KR20160060759A - 급성 신장 손상의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ｛4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시｝-아세트산 - Google Patents

Abstract

AKI(급성 신장 손상)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염. 약제 및 이의 약제학적 조성물.

Description

급성 신장 손상의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ｛4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시｝-아세트산{｛4-[5-(3-CHLORO-PHENOXY)-OXAZOLO[5,4-D]PYRIMIDIN-2-YL]-2,6-DIMETHYL-PHENOXY｝-ACETIC ACID FOR USE IN THE PREVENTION OR TREATMENT OF ACUTE KIDNEY INJURY}

본 발명은 급성 신장 손상(acute kidney injury, AKI)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 이의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 화합물 4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 제조 방법은 특허 출원 WO2011/086079에 기재되어 있다. 이 화합물은 S1P₁/EDG1 수용체에 대한 친화성을 갖는다.

이전에 "급성 신부전(acute renal failure)"으로 알려진 급성 신장 손상(AKI)은 혈청 크레아티닌(SCr)의 일시적 상승으로부터 무뇨 확정적 신부전(anuric definitive renal failure)에 이르는 범위까지의 임상 소견과 함께 다양한 환경(setting)에서 발생하고 있는 빈번하고 잠재적으로 심각한 장애이다. AKI는 전통적으로 혈청 크레아티닌의 증가에 의해 측정된 바와 같은 신장 기능의 급작스러운(48시간 이내) 감소로 기재되어 왔다. 최근의 KDIGO(Kidney Disease Improving Global Outcomes)는 하기에 열거된 실험실값 및 임상값에 기초한 진단 기준을 둘러싸고 확립된 합의에 대한 지침을 마련하고 있다(문헌[Working group of ERBP(European Renal Best Practice), 2012, NDT 27: 4263-4272]). AKI는 하기 중 어느 하나로서 정의되고 단계 지어진다.

● 48시간 이내에 0.3 mg/dL 이상(26.5 μmol/L 이상)으로의 SCr의 증가; 또는

● 사전 7일 이내에 발생한 것으로 알려져 있거나 추정되는, 기준선의 1.5배 이상으로의 SCr의 증가; 또는

● 6시간 동안 0.5 mL/kg/h 미만의 소변 부피.

AKI는 모든 입원 환자의 대략 7%에서 발생하고 있으며([Nash et al., 2002, Am J Kidney Dis 39: 930-936]), 사용된 정의에 따라 중증 환자들의 최대 36 내지 67%에서 발생하고 있다. 중도의 AKI는 모든 집중 치료실(Intensive Care Unit, ICU) 입원 건수의 4 내지 25%에서 발생하고 있으며, AKI를 갖는 ICU 환자들의 약 5%는 신장 대체 요법을 필요로 한다(Hoste et al. 2006, Crit Care 10: R73; Mehta et al., 2004, Kidney Int 66: 1613-1621; Uchino et al., 2005, Jama 294: 813-818; Uchino et al., 2006, Crit Care Med 34: 1913-1917; Ostermann et al., 2007, Crit Care Med 35: 1837-1843). AKI의 가장 일반적인 원인은 패혈증, 대수술, 혈량저하증 및 투약제이다. AKI의 발생에 대한 위험 인자에는 고령(75세 초과), 만성 신장 질병(CKD, eGFR(estimated Glomerular Filtration Rate, 추산 사구체 여과율) 60 mL/min/1.73 m² 미만), 죽상동맥경화성 말초 혈관 질병, 심부전, 간질병, 진성 당뇨병 및 신독성 투약이 포함된다.

예방적 전략 및 지원 조치에서의 진보에도 불구하고, AKI는 높은 이환율 및 사망률과 계속 관련 있는데, 이는 특히 ICU에 입원한 사람들에서 그러하며, ICU에서의 병원내 사망률은 50%를 초과할 수도 있다. 사망률에 더하여, 만성 신장 질병(CKD) 발생의 고위험 및 말기 신장 질병(end-stage renal disease, ESRD)의 조기 발생을 포함한 만성 결과가 있다(Hsu et al., 2009, Clin J Am SocNephrol 4: 891-898; Ishani et al., 2009, JASN 20: 223-228; Coca et al., 2009, Am J Kidney Dis 53: 961-973). 이환율은 또한 입원의 증가된 기간 및 증가된 비용과 관련되어 있다.

병인이 무엇이든 간에 AKI의 예방 및 치료에 대한 승인된 요법이 없기 때문에 명백한 미충족의 의학적 요구가 존재한다. 이러한 질환의 관리는 중도의 AKI를 갖는 환자에 대한 보호의 중심적 요소로서 신장 대체 요법(RRT)에 의해 주로 지원된다. 수화는 조영제 유발 신병증(contrast induced nephropathy, CIN)을 위한 가장 적절한 예방적 조치로 남아 있다.

스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 S1P_{1 -5}로 불리는 5개의 GPCR(G 단백질-결합 수용체)에 결합하는 지질 매개체이다(Brinkman et al., 2007, Pharmacol Ther 115: 84-105). 순환하는 S1P는 내피 세포, 혈소판 및 적혈구로부터 주로 기원하고, 알부민 및 HDL(High Density Lipoprotein, 고밀도 지질단백질) 내의 ApoM(아포지질단백질(Apolipoprotein) M)을 포함한 혈장 단백질에 고도로 결합되는 것으로 확인되었다(Hammad et al., 2012, J Lipids; Karuna et al., 2011, Atherosclerosis 219: 855-863). S1P₁은, 내피 세포, 면역 세포, 및 신장 상피 세포에서의 발현을 비롯하여 널리 발현된다. S1P₁은 내피 장벽 완전성(세포골격 재배열)의 유지, 세포 성장, 생존, 분화, 혈관생성 및 면역 세포 수송을 포함한 많은 생리학적 기능을 조절한다. S1P₁은 신장 수질에서 고도로 발현되는데(Zhu et al., 2011, Am J Physiol Renal Physiol 301: F35-F41), 이때 신장 수질은 소변 농축을 위하여 특별히 설계된 세뇨관-혈관 해부학에 의해 혈류 및 산소 공급이 제한되는 신장의 영역이다. 이 영역 내의 세포는 높은 산소 소비를 갖기 때문에, 수질은 특히 저산소 손상에 취약하다. 피질 세뇨관 손상은 수질 손상 및 근위 세뇨관 세포에 대한 직접적인 손상의 결과이다. S1P₁은 신장 허혈 재관류 손상 후에 상향조절되고(Awad et al., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524), 그의 활성화는 3가지 주요 기전에 의해 신장 기능을 보존하는 것으로 예상된다:

● 내피 장벽 기능의 유지. 이 장벽은 AKI에서 손상되어, 손상된 혈관 침투성 및 접착 특성으로 이어짐,

● 근위 세뇨관 상피 세포의 아폽토시스의 제한,

● 염증성 세포 침윤의 감소. AKI에서의 염증은 종종 세뇨관 상피 세포와 내피 장벽에 대한 복합된 손상의 결과이다.

내피 장벽 완전성을 조절하는 데 있어서의 S1P-S1P₁ 경로의 역할은 광범위하게 문서에 기재되어 왔다(Wang and Dudek, 2009, Microvasc Res 77: 39-45; Mc Verry and Garcia, 2005, Cell signalling 17: 131-139; Lucke and Levkau, 2010, Cell Phys Biochem 26: 87-96). S1P₁의 활성화는 PLC/Ca^{2 +}/FAK/pRac 경로 활성화를 통하여 내피 장벽 기능을 개선한다(Belvitch and Dudek, 2012, Microvasc Res 83: 22-30). HDL-ApoM 관련 S1P는 eNOS 활성화를 통해 내피 장벽 기능을 연장시키는 것으로 밝혀졌다(Wilkerson et al., 2012, JBC 287: 44645-44653; Christoffersen et al., 2011, PNAS 108: 9613-9618; Argraves et al., 2008, JBC 283: 25074-25081). 이에 관하여, 낮은 혈장 HDL 수준은 혈관 수술을 받은 환자에서의 AKI 발생 위험과 관련되어 왔다(Miller GJ and Miller NE.,1975, Lancet 1:16-19; Castelli WP, Garrison RJ, Wilson PW, et al.,1986, JAMA; 256:2835-2838).

S1P₁의 전체적 또는 내피-특이적 결손은 다수의 기관에 영향을 주는 대량 출혈로 인해 배아-치사를 유발한다(Kono et al., 2004, JBC 279: 29367-29373). S1P 생합성을 담당하는 효소(스핑고신 키나제 1 및 2)가의 결손된 녹아웃 마우스에서 동일한 결함이 관찰된다(Mizugishi et al., 2005, Mol Cell Biol 25: 11113-11121). 유사하게, S1P₁ 길항제가 또한 혈관 침투성을 증가시킨다. AKI 모델에서의 S1P₁ 기능적 길항제의 급성 보호 효과에도 불구하고(Bajwa et al., 2010, JASN 21: 955-965; Awad et al., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524), 이들 S1P₁ 기능적 길항제에 의한 만성 치료는 폐 손상 모델에서 혈관 누출을 극적으로 악화시키고 시험관내 내피 장벽 완전성을 파괴한다(Shea et al., 2010, Am J Respir Cell Mol Biol 43: 662-673). 유사한 내피 결함이 또한 S1P 부족 마우스에서 모방되었다(Camerer et al., 2009, JCI 119: 1871-1879).

환자 및 AKI 모델에서는, TNF-α와 같은 사이토카인이 내피 세포로부터 방출되고, 세뇨관-간질 실질 내로의 염증성 세포 침윤에 기여하는 ICAM-1, VCAM-1 및 P/E-셀렉틴과 같은 접착 분자를 상향조절한다(Bonventre et al., 2003, JASN 14: 2199-2210; Singbartl et al., 2000, Crit Care Med 28: 2507-2514; Sadik et al, 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81). 더욱이, 배양된 인간 내피 세포에서, 이들 내피 접착 분자 중 몇몇은 저산소증/재산소화 후에 상향조절된다(Lutz et al., 2008, J Mol Med 86: 1329-1339). S1P₁ 활성화는 이들 접착 분자를 하향조절하고, 이에 따라 염증성 세포 침윤을 감소시킨다(Lien et al., 2006, Kidney Int 69: 1601-1608). 급성 신장 손상에서 내피 기능을 보존하는 데 있어서의 S1P의 본질적인 역할은 마우스에서의 내피 S1P₁ 수용체의 조건적 결손을 사용하여 입증되어 왔다(Ham A., 2013, Kidney Int, Sept).

