KR20160068950A - 안정성이 증가된 프로테아제 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열 1에 명시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 그의 전장에 걸쳐 가지며, 여기서 서열 1에 따른 3, 4, 99, 188 및 199번 위치에 상응하는 위치의 아미노산은 S3T, V4I, R99D/E, A188P 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P 및 V199I로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제, 및 그의 제조 및 용도에 관한 것이다. 상기 프로테아제는 우수한 세정력을 가짐과 동시에, 매우 우수한 안정성, 특히 온도 안정성을 나타낸다.

Description

안정성이 증가된 프로테아제 변이체 {PROTEASE VARIANTS WITH INCREASED STABILITY}

본 발명은 효소 기술 분야에 포함된다. 본 발명은 그의 아미노산 서열이 특히 세제 및 세정제에서의 용도와 관련하여 상응하는 변형을 가지는 모든 충분히 유사한 프로테아제로 변형된 것인, 특정 프로테아제, 및 그의 제조, 및 그를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 프로테아제의 방법 및 적용, 및 그를 함유하는 작용제, 특히 세제 및 세정제에 관한 것이다.

프로테아제는 전체 효소 중 기술상 가장 중요한 것 중 하나이다. 세제 및 세정제의 경우, 프로테아제는 사실상 모든 현 고성능 세제 및 세정제에 존재하는 효소 중 가장 오랫동안 확립된 효소이다. 이는 세정하고자 하는 품목 상의 단백질 함유 얼룩을 분해한다. 이들 중에서 결국은, 세린 프로테아제로서 분류되는 서브틸리신-유사 프로테아제 (서브틸라제, 서브틸로펩티다제, EC 3.4.21.62)가 촉매상 활성인 아미노산에 기인하여 특히 중요하다. 이는 비특이 엔도펩티다제로서 작용하고, 펩티드 또는 단백질 내에 위치하는 산-아미드 결합을 가수분해한다. 그의 최적의 pH는 보통 명백하게 알칼리성 범위이다. 상기 패밀리에 관한 개요는 예를 들어, R. 보트(R. Bott) 및 C. 베첼(C. Betzel)(뉴욕, 1996)에 의해 편집된 논문 ["Subtilases: subtilisin-like proteases" by R. Siezen, pages 75-95, in "Subtilisin Enzymes"]에서 살펴볼 수 있다. 서브틸라제는 천연적으로 미생물에 의해 형성된다. 이들 중에서도, 바실루스(Bacillus) 종에 의해 형성되고 분비된 서브틸리신을 특히 서브틸라제에서 가장 중요한 군인 것으로서 언급하고자 한다.

바람직하게 세제 및 세정제에서 사용되는 서브틸리신-유사 프로테아제의 예로는 서브틸리신 BPN' 및 칼스버그(Carlsberg), 프로테아제 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 특히 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 프로테아제, 서브틸리신 DY, 및 서브틸라제로 분류하고자 하지만, 엄격한 의미에서는 이제 서브틸리신으로 분류되지 않는 효소, 즉, 써미타제, 프로테이나제 K, 및 프로테아제 TW3 및 TW7 뿐만 아니라, 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 아미노산 서열이 변형되어 있는 것인, 상기 언급된 프로테아제의 변이체가 있다. 프로테아제는 선행 기술로부터 공지된 방법에 의해 선택적으로 또는 무작위로 변형되고, 이로써 예를 들어 세제 및 세정제에서 사용하기 위한 것으로 최적화된다. 상기 방법으로는 점 돌연변이유발법, 결실 또는 삽입 돌연변이유발법, 또는 다른 단백질 또는 단백질 성분과의 융합을 포함한다. 따라서, 선행 기술로부터 공지된 대부분의 프로테아제에 대해 상응하는 최적화된 변이체가 공지되어 있다.

국제 특허 출원 WO 95/23221 및 WO 92/21760에는 세제 또는 세정제에서의 그의 사용에 적합한, 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제의 변이체가 개시되어 있다. 추가로, 국제 특허 출원 WO 2011/032988에는 유사하게 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제의 변이체를 함유하는 세제 및 세정제가 개시되어 있다. 상기 공개 문헌에 개시된 프로테아제 변이체는 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제에 대한 열거 방법에서 다른 위치는 제외하고 3, 4, 99, 및 199번 위치에서 변형될 수 있고, 예를 들어, 상기 위치에서 아미노산 3T, 4I, 99D, 99E, 또는 199I를 가질 수 있다. 그러나, 이하 기술되는 바와 같은 변형은 상기 공개 문헌으로부터 나타나지 않는다.

이제 놀랍게도, 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제 유형 또는 (서열 동일성에 기초하여) 그와 충분히 유사한 프로테아제의, 치환 3T, 4I, (99D 또는 99E), 및 199I 이외에도, 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제에 대한 열거 방법에서 188번 위치의 아미노산이 프롤린에 의해 치환된 치환 (188P)을 갖는 프로테아제가 세제 또는 세정제에서 그를 사용하는 데 특히 적합하고, 특히 안정성과 관련하여 이롭게 개선된 것으로 밝혀졌다.

그러므로, 제1 측면에서, 본 발명의 대상은 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 그의 전장에 걸쳐 가지며, 각 경우에 서열 1에 따른 넘버링에 기초하여 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 가지는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제이다. 서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 추가의 대상은 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 그의 전장에 걸쳐 갖는 원래의 프로테아제에서, 프로테아제가 상응하는 위치에 아미노산 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4I, 99E, 188P, 및 199I를 포함하도록 하는 방식으로, 서열 1의 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산을 치환을 포함하는 프로테아제를 제조하는 방법이다.

서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

그러므로, 본 특허 출원의 의미에 포함된 프로테아제는 상기와 같은 프로테아제 및 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 프로테아제, 둘 모두를 포함한다. 그러므로, 프로테아제에 관한 모든 언급은 물질로서의 프로테아제, 및 상응하는 방법, 특히 프로테아제 제조 방법 둘 모두를 나타낸다.

본 발명의 추가의 대상으로서 본 발명의 프로테아제 또는 본 발명의 프로테아제 제조 방법과 관련된 것은 상기 프로테아제를 코딩하는 핵산, 본 발명의 프로테아제 또는 핵산을 함유하는 비-인간 숙주 세포, 또는 본 발명의 프로테아제를 포함하는 작용제, 특히 세제 및 세정제, 세척 및 세정 방법, 및 본 발명의 프로테아제에 의해 정의되는 적용이다.

본 발명은 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제에서, 아미노산 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4I, 99E, 188P, 및 199I가 상응하는 위치에 존재하도록 하는, 서열 1에 따른 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제의 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치의 본 발명에 따른 변형이 세제 및 세정제에서 상기 변형된 프로테아제의 안정성을 개선시킨다는 본 발명자들에 의한 놀라운 인식에 기초한다. 이는 치환 3T, 4I, 99E, 및 199I를 갖는 공지된 프로테아제의 안정성이 188번 위치에서의 추가 치환의 도입에 의해 상승적으로 개선된다는 점에 있어 특히 놀라운 것이며; 즉, 놀랍게도 돌연변이 188P는 이미 달성된 안정화 효과와 상승적으로 작용한다.

본 발명의 프로테아제는 예를 들어, 계면활성제 및/또는 표백제 및/또는 온도 효과, 특히 고온, 예를 들어, 50 내지 65℃, 특히 60℃, 및/또는 산성 또는 알칼리성 조건 및/또는 pH 변화 및/또는 변성제 또는 산화제 및/또는 단백질 분해성 분해 및/또는 산화 환원 조건 변화에 관하여 세제 또는 세정제에서 특히 안정성을 갖는다. 결과적으로, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 의해 성능이 개선된 프로테아제 변이체가 제공된다. 그 결과, 본 발명의 프로테아제의 상기 유익한 실시양태는 광범위한 온도 범위에서 프로테아제 감수성 얼룩의 세척 결과를 개선시킬 수 있다.

그러므로, 상기 언급된 국제 특허 출원 WO 95/23221, WO　92/21760, 및 WO 2011/032988과 관련하여, 본 발명은 세제 또는 세정제에 대하여 특히 안정적이고, 이로써 고성능인 프로테아제 변이체를 수득할 수 있도록 하는 대안적 서열 변형에 관한 것이다. 이는 188번 위치가 별개로 또는 치환 V193M과 함께 조합하여 안정화 효과를 갖는다고 앞서 기술되어 있되; 그럼에도 불구하고, 상기 위치에서의 돌연변이와, 이미 매우 큰 안정화 효과를 가지는, 3, 4, 99, 및 199번 위치의 치환과의 조합이 안정성을 추가로 상당히 증가시킬 것이라고는 예상되지 못했다는 점에서 놀라운 것이다.

