg Pathol. 2013 Oct;37(10):1586-91 * |
Anticancer Res. 2013 Nov;33(11):4779-84 * |
Orv Hetil. 2011 Apr 24;152(17):672-7 * |
Virchows Arch. 2014 Jul;465(1):73-8. doi: 10.1007/s00428-014-1589-3. Epub 2014 May 15. * |
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