S1P₁의 자극은 Akt 인산화를 통한 내피 산화질소 합성효소(eNOS)를 활성화하는데, 이 효소는 NO의 생성을 통해 국소 혈관이완을 조절하는 핵심 효소이다(Morales-Ruiz et al., 2001, JBC 276: 19672-19677; Igarashi et al, 2000, JBC 275: 32363-32370; Igarashi et al, 2008, BBA 1781: 489-495). 따라서, S1P는 내피 및 NO-의존적 방식으로 혈관이완을 유발한다(Roviezzo et al., 2006, FASEB J 20: 340). NO는 I/R-유발 AKI의 동물 모델에서 신장 기능에 대한 보호 효과를 갖는다(Garcia-Criado et al, 1998, Transplantation 66: 982-990). 래트에서, eNOS 억제는 신장 혈류를 35% 감소시키며, 이와 함께, 결합된 GFR 감소 및 증가된 신장 혈관 저항을 갖는다(Cao et al, 2010, Am J Physiol Renal Physiol 299: F1056-F1064). S1P는 내피 산화질소의 가장 효과적인 활성화 인자 중 하나로서 간주되며, 이는 국소 혈류를 개선하는 것뿐만 아니라, 특히 취약한 피질-수질 영역에서, 혈소판 활성화 및 혈관의 응혈을 제한하는 것으로도 알려져 있다. 이 기전은 AKI 동안 신장 기능을 보존하는 데 중요할 수 있다. 중요한 것은, 감소된 산화질소 생체이용률이 심폐 우회술(CPB) 및 패혈증 환자에서 AKI와 관련되어 있다는 것이다(Lema et al., 2009, J Cardio Thorac Vasc Anesth 23:188-194; Sadik et al., 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81). 흥미롭게도, 심폐 우회술을 받은 심장 수술 환자에서 인간 eNOS 프로모터에서의 786C 다형성이 감소된 전사 활성을 나타내고 신장 기능장애와 관련된다(Popov et al., 2009, Eur J Cardio-Thorac Surgery 36: 651-656; Nakayama et al., 1999, Circulation 99: 2864-2870). 다형성 빈도는 약 50%이고, AKI 발생 위험이 더 높을 뿐만 아니라, 예컨대 S1P₁의 활성화를 통해, 국소 NO 수준을 회복하는 치료제에 대한 반응이 더 높은 유의한 하위집단을 나타낼 수 있다.

더욱이, S1P₁의 활성화는 pERK 및 pAkt 생존 경로를 활성화함으로써 근위 세뇨관 상피 세포의 아폽토시스를 직접적으로 제한한다. 근위 세뇨관 상피 세포에서의 S1P₁의 특이적 결손은 허혈-재관류 손상 후에 신장 기능장애를 악화시킬 뿐만 아니라(Bajwa et al., 2010, JASN 21: 955-965), 세뇨관 괴사도 악화시키는데, 이는 내인성 S1P의 정상상태(tone)가 재관류 손상의 중증도를 완화시킨다는 것을 분명히 보여준다. 이들 데이터는 내피 및 상피 축 둘 모두에 대한 AKI에서의 S1P-S1P₁ 시스템의 보호 역할의 중요성을 강조한다.

S1P는 S1P₁ 활성화를 통해 림프절로부터의 혈액으로의 림프구의 배출을 담당한다. 이러한 S1P₁ 활성화는 수용체 내재화에 이어서 다시 세포 표면으로의 수용체의 재순환을 야기하여 재활성화를 가능하게 한다. 그러나, S1P₁ 기능적 길항제 또는 길항제는 내재화된 S1P₁ 수용체를 다시 세포 표면으로 재순환하는 것을 억제하거나 S1P₁ 활성화를 차단함으로써 림프구감소증을 야기하고, 이에 따라 세포 표면 S1P₁의 대폭적이고 지속적인 감소를 야기하는 것으로 여겨진다. 결과적으로, 이들 길항제는 전임상적으로 및 임상적으로 관찰되는 바와 같이 혈액 림프구의 크고 지속적인 하락을 보여준다.

몇몇 보고서는 T 림프구가 급성 신장 손상에 기여함을 보여준다. 손상이 T 세포의 결손에 의해 개선되고 CD4+ T 세포의 입양 전달과 함께 재구성된다는 관찰이, 그것이 CD4+ T 세포에 의존적이라는 증거이다(Burne et al., 2001, J. Clin Invest 108: 1283-1290; Ysebaert et al., 2004, Kidney Int 66: 491-496). 따라서, 핀골리모드(fingolimod) 및 SEW2871을 포함한 S1P₁ 기능적 길항제가 림프구감소 용량으로 급성 신장 손상 모델에서 보호작용을 한다는 것은 놀라운 일이 아니다(Lien et al., 2006, Kidney Int 69: 1601-1608).

그러나, 림프구감소증은 기회성 감염에 대한 소인성 요인(predisposing factor)인데, 이는 특히, 매우 민감한 쇠약한 환자, 예컨대 높은 AKI 위험에 있는 환자(고령, 심장 질병, 당뇨병 및 만성 신장 질병)에서 그러하다. 결과적으로, 제한된 림프구감소증, 또는 최상의 경우에는 비 림프구감소증(non lymphopenia)을 유발하고, AKI의 치료에서 치료적 유용성을 갖는 선택적 S1P₁ 효능제(agonist)에 대한 필요성이 있다. 의외로, 화합물 4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 그것이 비 림프구감소성인 용량에서 포유류에서 AKI 보호를 야기한다는 사실에 의해, 다른 S1P₁ 조절제와 상이하다. 4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산의 이러한 특성은, 최소한의 기능적 길항작용 또는 탈감작화 효과와 함께, S1P₁ 수용체에서의 그의 편향된 효능작용(agonism)과 관련될 수 있는 것으로 여겨진다. 이는 AKI의 치료에서의 4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산의 사용에 대해 유의한 임상 안전성 이점을 나타낼 것이다.

본 발명은 AKI(급성 신장 손상)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

본 발명은 또한 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것으로, 여기서 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 AKI 보호 용량이 투여될 때에는 림프구감소증을 유발하지 않고 더 높은 용량이 투여될 때에는 제한된 림프구감소증을 유발한다.

본 발명은 또한 AKI의 예방 또는 치료에서 비 림프구감소제로서 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

본 발명은 또한 AKI 보호 용량이 투여될 때 비 림프구감소 효과 없이 AKI의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

본 발명은 또한 전술된 바와 같이 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것으로, 여기서 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 비 림프구감소성 용량이 투여될 때 AKI 보호를 나타낸다.

본 발명은 또한 AKI(급성 신장 손상)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것으로, 여기서 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 수용체 탈감작화를 유발하지 않는 선택적 S1P₁ 효능제이다.

본 발명은 또한 AKI(급성 신장 손상)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것으로, 여기서 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 AKI 보호 용량에서 비 림프구감소성인 선택적 S1P₁ 효능제이다.

본 발명은 또한 AKI의 예방 또는 치료에서 림프구감소 효과 없이 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 AKI의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 활성 성분으로서의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 제조 물품에 관한 것으로, 본 제조 물품은

- 패키징 재료;

- 활성 성분으로서의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물; 및

- 환자가 본 약제학적 조성물에 의해 AKI에 대해 치료될 수 있음을 표시하는, 패키징 재료 내에 들어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물(package insert)을 포함한다.

본 발명은 또한 AKI의 치료를 필요로 하는 환자에서 AKI를 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 상기 환자에게 치료적 유효량의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 AKI의 치료를 필요로 하는 환자에서 AKI를 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 상기 환자에게 치료적 유효량의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하며, {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 비 림프구감소 효과를 갖지 않는다.

본 발명은 또한 AKI의 치료를 필요로 하는 환자에서 AKI를 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 상기 환자에게 치료적 유효량의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하며, {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 AKI 보호 용량이 투여될 때 비 림프구감소 효과를 갖지 않는다.

본 발명은 또한 AKI의 치료를 필요로 하는 환자에서 AKI를 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 상기 환자에게 치료적 유효량의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하며, 치료는 예방적이다.

본 발명은 또한 제조 물품에 관한 것으로, 본 제조 물품에서 패키징 재료 내에 들어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물은 환자가 림프구감소 효과 없이 상기 언급된 약제학적 조성물에 의해 AKI에 대해 치료될 수 있음을 표시한다.

본 발명은 또한 제조 물품에 관한 것으로, 본 제조 물품에서 패키징 재료 내에 들어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물은 환자가 림프구감소 효과 없이 상기 언급된 약제학적 조성물에 의해 AKI에 대해 치료될 수 있음을 표시하고, 치료는 예방적이다.

정의

편의상 그리고 가독성을 위하여, 화합물 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 본 명세서의 장(chapter)에서 그리고 도면에서 "화합물 A"로 재명명되었다.

본 발명을 위하여, 하기의 용어가 그에 맞추어 이해되어야 한다:

- 선택적 S1P₁ 효능제는 다른 4개의 S1P 수용체, S1P_{2 -5}에 비하여 S1P₁에 대해 더 강력한 화합물이다. 게다가, 본 화합물은 광범위한 수용체, 효소 및 이온 채널 검정에서 최소한의 활성 또는 무활성을 가져야 한다.

- 림프구감소증은 면역 시스템에서 중요한 기능을 갖는 백혈구인 혈액 림프구의 비정상 하락을 갖는 질환이다. 성인에서는, 1,500개 세포/마이크로리터 미만의 림프구 수준이 진단적이고(질환을 입증하고), 소아에서는, 3,000개 세포/마이크로리터 미만의 림프구 수준이 진단적이다.

S1P₁ 활성화에 의해 매개된 림프구감소증은 S1P₁ 조절제를 사용함으로써 야기된 림프구감소 질환을 지칭한다. S1P는 림프절로부터 혈액으로의 림프구의 S1P₁-매개 배출을 담당하기 때문에, S1P₁ 조절제는 내재화된 S1P₁ 수용체를 다시 세포 표면으로 재순환하는 것을 억제하거나 S1P₁ 활성화를 차단함으로써 림프구감소증을 야기하는 것으로 여겨진다.

- 제한된 림프구감소증은 혈액 림프구의 일시적 감소(절대 림프구 카운트가 치료 전에 정상 범위 밖에 있음)이다. 일시적이란, 림프구 수의 잠시 동안의 변화를 지칭하는 것으로, 이러한 변화는 24시간 또는 48시간 이내에 정상 범위로 되돌아온다.

- 비 림프구감소성 또는 무림프구감소증은 혈액 림프구의 일시적 또는 지속적 감소의 결여(절대 림프구 카운트가 치료 전에 정상 범위 밖에 있음)를 지칭한다. 일시적이란, 림프구 수의 잠시 동안의 변화를 지칭하는 것으로, 이러한 변화는 24시간 이내에 정상 범위로 되돌아오는 반면, 지속적이란, 24시간을 넘어서 지속되는 감소를 지칭한다.

- AKI 보호 용량: 적어도 30%의 혈장 크레아티닌의 유의한 감소를 제공하는 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산의 용량.

- 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 치료적 유효량은 AKI에 대해 효과를 생성하는 약제학적 화합물, 예컨대 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산의 양을 의미한다.

- 환자는 인간 환자를 의미한다.

- 예방적이란, 원치 않는 효과에 대해 방지 또는 보호하는 역할을 하는 것이며, 의학적 질환, 특히 질병이 발생되는 것을 방지하고자 하는 것이다.

제1 구현예는 AKI의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 AKI 보호 용량에서 비 림프구감소성이다.

제2 구현예는 AKI의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서 보호 효과는 림프구감소증의 유발 없이 S1P₁ 활성화에 의해 매개된다.

또 다른 구현예는 전술된 바와 같은 제조 물품이며, 패키징 재료 내에 들어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물은 상기 언급된 약제학적 조성물에 의해 치료를 받는 환자가 림프구감소증의 유발 없이 AKI에 대해 치료될 수 있음을 표시한다.

약어

AKI 급성 신장 손상

ApoM 아포지질단백질 M

CIN 조영제 유발 신병증

CKD 만성 신장 질병

DMSO 디메틸설폭사이드

ERBP 유럽 신장 모범 실무(European Renal Best Practice)

eGFR 추산 사구체 여과율

eNOS 내피 산화질소 합성효소

ESRD 말기 신장 질병

FlipR 형광 이미징 플레이트 리더

GPCRs G 단백질-결합 수용체

HDL 고밀도 지질단백질

HDMEC 인간 진피 미소혈관계 내피 세포(Human Dermal Microvascular Endothelial Cell)

HSC 간 성상 세포(Hepatic Stellate Cell)

ICU 집중 치료실

I/R 허혈/재관류

KDIGO 세계 신장병 예후 개선 위원회(Kidney Disease Improving Global Outcome)

PBS 인산염 완충 식염수

RRT 신장 대체 요법

S1P 스핑고신-1-포스페이트

S1P₁ 스핑고신-1-포스페이트 1

SCr 혈청 크레아티닌

s.e.m 평균 표준 오차

실시예

하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하며 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 편의상 그리고 가독성을 위하여, 화합물 4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산은 도면 및 결과에서 "화합물 A"로 재명명되었다.