본 발명의 프로테아제는 단백질 분해성 활성을 가지며; 다시 말해, 특히 세제 또는 세정제에서 폴리펩티드 또는 단백질의 펩티드 결합을 가수분해시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 프로테아제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매화하여 펩티드 또는 단백질을 절단할 수 있는 효소이다. 추가로, 본 발명의 프로테아제는 바람직하게 성숙 프로테아제, 즉, 신호 펩티드(들) 및/또는 프로펩티드(들) 없이 촉매적으로 활성인 분자이다. 달리 언급하지 않는 한, 제공된 서열은 또한 각 경우에 성숙 효소를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 프로테아제, 특히 성숙 프로테아제는 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 및 98.8% 이상 그의 전장에 걸쳐 동일하고, 서열 1에 따른 열거에서 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4I, 99E, 188P, 및 199I를 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 프로테아제가 명시된 치환을 갖는다는 특징은 프로테아제가 상응하는 위치에 모든 상응하는 아미노산을 함유하고; 즉, 5개의 위치 중 어느 하나도 추가로 돌연변이화되지 않거나, 또는 예를 들어, 프로테아제의 단편화에 의해 결실되지 않는다는 것을 의미한다. 서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 상기 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 따라 바람직한 상기 프로테아제는 서열 2에 기재되어 있다.

핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열 비교에 의해 측정된다. 이러한 서열 비교는 선행 기술에서 확립된, 관례적으로 사용되는 BLAST 알고리즘에 기초하고 (예를 들어, 문헌 [Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410], 및 [Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res., 25, pp. 3389-3402] 참조), 이는 기본적으로 핵산 또는 아미노산 서열 중 뉴클레오티드 또는 아미노산의 유사 서열들을 서로 배정함으로써 수행된다. 관련 위치의 표 방식의 배정을 정렬로 명명한다. 선행 기술에서 이용가능한 또 다른 알고리즘은 FASTA 알고리즘이다. 서열 비교 (정렬), 특히 다중 서열 비교는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 컴파일링된다. 예를 들어, 클러스탈(Clustal) 시리즈 (예를 들어, 문헌 [Chenna et al. (2003): "Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs." Nucleic Acid Research 31, 3497-3500] 참조), T-커피(T-Coffee) (예를 들어, 문헌 [Notredame et al. (2000): "T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments." J. Mol. Biol. 302, 205-217] 참조), 또는 상기 프로그램 또는 알고리즘에 기반한 프로그램이 빈번하게 사용된다. 본 특허 출원에서, 모든 서열 비교 (정렬)는, 서열 비교를 위한 그의 얼라인X(AlignX) 모듈이 클러스탈W에 기반하는 것인 미리 정의된 디폴트 파라미터와 함께 컴퓨터 프로그램 벡터 NTI^® 스위트 10.3(벡터 NTI^® Suite 10.3) (인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation: 미국 캘리포니아주 칼즈배드 패러데이 애비뉴 1600)을 이용하여 작성하였다.

또한 이런 종류의 비교를 통해 비교되는 서열의 유사성에 대해 결론을 지을 수 있다. 이는 보통 동일성(%), 즉, 정렬되었을 때 같은 위치에 또는 서로 상응하는 위치에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 위치하는 비율로 제시된다. 더욱 광범위하게 해석되는 상동성이라는 용어는 아미노산 서열의 경우, 보존되는 아미노산 교환, 그러므로, 화학 활성이 유사한 아미노산을 포함하는데, 이는 그가 단백질 내에서 거의 유사한 화학 활성을 수행하기 때문이다. 그러므로, 비교되는 서열의 유사성은 또한 상동성(%) 또는 유사성(%)으로 제시될 수도 있다. 동일성 및/또는 상동성 데이터는 전체 폴리펩티드 또는 유전자, 또는 오직 개별 영역만을 나타낼 수 있다. 그러므로, 다양한 핵산 또는 아미노산 서열의 상동성 또는 동일한 영역은 상기 서열 중의 매치에 의해 정의된다. 상기 영역은 대개 동일한 기능을 한다. 이는 작고, 단지 소수의 뉴클레오티드 또는 아미노산만을 포함할 수 있다. 상기 작은 영역은 대개 단백질의 전반적인 활성에 필수적인 기능을 수행한다. 그러므로, 서열 매치를 오직 개별, 임의적으로는 작은 영역과 결부시키는 데 유용할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 그러나, 본 출원에서 동일성 또는 상동성 데이터는 각 경우에 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 전체 길이에 관한 것이다.

그러므로, 본 발명과 관련하여, 아미노산 위치는 서열 1에서 번호로 지정된 위치에 상응한다라는 언급은 상응하는 위치는 상기 정의된 바와 같이 정렬되었을 때 서열 1에서 번호로 지정된 위치로 배정된다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 프로테아제는 서열 1, 3, 또는 4에 기재된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제와 비교하였을 때 그의 세정 성능은 유의적으로 감소되지 않다는 점, 즉, 참조 세척 성능의 80% 이상을 갖는다는 점을 특징으로 한다. 세정 성능은 세척액 및 프로테아제 1 ℓ당 4.5 내지 7.0　g인 용량으로 세제를 함유하는 세척 시스템에서 측정될 수 있고, 그에 의해 비교되는 프로테아제는 (활성 단백질에 기초하여) 같은 농도로 사용되고, 세정 성능은 세척된 직물의 백색도를 측정함으로써 면 위의 얼룩, 특히

면 위의 얼룩 혈유/잉크: 제품 번호 C-05 (CFT (센터 포 테스트메트리얼즈(Center For Testmaterials: 네덜란드 B.V. 플라르딩겐)로부터 입수가능);

초콜렛-밀크/녹: 제품 번호 C-03 (CFT (센터 포 테스트메트리얼즈 (네덜란드 B.V. 플라르딩겐)로부터 입수가능);

밀크/오일: 제품 번호 PC-10 (CFT (센터 포 테스트메트리얼즈 (네덜란드 B.V. 플라르딩겐)로부터 입수가능);

전란/색소: 제품 번호 10N WFK 10N (면 위의 전란/색소, wfk - 클리닝 테크놀러지 인스티튜트 e.V.(Cleaning Technology Institute e.V.: 독일 크레펠트)); 및

코코아: 제품 번호 EMPA 112, EMPA 112 (면 위의 코코아, 아이드게노쉬 마트리알- 운트 프루판스탈트 (EMPA) 테스트마트리알리언 아게(Eidgenoessische Material- und Pruefanstalt (EMPA) Testmaterialien AG) [스위스 연방 재료 과학 & 기술 (EMPA) 실험 재료 연구소(Swiss Federal Laboratories for Materials Science & Technology (EMPA) Test Materials)] (스위스 갈렌 스트리트))에 관하여 측정되며, 여기서, 세척 공정은 40℃ 온도에서 70분 동안 수행되고, 물의 물경도는 15.5 내지 16.5°(독일 경도)이다. 상기 세척 시스템용으로 지정된 세제 중 프로테아제의 농도는 활성 단백질에 기초하여 0.001중량% 내지 0.1중량%, 바람직하게는 0.01중량% 내지 0.06중량%이다.

상기 유형의 세척 시스템에 바람직한 액체 세제는 하기 조성을 갖는다 (모든 양은 중량%로 제시된다): 0.3 내지 0.5% 크산탄 검, 0.2 내지 0.4% 소포제, 6 내지 7% 글리세롤, 0.3 내지 0.5% 에탄올, 4 내지 7% FAEOS (지방 알콜 에테르 술페이트), 24 내지 28% 비이온성 계면활성제, 1% 붕산, 1 내지 2% 시트르산나트륨 (디히드레이트), 2 내지 4% 탄산나트륨, 14 내지 16% 코코넛 지방산, 0.5% HEDP (1-히드록시에탄-(1,1-디포스폰산)), 0 내지 0.4% PVP (폴리비닐피롤리돈), 0 내지 0.05% 광학 증백제, 0 내지 0.001% 염료, 나머지 탈염수. 바람직하게는 액체 세제의 용량은 세척액 1 ℓ당 4.5 내지 6.0 g, 예를 들어, 세척액 1 ℓ당 4.7, 4.9, 또는 5.9 g이다. 세척은 바람직하게 pH 8 내지 pH 10.5, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 9의 pH 값 범위에서 이루어진다.

상기 유형의 세척 시스템에 바람직한 분말형 세제는 하기 조성을 갖는다 (모든 양은 중량%로 제시된다): 10% 선형 알킬벤젠 술포네이트 (나트륨 염), 1.5% C12-C18 지방 알콜 술페이트 (나트륨 염), 2.0% 7 EO의 C12-C18 지방 알콜, 20% 탄산나트륨, 6.5% 탄산수소나트륨, 4.0% 비정질 이규산나트륨, 17% 탄산나트륨 퍼옥시히드레이트, 4.0% TAED, 3.0% 폴리아크릴레이트, 1.0% 카르복시메틸셀룰로스, 1.0% 포스포네이트, 27% 황산나트륨, 나머지: 발포 억제제, 광학 증백제, 방향제. 바람직하게는 분말형 세제의 용량은 세척액 1 ℓ당 4.5 내지 7.0 g, 예를 들어, 및 특히 바람직하게는 세척액 1 ℓ당 4.7 g, 또는 세척액 1 ℓ당 5.5, 5.9, 또는 6.7 g이다. 세척은 바람직하게 pH 9 내지 pH 11의 pH 값 범위에서 이루어진다.

본 발명의 범주에서, 세정 성능은 상기 명시된 액체 세제를 사용하여 40℃에서 측정되고, 그에 의해 세척 공정은 바람직하게 70분 동안 이루어진다.

백색도, 즉, 얼룩의 탈색은 세정 성능의 척도로서 바람직하게는 광학 측정 방법을 사용하여, 바람직하게는 광도 측정에 의해 측정된다. 이에 적합한 장치는 예를 들어, 미놀타(Minolta) CM508d 분광계이다. 측정에 사용되는 장치는 보통 백색 표준, 바람직하게는 제공된 백색 표준을 사용하여 사전에 보정된다.

