TW201605453A

TW201605453A - 用於預防或治療急性腎損傷的4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸

Info

Publication number: TW201605453A
Application number: TW103135715A
Authority: TW
Inventors: 維洛尼克布蘭德; 莎賓葛來契爾; 湯瑪士乎伯許爾; 菲利浦賈尼雅客; 迪耶特卡德瑞特; 阿許法克帕克; 布魯諾波以瑞爾; 馬提耶斯莎耶芙; 包勒斯沃法特
Original assignee: 賽諾菲公司
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2016-02-16
Also published as: SG11201602263TA; CA2926211C; NZ719089A; IL244686B; DK3057591T3; AR098028A1; US9782411B2; CN105658220A; PH12016500563A1; EA201690762A1; TWI685340B; EP3057591A1; WO2015055694A1; CR20160172A; CN105658220B; BR112016007669A2; JP2016534986A; KR20160060759A; MA39032B2; BR112016007669B1

Abstract

本發明係關於用於預防或治療AKI(急性腎損傷)的{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽。本發明係關於藥物及其醫藥組合物。

Description

用於預防或治療急性腎損傷的4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-D]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸

本發明係關於用於預防或治療急性腎損傷(AKI)的{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及其醫藥組合物。

化合物4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽以及其製備方法描述於專利申請案WO2011/086079中。此化合物對於S1P₁/EDG1受體具有親合性。

急性腎損傷(AKI)，以前稱為「急性腎衰竭」，為出現在各種環境下之常見且可能很嚴重之病症，臨床表現為自血清肌酸酐(SCr)短暫升高至無尿性腎衰竭。傳統上，AKI被描述為腎功能突然(在48小時之內)降低，其藉由血清肌酸酐之升高來測定。最近的KDIGO(腎臟疾病改善全球預後組織)指南建立了關於診斷標準之共識，此診斷標準基於下列實驗室及臨床數值(Working group of ERBP(European Renal Best Practice),2012,NDT 27：4263-4272)。AKI被定義及分為下列階段之一：●在48小時之內，SCr升高0.3mg/D1(26.5μmol/L)；或●SCr升高至1.5倍基線，在前7天內便已知或推測出現此狀況；或●尿量<0.5mL/kg/h，持續6小時。

在所有就醫的患者當中，AKI出現約7%(Nash等人，2002,Am J Kidney Dis 39：930-936)，且根據所使用之定義，垂危患者高達36%-67%。在所有重病監護室(ICU)入住當中，嚴重的AKI出現4%-25%，且約5%患有AKI之ICU患者需要腎臟替代治療(Hoste等人2006,Crit Care 10：R73，Mehta等人2004,Kidney Int 66：1613-1621；Uchino等人2005,Jama 294：813-818；Uchino等人2006,Crit Care Med 34：1913-1917；Ostermann等人2007,Crit Care Med 35：1837-1843)。AKI之最常見病因為敗血症、大手術、血容量過低及藥物。形成AKI之風險因素包括：老年(>75歲)、慢性腎病(CKD，eGFR(估計的腎小球過濾率)<60mL/min/1.73m²)、動脈粥樣硬化周圍血管疾病、心力衰竭、肝臟疾病、糖尿病及腎毒性藥物。

儘管預防策略及支援措施得到發展，但AKI仍保持高發病率及死亡率，尤其是進入ICU之彼等患者，其中住院死亡率可超過50%。除了死亡率之外，亦存在慢性後果，包括：出現慢性腎病(CKD)之高風險及促進形成晚期腎病(ESRD)(Hsu等人2009,Clin J Am Soc Nephrol 4：891-898；Ishani等人2009,JASN20：223-228；Coca等人2009,Am J Kidney Dis 53：961-973)。發病還伴隨著費用升高及長時間住院。

無論病原如何，由於沒有得到認可之預防或治療AKI之方法，所以，還存在明顯未得到滿足之醫學需要。病症之處理基本上為支持性的，對於嚴重AKI患者而言，腎臟替代治療(RRT)作為護理之中心部分。水化仍為對比劑腎病(CIN)之最適合之預防法。