통계학적 분석 및 p 값 계산을 수행하였으며, 실험 조건에 따라 도면에서 "*" 또는 "#" 기호로 표시되어 있다.

도 1: 래트 허혈- 재관류 (I/R) 모델에서 화합물 A 및/또는 BAF -312의 단회 또는 반복 투여의 효과. 피셔(Fischer) 래트에 모의 수술(sham surgery) 또는 25분 양측 신장 동맥 폐색을 실시하고, 24시간 재관류 후에 혈장 크레아티닌을 측정하였다. (도 1a) 폐색 1시간 전에 제공된 0.3, 1 및 3 mg/kg p.o.로 화합물 A를 평가하였다. (도 1b) 폐색 1시간 전에 제공된 3, 10 및 30 mg/kg p.o.로 BAF-312를 평가하였다. 화합물이 없는 대조군에는 폐색 1시간 전에 비히클을 제공하였다. *** p<0.001 I/R-비히클군 대 모의군. # p<0.05; ## p<0.01 화합물 처리군 대 비히클군. 막대(bar)는 평균 +/- s.e.m이다. (도 1c) 신장 샘플을 수집하여 래트 I/R 손상 후의 피질 알부민 함량에 대한 화합물 A의 효과를 평가하였다. 모의-수술받은 래트, I/R-비히클-처리된 래트 또는 I/R-화합물 A(3 mg/kg p.o.)-처리된 래트로부터의 대표적인 신장의 피질 영역에서 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 알부민을 측정하였다. (도 1d) 화합물 A(3 mg/kg p.o.) 또는 비히클을 5일 동안 일일 2회 투여하였다. 마지막 투여는 폐색 1시간 전에 제공되었다. ** p<0.01 I/R-비히클군 대 모의군. ### p<0.001 화합물 A 처리군 대 비히클군. 막대는 평균 +/- s.e.m이다.

도 2: 마우스에서의 횡문근융해증-유발 AKI 손상에 대한 화합물 A의 효과. 수컷 CD1 마우스에 8 mL/kg으로 글리세롤(PBS 중 50% v/v)을 (뒷다리) 근육내 주사하기 1시간 전에 화합물 A(0.3, 1, 3 및 10 mg/kg) 또는 비히클을 경구 투여하였다. 모의군은 상응하는 부피의 PBS를 투여받았다. 혈장 크레아티닌을 24시간 후에 평가하였다. ** p<0.01 글리세롤-비히클군 대 모의군. # p<0.05 화합물 A 처리군 대 비히클군. 막대는 평균 +/- s.e.m이다.

도 3: 단회 투여 후의 피셔 래트에서의 말초 혈액 림프구(도 3a) 또는 단회 투여 후의 스프라그 -돌리(Sprague- Dawley ) 래트에서의 말초 혈액 림프구(도 3b) 또는 반복 투여 후의 스프라그 -돌리 래트에서의 말초 혈액 림프구(도 3c). 피셔 래트에는 1, 3, 10 및 30 mg/kg으로, 또는 스프라그-돌리 래트에는 3 mg/kg으로 화합물 A를 경구 투여하였다. 피셔 래트에는 1 및 10 mg/kg으로, 또는 스프라그-돌리 래트에는 3 mg/kg으로 BAF-312를 경구 제공하였다(n=8). 반복 투여 프로토콜에서는, 5일 동안 b.i.d로 화합물을 투여하였다. 혈액 림프구는 곡선 아래 면적(AUC)으로(도 3a) 또는 매 시점에서의 총 백혈구의 백분율로(도 3b/3c) 표현되고, 평균 +/- s.e.m으로 나타낸다. ** p<0.01 대 기준선. (도 3d) 피셔 래트에서의 AKI 보호와 림프구감소증 사이의 관계. 3 mg/kg의 화합물 A의 경우 림프구감소증의 부재 및 완전한 AKI 보호를 나타내는 반면, BAF-312는 림프구감소를 나타내고 부분 AKI 보호를 보여주는 박스에 주목한다.

도 4: C57Bl6 /J 마우스에서의 말초 혈액 림프구. 화합물 A를 1, 3, 10 및 30 mg/kg p.o.로 투여하였다 (n=8). 매 시점에서의 혈액 림프구는 총 백혈구의 백분율로 표현되고 평균 +/- s.e.m으로 나타낸다. *** p<0.001 대 기준선.

도 5: 비글개(beagle dog)에서의 말초 혈액 림프구. 기준선 림프구 카운트를 얻고, 이어서 개들에게 3, 10 및 30 mg/kg의 화합물 A(n=8), 또는 10 mg/kg의 BAF-312(n=4)의 단회 경구 용량을 투여하였다. 동물들을 7일 동안 모니터링하였으며(도 5a), BAF-312의 경우에는 최대 66일 동안 모니터링하였다(도 5b), * p< 0.05; ** p<0.01; *** p<0.001 대 기준선. 막대는 평균 +/- s.e.m이다. 화합물 A는 3 mg/kg 투여 동안 측정된 시점 중 어디에서도 어떠한 유의한 림프구감소증도 유발하지 않았음에 주목한다.

도 6: 건강한 C57Bl6 /J 마우스 및 피셔 래트에서의 폐 혈관 누출. 마우스를 화합물 A(3 및 10 mg/kg p.o. b.i.d.), BAF-312(1 및 3 mg/kg p.o. b.i.d.) 및 핀골리모드(0.1 및 1 mg/kg p.o. b.i.d.)로 7일 동안 처리하였다(n=5 내지 8). (도 6a) 에반스 블루 혈관외유출(Evan's blue extravasation)을 사용하여 평가된 혈관 침투성. (도 6b) 폐 중량. 래트를 7일 동안 화합물 A(1, 3, 10, 30 및 100 mg/kg p.o. b.i.d.) 및 BAF-312(0.03, 0.1, 0.3, 3 및 30 mg/kg p.o. b.i.d.)로 처리하였다. (도 6c) 에반스 블루 혈관외유출을 사용하여 평가된 혈관 침투성. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001 대 마우스의 경우 대조군(화합물 없음) 또는 래트의 경우 비히클(물 중 메틸셀룰로스 0.6% - tween 80 0.5%). 막대는 평균 +/- s.e.m이다.

도 7: 임피던스 검정을 사용한 인간 진피 미소혈관계 내피 세포(HDMEC)에 대한 S1P ₁ 수용체 탈감작화 . HDMEC를 S1P(1 μM), 핀골리모드(100 nM) 또는 화합물 A(1 μM)를 사용하여 1시간 동안 첫 번째로 자극한 후, 30분간 세척하였다. S1P(3개의 농도)의 두 번째 자극을 사용하고 얻어진 임피던스를 측정하여 수용체 탈감작화에 대한 첫 번째 자극의 효과를 평가하였다(n=3의 실험). 첫 번째 자극의 모든 농도는 EC₉₀ 초과였다. 막대는 +/- s.e.m을 의미한다.

도 8: 임피던스 검정을 사용한 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 S1P ₁ 수용체 탈감작화 . HUVEC를 S1P(1 μM), 화합물 A(1 μM), 핀골리모드(100 nM) 또는 SEW2871(1 μM)을 사용하여 1시간 동안 첫 번째로 자극한 후, 30분간 세척하였다다. S1P(4개의 농도)의 두 번째 자극을 사용하여 얻어진 임피던스를 측정하여 수용체 탈감작화에 대한 첫 번째 자극의 효과를 평가하였다(n=3의 실험). 첫 번째 자극의 모든 농도는 EC₉₀ 초과였다. 막대는 +/- s.e.m을 의미한다.

도 9: FlipR 검정을 사용한 S1P ₁ (G-융합)을 과발현하는 CHO 세포에 대한 S1P ₁ 수용체 탈감작화 . (도 9a) 이 프로토콜은 지시된 농도의 S1P(100 nM), 화합물 A, 핀골리모드, BAF-312, 포네시모드(ponesimod)에 의한 5분간의 첫 번째 자극을 수반하였다. 첫 번째 자극의 모든 농도는 EC₉₀ 초과이도록 선택하였다. 변동하는 세척 기간 후에, S1P(100 nM)에 의한 두 번째 자극을 사용하여 수용체 탈감작화를 평가하였다. (도 9b) 베이스 반응의 백분율로 표현된 S1P-유발 FlipR 반응이 변동하는 세척 기간에 따라 각각의 화합물에 대해 표시되어 있다(15 내지 60분, n=4의 실험). 막대는 평균 +/- s.e.m이다.

도 10: FlipR 검정을 사용한 인간 간 성상 세포( HSC )에서의 S1P ₁ 수용체 탈감작화 . (도 10a) 이 프로토콜은 화합물 A(10 μM) 또는 BAF-312(300 nM)에 의한 첫 번째 자극을 수반하였다. 첫 번째 자극의 모든 농도는 EC₉₀ 초과이도록 선택하였다. 1시간 또는 3시간의 세척 기간 후에, 동일한 화합물에 의한 두 번째 자극을 사용하여 수용체 탈감작화를 평가하였다. (도 10b) 형광 단위로 표현된 화합물 A 또는 BAF-312 유발 FlipR 반응이 변동하는 세척 기간에 따라 각각의 화합물에 대해 표시되어 있다(n=3의 실험). 막대는 평균 +/- s.e.m이다.

도 11: C57Bl6 /J 마우스에서의 I/R 손상 후의 혈장 S1P의 시간-경과. 가짜 수술 후에 또는 22분 양측 신장 동맥 폐색 후에 재관류를 행한 후, 혈장 S1P 수준(에켈론(Echelon)으로부터의 엘리사(Elisa) 키트)을 평가하였다. 대조군(CTRL)은 수술을 받지 않았다. ### p<0.001 대 모의군(시간-쌍 형성(time-paired)). * p<0.05; ** p<0.001; *** p<0.001 대 대조군(CTRL). 막대는 평균 +/- s.e.m이다.

방법

재료:

핀골리모드 및 SEW2871는 구매 가능하다. BAF-312 및 포네시모드는 공개된 방법에 따라 합성하였다:

● BAF-312에 대해서는 WO04/103306,

● 포네시모드에 대해서는 WO05/054215.

화합물 A는 WO2011/086079 문헌에 기재된 방법에 따라 합성하였다.

모든 생체내 연구는 실험실용 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 공동체 표준(European Community Standards on the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행하였으며 사노피 리서치 앤드 디벨럽먼트(Sanofi Research & Development)의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)에 의해 승인받았다.

통계학적 분석:

평가된 파라미터에 대한 차이를 평가하기 위하여, 분포의 정규성 및 변량의 동질성에 기초하여(레벤(Levene) 검정), 스튜던트(Student) 검정 또는 윌콕슨(Wilcoxon) 검정을 사용하여 모의군/대조군을 비히클 처리군과 대비하였다. 이어서, Everst＠t V6 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 이원 ANOVA를 실행하여 비히클 처리군을 화합물 처리군(들)과 대비하였다. 이러한 1차 분석 후에는 적절한 경우에 더넷(Dunnett) 사후 검정을 행하였다. 변량의 비-동질성의 경우에, 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정을 적용하였다. p<0.05인 경우에 집단들 사이의 차이가 유의한 것으로 간주하였다.