프로테아제 활성 측정 방법은 효소 기술의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 기술자들은 이를 통상적으로 사용한다. 상기 방법은 예를 들어, 문헌 [Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132]에 개시되어 있다. 별법으로, 프로테아제 활성은 기질인 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드 (AAPF)로부터의 발색단인 파라-니트로아닐린 (pNA)의 유리를 통해 측정될 수 있다. 프로테아제는 기질을 절단하여 pNA를 유리시킨다. pNA가 유리되면, 410 nm에서의 흡광은 증가하게 되고, 그 시간 경과가 효소 활성의 척도이다 (문헌 [Del Mar et al., 1979] 참조). 측정은 온도 25℃, pH 8.6, 및 파장 410 nm에서 수행된다. 측정 시간은 5분이며, 측정 간격은 20초 내지 60초이다. 프로테아제 활성은 보통 프로테아제 단위 (PU)로 제시된다. 적합한 프로테아제 활성은 예를 들어, 세척액 1 ml당 2.25, 5, 또는 10 PU이다. 그러나, 프로테아제 활성은 0은 아니다.

단백질 농도는 공지 방법, 예를 들어, BCA 방법 (비신코닌산; 2,2'-디퀴놀릴-4,4'-디카르복실산) 또는 비우렛(Biuret) 방법의 도움으로 측정될 수 있다 (A.G. Gornall, C.S. Bardawill, and M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). 이와 관련하여 활성 단백질 농도는 적합한 비가역성 억제제 (프로테아제인 경우, 예를 들어, 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF))를 사용하여 활성 부위를 적정함으로써 및 잔류 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다 (문헌 [M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pp. 5890-5913] 참조).

단백질은 항혈청 또는 특이 항체와의 반응에 의해 면역학상 관련된 단백질 군으로 조합될 수 있다. 상기 군의 구성원은 항체에 의해 인식되는 동일한 항원 결정기를 갖는다는 점을 특징으로 한다. 이들은 구조상 매우 유사하며, 따라서 항혈청 또는 특이 항체에 의해 인식된다. 그러므로, 본 발명의 추가의 대상은 본 발명의 프로테아제와 1개 이상의, 및 더욱 바람직하게는 2, 3, 또는 4개의 상응하는 항원 결정기를 갖는다는 점을 특징으로 하는 프로테아제이다. 그의 면역학적 유사성에 기초한 상기 프로테아제는 본 발명의 프로테아제와 구조상 매우 유사하며, 이로써, 이는 또한 동일한 기능을 가질 것으로 추정될 수 있다.

상기 기술된 아미노산 변형 이외에도, 본 발명의 프로테아제는 추가의 아미노산 변형, 특히 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 가질 수 있다. 상기 프로테아제는 추가로, 예를 들어, 표적화된 유전적 변형에 의해, 즉, 돌연변이유발 방법에 의해 개발되고, 구체적인 목적을 위해, 또는 특별한 특성과 관련하여 (예를 들어, 그의 촉매 활성, 안정성 등과 관련하여) 최적화된다. 추가로, 본 발명의 핵산은 재조합 배치 내로 도입될 수 있고, 이로써, 완전히 신규한 프로테아제 또는 다른 폴리펩티드를 생성하는 데 사용될 수 있다.

본 목적은 예를 들어, 본 발명의 효소의 세정 성능을 개선시키기 위하여 표적화된 돌연변이, 예컨대, 치환, 삽입, 또는 결실을 공지된 분자 내로 도입하고자 하는 것이다. 이 목적을 달성하기 위해, 특히 분자의 표면 전하 및/또는 등전점 및 그에 의해 기질과 그의 상호작용은 변형될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 특히 세제 및 세정제에서의 사용을 위해 그에 따라 기질 변형에 영향을 주기 위해서 효소의 순전하가 변형될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 프로테아제의 안정성은 또한 추가로 하나 이상의 적절한 돌연변이에 의해 증가될 수 있고, 그 결과로서 그의 세정 성능은 개선될 수 있다. 개별 돌연변이, 예컨대, 개별 치환의 유익한 특성이 서로 보완될 수 있다. 그러므로, 특정 특성과 관련하여, 예를 들어, 계면활성제 및/또는 표백제 및/또는 다른 성분과 관련하여 그의 안정성 면에서 이미 최적화된 프로테아제는 본 발명의 맥락 내에서 추가로 개발될 수 있다.

단 하나의 아미노산 위치에 관한 치환 (아미노산 교환)을 기술하는 데 하기 관행이 사용된다: 먼저, 자연 발생 아미노산을 국제적으로 인정된 1문자 코드 형태로 식별하고; 그 다음으로는 관련된 서열 위치, 및 마지막으로 삽입된 아미노산이 뒤따른다. 동일 폴리펩티드 쇄 내의 다중 교환은 슬래시 표시로 서로 분리시킨다. 삽입인 경우, 추가 아미노산은 서열 위치 다음에 열거된다. 결실인 경우, 결손 아미노산은 기호, 예컨대, 별표 또는 대시 표시로 대체되거나, 상응하는 위치 앞에 Δ가 제공된다. 예를 들어, A95G는 95번 위치의 알라닌의 글리신으로의 치환을 기술하고, A95AG는 95번 위치의 아미노산 알라닌 다음의 글리신 삽입을 기술하고, A95* 또는 ΔA95는 95번 위치의 알라닌의 결실을 기술한다. 이러한 명명법은 효소 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

그러므로, 본 발명의 추가의 대상은 모체 분자로서 상기 기술된 바와 같은 프로테아제로부터 단일 또는 다중 보존적 아미노산 치환에 의해 수득 가능하고, 상기 프로테아제는 서열 1에 따른 열거에서 상기 기술된 바와 같이 서열 1의 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 본 발명의 아미노산 치환을 여전히 그대로 가지는 것을 특징으로 하는 프로테아제이다. "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 한 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기와 교환 (치환)되는 것으로서, 이로써, 상기와 같은 교환이 교환된 아미노산 위치에서의 극성 또는 전하를 변화시키지 않는 것을 의미하며, 예컨대, 한 비극성 아미노산 잔기의 또 다른 비극성 아미노산 잔기와의 교환이 있다. 본 발명의 범주 내의 보존적 아미노산 치환으로는 예를 들어: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T를 포함한다. 서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 상기 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

별법으로 또는 추가로, 프로테아제는 모체 분자로서의 본 발명의 프로테아제로부터 단편화에 의해, 또는 결실, 삽입, 또는 치환 돌연변이유발법에 의해 수득 가능하고, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 또는 266개 이상의 연속하는 아미노산 길이에 걸쳐 모체 분자와 매칭되는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 1의 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 모체 분자의 돌연변이화된 아미노산 잔기가 여전히 그대로 존재한다는 점을 특징으로 한다. 서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 상기 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

따라서, 예를 들어, 하기 결실에 의해 단백질 분해성 활성이 손실되거나, 감소되게 하지 않으면서, 효소의 말단에서 또는 루프에서 개별 아미노산을 결실시킬 수 있다. 추가로, 예를 들어, 상기와 같은 단편화 및 결실, 삽입, 또는 치환 돌연변이유발법에 의해 관련 효소의 알레르기 발현성 또한 감소될 수 있고, 이로써, 그의 유용성도 전반적으로 개선될 수 있다. 이롭게는, 효소는 돌연변이유발법 이후에도 또한 그의 단백질 분해성 활성을 유지하며; 즉, 그의 단백질 분해성 활성은 적어도 모체 효소의 것과 상응하고; 즉, 바람직한 실시양태에서, 단백질 분해성 활성은 모체 효소의 활성의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상을 구성한다. 추가의 치환은 또한 유익한 효과를 가질 수 있다. 개별 및 다중의 연속하는 아미노산 둘 모두 다른 아미노산과 교환될 수 있다.

별법으로 또는 추가로, 프로테아제는 정렬되었을 때 서열 1에 따른 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 193, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255, 및 268번 위치에 배정되는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 모체 분자로서의 본 발명의 프로테아제로부터 수득 가능하고, 상기 프로테아제는 서열 1에 따른 열거에서 상기 기술된 바와 같이 서열 1의 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 치환을 여전히 그대로 갖는다는 점을 특징으로 한다. 이에 다른 아미노산 위치는 서열 1에 기재되어 있는 바와 같이, 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열과 본 발명의 프로테아제의 아미노산 서열의 정렬에 의해 정의된다. 추가로, 위치 배정은 성숙 단백질에 기초한다. 이러한 배정은 또한 특히 본 발명의 프로테아제의 아미노산 서열이 서열 1에 따른 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제보다 더 많은 개수의 아미노산 잔기를 포함할 경우에 사용되어야 한다. 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열 중의 명시된 위치로부터 출발하여, 본 발명의 프로테아제 중의 변형 위치는 정렬되었을 때 상기 위치에 정확하게 배정된 위치이다. 서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

따라서, 바람직하게는 본 발명의 프로테아제의 상동 위치로 전달되었을 때, 중요하고 유익한 기능적 특성을 프로테아제에 부여하는, 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 서열 변형, 특히 치환에 유익한 위치는, 서열 1과 정렬하여 서열 1에 따른 열거의 지정에 있어 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 193, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255, 및 268번 위치이다. 하기 아미노산 잔기가 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 야생형 분자의 명시된 위치에 위치한다: S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, A101, I102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, V193, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255, 또는 T268. 그러나, 돌연변이 M193V는 임의적으로 다른 것에 의해 커버될 수 있다. 그러나, 서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

특히, 예를 들어, 치환 G61A, S154D, 및 S154E는 본 발명의 프로테아제 중 상응하는 상동 위치가 이미 상기 바람직한 아미노산 중 하나에 의해 천연적으로 점유된 상태가 아니라면 이롭다.

