KR20160075951A - Multiplex Primers for Detecting Plurality of Insect Pathogens and Use Thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 산업적 유용 곤충 사육에 치명적인 피해를 입히는 6종의 병원균을 동시에 검정할 수 있는 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a multiplex primer set capable of simultaneously testing six kinds of pathogens damaging to industrially useful insect rearing and its use.
곤충은 지구상 최대 미개발 생물자원이라는 장점 때문에, 신규 곤충자원 소재 개발 및 지역별 특화된 곤충자원의 산업화를 정부차원에서 장려하는 추세로서, 이러한 산업화의 대상이 되고 있는 곤충은 장수풍뎅이, 사습벌레, 꽃무지 등 50여종; 뒤영벌, 가위벌, 꿀벌; 무당벌레, 진디혹파리, 칠레이리응애 등 34종; 나비류, 반딧불이; 동애등에, 풍뎅이 유충, 거미, 거머리 등이 대표적이며, 학습용, 애완용, 화분매개용, 천적곤충, 지역행사용 곤충, 사료용 또는 의료용으로 그 활용범위도 상당히 다양하다.Because insects are the largest untapped biomass resources on the planet, the government is promoting the development of new insect resource materials and the industrialization of specialized insect resources for each region. Insects that are subject to such industrialization are insects such as longevity beetles, 50 species; Bees, bees; 34 species including Ladybird, Aphididae, and Chilean mite; Butterflies, fireflies; It is widely used for education, pet, pollen, insect, local event insect, feed or medical use.
이러한 흐름에 따라, 최근의 곤충(장수풍뎅이, 흰점박이꽃무지 및 갈색거저리)이 식품소재 및 동물사료 등으로 산업적 가치가 높아짐에 따라, 곤충을 사육하는 농가들이 증가하는 추세에 있다. 그러나, 대량사육 등 사육규모가 증가할수록 곤충병원성 진균, 박테리아 및 바이러스 등에 의한 곤충 질병 문제가 커지고 있는 실정이므로 이를 예방하기 위한 빠르고 정확한 진단이 시급히 요구되고 있다.According to this trend, as the insects (longevity beetle, white spotted flowers and brown goats) become more industrial value with food materials and animal feeds, farmers who keep insects are increasing. However, as the size of breeding such as mass rearing increases, insect diseases caused by insect pathogenic fungi, bacteria and viruses are increasing. Therefore, rapid and accurate diagnosis is urgently needed to prevent such diseases.
곤충병원성 진균은 대부분 불완전 균류의 Hyphomycetes에 속하는 곰팡이로 사람과 동물, 식물에는 무해하나 곤충에만 특이적으로 병원성을 가진다(Lacey et al., 2001). 곤충의 섭식에 의해 감염되는 곤충병원성 바이러스 및 박테리아와는 달리 곤충병원성 진균은 곤충에 직접 접촉으로 표피를 침투하여 기주 곤충의 면역작용을 차단하고 독성물질을 분비하여 곤충을 폐사시킨다(Charnley et al., 1997). 또한 기주 곤충의 혈강 내에서 대량으로 증식하여 기주곤충의 영양분을 고갈시켜 죽게 하고, 죽은 곤충의 표피에 포자를 형성하여 건전한 개체에 2차 감염되도록 한다. 이러한 곤충병원성 진균은 현재 약 85 속 750 여종이 알려져 있으며 가장 일반적으로는 Metarhizium, Beauveria, Verticillium(Lecanicillium으로 재명명됨), Isaria, Nomuraea, Entomophthora, Neozygites를 등이 알려져 있다(Hajek et al., 1994; Supakdamrongkul et al., 2010). Insect pathogenic fungi are mostly fungi belonging to Hyphomycetes of incomplete fungi, which are innocuous to humans, animals and plants, but only specific to insects (Lacey et al ., 2001). Unlike insect pathogenic viruses and bacteria that are infected by insect feeding, insect pathogenic fungi penetrate the epidermis in direct contact with insects, blocking the immune function of host insects and releasing toxic substances to kill insects (Charnley et al . , 1997). It also proliferates in large amounts in the host insect's bloodstream to deplete the nutrients of the host insect, causing spores to form on the epidermis of the dead insect and allowing secondary infection to healthy individuals. It is known that more than 750 species of insect pathogenic fungi are present in about 85 genera and most commonly are Metarhizium, Beauveria, Verticillium ( renamed as Lecanicillium ), Isaria, Nomuraea, Entomophthora and Neozygites (Hajek et al ., 1994 Supakdamrongkul et al ., 2010).
이 중에서 B. bassiana는 기주 범위가 넓어 약 500 여 종의 곤충에 감염된다고 알려져 있으며, Metarhizium속의 M. anisopliae와 M. flavoviridae 중 특히 M. anisopliae는 분포지역이 넓고 기주범위도 넓어 7 목 200 종의 곤충에 대해 병원성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 반면 기주 체내 침입은 주로 경피적으로 일어나지만 Culicinomyces처럼 경구적으로만 모기체내에 침입하는 것도 있다. Among B. bassiana it is known to be infected with a wider host range of more than 500 species of insects, Metarhizium in the M. anisopliae and M. flavoviridae Especially, M. anisopliae is widely distributed and its host range is wide and it is known that it exhibits pathogenicity to 200 insects of 7 species. On the other hand, intracorporeal invasion occurs mainly percutaneously, but it may enter the mosquito body only orally, such as Culicinomyces .