1. 심혈관 기능 안전성

a) hERG 검정

인간 ERG(ether-a-go-go 관련 유전자) 칼륨 채널을 발현하는 재조합 CHO(Chinese Hamster Ovary, 중국 햄스터 난소) 세포주(Cytomyx 카탈로그 번호: CYL3002)를 하기 프로토콜에 따라 배양하였다. 필요한 경우, 냉동된 분취물로부터 배양을 재시작하였다. 냉동된 세포의 분취물(1 mL)을 37℃까지 급속히 가온하고 먼저 75 cm² 플라스크(Corning사) 내에서 리플레이팅하였다(replated). 이어서, 10% 우태아 혈청(fetal calf serum)을 함유하는 α-최소 필수 배지(Minimum Essential Medium)(Gibco 32571-028)를 사용하여 부피를 10 mL로 조정하였다. 배지를 24시간 후에 새로 교체하였으며, 1% 게네티신(G418, Gibco 10131)을 첨가하여 세포 유도를 방지하였다. 2일 또는 3일 후에, T25 플라스크에 의해 세포를 1.5x10⁶개 세포로 시딩하였다. 플라스크들을 1시간 동안 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에 두었으며; 그 후에 이들을 2일 동안 28℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에 두었다. 세포 단리에 대한 절차를 28℃에서의 2일의 인큐베이션 후에 수행하였다. 세포를 Accumax(Sigma사; 1:4) 또는 Versene(Gibco사)로 수거하고 세포외 배지에 위치시켰다.

세포에 세포외 용액 PATCH(NaCl, 138 mM; KCl, 4 mM; CaCl₂, 1.8 mM; MgCl₂, 1 mM; 글루코스, 5.6 mM, HEPES, 10 mM)를 표면관류하였다(superfuse). NaOH를 사용하여 pH를 7.3으로 조정하였다. 몰랄 삼투압 농도(osmolarity)를 285 mOsm으로 조정한다. 내부 용액을 다음과 같이 제조하였으며: KCl, 60 mM; KF, 70 mM; NaCl, 15 mM; HEPES, 5 mM; EGTA(K), 5 mM; KOH를 사용하여 pH를 7.25로 조정하였다. 몰랄 삼투압 농도를 290 mOsm으로 조정하였다.

hERG 전류를 -80 mV의 유지 전위로부터 +20 mV의 시험 전위로 전압 스텝들(2초)에 따라 활성화한 후 -100 mV까지 재분극을 행하였다. 전압 스텝들을 20초 간격으로 적용하였다. -100 mV에서의 테일 불활성화 전류(tail deactivating current)로서 hERG 전류를 측정하였다. 기준선 측정을 위한 3분의 기간 후에, 용액의 변화 후 4 내지 6분째에 화합물 A의 효과를 측정하였다. 각각의 실험의 종료 시점에서는, 10 μM 농도의 특이적 hERG-차단제, 즉 리스페리돈(이는 약 0.7 μM의 IC₅₀을 나타냄)을 표면관류하여 hERG의 100% 억제를 측정할 수 있게 하였다.

데이터베이스 및 분석 소프트웨어 DataXpress 1.0(Axon Instruments/Molecular Devices사)을 사용하여 전류를 분석하였다. 전류의 선형 런다운(linear rundown)을 기준선 측정 기간으로부터 외삽하였으며, 약물 효과 후의 hERG 전류 억제의 백분율을 다음과 같이 계산하였다:

hERG 전류 억제의 백분율(%) = 100 - [((I - I_{리스페리돈})/(I_기준선 - I_{리스페리돈})) x 100].

여기서, "I"는 약물 효과 후에 측정된 전류이고, "I_{리스페리돈"}은 특이적 hERG-차단제의 효과 후에 측정된 전류이고, "I_기준선"은 약물의 표면관류 전에 측정된 전류였다.

b) 래빗 퍼킨제(Purkinje) 섬유 검정

단리된 래빗 퍼킨제 섬유(수컷, 뉴질랜드 래빗; 1.3 내지 1.5 kg; 9 내지 12 주령)로부터 기록된 휴지 막 전위 및 작동 전위 파라미터에 대한 화합물 A의 효과를 미세전극 기법을 통해 평가하였다. 하기의 파리미터들을 측정하였다: 휴지 전위(RP, 단위 mV), 작동 전위 진폭(APA, 단위 mV), 작동 전위의 최대 상승 속도(V_max, 단위 V/s), 50 및 90%의 재분극에서의 작동 전위 지속시간(APD₅₀ 및 APD₉₀, 단위 ms). 섬유들에 하기를 함유하는 산소 생리학적 용액을 36±1℃에서 표면관류하였다(단위 mmol/L): NaCl, 120; KCl, 4; MgCl_{2 ,} 1; NaH₂PO₄, 1.8; NaHCO₃, 25; 글루코스, 11; CaCl₂, 1.8; pH = 7.4. 화합물 A를 먼저 DMSO 중에 용해시켜 12 mmol/L 스톡 용액을 수득하였다. 이 용액을 DMSO 중에 추가로 희석시키고, 이어서 생리학적 용액 내로 첨가하여 0.3, 1, 3, 10 및 30 μmol/L(즉, 각각 0.1, 0.5, 1.4, 4.5 및 13.6 μg/mL의 활성 성분)의 적절한 공칭 농도를 수득하였다. 시험 제형 내의 DMSO의 최종 농도를 생리학적 용액 중에 0.25% (v/v)로 일정하게 유지하였다. 퍼킨제 섬유(n=4)를 먼저 생리학적 용액으로 표면관류하였다. 30분의 제어 기간 후에, 증가하는 농도로 시험 화합물을 평가하였는데, 증가하는 농도는 매 30분마다 순차적으로 적용하였다. 각각의 시험된 농도에 대해, 섬유들을 초당 1 펄스(1 Hz)의 베이스 속도로 자극하였다. 게다가, 자극 속도를 초당 1 펄스(1 Hz)로부터 3분 동안 매 4초당 1 펄스(0.25 Hz)로 감소시키고, 1분 동안 초당 1 펄스로 다시 증가시키고, 마지막으로 (19분째와 25분째 사이에) 추가 2분 동안 초당 3 펄스(3 Hz)로 증가시켰는데, 이는 하기에 기재된 바와 같다:

작동 전위의 재분극 단계(repolarization phase) 동안 비정상인 전기적 사건의 발생을 유리하게 하기 위하여 그리고 조기 후탈분극(Early After Depolarization, EAD)의 발생을 용이하게 하기 위하여 낮은 자극 속도를 사용하였다. 사용-의존성 나트륨 채널 차단을 평가하기 위하여 높은 자극 속도를 사용하였다. 최고 농도 후에, 생리학적 용액을 다시 표면관류하여 약물 효과(세척)의 가역성을 평가하였다.

c) 개 원격측정(telemetry) 연구

이 연구의 목적은 의식있는 원격측정 처리된 개에서 투여 후 24시간 기간에 걸쳐 심혈관 기능(혈압, 심박수 및 ECG)에 대한 화합물 A의 잠재성 효과를 평가하는 것이었다.

의식있는 자유롭게 움직이는 개(Marshall Farms사, n = 4, 수컷 2 마리 및 암컷 2 마리, 6.9 내지 10.8 kg 체중 및 44 내지 64 개월)에게 음성 대조 물품(즉, 경구 경로를 위한 0.5% (w/w) 하이드록시에틸셀룰로스 / 0.6% (w/w) 폴리소르베이트 80의 수용액, 또는 20% Captisol의 수용액, pH 7.5 내지 8)의 경구 또는 정맥내 용량을 투여한 후, 음성 대조 물품 중의 현탁액으로서의 경구 경로를 위한 30 및 100 mg/kg의, 또는 음성 대조 물품 중의 용액으로서의 i.v. 경로를 위한 10 및 30 mg/kg의 화합물 A를 투여하였는데, 이는 각각의 투여 사이에 적어도 4일의 세척 기간(경구 경로에 대해서 또는 경정맥 내로의 30분 주입에 대해서 5 mL/kg)을 갖는 상승 용량 연구 설계에 따라 행해졌다. 동맥 혈압 및 리드 II ECG 신호(미국 소재의 Data Science사로부터의 송신기)를 투여 전 대략 2시간부터 투여 후 24시간까지 각각의 처리 일자에 연속적으로 기록하였다. 다음 파라미터들을 몇몇 시점에서 분석하였다: 동맥 혈압(수축기 혈압, 확장기 혈압, 및 평균 혈압), 심박수, RR, PQ(=PR), QT 간격 지속시간 및 QRS 복합체 지속시간의 심전도 파라미터, 및 체온. 프리데리시아(Fridericia) 식 및 반 데 바테르(van de Water) 식에 따라 QT 간격을 심박수 변동에 대해 보정하였다. 전체 ECG 신호를 투여 후 30분부터 6시간까지 임의의 조율 장애(rhythm disturbance) 및 파형 형태에 대해 비트 대 비트로 검사하였다. 각각의 처리 일자에, 임상 관찰을 수행하였다. 비디오 기록을 검토하여 잠재적인 육안상 행동 변화 및 심혈관 파라미터에 대한 잠재적인 간섭을 확인하였다. 투여 후, 분석을 위한 시점들은 다음과 같았다: 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16 및 24시간.

2. 내피 장벽 완전성에 대한 차별성

a) 마우스에서의 폐 혈관 누출 연구

수컷 C57Bl6/J 마우스(n = 5 내지 8, 25 내지 30 g)(프랑스 소재의 Charles River Laboratory사)를 3 및 10 mg/kg의 화합물 A 또는 1 및 3 mg/kg의 BAF-312, 0.1 및 1 mg/kg의 핀골리모드 또는 10 mL/kg의 투여 부피 이내의 비히클 물품(물 중 메틸셀룰로스 0.6% - tween 80 0.5%)으로 7일 동안 일일 2회 경구 처리하였다. 각각의 집단 내에 포함된 마우스의 수는 5 내지 8마리였다. 7일 후에, 케타민(100 mg/kg) 및 자일라신(10 mg/kg) 혼합물의 i.p. 주사를 사용하여 마우스를 마취하였다. 에반스 블루를 1 mL/kg에서의 15 mg/kg으로 경정맥에 i.v. 주사하였다. 10분 후에, 생리학적 혈청을 좌심실에 의해 주사하여 잔류하는 혈관내 에반스 블루로부터 몸을 헹구었다. 폐 조직을 수집하고 칭량하고, 이어서 24시간 동안 순수 포름아미드 용액 중에 침지하여 조직 내 에반스 블루를 추출하고, 이에 따라 혈관 침투성을 평가하였다. 에반스 블루 농도를 표준 곡선을 사용하여 630 nM에서 평가하고 폐 중량으로 정규화하였다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

b) 래트에서의 폐 혈관 누출 연구

수컷 피셔 래트(n = 4 내지 8, 280 내지 350 g)(프랑스 소재의 Charles River Laboratory사)를 화합물 A(1, 3, 10, 30 및 100 mg/kg), BAF-312(0.03, 0.1, 0.3, 3 및 30 mg/kg) 또는 2 mL/kg의 투여 부피 이내의 비히클 물품(물 중 메틸셀룰로스 0.6% - tween 80 0.5%)으로 7일 동안 일일 2회 경구 처리하였다. 7일 후에, 펜토바르비탈(50 mg/kg)의 i.p. 주사를 사용하여 래트를 마취하였다. 에반스 블루를 1 mL/kg에서의 30 mg/kg으로 안구 후방동(retro-orbital sinus)에 i.v. 주사하였다. 15분 후에, 생리학적 혈청을 좌심실에 의해 주사하여 잔류하는 혈관내 에반스 블루로부터 몸을 헹구었다. 폐 조직을 수집하고 칭량하고, 이어서 24시간 동안 순수 포름아미드 용액(4 mL/g 조직 중량) 중에 침지하여 조직 내 에반스 블루를 추출하고, 이에 따라 혈관 침투성을 평가하였다. 에반스 블루 농도를 표준 곡선을 사용하여 630 nM에서 평가하였다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