변형시키고자 하는 아미노산, 즉, 특히 그의 기능적 등가물의 정확한 배정에 관한 추가 확인은, 정렬에 기초하여 서로에 대해 배정된 두 위치가 비교되는 두 프로테아제 모두에서 동일한 방식으로 변형되고, 효소 활성이 두 경우 모두에서 동일한 방식으로 변형되는지 여부를 관찰하는 비교 실험에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 서열 1에 따른 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 특정 위치에서의 아미노산 교환이 예를 들어, K_M 값 증가에 의한 효소 파라미터의 변화를 동반한다면, 및 효소 파라미터의 상응하는 변화, 따라서, 예를 들어, 유사하게, K_M 값 증가가, 아미노산 교환이 동일의 삽입된 아미노산에 의해 달성된 본 발명의 프로테아제 변이체에서 관찰된다면, 이는 정확한 배정의 확인인 것으로 간주될 수 있다.

명시된 요소들 모두 또한 프로테아제를 제조하는 데 본 발명의 방법에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하기 공정 단계 중 하나 이상의 것을 추가로 포함한다:

(a) 단일 또는 다중의 보존적 아미노산 치환을 도입함으로써, 서열 1에 따른 열거에서 프로테아제가 아미노산 치환 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4I, 99E, 188P, 및 199I를 가지는 것인 단계;

(b) 단편화에 의해, 또는 결실, 삽입, 또는 치환 돌연변이유발법에 의해 아미노산 서열을 변형시켜 프로테아제가, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 또는 266개 이상의 연속하는 아미노산 길이에 걸쳐 모체 분자와 매칭되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 모체 분자 중의 아미노산 치환 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4T, 99E, 188P, 및 199I는 여전히 그대로 존재하도록 하는 단계;

(c) 정렬되었을 때 서열 1에 따른 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 193, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255, 및 268번 위치에 배정되는 위치 중 하나 이상의 위치로 단일 또는 다중의 아미노산 치환을 도입하여, 서열 1에 따른 열거에서 프로테아제는 아미노산 치환 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4I, 99E, 188P, 및 199I를 가지는 것인 단계. 서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

모든 언급한 내용은 또한 본 발명의 방법에 적용된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 프로테아제 또는 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 프로테아제는 서열 2에 기재된 아미노산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 또는 98.8% 이상 여전히 그의 전장에 걸쳐 동일하다. 별법으로, 프로테아제 또는 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 프로테아제는 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 또는 98% 이상 여전히 그의 전장에 걸쳐 동일하다. 프로테아제 또는 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 프로테아제는 아미노산 치환 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4I, 99E, 188P, 및 199I를 갖는다.

서열 1에 따른 열거 방법에서 193번 위치에 상응하는 위치에서는 원래의 프로테아제와 비교하였을 때 어떤 변형도 가지지 않는 프로테아제, 특히 상기 위치에 V (발린)인 V193을 가지는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 추가 대상은 특히 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 치환에 의해, 또는 중합체에의 커플링에 의해 추가로 안정화된, 앞서 기술된 프로테아제이다. 이어서, 보관 동안 및/또는 예를 들어, 세척 공정에서 사용하는 동안의 안정성 증가는 효소 활성이 더욱 장기간 동안 지속되고, 이로써 세정 성능이 개선된 것의 결과를 갖는다. 기본적으로, 모든 적절한 안정화 옵션 및/또는 선행 기술에 기술된 것이 사용될 수 있다. 바람직한 안정화는 효소 그 자체의 돌연변이에 의해 달성되는 것인데, 그 이유는 상기와 같은 안정화는 효소 회수 이후에 추가의 작업 단계를 필요로 하지 않기 때문이다. 이러한 목적에 적합한 서열 변형의 예는 상기에 제시되어 있다. 다른 적합한 서열 변형은 선행 기술로부터 공지된다. 따라서, 예를 들어, 프로테아제는 또한 다른 아미노산 대신으로 하나 이상의 티로신 잔기를 교환함으로써 안정화될 수 있다.

안정화를 위한 추가의 옵션으로는 예를 들어:

- 예를 들어, 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 대신으로 칼슘 결합에 관여하는 아미노산 중 하나 이상의 것을 교환함으로써 및/또는 2개의 아미노산 아르기닌/글리신의 서열 중 적어도 하나에 서열 변형을 도입함으로써 금속 이온의, 특히 칼슘 결합 부위의 결합을 변형시키는 옵션;

- 단백질의 표면 상에서의, 또는 표면에서의 아미노산 서열을 변화시키는 돌연변이에 의해 변성제, 예컨대, 계면활성제의 효과로부터 보호하는 옵션;

- 가정컨대 비공유 상호작용에 의해 분자 나머지 부분과 접촉하고, 이로써, 구형 구조를 유지하는 데 기여하는 것으로 추정되는 아미노산 대신으로 N-말단에 가깝게 위치하는 아미노산을 교환하는 옵션.

바람직한 실시양태는 효소가 여러 방식으로 안정화된 것이며, 그 이유는 다중의 안정화 돌연변이가 상가적으로 또는 상승적으로 작용하기 때문이다.

본 발명의 추가 대상은 1개 이상의 화학적 변형을 가지는 것을 특징으로 하는, 상기 기술된 바와 같은 프로테아제이다. 상기 변형을 가지는 프로테아제는 유도체로 지정되며; 즉, 프로테아제는 유도체화된 것이다.

따라서, 본 출원의 의미 내에서 유도체란, 그의 순수한 아미노산 쇄가 화학적으로 변형된 것인 단백질로서 이해된다. 상기 유도체화는 예를 들어, 상기 단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 생체내에서 수행될 수 있다. 이와 관련하여 특히 저분자량 화합물, 예컨대, 지질 또는 올리고당의 커플링이 강조되어야 한다. 그러나, 유도체화는 또한 예를 들어, 아미노산의 측쇄의 화학적 전환에 의해, 또는 상이한 화합물의 단백질에의 공유 결합에 의해 시험관내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 등전점을 변형시키기 위해 아민을 효소의 카르복실 기에 커플링시킬 수 있다. 상기와 같은 또 다른 화합물은 또한 예를 들어, 이작용성 화학 화합물에 의해 본 발명의 단백질에 결합된 추가의 단백질일 수 있다. 유도체화는 또한 거대분자 캐리어에의 공유 결합으로서, 또는 적합한 거대분자 케이지 구조 내로의 비공유 포접으로서 이해하여야 한다. 예를 들어, 유도체화는 기질 특이성, 또는 기질에의 결합의 강도에 영향을 줄 수 있거나, 또는 커플링된 물질이 억제제인 경우, 효소 활성은 일시적으로 차단될 수 있다. 이는 예를 들어, 보관 기간 동안 유용할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가로 안정성 또는 효소 활성에도 영향을 줄 수 있다. 게다가, 이는 또한 단백질의 알레르기 발현성 및/또는 면역원성을 감소시킴으로써, 예를 들어, 그의 피부 적합성을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 거대분자 화합물, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜에의 커플링이 안정성 및/또는 피부 적합성과 관련하여 단백질을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 단백질의 유도체는 또한 가장 광범위한 의미에서 상기 단백질의 제제로서 이해될 수 있다. 회수, 프로세싱, 또는 제조에 따라, 단백질은 예를 들어, 제조 미생물의 배양물로부터 각조의 다른 물질과 회합될 수 있다. 단백질은 또한 예를 들어, 그의 보관 안정성을 증가시키기 위하여 다른 물질이 의도적으로 그에 첨가되도록 할 수 있다. 이러한 이유에서, 본 발명의 단백질의 제제 모두 이 또한 신규한 것이다. 이는 또한 실제로 특정 제제 중에서 상기의 효소 활성을 보이는지 여부와는 상관이 없다. 보관 동안 활성을 거의 갖지 않거나, 또는 전혀 가지지 않고, 오직 사용시에만 그의 효소 작용을 발휘하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들어, 적합한 동반 물질에 의해 제어될 수 있다. 특히 이와 관련하여 프로테아제와 프로테아제 억제제의 공동 제제가 가능하다.

본 발명의 범주 내에서 상기 기술된 모든 프로테아제 또는 프로테아제 변이체 및/또는 유도체와 관련하여, 그의 안정성 및/또는 활성이 적어도 서열 2에 따른 프로테아제의 것에 상응하고/거나, 그의 세정 성능이 적어도 서열 2에 따른 프로테아제의 것에 상응하고, 그에 의해 세정 성능은 상기 기술된 바와 같이 세척 시스템에서 측정되는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 추가 대상은 본 발명의 프로테아제를 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산을 함유하는 벡터, 특히 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다.