神經鞘胺醇-1磷酸鹽(S1P)為與五個GPCR(G蛋白偶合受體)結合之脂質介質，稱為S1P_1-5(Brinkman等人2007,Pharmacol Ther 115：84-105)。循環S1P主要由內皮細胞、血小板及紅細胞產生，且發現其與血漿蛋白高度結合，包括HDL(高密度脂蛋白)中之ApoM(脫脂載脂蛋白M)(Hammad等人2012,J Lipids；Karuna等人，2011,Atherosclerosis 219：855-863)及白蛋白。S1P₁經普遍表現，包括在內皮、免疫及腎臟上皮細胞中表現。S1P₁調節許多生理功能，包括：保持內皮屏障之完整性(細胞骨架重排)、細胞生長、存活、分化、血管生成及免疫細胞輸送。S1P₁在腎臟髓質(Zhu等人2011,Am J Physiol Renal Physiol 301：F35-F41)中高度表現，其為血流及供氧受到特別為尿濃度而設計之血管解剖學限制之腎臟區域。由於該區域中之細胞具有高耗氧性，所以，髓質尤其易受缺氧傷害之影響。腎皮質管損傷為髓質損傷及近端管狀細胞之直接損傷之結果。腎臟缺血再灌注損傷之後，S1P₁上調(Awad等人2006,Am J Physiol Renal Physiol 290：F1516-F1524)，且預計其活化能夠保持腎臟功能，此係由於三個主要機理：●保持內皮屏障功能。在AKI中，此屏障受到損傷，導致血管通透性及黏附效能削弱，●限制近端管狀上皮細胞之細胞程序死亡，●降低炎性細胞浸潤。在AKI中，炎症經常為對管狀上皮細胞及內皮屏障之複合傷害之結果。

文獻已廣泛地記錄S1P-S1P₁途徑在調節內皮屏障完整性中之作用(Wang and Dudek,2009,Microvasc Res 77：39-45；Mc Verry and Garcia,2005,Cell signalling 17：131-139；Lucke and Levkau,2010,Cell Phys Biochem 26：87-96)。S1P₁之活化，藉由PLC/Ca²⁺/FAK/pRac途徑活化來提高內皮之屏障功能(Belvitch and Dudek,2012,Microvasc Res83：22-30)。HDL-ApoM結合之S1P藉由eNOS活化來延長內皮之屏障功能(Wilkerson等人2012,JBC 287：44645-44653；Christoffersen等人2011,PNAS 108：9613-9618；Argraves等人2008,JBC 283：25074-25081)。關於此點，在進行血管手術之患者中，低血漿HDL水準與出現AKI之危險有關(Miller GJ and Miller NE.,1975,Lancet 1：16-19；Castelli WP,Garrison RJ,Wilson PW等人1986,JAMA；256：2835-2838)。

S1P₁之完全或內皮特異性缺失，由於影響多個器官之大出血而引起胚胎死亡(Kono等人2004,JBC 279：29367-29373)。在負責S1P生物合成(鞘胺醇激酶1及2)之酶缺失之剔除小鼠中，可發現相同之缺陷(Mizugishi等人2005,Mol Cell Biol 25：11113-11121)。類似地，S1P₁拮抗劑還增加血管通透性。儘管S1P₁功能性拮抗劑在AKI模型中具有急性保護作用(Bajwa等人，2010,JASN 21：955-965；Awad等人2006,Am J Physiol Renal Physiol 290：F1516-F1524)，但在肺損傷模型中，用此等S1P₁功能性拮抗劑進行長期治療，顯著地惡化血管滲漏，且體外破壞(Shea等人2010,Am J Respir Cell Mol Biol 43：662-673)內皮屏障之完整性。在S1P不足之小鼠中，亦模擬類似之內皮缺陷(Camerer等人，2009,JCI 119：1871-1879)。

在患者及AKI模型中，從內皮細胞中釋放細胞素(例如，TNF-α)，且上調黏附分子，例如ICAM-1、VCAM-1及P/E-選擇蛋白，此有助於炎性細胞滲透至管狀間質軟組織中(Bonventre等人2003,JASN 14：2199-2210；Singbartl等人2000,Crit Care Med 28：2507-2514；Sadik等人2012,Mol Cell Biochem 359：73-81)。此外，在培養之人類內皮細胞中，在低氧/再氧化之後，此等內皮黏附分子中之一些黏附分子經上調(Lutz等人2008,J Mol Med 86：1329-1339)。S1P₁活化向下調節此等黏附分子，並因此降低炎性細胞浸潤(Lien等人2006,Kidney Int 69：1601-1608)。使用內皮S1P₁受體條件性缺失之小鼠，證明S1P在急性腎損傷中保持內皮功能方面之主要作用(Ham A.,2013,Kidney Int,Sept)。