3. 림프구감소 활성에 대한 차별성

a) 래트 림프구감소증 연구

수컷 스프라그-돌리 래트(n = 8, 250 내지 350 g)(프랑스 소재의 Charles River Laboratory사)에게 3 mg/kg의 화합물 A, 3 mg/kg의 BAF-312 또는 2 mL/kg의 투여 부피 이내의 비히클 물품(물 중 메틸셀룰로스 0.6% - tween 80 0.5%)을 경구 투여하였다. 2가지 프로토콜을 사용하였다: 단회 투여 또는 5일간 연속 일수 동안 반복 b.i.d. 투여. 혈액학적 분석에 대해 화합물 투여(반복 프로토콜의 경우 마지막 투여) 후 2, 6 및 24시간째에 혈액을 수집하여 전혈 림프구 카운트를 결정하였다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

수컷 피셔 래트(n = 8, 250 내지 350 g)(프랑스 소재의 Charles River Laboratory사)에게 화합물 A(1, 3, 10 및 30 mg/kg), BAF-312(1 및 10 mg/kg) 또는 2 mL/kg의 투여 부피 이내의 비히클 물품(물 중 메틸셀룰로스 0.6 % - tween 80 0.5%)을 단회 경구 투여하였다. 혈액학적 분석에 대해 화합물 투여 후 2, 6 및 24시간째에 혈액을 수집하여 전혈 림프구 카운트를 결정하였다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

b) 마우스 림프구감소증 연구

수컷 C57Bl6/J 마우스(n = 8, 25 내지 30 g)(프랑스 소재의 Charles River Laboratory사)에게 1, 3, 10 및 30 mg/kg의 화합물 A 또는 10 mL/kg의 투여 부피 이내의 비히클 물품(물 중 메틸셀룰로스 0.6 % - tween 80 0.5%)을 단회 경구 투여하였다. 혈액학적 분석에 대해 화합물 투여 후 2, 6 및 24시간째에 혈액을 수집하여 전혈 림프구 카운트를 결정하였다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

c) 개 림프구감소증 연구

의식있는 자유롭게 움직이는 개(Marshall Farms사, n = 8, 10.5 내지 14.3 kg 체중)에게 음성 대조 물품(즉, 0.5% (w/w) 하이드록시에틸셀룰로스 / 0.6% (w/w) 폴리소르베이트 80의 수용액)의 경구 용량, 또는 음성 대조 물품 중의 현탁액으로서의, 3, 10 및 30 mg/kg의 화합물 A 또는 10 mg/kg의 BAF-312를 투여하였는데, 이는 각각의 투여 사이에 적어도 7일의 세척 기간(5 mL/kg)을 갖는 상승 용량 연구 설계에 따라 행해졌다. 혈액학적 분석을 위하여 두 화합물 모두에 대해 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 48 및 168시간째에(그리고 BAF-312에 대해서는 최대 66일까지) 혈액을 수집하여 전혈 림프구 카운트를 결정하였다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

4. 시험관내 약리학

a) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, Chem 세포 및 HSC에서의 칼슘 동원(FlipR) 검정

1. CHO 세포

화합물 A, BAF-312 및 핀골리모드의 활성을 CHO 세포에서 hS1P₁-G-융합 작제물에 의한 Flp-In 안정 형질감염에 대해 시험하였으며(독점적), hS1P₂- 및 hS1P₃- G-융합 작제물에 대해서는 선택적으로 시험하였다(독점적). 세포주 생성은 WO2011/086079에 기재되어 있다.

이들 화합물에 의한 S1P₁ 수용체의 활성화를, 인간 S1P₁ 수용체가 안정하게 과발현된 CHO 세포(Flp-In 시스템, Invitrogen사)의 사용에 의한 세포-기반 칼슘 형광 검정에서의 S1P₁ 수용체-관련 칼슘 방출에 대한 그들의 효과에 의해 정량화하였다. G-단백질 커플링을 강화시키고 Ca^{2 +} 방출을 향해 신호전달을 안내하기 위하여, 과발현된 수용체는 개질된 G-단백질(Gα_i4qi4)의 C-말단 서열을 추가로 가졌다(WO 02/04665). 형광 이미징 플레이트 판독기(FlipR, Molecular Dynamics사)에서의 칼슘-감수성 염료 fluo-4(Invitrogen사)에 의한 형광 측정에 의해 세포내 칼슘의 변화를 결정하였다.

인간 S1P₁ 수용체를 안정하게 과발현하는 CHO 세포를 실험 전 대략 18 내지 24시간에 흑색 투명-바닥 폴리-D-리신-코팅된 96웰 플레이트(Becton Dickinson, Biocoat Cellware사) 내에 시딩(seeding)하였다(웰당 40.000개). 1 % (vol/vol) 페니실린/스트렙토마이신(PAN, #P06-07100), 10% (vol/vol) 우태아 혈청(FCS; Hyclone 목탄 / 덱스트란 처리된 FBS #SH30068) 및 hygromycinB(Invitrogen, #10687-010) 300 mg/L(최종 농도)로 보충된 F-12 glutamax 배지(Gibco #31765)를 기반으로 한 세포 배양 배지 내에서 37 ℃, 5% 이산화탄소 및 95% 습도의 인큐베이터 내에서 세포를 성장시켰다.

FlipR 실험 전에, 수산화나트륨으로 pH 7.5로 조정된, 2 μM(모든 데이터는 최종 농도에 대해 주어짐)의 fluo-4 AM, Pluronic® F-127 0.05% (vol/vol) (Invitrogen, #P-3000MP), HEPES 20 mM(Gibco #15630), 프로베네시드 2.5 mM(Sigma #P-8761) 및 소혈청 알부민(BSA) 0.05%(Sigma #A-6003)로 보충된 행크 평형 염 용액(Hanks' Balanced Salt Solution)(HBSS; Invitrogen #14065049)으로 이루어진 염료-로딩 완충액 중에서 37℃, 5% 이산화탄소 및 95% 습도의 인큐베이터 내에서 60분 동안 fluo-4 아세톡시메틸 에스테르(fluo-4 AM, Invitrogen, #F14202)를 세포에 로딩하였다. 세포 로딩 동안, fluo-4 AM은 세포내 에스테라제에 의해 절단되어 세포 내에의 염료 fluo-4의 포획을 초래한다. 세포 세척기(Tecan Power washer) 내에서, 앞서 명시되었지만 fluo-4 AM 및 BSA는 함유하지 않은 완충액으로 3회 세포를 세척함으로써 로딩을 종결하였다. 후자의 완충액을 또한 후속 세포 형광 측정에서 완충액으로서 사용하였다.

이어서, 염료-로딩 및 세척된 세포를 DMSO 중의 용액(DMSO의 0.3% vol/vol 최대 최종 농도)으로서 첨가된 다양한 농도로의 각각의 화합물들로, 또는 각각의 농도에서의 DMSO 중 S1P(100 nM 최종 농도) 단독(양성 대조군)으로 자극하였다. S1P 수용체를 활성화한 화합물은 내부 저장으로부터의 세포내 칼슘의 방출로 이어졌으며, 그 결과 fluo-4 형광 신호의 일시적인 큰 증가가 있었는데, 이 신호는 대략 3분에 걸쳐 모니터링되었다. 시험 화합물에 의해 야기된 퍼센트 활성화를 S1P 양성 대조군에 대한 최대 형광 반응과 대비하여 최대 형광 반응으로부터 결정하였다. 모든 형광값을 DMSO 단독으로 사전-인큐베이션되고 S1P(기준선 대조군)로 처리되지 않은 세포에 대해 얻어진 기준선 형광값에 대해 보정하였다. 모든 측정은 3회 반복하여 실행하였다. 다양한 농도에서의 활성화로부터, EC₅₀ 값을 계산하였다.

2. Chem 세포

Millipore사로부터의 GPCR Profiler® 검정을 사용하여 S1P₁, S1P₂, S1P₃, S1P₄ 또는 S1P₅ 수용체에 대한 화합물 A, BAF-312 및 핀골리모드의 EC₅₀ 활성을 결정하였다. 이들 검정은 ChemiScreen GPCR 안정 세포주를 사용하였다.

3. HSC

인간 HSC(Sciencell사)를 96 멀티웰 플레이트(100 μL/웰) 내에 웰당 25x10³개 세포로 시딩하고, 1% 보충제(Sciencell SC5352) 및 2% FCS를 함유하는 완전 배지(Sciencell SC5301) 중에서 24시간 동안 접착되게 하였다. 추가 24시간 기간을 위하여 2% FCS는 함유하지만 보충제는 함유하지 않는 Sciencell 배지로 배양 배지를 대체하였다. 세포를 세척하고, 100 μL의 검정 완충액(HBSS, 0.8 mM MgSO₄, 20 mM Hepes, 3.3 mM Na₂CO₃, 1 mM CaCl₂, 10% BSA) 중에 넣었다. 암소에서 37℃에서 1시간 동안 플루론산의 존재 하에서 fluo 4-AM을 세포에 로딩하였다. 로딩 배지를 제거하고 200 μL/웰의 검정 완충액으로 대체하였다. 세포를 암소에서 실온에서 20분 동안 안정되게 하였다. 배양 플레이트를 FlipR 기기 내에 넣고, 화합물 A 또는 BAF-312를 50 μl의 부피 미만으로 첨가하였으며(5X 용액, 최종 농도 10 μM), 칼슘 형광을 6분 동안 연속적으로 기록하였다. 탈감작화 실험을 위하여, 화합물 A 또는 BAF-312의 첫 번째 주입 후에, 배양 플레이트를 1회 세척하고 검정 완충액 중에서 1 또는 3시간 동안 회복되게 한 후, 화합물 A 또는 BAF-312의 두 번째 첨가를 행하였다. 대조 실험을 위하여, 화합물 A 또는 BAF-312의 첫 번째 주입을 검정 완충액으로 대체하였으며, 화합물 A 또는 BAF-312에 의한 두 번째 주입을 참조로 간주하였다. 결과는 형광 단위(FU)로 표현되어 있다.

b) β-아레스틴 검정

DiscoverX사로부터의 PathHunter® β-아레스틴 검정을 사용하여 S1P₁, S1P₂, S1P₃, S1P₄ 또는 S1P₅ 수용체에 대한 화합물 A, BAF-312 및 핀골리모드의 EC₅₀ 활성을 결정하였다. 이들 화합물을 0.5% FBS를 함유하는 검정 배지 내에서 시험하였다.

c) GTPγS 검정

이 방법은 WO2011/086079에 기재되어 있다.

d) 내재화 검정

DiscoverX사로부터의 PathHunter® 활성화 GPCR 내재화 검정을 사용하여 S1P₁ 수용체에 대한 화합물 A, BAF-312 및 핀골리모드의 EC₅₀ 활성을 결정하였다. 이들 화합물을 0.5% FBS를 함유하는 검정 배지 내에서 시험하였다.

e) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 및 HUVEC에서의 cAMP 검정

1. CHO 세포

DiscoverX사로부터의 Hit Hunter® cAMP 검정을 사용하여 S1P₁에 대한 화합물 A, BAF-312 및 핀골리모드의 EC₅₀ 활성을 결정하였다. 이들 화합물을 0.5% FBS를 함유하는 검정 배지 내에서 시험하였다.