기주곤충이 폐사하면 균사가 생성되는 과정에서 기주 곤충의 장내 미생물과의 경합이 일어나며, 고온환경에서는 드물게 세균이 우세하여 사충이 부패하지만 많은 경우에 사상균이 우세하여 체내의 모든 조직내에 침입한다. 균사가 체내의 수분을 고갈시키기 때문에 사충체가 점점 굳어져서 미이라처럼 되고 종종 적색, 황색, 갈색 또는 자주색을 띤다. 건조한 조건이나 균사가 생육할 수 없는 저온에서는 사충체가 그 상태로 보존되지만 포화습도에 가까운 고온조건에서는 체내의 균사가 큐티클이 얇은 몸마디 사이 부분이나 기문을 통해 밖으로 나와 사충체 외부를 덮고 분생자병을 내서 분생자를 형성한다. 분생자는 다량으로 형성되며 사상균의 종류에 따라 그 특유의 색을 가지므로 사충체는 선명한 색을 띤 가루로 덮이게 된다. 이러한 증상으로 인하여 불완전 균류를 총칭하여 굳음병이라고도 한다.
When the host insects are killed, competition with the intestinal microorganisms occurs in the course of the mycelial production. In the high temperature environment, the microorganisms predominate rarely to decay the larvae, but in many cases, the molds dominate and invade all tissues of the body. As the mycelium depletes the body's moisture, the quencher solidifies and becomes like a mummified, often red, yellow, brown or purple. At low temperatures where dry conditions and hyphae can not grow, the quasar is preserved in that state. However, at high temperature conditions close to saturated humidity, the hyphae of the body will come out through the cuticle or thin part of the body, To form a congener. Conidia are formed in large quantities and have their distinctive colors depending on the type of filamentous fungus, so that they are covered with brightly colored powder. Because of these symptoms, incomplete fungi are collectively referred to as callus disease.
곤충병원성 박테리아는 B. thuringiensis가 대표적으로 포자형성 시기 동안 포자낭내에 내독소 단백질을 형성하여 곤충 체내에서 독소로 작용하고 포자는 다시 발아하는 생활사를 반복하는 특징이 있다. 이 때 내독소 단백질은 유전자간의 아미노산 서열의 유사성과 숙주특이성에 따라 CryI은 나비목 유충에, CryII는 나비목과 파리목에, CryIII는 딱정벌레목에, CryIV는 파리목에, CryV는 딱정벌레목과 나비목에 이중 독성을 나타낸다. 숙주 범위에 있어서도 나비목 160 여 종, 파리목 30 여 종, 딱정벌레목 10 여 종 등에 독성을 가지는 다양한 내독소 단백질 등이 알려져 있다.
Insect pathogenic bacteria are characterized in that B. thuringiensis typically forms an endotoxin protein in the sporangium during spore formation, acting as a toxin in the insect body, and repeating the lifespan of germinating spores. The endotoxin protein is double-toxic to the Lepidoptera, CryII to the Lepidoptera, Diptera, CryIII to the Coleoptera, CryIV to the Diptera, and CryV to the beetle and Lepidoptera depending on the homology and host specificity of the genes . In the host range, various endotoxin proteins having toxicity such as 160 species of the lepidoptera, 30 species of the paralytic species and 10 species of the beetle species are known.
곤충 바이러스는 다수의 곤충 바이러스가 광학현미경으로도 쉽게 진단할 수 있 다각체라는 거대한 봉입체 형성능이 있기 때문에, 1900년대부터 연구가 시작되었다. 곤충 바이러스는 double-strand DNA virus인 Baculoviridae , Polydnaviridae, Poxviridae, Ascoviridae 및 Iridoviridae; Single-strand DNA virus인 Parvoviridae; double-strand RNA virus는 Reoviridae; Single-strand RNA virus인 Picornaviridae, Caliciviridae, Nodaviridae, Rhobdoviridae 및 Retroviridae에 속하는 바이러스를 포함하여 현재 크게 12 과가 대표적으로 알려져 있다.Insect viruses have been studied since the 1900s because many insect viruses can easily be diagnosed by optical microscopy and have a large inclusion body structure, called polyhedra. Insect viruses include double-stranded DNA viruses Baculoviridae , Polydnaviridae, Poxviridae, Ascoviridae and Iridoviridae ; Single-strand DNA virus Parvoviridae ; Double-strand RNA viruses were identified as Reoviridae ; The viruses belonging to the single-strand RNA viruses Picornaviridae, Caliciviridae, Nodaviridae, Rhobdoviridae and Retroviridae are now known to be largely known.