刺激S1P₁，藉由Akt磷酸化，能夠激活內皮氧化氮合酶(eNOS)，其為藉由產生NO來調節局部血管舒張之關鍵酶(Morales-Ruiz等人 2001,JBC 276：19672-19677；Igarashi等人2000,JBC 275：32363-32370；Igarashi等人2008,BBA 1781：489-495)。因此，S1P在內皮中以NO依賴性方式引起血管舒張(Roviezzo等人2006,FASEB J 20：340)。在I/R引起之AKI之動物模型中，NO對腎臟功能具有保護作用(Garcia-Criado等人1998,Transplantation 66：982-990)。在大鼠中，抑制eNOS能夠使腎血流量降低35%，同時降低GFR，且增加腎血管阻力(Cao等人2010,Am J Physiol Renal Physiol 299：F1056-F1064)。認為S1P為內皮一氧化氮之最有效活化劑之一，已知道的為，其可使局部血流增加，而且限制血小板活化及血管充血，尤其在易受損之皮質延髓區域。在AKI期間，此機理可能對保持腎臟功能很重要。重要的為，在心肺旁路(CPB)及敗血症患者中，一氧化氮生物利用率降低與AKI有關(Lema等人2009,J Cardio Thorac Vasc Anesth 23：188-194；Sadik等人2012,Mol Cell Biochem 359：73-81)。有趣的為，人類eNOS中之786C多態性降低轉錄活性，且與心肺旁路之心臟手術患者之腎功能障礙有關(Popov等人2009,Eur J Cardio-Thorac Surgery 36：651-656；Nakayama等人1999,Circulation 99：2864-2870)。多態性頻率大約為50%，且可代表重要之子群，此子群不但更加處於出現AKI之危險之中，而且對修復局部NO水準之治療產生更大反應，例如，藉由S1P₁之活化。

此外，S1P₁之活化，藉由激活pERK及pAkt存活途徑，直接限制近端管狀上皮細胞之細胞程序死亡。在缺血再灌注損傷之後，近端管狀上皮細胞中S1P₁之特異性缺失，惡化腎臟功能障礙(Bajwa等人2010,JASN 21：955-965)，以及使腎小管壞死，此說明，內原性之S1P增強(tone)可減緩再灌注損傷之嚴重程度。此等數據著重說明S1P-S1P₁系統在AKI中對內皮及上皮軸之保護作用之重要性。

藉由S1P₁活化S1P決定著淋巴細胞從淋巴結流出至血液中。此 S1P₁活化引起受體內化作用，而後受體再循環回至細胞表面，進行重新活化。然而，人們認為，S1P₁功能性拮抗劑或拮抗劑藉由抑制內化之S1P₁受體回至細胞表面或抑制S1P₁活化而導致淋巴球減少，由此導致細胞表面S1P₁之顯著及持續減少。因此，最近之藥劑顯示出在臨床前及臨床上觀測到血液淋巴細胞之大量及持續減少。

一些報道表明，T淋巴細胞促進急性腎損傷。藉由消耗T細胞且與CD4+ T細胞之繼承轉移進行重組而使損傷得到改善，此觀測結果證明其依賴於CD4+ T細胞(Burne等人2001,J.Clin Invest 108：1283-1290；Ysebaert等人2004,Kidney Int 66：491-496)。因此，毫不奇怪的為，S1P₁功能性拮抗劑，包括芬戈莫德(fingolimod)及SEW2871，在急性腎損傷模型中，在淋巴球減少性劑量下，能夠起保護作用(Lien等人2006,Kidney Int 69：1601-1608)。