이는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이는 단일 가닥으로서, 상기 단일 가닥에 상보적인 단일 가닥으로서, 또는 이중 가닥으로서 존재할 수 있다. DNA 분자인 경우, 특히 두 상보적인 가닥 모두의 서열은 3개의 가능한 모든 리딩 프레임으로 각 경우에 고려되어야 한다. 상이한 코돈, 그러므로, 염기 트리플랫이 같은 아미노산을 코딩할 수 있으며, 이로써, 특이적인 아미노산 서열이 다중의 상이한 핵산에 의해 코딩될 수 있다는 것도 추가로 고려되어야 한다. 이러한 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 상기 기술된 프로테아제 중 하나를 코딩할 수 있는 모든 핵산 서열이 본 발명의 상기 대상에 포함된다. 유전자 코드의 축퇴성에도 불구하고, 정의된 아미노산이 개별 코돈으로 배정되어야 하기 때문에, 통상의 기술자는 상기 핵산 서열을 명확하게 결정할 수 있다. 그러므로, 통상의 기술자는 아미노산 서열로부터 기인하여 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 쉽게 알아낼 수 있다. 추가로, 본 발명의 핵산의 경우에, 하나 이상의 코돈은 동의적 코돈에 의해 대체될 수 있다. 이러한 측면은 특히 본 발명의 효소의 이종성 발현에 관한 것이다. 모든 유기체, 예를 들어, 생산 균주의 숙주 세포는 특이적인 코돈 사용 빈도를 갖는다. 코돈 사용 빈도는 각 유기체에 의한 유전자 코드의 아미노산으로의 번역으로 이해된다. 단백질 생합성에서 병목 현상은 유기체에서 핵산 상에 위치하는 코돈이 비교적 소수의 하전된 tRNA 분자와 직면하게 될 경우에 발생할 수 있다. 비록 같은 아미노산을 코딩하기는 하지만, 결과는 코돈이 유기체에서 같은 아미노산을 코딩하는 동의적 코돈보다 덜 효율적으로 번역된다는 것이다. 동의적 코돈에 대하여 더 많은 개수의 tRNA 분자가 존재하기 때문에, 후자인 동의적 코돈이 유기체에서 더욱 효율적으로 번역될 수 있다.

오늘날 보편적으로 공지되어 있는 방법, 예를 들어, 화학적 합성법 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 분자 생물학 또는 단백질 화학의 표준 방법과 함께 조합하여 사용함으로써, 통상의 기술자는 공지된 DNA 서열 및/또는 아미노산 서열에 기초하여 상응하는 핵산을 최대 완전한 유전자까지 제조할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Laboratory Press]로부터 알려진 것이다.

본 발명의 의미 내에서, 벡터는 핵산으로 구성되고, 본 발명의 핵산을 특징적인 핵산 영역으로서 함유하는 요소인 것으로 이해된다. 이를 통해 종 또는 세포주에서 다세대에 걸쳐 또는 세포 분열에 걸쳐 상기 핵산을 안정적인 유전적 요소로서 확립할 수 있다. 박테리아에서 사용될 때, 특히 벡터는 특수 플라스미드, 그러므로, 고리형 유전적 요소이다. 본 발명의 범주 내에서, 본 발명의 핵산은 벡터로 클로닝된다. 벡터는 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 바이러스, 또는 박테리오파지로부터 기원하는 것, 또는 주로 합성 벡터, 또는 매우 다양한 기원의 요소를 가지는 플라스미드를 포함한다. 각 경우에 추가의 유전적 요소가 존재하는 경우, 벡터는 관련 숙주 세포에서 다세대에 걸쳐 그 자신을 안정적인 단위로서 확립할 수 있다. 이는 별개의 단위로서 염색체외에 존재하할 수 있거나, 또는 염색체 내로 또는 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.

발현 벡터는 그를 함유하는 숙주 세포, 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 박테리아에서 그의 복제가 이루어질 수 있고, 그 안에 함유되어 있는 핵산의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 발현은 특히 전사를 조절하는 프로모터(들)에 의해 영향을 받는다. 원칙적으로, 발현은 원래 발현시키고자 하는 핵산 앞에 위치하는 천연 프로모터에 의해 수행될 수 있을 뿐만 아니라, 발현 벡터 상에 제공된 숙주 세포 프로모터에 의해, 또는 상이한 유기체 또는 상이한 숙주 세포의 변형된 또는 완전히 다른 프로모터에 의해서도 수행될 수 있다. 본 경우에서, 본 발명의 핵산의 발현을 위해 1개 이상의 프로모터가 제공되고, 그의 발현을 위해 사용된다. 추가로, 발현 벡터는 예를 들어, 배양 조건의 변화에 의해, 또는 그를 함유하는 숙주 세포가 특정 세포 밀도에 도달하였을 때, 또는 특이 물질, 특히 유전자 발현의 활성제의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 상기 물질의 한 예로는 박테리아 락토스 오페론 (lac 오페론)의 활성제로서 사용되는, 갈락토스 유도체인 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)가 있다. 발현 벡터오 달리, 함유된 핵산은 클로닝 벡터에서는 발현되지 않는다.

본 발명의 추가 대상은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터를 함유하거나, 또는 본 발명의 프로테아제를 함유하는 비-인간 숙주 세포, 특히 숙주 세포 주변 배지로 프로테아제를 분비하는 것이다. 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터는 바람직하게는 미생물 내로 형질전환되고, 이어서, 이는 본 발명의 숙주 세포를 나타낸다. 별법으로, 개별 성분, 즉, 본 발명의 핵산의 핵산 부분 또는 단편 또한 이후 생성되는 숙주 세포가 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터를 함유하도록 하는 방식으로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 방법은, 숙주 세포가 이미 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터의 하나 이상이 성분을 함유하고 있고, 이어서, 추가 성분이 그에 맞춰 첨가되는 경우에 특히 적합하다. 세포 형질전환 방법은 선행 기술에서 확립되었고, 이는 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있다. 모든 세포, 즉, 원핵 또는 진핵 세포는 원칙적으로 숙주 세포로서 적합하다. 이롭게는 예를 들어, 핵산 또는 벡터를 사용하는 형질전환 및 그의 안정적인 확립과 관련하여 유전적으로 조작될 수 있는 숙주 세포, 예를 들어, 단세포 진균 또는 박테리아가 바람직하다. 추가로, 바람직한 숙주 세포는 미생물학적 및 생물 공학적 용어에서 쉽게 조작될 수 있는 것으로 유명하다. 이는 예를 들어, 용이한 배양 가능성, 높은 성장률, 발효 배지에 대한 낮은 요건, 및 외래 단백질에 대한 우수한 생산 및 분비율을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 (트랜스제닉 기법에 의해) 발현된 단백질을 숙주 세포 주변 배지로 분비한다. 추가로, 프로테아제는 그의 생산 이후에, 그를 생산한 세포에 의해, 예를 들어, 당 분자의 부가, 포르밀화, 아미노화 등에 의해 변형될 수 있다. 이러한 종류의 번역 후 변형이 프로테아제에 기능적으로 영향을 줄 수 있다.

숙주 세포의 활성이 예를 들어, 벡터 상에 제공되기도 하지만, 최초에 상기 세포에 존재할 수 있는 유전적 조절 요소에 기초하여 조절될 수 있는 것인 숙주 세포가 추가로 바람직한 실시양태를 나타낸다. 이는 예를 들어, 활성제로서 작용하는 화학 화합물의 제어된 부가에 의해, 배양 조건을 변화시킴으로써, 또는 특정 세포 밀도에 도달하였을 때 발현되도록 자극을 받을 수 있다. 본 발명의 단백질이 경제적으로 제조될 수 있도록 할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 상기 화합물의 한 예는 IPTG이다.

바람직한 숙주 세포는 원핵 또는 박테리아 세포이다. 박테리아는 세대 기간이 짧고, 배양 조건과 관련하여 요구 수준이 낮은 것으로 유명하다. 그 결과, 비용면에서 효율적인 배양 방법 또는 제조 방법이 확립될 수 있다. 추가로, 통상의 기술자는 박테리아 경우에 있어 발효 기술에서 매우 다양한 경험을 갖는다. 예컨대, 영양 공급원, 생성물 형성률, 시간 요건 등 개별 경우에서 실험적으로 결정되는 매우 다른 이유에서 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아가 특이적인 제조에 적합할 수 있다.

그람-음성 박테리아, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 복수 개의 단백질이 주변세포질 공간으로, 따라서, 세포를 에워 싸는 2개의 막 사이의 구획 내로 분비된다. 이는 특이적인 적용에 이로울 수 있다. 추가로, 그람-음성 박테리아는 또한 발현된 단백질을 주변세포질 공간 뿐만 아니라, 박테리아 주변의 배지로 방출하도록 발생될 수 있다. 그에 반해, 그람-양성 박테리아, 예컨대, 바실리(bacilli) 또는 악티노마이세테스(actinomycetes), 또는 악티노마이세탈레스(Actinomycetales)의 다른 대표는 외부 막이 없고, 이에 분비된 단백질은 배지로, 대체로는 박테리아 주변의 영양 배지로 직접 방출되며, 발현된 단백질은 상기 배지로부터 정제될 수 있다.

이는 배지로부터 직접 단리될 수 있거나, 또는 추가로 프로세싱될 수 있다. 추가로, 그람-양성 박테리아는 기술상 중요한 효소에 대해 대부분의 공급원 유기체와 관련이 있거나, 또는 동일하고, 보통 그 스스로 유사한 효소를 형성하며, 이로써, 유사한 코돈 사용 빈도를 가지고, 그의 단백질 합성 기구는 천연적으로 그에 맞춰 조직화된다.