2. HUVEC (Human Umbilical Venous Endothelial Cell, 인간 제대 정맥 내피 세포)

화합물 A, BAF-312 또는 핀골리모드에 따른 사이클릭 AMP를 cAMP HTRF® 키트(Cisbio사)에 의해 포스콜린(Forskolin)-처리된 HUVEC 세포에서 평가하였다. 간략히 말하면, HUVEC(Lonza사)를 백색 96 멀티웰 플레이트(절반 부피) 내에 EGM2 배지(Lonza사) 중에 24시간 동안 웰당 5x10³개 세포로 시딩하였다. 실험의 시작 시에, EGM2 배지를 Hepes(10 mM), BSA(0.1%) 및 IBMX(0.5 mM)를 함유하는 HBSS로 이루어진 검정 완충액으로 대체하였다. 세포를 15분 동안 회복되게 하였다. 화합물 A, BAF-312 또는 핀골리모드(10 nM 내지 100 μM)를 15분 동안 세포에 첨가한 후, 포스콜린(FSK, 10 μM)을 첨가하였다. 45분의 FSK 처리 후에, 1시간 동안 MAb 항-cAMP-크립테이트 및 cAMP-D2를 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 인큐베이션의 종료 시점에서, 형광을 판독하고(Envision, Perkin Elmer사), 검정 키트 프로토콜에 따라 FRET 비를 계산하였다. 로지스틱 방정식 모델에 따라 Sanofi BIOST＠T-SPEED 소프트웨어를 사용하여 화합물 A, BAF-312 또는 핀골리모드(EC₅₀)의 효력을 계산하였다.

f) (베이스 조건 하에서의 또는 투니카마이신 시험투여 후의) RPTEC 세포 검정에서의 Akt 및 ERK_{1 /2} 인산화

RPTEC 세포(Lonza사)를 6개의 멀티웰 플레이트 내에 24시간 동안 웰당 2 mL의 완전 REBM/REGM 배지(Lonza사) 중에 웰당 0.3x10⁶개 세포로 시딩하였다. 세포를 900 μL의 정지 배지(quiescent medium) 중에 추가 24시간 기간 동안 혈청과 함께 기아상태에 두었다. 37℃에서 10분 동안 각각의 웰 내 100 μL의 부피 미만으로 화합물 A의 증가하는 농도(10X)를 첨가하였다. 사용될 때, 투니카마이신(100 μL)은 화합물 A의 첨가 30분 전에 첨가하였다. 배지 제거 후에, 세포를 차가운 PBS로 헹구고, 1% 트리톤, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 100 μL의 차가운 RIPA 완충액 중 얼음 상에서 용해시켰다. 웨스턴 블로팅을 위하여, 30 μg의 총 단백질 용해물을 4 내지 12% 비스-트리스 겔(Invitrogen사) 중에 로딩하였다. 이동 및 전달 후에, 니트로셀룰로스 막을 항 포스포-Akt(포스포-Ser473, Cst #9271) 및 항 포스포-Erk_{1 /2}(포스포-Tyr202/Tyr204, Cst #4377)로 프로빙하였다. 항 α-튜불린(Cst #2144)으로 표지화한 튜불린을 필름의 덴시토메트리 분석 후에 정규화에 사용하였다.

g) (기아 하에서의) HUVEC 세포 검정에서의 Akt 및 ERK_{1 /2} 인산화

HUVEC 세포(Lonza사)를 6개의 멀티웰 플레이트 내에 24시간 동안 웰당 2 mL의 완전 EGM2 배지(Lonza사) 중에 웰당 0.3x10⁶개 세포로 시딩하였다. 세포를 900 μL의 정지 배지 중에 추가 24시간 기간 동안 혈청을 사용하여 기아상태에 두었다. 37℃에서 10분 동안 각각의 웰 내 100 μL의 부피 미만으로 화합물 A, BAF-312 또는 핀골리모드의 증가하는 농도(10X)를 첨가하였다. 배지 제거 후에, 세포를 차가운 PBS로 헹구고, 1% 트리톤, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 100 μL의 RIPA 완충액 중 얼음 상에서 세포를 용해시켰다. 웨스턴 블로팅을 위하여, 30 μg의 총 단백질 용해물을 4 내지 12% 비스-트리스 겔(Invitrogen사) 중에 로딩하였다. 이동 및 전달 후에, 니트로셀룰로스 막을 항 포스포-Akt(포스포-Ser473, Cst #2965) 및 항 포스포-Erk_{1 /2}(포스포-Tyr202/Tyr204, Cst #4377)로 프로빙하였다. 항 α-튜불린(Cst #2144)으로 표지화한 튜불린을 필름의 덴시토메트리 분석 후에 정규화에 사용하였다.

h) 투니카마이신-유발 아폽토시스 검정

RPTEC에서의 투니카마이신(TN)-유발 아폽토시스에 대한 화합물 A의 효과를 Caspase-Glo 3/7 검정 키트(Promega사)에 의해 측정하였다. 간략히 말하면, RPTEC 세포(Lonza사)를 96 멀티웰 백색 플레이트 내에 REGM(REBM 배지 + 0.5% FCS + Single quot, Lonza사) 중에 웰당 30x10³개 세포로 시딩하고, 24시간 동안 접착되게 하였다. 24시간 후, 완전 배지를 혈청 및 보충제 무함유 배지(56 μL/웰)로 대체하였다. 세포를 화합물 A(최종 농도 0.3 내지 30 μM, 7 μL)에 의해 30분 동안 사전-처리한 후, 투니카마이신(TN, 최종 농도, 0.1 μg/mL, 7 μL)을 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂에서 24시간 후에, 70 μL의 Caspase-Glo 시약을 첨가하고, 배양 플레이트를 1시간 동안 진탕 하에 두었다. Envision 판독기(Perkin Elmer사)에 의해 발광을 기록하였다. 결과는 TN-유발 아폽토시스의 퍼센트 억제로 표현되어 있다.

i) 부착 분자의 TNF-α 유발 과발현 검정

ELISA에 의해 HUVEC에서 ICAM-1, VCAM-1 및 P/E-셀렉틴 발현을 측정하였다. HUVEC 세포를 96 멀티웰 플레이트 내에 EGM2 배지(Lonza사) 중에 100 μL 부피 미만으로 웰당 25x10³개 세포로 시딩하고, 24시간 동안 접착되게 하였다. 24시간 후, 완전 배지를 3시간 동안 정지 배지(보충제 및 혈청을 함유하지 않는 EGM2)로 대체하였다. 이후에, 세포를 18시간 동안 화합물 A 또는 BAF-312(1-30 μM)로 사전-처리하였다. 이어서, 세포를 추가 6시간 기간 동안 성장-인자들 무함유 배지 중에서 TNF-α (3 ng/mL)로 처리하였다. 배지를 제거하고, 세포를 4 ℃에서 20분 동안 웰당 100 μL의 RLC2 용액(Alphelys #01-RLC2-RTU30)으로 세척하고 고정하였다. 고정된 세포를 100 μL의 HBSS로 2회 세척한 후, 1시간 동안 항체 항-ICAM-1(#BBA3, R&D System사), 항-VCAM-1(#BBA5, R&D System사) 및 항-P/E-셀렉틴(#BBA1, R&D system사)을 첨가하였다. 광범위한 세척 후, 항-마우스 IgG HRP(#NA931, Amersham사)를 2시간 동안 첨가하였다. 세척 및 HRP 기질(OPD, Sigma #P9187)의 첨가 후에 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였다(Envision). 결과는 TNF-α유발 부착 분자 발현의 퍼센트 억제로 표현되어 있다.

j) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 및 내피 세포에서의 임피던스 측정 검정

1. CHO 세포

CEREP사로부터의 임피던스 검정을 사용하여 S1P₁에 대한 화합물 A, BAF-312 및 핀골리모드의 EC₅₀ 활성을 결정하였다.

2. 내피 세포

인간 진피 미소혈관계 내피 세포(HDMEC) 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 둘 모두에 대한 S1P₁ 수용체 탈감작화를 모니터링하기 위해 화합물 A, BAF-312, 핀골리모드, SEW2871 및 S1P(양성 대조군으로 사용됨)를 형상 변화에 대한 그들의 효과에 대해 농도-의존적으로 시험하였는데, 이때 형상 변화는 전기 임피던스의 변화에 의해 검출된다(X-celligence 시스템). 일수 1에, 1차 세포를 웰당 20,000개의 세포로 콜라겐-I로 사전-코팅된 96웰 e-플레이트 내로 시딩하였다. 24시간의 접착 및 증식 후에, HDMEC 및 HUVEC를 S1P(1 μM), 화합물 A(HDMEC에 대해서는 1 μM; HUVEC에 대해서는 0.1, 1, 10 μM), BAF-312(단지 HUVEC에서만 1, 10, 100 nM), 핀골리모드(HDMEC에 대해서는 100 nM; HUVEC에 대해서는 1, 10, 100 nM) 또는 SEW2871(단지 HUVEC에서만 0.1, 1, 10 μM)로 1시간 동안 첫 번째로 자극하였다. S1PR 효능제와 함께 인큐베이션한 후에, 세포를 배지로 2회 조심스럽게 세척한 후, 5.5시간의 회복 기간이 뒤따랐다. 증가하는 S1P 농도(0.1, 1 및 10 μM)의 두 번째 자극을 사용하고 얻어진 임피던스를 측정하여 수용체 탈감작화에 대한 앞서의 첫 번째 자극의 효과를 평가하였다. 모든 측정은 적어도 3회 반복하여 행하였다. 첫 번째 자극의 모든 농도는 HDMEC에서 EC₉₀ 초과였다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 임의의 임피던스 단위로 표현되어 있다.

5. 생체내 약리학

a) 신장 허혈 재관류(I/R) 손상의 래트 모델

수컷 피셔 래트(n = 3 내지 9, 250 내지 300 g)(프랑스 소재의 Charles River Laboratory사)에게 0.3, 1 및 3 mg/kg의 화합물 A, 또는 3, 10 및 30 mg/kg의 BAF-312 또는 2 mL/kg의 투여 부피 이내의 비히클 물품(물 중 메틸셀룰로스 0.6% - tween 80 0.5%)을 신장 허혈 1시간 전에 경구 투여하였다. 제2 세트의 실험에서는, 화합물 A를 5일 동안 b.i.d. 투여하여 잠재적인 타키필락시스(tachyphylaxis)를 평가하였다. 간단히 말하면, 동물들에 모의 수술(즉, 개복술, 신장 동맥 분리) 또는 펜토바르비탈(50 mg/kg i.p.) 마취 하에서의 25분 양측 신장 동맥 폐색을 실시하였다. 수술 절차를 표준화하고 개체간 변동성을 제한하기 위해 체온(37℃ 내지 38℃) 및 수화(생리학적 혈청의 복막 주사)를 조심스럽게 모니터링하였다. 허혈 기간의 종료 시점에서, 클램프를 제거함으로써 신장을 재관류하고, 근육 및 피부 봉합 계획 전에 재관류의 질을 제어하였다(불량한 재관류를 갖는 동물은 즉시 제외시켰다). 24시간 후에, 혈액 및 신장을 수집하였다. 생화학적 분석기(P400, 프랑스 소재의 Horiba사)를 사용한 크레아티닌 평가를 위하여, 혈액을 원심분리하고(3000 g, 10분) 헤파린 첨가된 혈장을 냉동시켰다. 하나의 신장은 조직 알부민(항-알부민, Santa Cruz사) 및 조직 HSP70(Santa Cruz #SC32239로부터의 단일클론 항-HSP70 항체) 평가를 위하여 웨스턴 블롯 분석을 위해 냉동시키고, 다른 하나는 5 μm 두께 슬라이스에 대한 조직학적 분석(고전적인 헤마톡실린-에리트로신-사프란, 변형된 마슨의 트리크롬(modified Masson's trichrome) 및 과요오드산-시프(periodic acid-Schiff) 회합 블루 알신을 사용한 급성 세뇨관 괴사 정량화) 및 면역조직화학 분석(Acris #BM4000으로부터의 단일클론 항-CD68 항체에 의한 대식세포 염색, 및 Santa Cruz #SC1506으로부터의 단일클론 항-PECAM 항체에 의한 모세혈관 염색; VMS Inc.사의 Ventana robot을 사용함)을 위하여 고정시키고(10% 중성-완충화된 포르말린) 및 파라핀-포매하였다. 급성 세뇨관 괴사는 신장 피질-수질 영역 내의 12 내지 15개의 필드에서 세포 괴사를 나타낸 세뇨관의 백분율로 표현되어 있다. CD68 및 PECAM 면역표지화는 전체 절단면 상의 양의 픽셀 카운트(positive pixel count)(Aperio 알고리즘)의 백분율로 표현되어 있다. 혈장 크레아티닌은 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