然而，淋巴球減少為機會感染之誘因，尤其對於很敏感、虛弱之患者，例如，處於AKI之高風險之患者(老年、心臟疾病、糖尿病及慢性腎病)。因此，還需要選擇性之S1P₁激動劑，此激動劑應能夠引起有限之淋巴球減少，或在最佳情況下，淋巴細胞不減少，且在治療AKI方面具有治療應用性。意外的為，化合物4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸不同於其他S1P₁調節劑，此係由於它在非淋巴球減少性劑量下，在哺乳動物中引起AKI保護作用。人們咸信，4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸之此效能可能與它對於S1P₁受體之偏向性激動作用有關，同時具有最小功能性拮抗作用或靈敏度降低效應。對於4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸在治療AKI方面之用途而言，此代表重要臨床安全優點。

本發明關於{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療AKI(急性腎損傷)。

本發明亦關於如下使用之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，當投與AKI保護劑量時，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸不會引起淋巴球減少，且當投與較高劑量時，引起有限的淋巴球減少。

本發明亦關於{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其在預防或治療AKI中用作非淋巴球減少劑。

本發明亦關於{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療AKI，當投與AKI保護劑量時，不產生淋巴球減少效果。

本發明亦關於用作上述用途之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，當投與非淋巴球減少性劑量時，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸為AKI保護性的。

本發明亦關於{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療AKI(急性腎損傷)，其中，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸為不引起受體靈敏度降低之選擇性S1P₁激動劑。

本發明亦關於{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療AKI(急性腎損傷)，其中，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸為在AKI保護劑量下呈非淋巴球減少性之選擇性S1P₁激動劑。

本發明亦關於{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其在無淋巴球減少效果之情況下用於預防或治療AKI。

本發明亦關於一種藥物，其包含作為活性成分之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽。

本發明亦關於一種醫藥組合物，其包含作為活性成分之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之賦形劑，用於預防或治療AKI。

本發明亦關於一種製品，其包含：-包裝材料；-醫藥組合物，其包含作為活性成分之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之賦形劑；及-包含於包裝材料內之標籤或包裝說明書，其表明可用該醫藥組合物治療患者之AKI。

本發明亦關於一種在需要之患者中治療AKI之方法，其包含：向該患者投與治療有效量之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽。

本發明亦關於一種在需要之患者中治療AKI之方法，其包含：向該患者投與治療有效量之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸無淋巴球減少效果。

本發明亦關於在需要之患者中治療AKI之方法，其包含：向該患者投與治療有效量之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，當投與AKI保護劑量時，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸無淋巴球減少效果。

本發明亦關於在需要之患者中治療AKI之方法，其包含：向該患者投與治療有效量之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，治療為預防性的。

本發明亦關於一種製品，其中，標籤或包裝說明書包含於包裝材料內，其表明可在無淋巴球減少效果之情況下用上述醫藥組合物治療患者之AKI。

本發明亦關於一種製品，其中，標籤或包裝說明書包含於包裝材料內，其表明可在無淋巴球減少效果之情況下用上述醫藥組合物治療患者之AKI，其中治療為預防性的。

定義

為方便起見，且為了便於閱讀，在本申請案之章節中及圖式中，化合物{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸更名為「化合物A」。

對於本發明而言，相應地理解下列字語：

-選擇性S1P₁激動劑為相比於其他4種S1P受體(S1P_2-5)對S1P₁更有效之化合物。此外，該化合物應在大量受體、酶及離子通道分析中具有最小活性或無活性。

- 淋巴球減少症為血液淋巴細胞，一種在免疫系統中具有重要功能之白細胞異常降低之病症。在成人中，低於1,500個細胞/微升之淋巴細胞含量為診斷性的(病症之證明)，且在兒童中，低於3,000個細胞 /微升之淋巴細胞含量為診斷性的。

S1P₁活化介導之淋巴球減少症係指由使用S1P₁調節劑引起之淋巴球減少性病症。由於S1P引起S1P₁介導之淋巴細胞自淋巴結流出到血液中，所以，咸信後一種藥劑藉由抑制內化S1P₁受體再循環回細胞表面或阻斷S1P₁活化而導致淋巴球減少症。

- 有限的淋巴球減少症為血液淋巴細胞之暫時減少(在處理之前，絕對的淋巴細胞計數超出正常範圍)。暫時係指淋巴細胞之短暫變化，其在24小時或48小時之內恢復至正常範圍。

- 非淋巴球減少或無淋巴球減少症係指血液淋巴細胞無暫時或持續減少(在處理之前，絕對的淋巴細胞計數超出正常範圍)。暫時係指淋巴細胞之短暫變化，其在24小時內恢復至正常範圍，而持續係指持續超出24小時之減少。