본 발명의 숙주 세포는 배양 조건에 대한 그의 요건과 관련하여 변형될 수 있고, 다른 또는 추가의 선별 마커를 가질 수 있거나, 또는 다른 또는 추가의 단백질을 발현할 수 있다. 이는 또한 특히 트랜스제닉 기법에 의해 다중의 단백질 또는 효소를 발현하는 숙주 세포일 수 있다.

본 발명은 원칙적으로는 모든 미생물을 이용하여, 특히 모든 발효가능한 미생물을 이용하여, 특히 바람직하게는 바실루스 속의 것을 이용하여 사용될 수 있고, 본 발명의 단백질이 상기 미생물의 사용으로 제조될 수 있다는 결과를 갖는다. 이어서, 상기 미생물은 본 발명의 의미 내에 포함된 숙주 세포를 나타낸다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아인 것, 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 속, 클레브시엘라(Klebsiella) 속, 바실루스 속, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아트로박터(Arthrobacter) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속을 포함하는 군으로부터 선택되는 것, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 바실루스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 렌투스, 바실루스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실루스 깁소니이(Bacillus gibsonii), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 바실루스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor), 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

숙주 세포는 또한 진핵 세포일 수 있지만, 그러나, 이는 세포 핵을 가지는 것을 특징으로 하는 것이다. 그러므로, 본 발명의 추가 대상은 세포 핵을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주 세포이다. 원핵 세포와 달리, 진핵 세포는 번역 후에 형성된 단백질을 변형시킬 수 있다. 그의 예로는 진균, 예컨대, 악티노마이세테스 또는 효모, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)가 있다. 이는 특히 예를 들어, 단백질이 그의 합성과 관련하여 상기 시스템에 의해 이루어질 수 있는 특이적인 변형을 거치게 될 경우에 이로울 수 있다. 진핵 시스템이 수행하는 변형, 특히 단백질 합성과 관련된 것으로는 예를 들어, 저분자량 화합물, 예컨대, 막 앵커 또는 올리고당의 결합을 포함한다. 이러한 종류의 올리고당 변형은 예를 들어, 발현된 단백질의 알레르기 발현성을 저하시키기 위해서 바람직할 수 있다. 상기 세포에 의해 천연적으로 형성된 효소, 예를 들어, 셀룰라제 또는 리파제와의 공동 발현 또한 이로울 수 있다. 추가로, 예를 들어, 고온성 진균 발현 시스템은 온도-저항성 단백질 또는 변이체의 발현에 특히 적합할 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는 종래 방식으로, 예를 들어, 불연속 또는 연속 시스템에서 배양 및 발효된다. 전자의 경우, 적합한 영양 배지를 숙주 세포로 접종하고, 실험적으로 결정된 시간이 경과한 후에 생성물을 배지로부터 수거한다. 연속 발효는 비교적 장기간 동안에 걸쳐 일부 세포는 사멸하지만, 일부는 재생도 하며, 형성된 단백질은 배지로부터 동시에 제거될 수 있는 것으로, 동적 평형을 달성하는 것으로 유명하다.

본 발명의 숙주 세포는 바람직하게 본 발명의 프로테아제를 제조하는 데 사용된다. 그러므로, 본 발명의 추가 대상은

a) 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계,

b) 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리시키는 단계를 포함하는, 프로테아제를 제조하는 방법이다.

본 발명의 상기 대상은 발효 방법을 포함한다. 발효 방법은 그 자체가 선행 기술로부터 공지되어 있고, 일반적으로는 계속해서 제조된 생성물, 예를 들어, 본 발명의 프로테아제에 대해 적합한 정제 방법으로 이어지는, 실제 대규모 제조 단계를 나타낸다. 본 발명의 프로테아제를 제조하는 데 적합한 방법에 기반한 모든 발효 방법이 본 발명의 상기 대상의 실시양태를 나타낸다.

발효가 공급 방식을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 방법이 특히 적절하다. 이러한 경우, 연속 배양 동안 소비되는 배지 성분을 공급받는다. 세포 밀도 및 세포 매스 또는 건조 매스, 둘 모두 및/또는 관심 프로테아제의 활성의 상당한 증가가 이러한 방식으로 달성될 수 있다. 추가로, 발효는 또한 바람직하지 못한 대사 생성물은 여과되거나, 완충제 또는 적합한 카운터이온의 첨가에 의해 중화되도록 디자인될 수 있다.

제조된 프로테아제는 발효 배지로부터 수거될 수 있다. 이러한 종류의 발효 방법, 즉, 세포 매스 (건조 매스)로부터 생성물을 회수하는 것은 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리시키는 것보다 바람직하지만, 적합한 숙주 세포 또는 하나 이상의 적합한 선별 마커 또는 기전 및/또는 수송 시스템의 제공을 필요로 하며, 이로써, 숙주 세포는 프로테아제를 발효 배지 내로 분비한다. 별법으로, 분비 없이, 프로테아제는 예를 들어, 황산암모늄 또는 에탄올을 사용하는 침전에 의해 또는 크로마토그래피 정제에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있으며, 즉, 세포 매스로부터 그의 정제가 이루어질 수 있다.

상기 요소들은 모두 본 발명의 프로테아제를 제조하는 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 대상은 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 작용제이다. 바람직하게는 작용제는 세제 또는 세정제이다.

본 발명의 상기 대상은 상업 규모로, 세척기에서, 또는 수동으로 세척 또는 세정할 때 사용하기 위한, 농축물 및 또한 희석되지 않은 형태로 사용되는 작용제 둘 모두인, 모든 가능한 유형의 세제 또는 세정제를 포함한다. 이는 예를 들어, 그에 대한 작용제가 세제라는 용어로 사용되는, 직물용, 카펫용, 또는 천연 섬유용 세제를 포함한다. 이는 또한 예를 들어, 세정제라는 용어가 그에 대해 사용되는 식기 세척기용 식기 세척제, 또는 수동용 식기 세척제 또는 하드 표면, 예컨대, 금속, 유리, 자기, 세라믹, 타일, 돌, 코팅된 표면, 플라스틱, 목재, 또는 가죽용 클리너, 그러므로, 수동 및 자동 식기 세척제 이외에도, 예를 들어, 또한 정련제, 유리 클리너, 화장실 클리너 등도 포함한다. 본 발명의 범주 내에 포함되는 세제 및 세정제는 추가의 효과를 달성하기 위해 수동 또는 자동 직물 세탁에서 실제 세제에 첨가되는 추가의 세척 첨가제를 포함한다. 추가로, 본 발명의 범주 내에 포함되는 세제 및 세정제는 또한 직물 처리 전 및 처리 후 작용제, 따라서, 예를 들어, 잘 지워지지 않는 얼룩을 용해시키기 위해 실제 세탁 이전에 세탁되는 품목이 접촉하게 되는 작용제 뿐만 아니라, 실제 직물 세탁 이후의 단계에서 세척된 품목에 추가의 바람직한 특성, 예컨대, 쾌감, 방추성, 또는 낮은 정전기를 부여하는 작용제를 포함한다. 그 중에서도 특히 섬유 유연제가 후자의 작용제 중에 포함된다.

분말형 고체로서, 압밀된 입자 형태로, 균질 용액 또는 현탁액으로서 존재할 수 있는 본 발명의 세척제 또는 세정제는 본 발명의 프로테아제 이외에도 상기 작용제에서 전형적인 모든 공지된 성분들을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 1개 이상의 추가의 성분이 상기 작용제 중에 존재한다. 본 발명의 작용제는 특히 계면활성제, 빌더, 과산소 화합물, 또는 표백 활성제를 함유할 수 있다. 이는 수 혼화성 유기 용매, 다른 효소, 격리제, 전해질, pH 조절제, 및/또는 추가 보조제, 예컨대, 광학 증백제, 회색화 억제제, 기포 조절제, 및 염료 및 방향제 뿐만 아니라, 그의 조합을 추가로 함유할 수 있다.

특히본 발명의 프로테아제와 작용제의 하나 이상의 다른 성분들의 조합이 유익한데, 그 이유는 본 발명의 바람직한 실시양태에서 이러한 유형의 작용제는 생성된 상승 작용에 기인하여 개선된 세정 성능을 가지기 때문이다. 상기 상승 작용은 특히 본 발명의 프로테아제와 계면활성제 및/또는 빌더 및/또는 과산소 화합물, 및/또는 표백 활성제의 조합에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 작용제의 이로운 성분은 국제 특허 출원 WO 2009/121725의 5페이지 끝에서 두 번째 단락에서부터 시작하여 13페이지 두번째 단락 다음까지에 개시되어 있다. 상기 개시내용은 명백하게 참조되며, 상기 문헌상의 개시 내용은 본 특허 출원에 포함된다.