바이러스의 침입과정은 우선 외부로부터 다각체 상태의 바이러스가 곤충의 먹이와 함께 체내로 유입되면, 곤충 유충의 중장내로 다각체가 이동하게 되고, 중장의 pH 10 정도의 강알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의하여 다각체가 용해되면서 바이러스 입자가 방출된다. 방출된 바이러스 입자는 중장의 미세융모(microvilli)와 융합에 의하여 상피세포(epithelial cell)에 침입하게 되고, 세포 내에 들어간 뉴클레오캡시드는 핵막으로 이동하여 DNA만 핵 내로 들어가게 된다. 핵 내에 들어간 DNA는 숙주세포의 대사산물을 이용하여 복제과정을 거치게 되며, 이 과정을 통해 다시 뉴클레오캡시드를 형성하여 핵막과 세포질막을 통하여 체강 내로 출아(budding)하면서 2차 감염원인 BV를 형성한다.
In the process of invasion of viruses, polyhedrosis migrates into the middle of insect larvae when viruses of various angles are introduced into the body together with food of insects. As the sieve dissolves, virus particles are released. The released viral particles enter into the epithelial cells by fusion with the microvilli of the middle ear, and the nucleocapsids entering into the cells migrate to the nuclear membrane and only the DNA enters into the nucleus. The DNA in the nucleus undergoes a replication process using the metabolite of the host cell. Through this process, a nucleocapsid is formed again, and budding into the body cavity through the nuclear membrane and the cytoplasmic membrane forms BV as a secondary infection .
곤충병원성 미생물의 감염상태를 진단하기 위해서 사용하던 종래의 PCR 방법은 한 쌍의 primer만을 사용하여 한 종의 병원균을 검정하는 기술로서, '여러 종'의 병원균을 동시에 검정하기 위해서는 Primer의 물리적 특성(Tm 또는 Ta)가 다를 수 있기 때문에, 동시에 사용하기 어렵고, '여러 번' PCR을 따로 진행하야하기 때문에, 신속한 검증이 어려운 문제가 있었다.The conventional PCR method used to diagnose the infection status of insect pathogenic microorganisms is a technique of testing one kind of pathogen by using only one pair of primers. In order to simultaneously test various pathogens, the physical properties of the primer Tm or Ta) may be different from each other, it is difficult to use them at the same time, and since it is necessary to separately perform PCR several times, rapid verification is difficult.
이에 본 발명자들은 장수풍뎅이와 흰점박이꽃무지 갈색거저리 유충에 치명적인 피해를 입히는 병원균 6 종을 동시에 검정할 수 있는 프라이머 세트를 제작하고 이를 이용하여 multiplex PCR을 수행하였으며, 프라이머 간 비특이적 혼성화 없이, 신속하고 정확한 검정결과가 도출됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors produced a primer set capable of simultaneously assaying six pathogens causing serious damage to larvae of white-spotted spider mites and white spotted spider mites, and performed multiplex PCR using them, Confirming that accurate assay results are obtained, and the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae), 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens) 및 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros)의 동시진단용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for the treatment and / bassiana , Metarhizium anisopliae), Bacillus Picchu ringi N-Sys (Bacillus thuringiensis , Pseudomonas aeruginosa), to provide a simultaneous diagnosis of a multiplex primer set, and its use in dry Serratia body sense (Serratia marcescens), and duck test Reno three Ross (Oryctes rhinoceros).
본 발명의 다른 목적은 상기 각각의 미생물의 특정 유전자를 검출하는 프라이머 세트를 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a primer set for detecting a specific gene of each microorganism.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; (ii) 서열번호 3 및 4으로 표시되는 프라이머 세트; (iii) 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머 세트; (iv) 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; (v) 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머 세트; 및 (vi) 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 곤충병원성 미생물 동시진단용 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a kit comprising (i) a primer set represented by SEQ ID NOs: 1 and 2; (ii) a primer set represented by SEQ ID NOs: 3 and 4; (iii) a primer set represented by SEQ ID NOs: 5 and 6; (iv) a primer set represented by SEQ ID NOs: 7 and 8; (v) a primer set represented by SEQ ID NOs: 9 and 10; And (vi) at least one primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NOs: 11 and 12, and a multiplex primer set for simultaneous diagnosis of insect pathogenic microorganisms.
본 발명은 또한 상기 프라이머 및 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae), 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens) 및 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros)의 동시진단용 키트를 제공한다.The present invention also relates to a method of screening for a compound of the present invention, which comprises using the primer and a reagent for carrying out an amplification reaction, such as Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae , Bacillus thuringiensis , Provides simultaneous diagnostic kits for laboratories ( Pseudomonas aeruginosa ), Serratia marcescens and Oryctes rhinoceros .
본 발명은 또한 상기 각 미생물의 특정 유전자 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention also provides a primer set for detecting a specific gene of each microorganism.
본 발명에 따른 곤충병원성 미생물 동시진단용 멀티플렉스 프라이머 세트는 이를 사용한 multiplex PCR에서 프라이머 세트 또는 주형(Template) 간에 비특이적 혼성화없이, 각 병원성 미생물 특이적으로 우수한 검출 효과를 나타내므로, 곤충 사육에서의 병원성 미생물 감염여부에 대한 검정이 신속하게 이루어져 효율적으로 대체할 수 있기 때문에, 곤충 사육 농가에서의 병원성 미생물 피해를 최소화함으로써, 신규 곤충자원 소재 개발 및 지역별 특화된 곤충자원의 산업화에 매우 유용하다.The multiplex PCR primer set for simultaneous diagnosis of insect pathogenic microorganisms according to the present invention exhibits excellent detection effect specifically for each pathogenic microorganism without nonspecific hybridization between primer sets or templates in the multiplex PCR using the same. Therefore, pathogenic microorganisms It is very useful for the development of new insect resource materials and the industrialization of specialized insect resources in each region by minimizing the damage of pathogenic microorganisms in the insect rearing farms since the test for infection can be performed promptly and efficiently.