b) 횡문근융해증-유발 신장 손상의 마우스 모델

스위스(Swiss)(CD1) 수컷 마우스(n = 5 내지 15, 13 내지 14 주령)(프랑스 소재의 Charles River Laboratory사)에게 0.3, 1, 3 및 10 mg/kg의 화합물 A 또는 10 mL/kg의 투여 부피 이내의 비히클 물품(물 중 메틸셀룰로스 0.6% - tween 80 0.5%)을 글리세롤 주사 1시간 전에 경구 투여하였다. 글리세롤(PBS 중 50% v/v) 또는 비히클 물품(PBS)의 근육내 주사를 펜토바르비탈(33 mg/kg) 및 케타민(40 mg/kg) 마취 하에서 8 mL/kg으로 뒷다리 내로 실시하였다(각 다리, 비복근 및 대퇴직근마다 2회 주사). 생화학적 분석기(P400, 프랑스 소재의 Horiba사)를 사용한 크레아티닌 평가를 위하여, 24시간 후에, 혈액을 수집하고, 원심분리하고(3000 g, 10분), 헤파린 첨가된 혈장을 냉동시켰다. 결과는 평균 +/- s.e.m으로 표현되어 있다.

결과

본 발명에 따른 화합물, 즉 화합물 A는 AKI 상황에서의 그의 활성, 및 S1P₁ 기능적 길항제를 능가하는 그의 차별성을 입증하기 위하여 다양한 시험관내 및 생 체내 실험의 대상이었다.

1- 심혈관 기능 안전성

화합물 A가 기능적 길항작용이 결여된 S1P₁ 효능제이긴 하지만, 잠재적인 표적-기반 우려사항은 S1P₁ 기능적 길항제와 유사할 수 있다. 지금까지의 최대의 임상 경험은 혼합 S1P_{1 /3/4/5} 화합물인 핀골리모드에 대해 발생되어 왔는데, 이는 방실 차단 및 서맥을 유발한다(Schmouder et al., 2006, J ClinPharmacol 46: 895-904). 이들 심독성 소견에서의 S1P₃의 관련에 관한 많은 전임상 증거가 있으며, 이에 따라 당업계는 이들 제한을 극복하기 위하여 선택적 S1P₁ 화합물을 확인하는 방향으로 움직여 왔다. 그러나, 뒤따라서 임상 단계에 들어가는 선택적 S1P₁ 화합물은 서맥을 또한 유발하는 것으로 나타나는데(Gergely et al., 2012, BJP 167: 1035-1047), 하지만 방실 차단에 대한 이들의 영향은 현재 알려져 있지 않다. 따라서, 화합물 A의 잠재적인 심독성을 평가하기 위해 통상의 연구에 더하여 다수의 연구를 실행하였다. hERG 검정에서, 화합물 A에 대한 IC₅₀은 30 μM 초과였다. 래빗 퍼킨제 섬유 검정에서는, 0.3 μM부터 10 μM까지 시험된 화합물 A에 대해 유의한 효과가 없었지만, 작동 전위의 단축이 26 μM에서 관찰되었다.

심박수 또는 방실 차단 또는 임의의 다른 ECG 파라미터에 대한 영향이, 개 원격측정 연구에서, 30 또는 100 mg/kg p.o. 및 10 또는 30 mg/kg i.v.(30분에 걸친 주입)에서 관찰되지 않았다. 두 용량 모두에서 혈압의 유의한 변화가 없었다.

2- 생체내 신장 약리학

신장 허혈 재관류(I/R) 손상의 래트 모델을 사용하여 환자에서 심장 수술 후에 발생되는 신장 손상을 모방하였다. 이 모델에서, 화합물 A는 AKI의 중증도를 현저히 감소시켰는데(85 내지 90%), 이는 혈청 크레아티닌(임상적으로 검증된 바이오마커)의 상승을 제한함으로써 반영된 바와 같다(도 1a는 5개의 독립된 연구를 나타낸다). 이 효과는 용량-의존적이고 1 및 3 mg/kg p.o.에서 통계학적으로 유의하였다(도 1a). 조직학적 분석은 화합물 A가 알부민 혈관외유출을 방지하고(도 1c) 모세혈관을 보존함으로써 혈관계에 대해 직접적인 효과를 가졌음을 보여주었다. 화합물 A는 또한 괴사로부터 신장 근위 세뇨관을 보호하였으며, 대식세포 침윤을 감소시켰으며, 신장 HSP70 단백질(신장 허혈 손상 후 회복과 관련된 마커)을 증가시켰다. 화합물 A는 단회 투여와 비교하여 5일간의 반복된 BID 투여 후에 유사한 활성이 유지되었기 때문에(도 1d), 타키필락시스의 징후를 보여주지 않았다.

횡문근융해증은 환자에서의 AKI의 또 다른 유의한 원인이며, 글리세롤의 근육내 주사에 의해 마우스에서 재현된다. 글리세롤은 미오글로빈의 방출과 함께 점진적인 근육 손상 및 후속으로의 신장 기능장애를 유발한다. I/R 모델에서 관찰된 바와 같이, 화합물 A는 이 모델 (n=3의 독립적인 연구)에서 신장 기능의 저하를 현저히(10 mg/kg p.o으로 약 85%) 그리고 용량-의존적으로 방지하였다(도 2).

신장 허혈 재관류 모델에서 S1P₁-선택적 기능적 길항제인 BAF-312와 화합물 A의 효과를 비교하였다. BAF-312는 시험관내 검정(내피 검정을 포함함 - 표 1 참조)에서 대부분의 S1P₁에서 적어도 10배 더 강력하고, 래트에서 화합물 A와 유사한 혈장/신장 노출을 갖는다. 그러나, BAF-312의 개선된 효력/노출 특성에도 불구하고, 최대 30 mg/kg p.o.의 용량에서조차도 허혈 재관류 모델에서 혈청 크레아티닌의 40% 초과의 감소를 보여주지 못했다(도 1b).

3- 림프구감소 활성에 대한 차별성

S1P는 S1P₁ 활성화를 통해 림프절로부터의 혈액으로의 림프구의 배출을 담당한다. 이러한 S1P₁ 활성화는 수용체 내재화에 이어서 다시 세포 표면으로의 수용체의 재순환을 야기하여 재활성화를 가능하게 한다. 그러나, S1P₁ 기능적 길항제(핀골리모드, BAF-312)는 내재화된 S1P₁의 분해를 야기하며, 이에 따라 세포 표면 S1P₁의 대폭적이고 지속적인 감소를 야기한다. 결과적으로, S1P₁ 기능적 길항제는 전임상적으로 그리고 임상적으로 관찰된 바와 같이 혈액 림프구의 크고 지속적인 하락을 보여준다(Mandala et al., 2002, Science 296: 346-349; 문헌Gergely et al., 2012, BJP 167: 1035-1047).

예측되는 바와 같이, BAF-312는 래트에서 두드러지고(-80%) 지속적인 림프구감소증을 유발하였다(도 3a, 도 3b). 이는 1 mg/kg p.o.만큼 낮은 용량(시험된 최저 용량)에서조차도 명백하였다. 래트 AKI 모델에서 부분적으로 유효한 2개의 용량은 더 높은 용량이었으며(10 및 30 mg/kg p.o., 도 1b) 고림프구감소 용량을 나타낸다. 대조적으로, 1 및 3 mg/kg p.o.의 화합물 A는, 래트에서의 5일간의 반복된 BID 투여(3 mg/kg p.o) 후조차도 림프구 감소를 나타내지 않았다(도 3c). 화합물 A의 더 높은 용량들은 용량-의존성 림프구감소증을 나타내었지만, 이들은 완전 AKI 보호에 대해 필요한 용량보다 더 높은 용량을 나타낸다.

유사하게, 화합물 A의 림프구감소 활성은 3 및 10 mg/kg에서도 마우스에서 관찰되지 않았는데(도 4), 이들 용량은 글리세롤-유발 횡문근융해증 모델에서 활성이었던 용량이다(도 2).

화합물 A는 3 mg/kg p.o.에서 개에서 비 림프구감소성이었다(도 5a). 개에서의 이러한 비 림프구감소 용량은 래트에서 완전 AKI 보호에 필요한 노출(3 mg/kg)을 초과하는 노출(Cmax 및 AUC)을 이미 제공한다(표 4). 개에서의 10 및 30 mg/kg p.o.의 더 높은 용량들에서, 화합물 A는 단지 일시적 림프구감소증을 유발하였을 뿐이다(도 5a). 대조적으로, BAF-312는 3 mg/kg p.o.에서 림프구의 두드러진(I_max 약 80%) 감소를 유발하였으며, 이는 회복하는 데 적어도 60일 걸렸다(도 5b).

화합물 A는 유일무이한 S1P₁ 효능제인데, 그 이유는 그것은 최초로 비 림프구감소 용량에서 강한 AKI 보호를 입증해주기 때문이다(도 3d). 다른 S1P₁ 화합물, 예컨대 핀골리모드 및 SEW2871이 또한 AKI 모델에서 활성이긴 하지만, 이들의 효과는 림프구감소 용량에서 일어난다(Awad et al., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524; Sanna et al., 2004, JBC 279: 13839-13848; Lai et al., 2007, Kidney Int 71: 1223-1231).

이들 생체내 데이터는 화합물 A가 비 림프구감소 용량에서 S1P₁ 효능제 유발 AKI 보호로서 작용한다는 것을 뒷받침한다. 화합물 A는 본 명세서에 기재된 바와 같이 BAF-312와 현저히 상이할 뿐만 아니라, 예를 들어 자가면역 질병에 대한 림프구감소제인 것으로 특별히 설계된 다른 S1P₁ 기능적 길항제와도 현저히 상이하다.

4- 내피 장벽 완전성에 대한 차별성

S1P₁ 기능적 길항작용은 내피-손상 효과와 관련되어 있다. 황반 및 폐 부종은 핀골리모드로 치료된 다발성 경화증 환자에서 두드러진 부작용이다(Jain and Bhatti, 2012, 78: 672-680).