본 발명의 작용제는 이롭게는 작용제 1 g당 2 ㎍ 내지 20 mg, 바람직하게는 5 ㎍ 내지 17.5 mg, 특히 바람직하게는 20 ㎍ 내지 15 mg, 및 매우 특히 바람직하게는 50 ㎍ 내지 10 mg인 양으로 프로테아제를 함유한다. 추가로, 작용제 중에 함유되어 있는 프로테아제, 및/또는 작용제의 추가 성분은 실온에서 또는 물의 부재에서 효소에 대해 불투과성이고, 작용제의 사용 조건하에서는 효소에 대해 투과성이 되는 물질로 케이싱될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 실시양태는 프로테아제가 실온에서 또는 물의 부재에서 프로테아제에 대해 불투과성인 물질로 케이싱된 것을 특징으로 한다. 추가로, 세제 또는 세정제 그 자체는 또한 용기에, 바람직하게는 통기성 용기에 패키징될 수 있고, 그로부터 세제 또는 세정제는 사용 직전에 또는 세척 작용이 진행되는 동안 방출된다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 작용제는

(a) 고체 형태로, 특히 벌크 중량이 300 g/L 내지 1200 g/L, 특히 500 g/L 내지 900 g/L인 유동성 분말로서 존재하거나,

(b) 페이스트상으로 또는 액체 형태로 존재하고/거나,

(c) 단일-성분 시스템으로서 존재하거나,

(d) 복수 개의 성분으로 분할된다는 점을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 실시양태는 모든 고체, 분말형, 액체, 겔-유사, 또는 페이스트상 전달 형태의 본 발명의 작용제를 포함하고, 이는 임의적으로 다중 상으로 이루어질 수 있고, 압축 또는 비압축 형태로 존재할 수 있다. 작용제는 특히 벌크 중량이 300 g/L 내지 1,200 g/L, 특히 500 g/L 내지 900 g/L, 또는 600 g/L 내지 850 g/L인 유동성 분말로서 존재할 수 있다. 고체 전달 형태의 작용제는 압출물, 과립, 정제 또는 파우치를 추가로 포함한다. 별법으로, 작용제는 또한 예를 들어, 비수성 액체 세제 또는 비수성 페이스트 형태의, 또는 수성 액체 세제 또는 물 함유 페이스트 형태의 액체, 겔-유사, 또는 페이스트상일 수 있다. 추가로, 작용제는 단일-성분 시스템으로서 존재할 수 있다. 상기 작용제는 단상으로 이루어진다. 별법으로, 작용제는 또한 다중상으로 이루어질 수 있다. 따라서, 이러한 종류의 작용제는 다중 성분으로 분포된다.

본 발명의 세제 또는 세정제는 전적으로 오직 프로테아제만을 함유할 수 있다. 별법으로, 이는 또한 작용제의 유효성에 적절한 농도로 다른 가수 분해 효소 또는 다른 효소를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 실시양태는 추가로 하나 이상의 추가 효소를 포함하는 작용제를 나타낸다. 본 발명의 작용제에서 촉매 활성을 나타낼 수 있는 모든 효소, 특히 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 만난아제, 탄나제, 크실라나제, 크산타나제, 크실로글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 카라기나제, 퍼히드롤라제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 또는 리파제 뿐만 아니라, 그의 혼합물이 바람직하게 추가 효소로서 사용가능하다. 추가 효소는 이롭게는 각 경우에 활성 단백질에 기초하여 1 x 10^-8 내지 5중량%인 양으로 작용제 중에 함유된다. 더욱 바람직하게는 각각의 추가 효소는 활성 단백질에 기초하여 1 x 10^-7 내지 3중량%, 0.00001 내지 1중량%, 0.00005 내지 0.5중량%, 0.0001 내지 0.1중량%, 및 특히 바람직하게는 0.0001 내지 0.05중량%인 양으로 본 발명의 작용제 중에 함유된다. 특히 바람직하게는 효소는 특정한 얼룩 또는 얼룩점과 관련하여 상승적 세정 성능을 보이며; 즉, 작용제 조성물 중에 존재하는 효소들은 그의 세정 성능에 있어 서로를 상호간에 보완한다. 상기 상승 작용은 특히 언급된 프로테아제와 아밀라제 및/또는 리파제 및/또는 만난아제 및/또는 셀룰라제 및/또는 펙티나제 사이의 것을 비롯한, 매우 특히 바람직하게는 본 발명의 프로테아제와 본 발명의 작용제의 또 다른 효소 사이에 존재한다. 상승 작용 효과는 상이한 효소 사이에 발생할 뿐만 아니라, 본 발명의 작용제의 다른 성분과 하나 이상의 효소 사이에도 발생할 수 있다.

본 발명의 추가 대상은 본 발명의 작용제가 1개 이상의 공정 단계에서 사용되거나, 또는 본 발명의 프로테아제가, 특히 프로테아제가 40 ㎍ 내지 4 g, 바람직하게는 50 ㎍ 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 ㎍ 내지 2 g, 및 매우 특히 바람직하게는 200 ㎍ 내지 1 g의 양으로 사용되도록 하는 방식으로 1개 이상의 공정 단계에서 촉매적으로 활성을 띠는 것을 특징으로 하는, 직물 또는 하드 표면을 세정하는 방법이다.

이는 수동 및 자동 방법, 둘 모두를 포함하며, 자동 방법이 바람직하다. 직물을 세정하는 방법은 일반적으로 다중 방법 단계에서 세정 활성을 가지는 각종의 물질이 세정하고자 하는 품목에 적용되고, 접촉 기간 이후에는 세척된다거나, 또는 세정하고자 하는 품목이 또 다른 방식으로 세제 또는 상기 작용제의 용액 또는 희석액으로 처리된다는 점에서 주목할 만하다. 직물 이외의 다른 모든 물질, 특히 하드 표면을 세정하는 방법에 동일하게 적용된다. 모든 가능한 세척 또는 세정 방법은 본 발명의 세제 또는 세정제, 또는 본 발명의 프로테아제를 사용함으로써 방법 단계 중 1개 이상에 보충될 수 있고, 이어서, 상기 방법은 본 발명의 실시양태를 나타낸다. 본 발명의 프로테아제 및 그를 함유하는 작용제에 대해 기술된 모든 요소, 대상, 및 실시양태는 또한 본 발명의 이러한 대상에도 적용될 수 있다. 그러므로, 이 시점에서 상응하는 지점에서 상기 개시내용은 명백하게 참조되며, 상기 개시내용 또한 본 발명의 상기 방법에 적용된다는 점에 주목한다.

본 발명의 프로테아제는 이미 가수분해 활성을 가지고 있고, 다르게는 세정력이 없는 매질, 예컨대, 단순 완충제 중에서도 잘 발현되기 때문에, 상기 방법 중 개별 단계 및/또는 오직 한 단계가 바람직하게는 완충 용액 중 또는 물 중에서 본 발명의 프로테아제를 임의적으로 유일의 활성 세정 성분으로서 얼룩과 접촉시키는 것으로 이루어질 수 있다. 이는 본 발명의 상기 대상의 또 다른 실시양태를 나타낸다.

본 발명의 상기 대상의 대체 실시양태는 또한 본 발명의 프로테아제가 1개 이상의 공정 단계에서 활성을 띠는, 직물 원료 처리, 또는 직물 관리 방법을 나타낸다. 본원에서는 천연 성분을 포함하는 직물 원료, 섬유, 또는 직물, 및 매우 특히 울 또는 실크를 가지는 것에 대한 방법이 바람직하다.

본 발명의 추가 대상은 특히 프로테아제가 40 ㎍ 내지 4 g, 바람직하게는 50 ㎍ 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 ㎍ 내지 2 g, 및 매우 특히 바람직하게는 200 ㎍ 내지 1 g인 양으로 사용되도록 하는, 직물 또는 하드 표면 세정을 위한 본 발명의 작용제의 용도, 또는 직물 또는 하드 표면 세정을 위한 본 발명의 프로테아제의 용도이다.

본 발명의 프로테아제 및 그를 함유하는 작용제에 대해 기술된 모든 요소, 대상, 및 실시양태는 또한 본 발명의 이러한 대상에도 적용될 수 있다. 그러므로, 이 시점에서 상응하는 지점에서 상기 개시내용은 명백하게 참조되며, 상기 개시내용 또한 본 발명의 상기 방법에 적용된다는 점에 주목한다.

실시예

모든 분자 생물학적 방법은 예를 들어, 프리츠(Fritsch), 삼브루크(Sambrook), 및 마니아티스(Maniatis)에 의한 매뉴얼인 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989], 또는 유사한 관련 연구에서 명시된 바와 같은 표준 방법, 또는 유사 관련 연구를 따른다. 효소 및 키트는 특정 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.

실시예 1: 프로테아제 제조

서열 1에 따른 아미노산 서열을 가지는 프로테아제로부터 출발하여, "퓨전 사이트-디렉티드 뮤타제네시스 키트(PHUSION Site-Directed Mutagenesis Kit)" (핀자임(Finnzyme), F541)에 의해 프로테아제를 코딩하는 핵산에서 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 본 발명의 프로테아제 변이체를 제조하였다. 상기와 같이 수행함으로써 명시된 아미노산 위치에 대한 코돈은 변형되었고, 이로써, 아미노산 서열과 비교하여 명시된 바와 같이 아미노산 치환이 번역 동안에 발생하였다. 종래 방식으로 적합한 발현 벡터로 바실루스 서브틸리스 DB 104 (Kawamura and Doi (1984), J. Bacteriol., Vol. 160 (1), pp. 442-444)를 형질전환시킨 후, 이어서, 프로테아제 변이체를 발현하는 형질전환체를 배양함으로써 프로테아제 변이체를 발현시켰다. 프로테아제를 상응하는 배양물로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

프로테아제 변이체 V1 (참조 프로테아제): 서열 1에 따른 열거에서 아미노산 치환 R99E를 포함하는, 서열 1에 따른 아미노산 서열을 가지는 프로테아제 (서열 3).