도 1은 곤충병원성 미생물의 유전자에 대한 프라이머 세트의 검출능 확인을 위하여 하는 개별 프라이머 세트를 이용한 PCR(A), 및 6종의 프라이머 세트를 혼합 사용한 multiplex PCR(B)의 증폭산물을 전기영동으로 확인한 결과이다(M: 100bp marker; 1: Metarhizium anisopliae(87bp); 2: Serratia marcescens(144bp); 3: Pseudomonas aeruginosa(202bp); 4: Beauveria bassiana(269bp); 5: Bacillus thuringiensis(368bp); 6: Oryctes rhinoseros(577bp) ; 7: 7㎕(loading volume); 8: 3㎕(loading volume); 9: 1㎕(loading volume); 10: 0.5㎕(loading volume)).
도 2는 곤충병원성 미생물 검출용 프라이머 세트의 다양한 조합을 PCR 및 mutiplex PCR의 증폭산물을 전기영동으로 확인한 결과이다(1: 6종의 프라이머 세트 혼합 증폭산물; 2-7: 각 프라이머 세트의 증폭산물; 8-11: 프라이머 세트 조합의 증폭산물; M: 100bp marker; O.r.:Oryctes rhinoseros ; B.t.:Bacillus thuringiensis ; B.b.:Beauveria bassiana; P.a.:Pseudomonas aeruginosa ; S.m.:Serratia marcescens); M.a.:Metarhizium anisopliae FIG. 1 shows the results of PCR (A) using an individual primer set for confirming the detection ability of a primer set against the gene of an insect pathogenic microorganism, and amplification products of multiplex PCR (B) using 6 kinds of primer sets mixed together by electrophoresis a check result (M: 100bp marker; 1: Metarhizium anisopliae (87bp); 2: Serratia marcescens (144bp); 3: Pseudomonas aeruginosa (202bp); 4: Beauveria bassiana (269bp); 5: Bacillus thuringiensis (368bp); 6 : Oryctes rhinoseros (577bp); 7 : 7㎕ (loading volume); 8: 3㎕ (loading volume); 9: 1㎕ (loading volume); 10: 0.5㎕ (loading volume)).
FIG. 2 shows the result of various combinations of primer sets for detecting insect pathogenic microorganisms by amplification products of PCR and mutiplex PCR by electrophoresis (1: 6 kinds of primer set mixed amplification products; 2-7: amplification product of each primer set ; 8-11: amplification product of primer set combination; M: 100 bp marker; Or : Oryctes rhinoseros ; Bt .: Bacillus thuringiensis ; Bb : Beauveria bassiana ; Pa .: Pseudomonas aeruginosa ; Sm .; Serratia marcescens ); Ma : Metarhizium anisopliae
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
신규 곤충자원 소재 개발 및 지역별 특화된 곤충자원의 산업화를 정부차원에서 장려에 부응하여 식품소재 및 동물사료 등의 산업적으로 곤충의 가치가 다양하고 커지면서 곤충을 사육하는 농가들이 증가하는 추세에 있다. 그런데 대량사육 등 사육규모가 증가할수록 곤충병원성 진균, 박테리아 및 바이러스 등에 의한 곤충 질병 문제가 커지고 있는 실정이므로 이를 예방하기 위한 빠르고 정확한 진단이 시급히 요구되고 있다.As the value of insects in industry, such as food materials and animal feeds, has increased and increased in response to the government's initiative to develop new insect resource materials and industrialization of specialized insect resources by region, there are increasing trends in farming insects. However, as the size of breeding such as mass rearing increases, the problem of insect diseases caused by insect pathogenic fungi, bacteria and viruses is increasing. Therefore, a quick and accurate diagnosis is urgently needed to prevent such diseases.
이에 본 발명자들은 장수풍뎅이와 흰점박이꽃무지 갈색거저리 유충에 치명적인 피해를 입히는 곤충병원균 6종을 동시에 검정할 수 있는 프라이머 세트를 제작하고 이를 이용하여 multiplex PCR을 수행하여, 프라이머 간 비특이적 혼성화 없이, 신속하고 정확한 검정결과가 도출됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have produced a primer set capable of simultaneously testing six insect pathogens, which cause fatal damage to larvae of white-spotted spider mites and white spider mites, and carried out multiplex PCR using the same to perform rapid multiplex PCR without nonspecific hybridization between primers And the exact test results are obtained, and the present invention has been completed.