본 발명자들은 건강한 마우스에서의 핀골리모드의 만성 경구 투여가 유의한 혈관 누출을 생성할 수 있다(도 6a, 도 6b)는 것을 확인하였는데, 이는 임상적 발견과 일치한다. 선택적 S1P₁ 효능제인 BAF-312는 1 및 3 mg/kg b.i.d.에서 폐에서 더욱 더 큰 혈관 누출을 유발하였다(도 6a, 도 6b). 이들 발견은 S1P₁ 기능적 길항제가 내피 장벽 완전성을 변경시키고 폐에서의 혈관 단백질 혈관외유출을 촉진시켰음을 입증하는 이전 보고서들과 일치한다(Shea et al., 2010, Am J Respir CellMolBiol 43: 662-673). 대조적으로, 화합물 A는 (마우스에서 최대 완전 AKI 보호 효과를 제공하는 용량을 나타내는) 3 및 10 mg/kg에서 혈관 누출의 증가를 보여주지 않았다(도 6a, 도 6b). 피셔 래트에서도 유사하게, 화합물 A는 (AKI 유효 용량을 나타내는) 1 및 3 mg/kg에서 또는 심지어는 1회 용량 더 높은 용량(10 mg/kg)에서조차도 폐 혈관 누출을 유발하지 않았다. 대조적으로, BAF-312는 3 mg/kg(무효한 AKI 용량) 및 30 mg/kg(부분적으로 유효한 AKI 용량) 둘 모두에서 래트에서 혈관 누출을 유발하였다.

BAF-312의 관찰된 내피-손상 특성을 고려한다면(도 6), BAF-312의 보호 특성은 그의 내피 유해 효과에 의해 상쇄될 수 있으며, 그 결과 부분 보호 효과가 관찰된다(도 1b). 내피 손상은 다수의 S1P₁ 기능적 길항제의 현저한 특징이다(도 6 및 공개된 데이터). 이에 따라, 화합물 A의 신규한 프로파일은 손상을 나타내기보다는 오히려 내피 보호를 나타내는 용량에서 급성 신장 손상에 대한 보호 가능성을 제공한다.

5- 시험관내 약리학

화합물 A는 강력한 S1P₁ 효능제인 것으로 밝혀졌다. 인간 S1P₁(G-융합)을 과발현하는 CHO 세포에서, EC₅₀은 칼슘 내재화 검정에서 31 nM, β-아레스틴 검정에서 656 nM, GTPγS 검정에서 206 nM, 그리고 내재화 검정에서 213 nM이었다(표 1).

[표 1] 다양한 시험관내 검정을 사용한 화합물 A, BAF -312 및 핀골리모드에 대한 EC ₅₀ 값.

인간 S1P₁을 과발현하도록 Chem^* 및 CHO 세포를 가공하였다. HUVEC는 S1P₁을 내인적으로 발현한다. ^#ChemiScreen 검정. "-"는 결정되지 않음을 의미한다.

^* 값은 2개의 별개의 실험의 평균이다. β-아레스틴 검정: 화합물 A - 800 및 511, BAF-312 - 7.9 및 2.83, S1P - 41 및 20.8; 내재화 검정: 화합물 A - 160 및 266, BAF-312 - <0.5 및 0.67, 핀골리모드-P - 0.7 및 4.74, S1P - 56 및 40.2.

화합물 A는 기능적 길항작용 특성을 나타내거나 수용체 탈감작화를 유발하거나 하지 않았다(도 7 내지 도 10). 이러한 차별성은 4개의 독립적인 시험관내 시스템에서 입증되었는데, 2개의 시스템은 내피 세포 HDMEC(인간 진피 미소혈관계 내피 세포) 및 HUVEC(인간 제대 정맥 내피 세포)에서의 임피던스 측정을 사용하였고, 2개의 시스템은 CHO 세포 및 HSC 세포(간 성상 세포)에서 FlipR 검정을 사용하였다. 화합물 A와의 사전-인큐베이션(이어서 세척 단계가 행해짐)은 S1P(도 7 내지 도 9) 또는 화합물 A(도 10)에 의한 거의 완전한 두 번째 자극을 가능하게 하였다. 그러나, 기능적 길항제와의 사전-인큐베이션은 S1P(도 7 내지 도 9) 또는 BAF-312(도 10)에 의한 완전한 두 번째 자극을 방해하였다. HUVEC 임피던스 검정에서는, 각각의 화합물이 S1P₁-유발된 임피던스 반응을 탈감작하기 시작하는 농도를 그 검정에서의 그의 절대 EC₅₀과 대비하였다. BAF-312는 5x EC₅₀에서, SEW2871은 20x EC₅₀에서 탈감작화를 시작하였지만, 화합물 A에 대해서는 최대 60x EC₅₀까지 탈감작화가 관찰되지 않았다.

도 7 내지 도 10에서의 데이터는 이들 기능적 길항제(핀골리모드, BAF-312, SEW2871 및 포네시모드)가 지속적인 수용체 탈감작화를 유발하였음을 나타낸다.

화합물 A는 BAF-312 또는 핀골리모드와 대비하여 S1P₁ 신호전달 경로에 대해 상이한 상대 효력을 나타내었다(표 1). 단백질에 관한 검정 조건이 시험들 간에 상이하였기 때문에, 본 발명자들은 동일한 배지 조건을 사용하여 cAMP, 베타 아레스틴 및 내재화에 대해서 CHO 검정에서 효력을 비교함으로써 상대 효력에 대한 단백질 결합의 가능한 영향을 제외시켰다. 표 2에 나타낸 바와 같이, (BAF-312 및 S1P와 관련하여) 화합물 A는 내재화 또는 베타-아레스틴과 대비하여 cAMP의 그의 활성화에 대하여 더 편향되어 있다.

[표 2] 화합물 A, BAF -312 및 S1P의 상대 EC ₅₀ 값( cAMP 검정에 대해 정규화됨). 배지는 3개의 시험에서 동일한 단백질 농도(0.5% FBS )를 함유함.

화합물 A는 농도 의존적으로 투니카마이신 손상(EC₅₀ 약 10 μM) 후에, 또는 베이스 조건 하에서 EC₅₀ 약 3 μM로 인간 신장 세뇨관 상피 세포(RPTEC)에서 생존 마커, pERK 및 pAKt를 유발하였다. 이들 생존 촉진(pro-survival) 효과는 혈청 기아 후에 인간 내피 세포에서 더 강력하였는데, 이때 P-Akt에 대해서는 EC₅₀ 101 nM, 그리고 P-ERK_{1 /2}에 대해서는 190 nM이었다. 더욱이, 화합물 A는 Caspase 3/7 활성에서 평가된 RPTEC에서 EC₅₀ 약 3 내지 10 μM로 투니카마이신-유발 아폽토시스를 억제하였다.

화합물 A는 BAF-312와 달리, 3개의 인간 내피 세포 유형(HPAEC, HUVEC 및 HRGEC)에 대하여 ICAM-I, VCAM-I, 및 P/E 셀렉틴을 포함한 부착 분자의 TNF-α 유발 과발현을 감소시켰다. 이들 내피 기능장애 마커는 AKI 환자로부터의 혈장 샘플에서 상향조절되고(Sadik et al., 2012, Mol Cell Biochem 359:73-81) 세뇨관-간질 공간 내로의 염증성 세포의 침윤 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.

화합물 A는 S1PR 패밀리 내의 다른 수용체들에 대하여(표 3), CEREP 패널 내의 110개 초과의 표적에 대하여, 216개 초과의 키나제에 대하여, 그리고 이온 채널 패널 내의 5개 초과의 표적에 대하여 매력적인 선택성 프로파일을 가졌다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 A는 핀골리모드와 비교하여 더 선택적인 S1P₁ 효능제이다. S1P₂ 및 S1P₃에 대한 활성의 결여는 이들 수용체가 내피 세포에 대한 S1P₁의 기능과 반대되는 기능을 하는 것으로 보고되어 있기 때문에 특히 중요하다.

[표 3] 스핑고신 수용체 패밀리의 구성원들에 대한 화합물 A, BAF -312 및 핀 골리모드의 선택성.

"-"는 결정되지 않음을 의미한다.

다른 것들(예를 들어, 내재화, β-아레스틴)에 대해서는 더 약한 효력을 갖는 데 반하여 화합물 A에 의한 일부 신호전달 경로의 우선적인 활성화(예를 들어, cAMP)는 AKI에 대한 원하는 프로파일(즉, 최소한의 수용체 탈감작화, 지속적이지 않은 림프구감소증, 내피 보호)을 제공한다. 이는 다발성 경화증에서 S1P₁ 기능적 길항제인 BAF-312 및 핀골리모드에 대해 요구되는 것(높은 수용체 탈감작화, 강한 림프구감소증 - 이와 함께, 내피 손상은 원치 않는 부작용임)과는 대조적이다. 이 프로파일은 화합물 A를 신규한 부류의 편향된 S1P₁ 효능제로서 규정한다.

[표 4] 수컷 피셔 래트 및 비글 개에서의 3 mg /kg p.o.의 화합물 A의 약동학적 특성.

결론

이들 전임상 데이터는, 내피 장벽 기능의 현저한 유지뿐만 아니라 세뇨관 괴사 및 대식세포 염증의 감소를 포함한, AKI에서의 다수의 기계적 종점들에 대한 화합물 A의 두드러진 영향을 보여준다. (마우스 및 래트 둘 모두에서의) 화합물 A의 모든 AKI-보호 용량은 비 림프구감소성이었으며, 상응하는 노출이 개에서 달성되었을 때, 화합물 A는 여전히 비 림프구감소성이었다. 화합물 A는 모든 AKI-보호 용량에서 비 림프구감소성이었기 때문에, AKI 보호에 관한 그의 기전은 림프구감소증과 무관하였다. 화합물 A는 내피 및 상피 세포에 대하여 직접적인 보호 효과를 보여주었는데, 이들 세포는 AKI에서의 작용 기전일 가능성이 높다.

이는 기존의 S1P₁ 화합물들과는 대조적인데, 기존의 S1P₁ 화합물들은 상이한 신호전달 프로파일을 갖고, i) S1P₁ 기능적 길항제이고, ii) 내피-손상을 나타내고, iii) 림프구감소를 나타내는 용량에서 I/R-유발 AKI의 단지 제한된 활성만을 보여준다.

화합물 A는 림프구감소증을 유발하지 않음으로써 상응하는 부작용(감염을 포함함)을 피하면서 AKI 환자를 치료할 신규한 가능성을 제공한다. 결과적으로, 이 화합물은 현재 환자가 이용 가능한 약물이 없는 분야에서 변형 요법(transformative therapy)에 대한 잠재성을 갖는다.

Claims (14)

1. AKI(급성 신장 손상)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
2. 제1항에 있어서,
   {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산이 AKI 보호 용량이 투여될 때에는 림프구감소증을 유발하지 않고 더 높은 용량이 투여될 때에는 제한된 림프구감소증을 유발하는, 상기에 따른 사용을 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   비 림프구감소제로서의, 상기에 따른 사용을 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   AKI 보호 용량이 투여될 때 림프구감소 효과를 갖지 않는, 상기에 따른 사용을 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
5. 제1항에 있어서,
   {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산이 비 림프구감소 용량이 투여될 때 AKI 보호를 나타내는, 상기에 따른 사용을 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
6. {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산이 수용체 탈감작화를 유발하지 않는 선택적 S1P₁ 효능제인, AKI(급성 신장 손상)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
7. AKI의 예방 또는 치료에서 림프구감소 효과 없이 사용하기 위한 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
8. 활성 성분으로서 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한, 활성 성분으로서의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
10. AKI의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자의 AKI를 치료하는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    치료가 예방을 위한 것인 방법.
12. - 패키징 재료;
    - 활성 성분으로서의 {4-[5-(3-클로로-페녹시)-옥사졸로[5,4-d]피리미딘-2-일]-2,6-디메틸-페녹시}-아세트산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물; 및
    - 환자가 약제학적 조성물에 의해 AKI에 대해 치료될 수 있음을 표시하는, 패키징 재료 내에 들어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함하는, 제조 물품.
13. 제12항에 있어서,
    패키징 재료 내에 들어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물이 환자가 림프구감소 효과 없이 약제학적 조성물에 의해 AKI에 대해 치료될 수 있음을 표시하는 제조 물품.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    치료가 예방을 위한 것인 제조 물품.

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