프로테아제 변이체 V2 (참조 프로테아제): 서열 1에 따른 열거에서 아미노산 치환 S3T, V4I, R99E, 및 V199I를 포함하는, 서열 1에 따른 아미노산 서열을 가지는 프로테아제 (서열 4).

프로테아제 변이체 E1 (본 발명의 프로테아제): 서열 1에 따른 열거에서 아미노산 치환 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 포함하는, 서열 1에 따른 아미노산 서열을 가지는 프로테아제 (서열 2).

실시예 2: 높은 pH 및 고온에서의 안정성

프로테아제 V1, V2, 및 E1 (실시예 1 참조)을 60℃ 및 pH 10에서 온도 안정성에 관하여 시험하였다. 일정한 간격을 두고 AAPF 검정법에 의해 활성을 측정하였다. 선형화 후, 유사 1차 가정하에 반감기를 계산하였다.

t½ [min.] V1 V2 E1

60℃/pH 10 6.5 37 57

이로써, E1의 온도 안정성 또한 안정화된 프로테아제 V2와 비교하였을 때, 상당히 증가되었다는 것도 명백해졌다.

실시예 3: 계면활성제 존재하에서의 안정성

분자 V1, V2, 및 E1 (실시예 1 참조)을 50℃, pH 8에서, 및 1% 선형 알킬벤젠 술포네이트 (LAS)의 존재하에서 안정성에 관하여 시험하였다. 일정한 간격을 두고 AAPF 검정법에 의해 활성을 측정하였다. 선형화 후, 유사 1차 가정하에 반감기를 계산하였다.

t½ [sec] V1 V2 E1

60℃/pH 10 160 340 470

이로써, E1의 온도 안정성 또한 안정화된 프로테아제 V2와 비교하였을 때, 상당히 증가되었다는 것도 명백해졌다.

실시예 4: 계면활성제 매트릭스 중에서의 보관 안정성

활성 단백질 면에서 동일한, 정제된 프로테아제 E1, V2, 및 V1을 37℃에서 세제 매트릭스 중에 보관하고, AAPF 측정법에 의해 4주 후 그의 잔류 활성에 대해 측정하였다.

활성 [%] V1 V2 E1

37℃, 4주 5% 35% 45%

E1이 상당히 개선된 안정성을 갖는다는 것은 분명하다.

실시예 5: 세척 성능

얼룩 PC-10, 10N, C-03, EMPA 112, 및 C-05에 대한 소형화된 세척 시험에서 활성 단백질 면에서 동일한 프로테아제 V1 및 E1을 사용하였다. 이를 위해, 상응하는 얼룩을 세제 매트릭스 및 활성 단백질 함량이 동일한 상응하는 프로테아제 변이체의 존재하에 48-웰 마이크로타이터 플레이트에서 인큐베이션시켰다. 이와 관련하여, 세척 시험 후 얼룩의 탈색을 효소가 없는 블랭크와 비교하였다 (델타 L). 델타 L 값의 합계를 통해 하기와 같은 결과를 얻었다:

델타 L 합계 V1 E1

37 37

이는 E1이 유의적으로 감소된 세척 성능을 가지지 않음을 보여주는 것이다.

실시예 6: 자동 식기 세척용 세제에서의 세정 성능

밀레 GSL(Miele GSL) 식기 세척기에서 50℃ ("일반" 사이클) 및 21°dH [독일 경도]에서 IKW 방법에 따라 세정 성능을 측정하였다. 결과는 산술 평균으로 기록하였다. 값이 더 높은 것은 세정 성능이 더 우수하다는 것을 나타내었다. 제제 F1은 세정하는 데 40 g의 용량으로 사용하였다. F1의 조성은 하기 표 1로부터 얻을 수 있으며; 이 경우 정량 데이터는 활성 물질의 중량%로 제시되어 있고, 단, % AS (활성 물질)는 상표명과 함께 제시되어 있지는 않다.

<표 1>

40℃에서 0, 1, 및 4주 경과 후의 보관 안정성

IKW에 따른 세정 성능의 출발 값 (0주째)을 100%로서 사용하였고; 각 경우에 40℃에서 1주 또는 4주간 보관한 이후의 세정 결과는 출발 값을 참조하여 나타낸다. 프로테아제 E1이 프로테아제 V2보다 보관 안정성이 더 우수하였다. 프로테아제 E1이 프로테아제-감수성 얼룩 다짐육 및 아밀라제-감수성 얼룩 전분, 둘 모두에서 40℃에서 4주간 보관한 이후에도 유의적으로 더 우수한 세정 성능을 가졌다.

SEQUENCE LISTING <110> Henkel AG & Co. KGaA <120> Proteasevarianten mit erh?ter Stabilit? <130> PT031931_PCT <150> DE 10 2013 221 206.2 <151> 2013-10-18 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus lentus <400> 1 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Blap mutant <400> 2 Ala Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Glu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 3 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Blap mutant <400> 3 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Glu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 4 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Blap mutant <400> 4 Ala Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Glu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265

Claims (10)

1. 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 그의 전장에 걸쳐 가지며, 각 경우에 서열 1에 따른 넘버링에 기초하여 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제.
2. i. 모체 분자로서의 제1항에 따른 프로테아제로부터 단일 또는 다중 보존적 아미노산 치환에 의해 수득 가능하고, 그에 의해 프로테아제는 서열 1에 따라 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 갖고/거나;
   ii. 모체 분자로서의 제1항에 따른 프로테아제로부터 단편화에 의해, 또는 결실, 삽입, 또는 치환 돌연변이유발법에 의해 수득 가능하고, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267, 또는 268개 이상의 연속하는 아미노산 길이에 걸쳐 모체 분자와 매칭되는 아미노산 서열을 포함하고, 그에 의해 프로테아제는 서열 1에 따라 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 포함하고/거나;
   iii. 모체 분자로서의 제1항에 따른 프로테아제로부터 서열 1에 따른 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 프로테아제의 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 193, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255, 및 268번 위치에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 수득 가능하고, 그에 의해 프로테아제는 서열 1에 따라 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
3. 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 그의 전장에 걸쳐 갖는 원래의 프로테아제에서, 프로테아제가 상응하는 위치에 아미노산 3T, 4I, 99D/E, 188P, 및 199I, 바람직하게는 3T, 4I, 99E, 188P, 및 199I를 포함하도록 하는 방식으로, 서열 1의 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산을 치환을 포함하는 프로테아제를 제조하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 하기 공정 단계:
   a) 단일 또는 다중의 보존적 아미노산 치환을 도입함으로써, 그에 의해 프로테아제는 서열 1에 따라 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 포함하는 것인 단계;
   b) 단편화에 의해, 또는 결실, 삽입, 또는 치환 돌연변이유발법에 의해 아미노산 서열을 변형시켜 프로테아제가, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 또는 266개 이상의 연속하는 아미노산 길이에 걸쳐 모체 분자와 매칭되는 아미노산 서열을 포함하고, 그에 의해 프로테아제는 서열 1에 따라 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 포함하는 것인 단계;
   c) 서열 1에 따른 바실루스 렌투스로부터의 프로테아제의 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 193, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255, 및 268번 위치에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 단일 또는 다중의 아미노산 치환을 도입하고, 그에 의해 프로테아제는 서열 1에 따라 3, 4, 99, 188, 및 199번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환 S3T, V4I, R99D/E, A188P, 및 V199I, 바람직하게는 S3T, V4I, R99E, A188P, 및 V199I를 포함하는 것인 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 따른 프로테아제를 코딩하거나, 또는 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 수득된 프로테아제를 코딩하는 핵산.
6. 제5항에 따른 핵산을 함유하는 벡터, 특히 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
7. 제5항에 따른 핵산 또는 제6항에 따른 벡터를 함유하거나, 또는 제1항 또는 제2항에 따른 프로테아제를 함유하거나, 또는 제3항 또는 제4항의 방법에 따라 수득된 프로테아제를 함유하는 비-인간 숙주 세포, 특히 프로테아제를 숙주 세포 주변 배지로 분비하는 숙주 세포.
8. a) 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
   b) 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리시키는 단계를 포함하는, 프로테아제를 제조하는 방법.
9. 1개 이상의, 제1항 또는 제2항에 따른 프로테아제, 또는 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 수득된 프로테아제를 특히 작용제 1 g당 2 ㎍ 내지 20 mg인 양으로 함유하고/거나,
   1개 이상의, 제1항 또는 제2항에 따른 프로테아제, 또는 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 수득된 프로테아제를 함유하고, 작용제 중의 프로테아제는 실온에서 또는 물의 부재에서 프로테아제에 대해 불투과성인 물질에 케이싱된 것을 특징으로 하는 작용제, 특히 세제 또는 세정제.
10. 제9항에 따른 작용제가 1개 이상의 공정 단계에서 사용되거나, 또는 특히 프로테아제가 1회 사용당 40 ㎍ 내지 4 g인 양으로 사용되도록 하는 방식으로 제1항 또는 제2항에 따른 프로테아제, 또는 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 수득된 프로테아제가 1개 이상의 공정 단계에서 촉매적으로 활성을 띠는 것을 특징으로 하는, 직물 또는 하드 표면을 세정하는 방법.