본 발명은 일 관점에서, (i) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; (ii) 서열번호 3 및 4으로 표시되는 프라이머 세트; (iii) 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머 세트; (iv) 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; (v) 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머 세트; 및 (vi) 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 곤충병원성 미생물 동시진단용 멀티플렉스 프라이머 세트에 관한 것이다. The present invention provides, in one aspect, (i) a primer set represented by SEQ ID NOS: 1 and 2; (ii) a primer set represented by SEQ ID NOs: 3 and 4; (iii) a primer set represented by SEQ ID NOs: 5 and 6; (iv) a primer set represented by SEQ ID NOs: 7 and 8; (v) a primer set represented by SEQ ID NOs: 9 and 10; And (vi) at least one primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NOs: 11 and 12, and to a set of multiplex primers for simultaneous diagnosis of insect pathogenic microorganisms.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트는 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana)의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the primer set represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 is characterized by detecting the gene of Beauveria bassiana .
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트는 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae)의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the primer set represented by SEQ ID NOS: 3 and 4 is characterized in that the gene of Metarhizium anisopliae is detected.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트는 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the primer set represented by SEQ ID NOS: 5 and 6 is characterized by detecting the gene of Bacillus thuringiensis .
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the primer set represented by SEQ ID NOS: 7 and 8 is characterized by detecting the gene of Pseudomonas aeruginosa .
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머 세트는 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens)의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the primer sets represented by SEQ ID NOS: 9 and 10 are characterized in that the gene of Serratia marcescens is detected.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트는 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros)의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the primer sets represented by SEQ ID NOs: 11 and 12 are characterized by detecting the gene of Oryctes rhinoceros .
본 발명의 프라이머 세트는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며, Multiplex PCR에 사용함에 있어서 비특이적인 반응이 일어나지 않는 특징이 있다.
The primer set of the present invention includes a forward primer and a reverse primer and is characterized in that a nonspecific reaction does not occur when used in Multiplex PCR.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 프라이머 세트, 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae), 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens) 및 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros)의 동시진단용 키트에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a method of amplifying a primer set comprising the primer set and a reagent for carrying out an amplification reaction, such as Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae , Bacillus thuringiensis ), Pseudomonas aeruginosa , Serratia marcescens and Oryctes rhinoceros . The present invention also relates to a kit for simultaneous diagnosis of Pseudomonas aeruginosa , Serratia marcescens and Oryctes rhinoceros .
본 발명에서 있어서, 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 한다.
In the present invention, the reagent for carrying out the amplification reaction is characterized by comprising a DNA polymerase, dNTPs and a buffer.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 곤충으로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라제를 첨가하여 상기 프라이머 세트를 이용한 증폭반응으로 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는 곤충 병원성 미생물 동시진단 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a method of isolating DNA comprising: (a) separating DNA from an insect; (b) using the separated genomic DNA as a template, adding a DNA polymerase and amplifying the target sequence by an amplification reaction using the primer set; And (c) identifying the amplification product. The present invention also relates to a method for simultaneous diagnosis of an insect pathogenic microorganism.
본 발명에 있어서, 상기 증폭반응의 어닐링 온도(annealing temperature, Ta)는 각각 55℃인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the annealing temperature (Ta) of the amplification reaction is 55 ° C.
또한, 본 발명에 따른 곤충 병원성 미생물 동시진단 방법에서의 상기 동정은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하나 이에 한정된 것은 아니다.In the method for simultaneous diagnosis of insect pathogenic microorganisms according to the present invention, the identification is performed by capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.
본 발명에 따른 동시진단 키트 및 방법에 있어서, 상기 '증폭'은 곤충으로부터 추출된 DNA 내에 혼합된 곤충 병원성 미생물의 DNA를 주형(Template)으로, 상기 주형 내의 특정 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 반복하여 시험관 내에서 해당 DNA 부위를 대량 합성하도록 반응시킨 후, 전기영동에서 뚜렷한 밴드로 가시화하여 진단하는 매우 유용한 진단법으로서, 본 발명의 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR), Multiplex PCR, RT-PCR(Reverse transcriptase PCR)에 활용할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.In the simultaneous diagnosis kit and method according to the present invention, 'amplification' refers to a method of inserting DNA of an insect pathogenic microorganism mixed in DNA extracted from an insect as a template into a primer that specifically binds to a specific DNA site in the template The primer sets of the present invention are polymerase chain reaction (PCR), which is a very useful diagnostic method in which a large number of DNA fragments are repeatedly synthesized in a test tube and then visualized by a visible band in electrophoresis. , PCR), Multiplex PCR, and RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR).
본 발명에서의 '프라이머'는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열로서, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 달라질 수 있다.The 'primer' in the present invention may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product as a single strand oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be amplified. The length and sequence of the primers may vary depending on the primer usage conditions such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
본 발명에서의 'Multiplex PCR'은 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 PCR 증폭하는 방법으로서, 일반적으로 Multiplex PCR을 수행하는 경우에는 각각의 PCR 반응을 수행하는 경우에 비해 PCR 산물의 생성 효율이 감소하지만, 본 발명의 프라이머 세트의 경우에는 6 종의 프라이머 세트를 하나의 튜브에 넣고 multiplex PCR을 수행해도 각각의 PCR 산물이 정확하게 생성되는 특징이 있다.'Multiplex PCR' in the present invention is a method of performing PCR amplification in one reaction tube at the same time using a plurality of primer sets. Generally, when multiplex PCR is performed, PCR product However, in the case of the primer set of the present invention, each PCR product is precisely generated even when multiplex PCR is performed by inserting six primer sets into one tube.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 '동정'은 증폭된 표적 서열에 검출가능한 표지 물질로 표지함으로써, 가능하다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the method of the present invention, the 'identification' is possible by labeling the amplified target sequence with a detectable labeling substance. The labeling substance may be a fluorescent, phosphorescent or radioactive substance but is not limited thereto.
본 발명의 방법에 있어서, 동정에 사용될 수 있는 상기 표지 물질은 Cy5 또는 Cy3일 수 있다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지시킬 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. In the method of the present invention, the labeling substance that can be used for identification may be Cy5 or Cy3. When the target sequence is amplified, PCR is carried out by labeling Cy5 or Cy3 at the 5'-end of the primer, so that the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. When the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution, the amplification product may be synthesized and the radioactive substance may be incorporated into the amplification product and the amplification product may be labeled as radioactive.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 동정 방법의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
In the method of the present invention, as one of the identification methods, gel electrophoresis can be performed. Gel electrophoresis can be performed using agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. In the fluorescence measurement method, when Cy5 or Cy3 is labeled at the 5'-end of the primer and the PCR is performed, the target sequence is labeled with a fluorescent label capable of detecting the fluorescence, and the fluorescence thus labeled can be measured using a fluorescence analyzer. In addition, in the case of performing the PCR, the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution to mark the amplification product, and then a radioactive measurement device such as a Geiger counter or liquid scintillation counter The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 및 2로 표시되는 핵산서열을 가지는 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana)의 유전자 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a primer set for gene detection of Beauveria bassiana having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 3 및 4로 표시되는 핵산서열을 가지는 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae)의 유전자 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a primer set for detecting a gene of Metarhizium anisopliae having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 7 및 8로 표시되는 핵산서열을 가지는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 유전자 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a primer set for detecting a gene of Pseudomonas aeruginosa having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 7 and 8.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 9 및 10로 표시되는 핵산서열을 가지는세라티아 마르체센스(Serratia marcescens)의 유전자 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a primer set for gene detection of Serratia marcescens having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 9 and 10.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 11 및 12로 표시되는 핵산서열을 가지는 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros)의 유전자 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a primer set for detecting genes of Oryctes rhinoceros having the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11 and 12.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are provided to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples in any sense.
이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
In this case, unless otherwise defined, technical terms and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In the following description and the accompanying drawings, A description of known functions and configurations that may unnecessarily obscure the description of the present invention will be omitted.
실시예Example 1: 프라이머 세트의 제조 1: Preparation of primer set
사육농가들의 곤충 병사충들에서 분리되는 곤충병원성 미생물 중에서 발생빈도가 높은 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae), 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens) 및 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros)의 6종의 미생물을 타겟으로 선택하였다.Among the insect pathogenic microorganisms isolated from the insect hostages of breeding farmers, the most frequently occurring species are Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae , Bacillus thuringiensis , Pseudomonas spp. Six microorganisms were selected as targets: Pseudomonas aeruginosa , Serratia marcescens and Oryctes rhinoceros .
프라이머 세트의 타겟 유전자는 NCBI data base에 등록된 각각 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana)는 MsW1, 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae)는 28S rRNA 유전자, 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 각각의 독소인 luxS 및 exoS, 및 Oryctes rhinoceros virus는 Pst1D fragment partial sequence, 및 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis)는 Yamada et al,. 1994의 primer 서열을 활용하여 MPprimer program(제조사)으로 상호 저해 또는 혼성화되지 않으면서 특이적으로 유전자 검출이 가능한 서열을 프라이머 세트로 선별하였다(표 1).The target genes of the primer set are MsW1 for Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae for 28S rRNA gene, Serratia marcescens and Pseudomonas spp. Registered in the NCBI data base, Pseudomonas aeruginosa has the toxins luxS and exoS , and Oryctes rhinoceros virus has the Pst1D fragment partial sequence, and Bacillus thuringiensis is Yamada et al . 1994 primer sequences were used to select specific sequences for gene detection without mutual inhibition or hybridization with the MPprimer program (manufacturer) (Table 1).
Position (bp)Position (bp)
(accession no.)(accession no.)
그 결과, 각 미생물 및 바이러스를 타겟으로 하는 프라이머 세트의 염기서열은 다음과 같다(표 2).As a result, the nucleotide sequences of the primer sets targeting each microorganism and virus are as follows (Table 2).
실시예 2: Multiplex PCR에서의 프라이머 세트 검출능 확인Example 2 Confirmation of Primer Set Detection Ability in Multiplex PCR
1. 미생물 gDNA의 추출1. Extraction of microbial gDNA
실험에 사용된 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana)는 PDA(Potato Dextrose Agar)배지에서, Metarhizium anisopliae는 SDA(Sabouraud dextrose agar)배지에서 24℃에서 약 2주 정도 배양한 후 DNeasy Plant Mini Kit(Quiagen, USA)를 사용하여 genomic DNA를 분리하였다.The beauveria bassiana used in the experiment was cultured on a PDA (Potato Dextrose Agar) medium, Metarhizium anisopliae, after about two weeks incubation at 24 ℃ in SDA (Sabouraud dextrose agar) medium using the DNeasy Plant Mini Kit (Quiagen, USA ) were isolated genomic DNA.
박테리아인 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens)는 Nutrient agar (NA) 배지에서 30℃에서 하루 배양한 후 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega, USA)를 사용하여 gDNA를 분리하였다. The bacteria Bacillus thuringiensis , Pseudomonas aeruginosa , and Serratia marcescens were cultured in Nutrient agar (NA) medium at 30 ° C for one day, followed by Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega, USA) was used to isolate gDNA.
또한, 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros) virus는 바이러스에 감염된 장수풍뎅이 유충표면을 Distilled water 로 깨끗이 씻은 후, hemolymph를 syringe로 분리하여 Distilled water로 1/10로 dilution하여 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega, USA)를 사용하여 gDNA를 분리하였다.
In addition, Oryctes rhinoceros virus was prepared by washing the surface of the larvae of virus-infected long beetle larvae with distilled water, separating the hemolymph into syringes, diluting 1/10 with distilled water, and using Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega , USA) was used to isolate gDNA.
2. Multiplex PCR2. Multiplex PCR
샘플의 gDNA의 농도는 각 1ng/㎕를 적용하고, AccuPower Multiplex PCR Premix(Bioneer, Korea)를 사용하였다. 프라이머의 농도는 Forward, Reverse에 대해 각각 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 30pM; 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae), 3.5pM; 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 50pM; 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 3.5pM; 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens), 3.5pM; 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros), 5pM를 반응에 사용하였다. total volume은 25㎕에서 PCR 조건은 initial denaturation 94℃에서 5분, denaturation 94℃에서 30초, annealing 55℃에서 30초, 및 extension 72℃에서 30초의 반응을 35cycle 반복하고, final extension 72℃에서 6분을 시행하였다. PCR product는 agarose gel 1%를 사용하고, 110V로 85분 loading하였다.The concentration of gDNA in each sample was 1 ng / μl, and AccuPower Multiplex PCR Premix (Bioneer, Korea) was used. The concentration of the primers was 30 pM for Beauveria bassiana for Forward and Reverse, respectively; Metarhizium anisopliae , 3.5 pM; Bacillus thuringiensis , 50 pM; Pseudomonas aeruginosa , 3.5 pM; Serratia marcescens , 3.5 pM; Oryctes rhinoceros , 5 pM was used for the reaction. For the total volume of 25 μl, the PCR conditions were 5 cycles of initial denaturation at 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds, Min. The PCR products were agarose
각 프라이머 세트를 개별적으로 사용하여 수행한 PCR의 결과는 증폭산물이 오리테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros, O.r.), 577bp; 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis, B.t.), 368bp; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana, B.b.), 269bp; 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, P.a.), 202bp; 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens, S.m.), 144bp; 및 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae, M.a.), 87bp로 확인할 수 있었다(도 1A). 또한 6종의 프라이머 세트를 동시에 사용한 Multiplex PCR 결과에 의하여, 프라이머의 민감도를 확인한 결과, PCR product의 0.5㎕까지 loading하여도 밴드 확인이 가능하였다(도 1B).
The results of the PCR performed using each primer set individually showed that the amplified product was Oryctes rhinoceros (Or ), 577 bp; Bacillus thuringiensis ( Bt ), 368 bp; Beauveria bassiana (Bb ), 269 bp; Pseudomonas aeruginosa (Pa ), 202 bp; Serratia marcescens, Sm ), 144 bp; And Metarhizium anisopliae (Ma ), 87 bp (Fig. 1A). The sensitivity of the primers was confirmed by Multiplex PCR using 6 kinds of primer sets at the same time. As a result, it was possible to confirm the band even when loading up to 0.5 μl of the PCR product (FIG. 1B).
또한, 서로 다른 조합의 프라이머 세트 사용에 의한 Multiplex PCR 민감도를 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 6종의 곤충병원균에 대한 6 세트의 프라이머를 이용하여 타겟 유전자를 증폭시킨 결과는 1번 lane은 6종의 곤충병원균을 모두 확인이 가능하였고, 2번 lane부터 7번 lane은 타겟 유전자 개별에 대한 확인이 가능하였다. 또한 8번부터 11번 lane은 진균, 박테리아, 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 조합의 증폭 결과로서, 각각의 밴드사이즈가 1번 lane의 것과 동일함을 확인하였다. As shown in FIG. 2, the target gene was amplified using 6 sets of primers for six insect pathogens. As a result, the results of amplification of the target gene in
8번 lane은 박테리아 B.t., P.a., 및 S.m.; 9번 lane은 B.b. 및 M.a.,; 10번 lane은 O.r. 바이러스 및 각각의 박테리아(B.t., P.a. 및 S.m.); 11번 lane은 바이러스 O.r., B.b. 및 M.a.를 동시 확인이 가능하였다. loading volume은 모두 3㎕이며, 1% agarose gel로 85분 loading하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Multiplex Primers for Detecting Plurality of Insect Pathogens and Use Thereof <130> P2014-0141 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bb_F primer <400> 1 atttctatac gatctcagcg ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bb_R primer <400> 2 ttttcgatga tttggccata gg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ma_F primer <400> 3 aactatgcct gtatagggtg aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ma_R primer <400> 4 cccatatttg acgatcgatt tg 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt_F primer <400> 5 atcggtgata cagataagac t 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt_R primer <400> 6 ccttcatacg tatgaatatt attt 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pa_F primer <400> 7 tgaacaggta gtgaagactt tc 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pa_R primer <400> 8 attcttgtag ttcgatatcc cg 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm_F primer <400> 9 taccatcacg gtatttgatc tg 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm_R primer <400> 10 gagatgtcga taatctccac g 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Or_F primer <400> 11 actcgtaatt tgtcggatac tc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Or_R primer <400> 12 attgtataac ggactcgttc tc 22 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Multiplex Primers for Detecting Plurality of Insect Pathogens and Use Thereof <130> P2014-0141 <160> 12 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bb_F primer <400> 1 atttctatac gatctcagcg ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bb_R primer <400> 2 ttttcgatga tttggccata gg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ma_F primer <400> 3 aactatgcct gtatagggtg aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ma_R primer <400> 4 cccatatttg acgatcgatt tg 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt_F primer <400> 5 atcggtgata cagataagac t 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt_R primer <400> 6 ccttcatacg tatgaatatt attt 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pa_F primer <400> 7 tgaacaggta gtgaagactt tc 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pa_R primer <400> 8 attcttgtag ttcgatatcc cg 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm_F primer <400> 9 taccatcacg gtatttgatc tg 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm_R primer <400> 10 gagatgtcga taatctccac g 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Or_F primer <400> 11 actcgtaatt tgtcggatac tc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Or_R primer <400> 12 attgtataac ggactcgttc tc 22
Claims (17)
(i) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트;
(ii) 서열번호 3 및 4으로 표시되는 프라이머 세트;
(iii) 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머 세트;
(iv) 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트;
(v) 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머 세트; 및
(vi) 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트.
A set of multiplex primers for simultaneous diagnosis of insect pathogenic microorganisms comprising at least one primer set selected from the group consisting of:
(i) a primer set represented by SEQ ID NOS: 1 and 2;
(ii) a primer set represented by SEQ ID NOs: 3 and 4;
(iii) a primer set represented by SEQ ID NOs: 5 and 6;
(iv) a primer set represented by SEQ ID NOs: 7 and 8;
(v) a primer set represented by SEQ ID NOs: 9 and 10; And
(vi) a set of primers represented by SEQ ID NOs: 11 and 12;
2. The multiplex primer set for simultaneous diagnosis of an insect pathogenic microorganism according to claim 1, wherein the primer set represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 detects the gene of Beauveria bassiana .
2. The multiplex primer set for simultaneous diagnosis of insect pathogenic microorganisms according to claim 1, wherein the primer set represented by SEQ ID NOS: 3 and 4 is a gene for Metarhizium anisopliae .
The multiplex primer set for simultaneous diagnosis of an insect pathogenic microorganism according to claim 1, wherein the primer set set forth in SEQ ID NOS: 5 and 6 detects the gene of Bacillus thuringiensis .
The multiplex primer set for simultaneous diagnosis of an insect pathogenic microorganism according to claim 1, wherein the primer set represented by SEQ ID NOS: 7 and 8 detects the gene of Pseudomonas aeruginosa .
2. The multiplex primer set for simultaneous diagnosis of insect pathogenic microorganisms according to claim 1, wherein the primer set represented by SEQ ID NOS: 9 and 10 is a gene for Serratia marcescens .
The multiplex primer set for simultaneous diagnosis of an insect pathogenic microorganism according to claim 1, wherein the primer set represented by SEQ ID NOs: 11 and 12 detects the gene of Oryctes rhinoceros .
A primer set according to any one of claims 1 to 7, and a reagent for carrying out an amplification reaction, such as Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae , Bacillus strain Simultaneous diagnostic kits for Bacillus thuringiensis , Pseudomonas aeruginosa , Serratia marcescens and Oryctes rhinoceros .
The simultaneous diagnostic kit according to claim 8, wherein the reagent for carrying out the amplification reaction comprises a DNA polymerase, dNTPs and a buffer.
(a) separating DNA from an insect; (b) amplifying the target sequence by amplification using a primer set according to any one of claims 1 to 7, using the separated genomic DNA as a template and adding a DNA polymerase; And (c) identifying the amplification product.
The method according to claim 10, wherein the annealing temperature (Ta) of the amplification reaction is 55 ° C.
11. The method for simultaneous diagnosis of an insect pathogenic microorganism according to claim 10, wherein the identification is performed by capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.
A primer set for gene detection of Beauveria bassiana having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2.
A primer set for detecting a gene of Metarhizium anisopliae having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3 and 4.
A primer set for detecting the gene of Pseudomonas aeruginosa having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOS: 7 and 8.
A primer set for detecting a gene of Serratia marcescens having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 9 and 10.
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| KR20220083302A (en) * | 2020-12-11 | 2022-06-20 | 대한민국(농촌진흥청장) | Primer set for multiple detection of Bombyx mori Pathogens, and use Thereof |
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- 2014-12-19 KR KR1020140184645A patent/KR101700600B1/en active IP Right Grant
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