- AKI保護劑量：使得血漿肌酸酐明顯降低至少30%的{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸之劑量。

- 如本文使用之治療有效量意謂對AKI產生影響之醫藥化合物，諸如{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸之量。

- 患者意謂人類患者。

- 預防性：用以預防或保護以免受非所需效果，且意欲預防出現醫學症狀，尤其為疾病。

第一實施例為用於預防或治療AKI之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸在AKI保護劑量下為非淋巴球減少性的。

第二實施例為用於預防或治療AKI之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，S1P₁活化介導保護作用而不引起淋巴球減少症。

另一實施例為一種上述製品，其中，包含於包裝材料之內的標籤或包裝說明書表明可在不引起淋巴球減少症之情況下治療接受上述醫藥組合物治療之患者的AKI。

縮寫

實例

下列實例進一步說明本發明，且不意欲限制本發明。為方便起見，且為了便於閱讀，在圖式及結果中，化合物{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸更名為「化合物A」。

進行統計分析及p值計算，且取決於實驗條件，在圖式中用「*」或「#」符號表示。

圖1：在大鼠缺血-再灌注(I/R)模型中，單次或重複投與化合物A及/或BAF-312之效果。對Fischer大鼠進行假手術或25分鐘雙側腎動脈閉塞，且在24小時再灌注之後量測血漿肌酸酐。(圖1-A)：評價在閉塞之前1小時以0.3、1及3mg/kg經口給予之化合物A。(圖1-B)：評價在閉塞之前1小時以3、10及30mg/kg經口給予之BAF-312。在封閉之前1小時，給予無化合物對照組媒劑。***p<0.001 I/R-媒劑相對於假手術組。#p<0.05；##p<0.01，化合物處理組相對於媒劑組。條形圖為平均值+/-s.e.m。(圖1-C)：在大鼠I/R損傷之後，收集腎樣品以評價化合物A對皮層的白蛋白含量之影響。在經假手術、I/R-媒劑處理或I/R-化合物A(3mg/kg，經口)處理之大鼠之樣品腎的皮質區中藉由西方墨點法(Western Blot)量測白蛋白。(圖1-D)：投與化合物A(3mg/kg，經口)或媒劑，每天兩次，持續5天。在閉塞之前1小時，進行最後一次投藥。**p<0.01，I/R-媒劑相對於假手術組。###p<0.001，化合物A處理組相對於媒劑組。條形圖為平均值+/-s.e.m。

圖2：化合物A對於小鼠中橫紋肌溶解引起之AKI損傷的影響。

在雄性CD1小鼠中，口服投與化合物A(0.3、1、3及10mg/kg)或媒劑，1小時之後，肌內注射(後肢)8mL/kg之甘油(50%，在PBS v/v 中)。使假手術組接受相應體積之PBS。24小時以後，評價血漿肌酸酐。**p<0.01，甘油-媒劑相對於假手術組。#p<0.05，化合物A處理組相對於媒劑組。條形圖為平均值+/-s.e.m。

圖3：單一給藥之後的Fischer大鼠中之周邊血液淋巴細胞(圖3-A)或(圖3-B)單一給藥或(圖3-C)重複給藥之後的Sprague-Dawley大鼠中之周邊血液淋巴細胞。

在Fischer大鼠中，口服投與1、3、10及30mg/kg之化合物A，或在Sprague-Dawley大鼠中，口服投與3mg/kg之化合物A。在Fischer大鼠中，口服投與1及10mg/kg之BAF-312，或在Sprague-Dawley大鼠中，口服投與3mg/kg之BAF-312(n=8)。在重複投藥方案中，投與化合物5天，每天兩次。將血液淋巴細胞表示為曲線下面積(AUC)(圖3-A)或每個時間點的總白血球之百分比(圖3-B/圖3-C)，且表示為平均值+/-s.e.m.。** p<0.01，相對於基線。(圖3-D)：在Fischer大鼠中，AKI保護與淋巴球減少症之間的關係。註釋：方框表示3mg/kg之化合物A無淋巴球減少症，且具有充分的AKI保護，而BAF-312為淋巴球減少性的，且顯示部分的AKI保護。

圖4：C57Bl6/J小鼠中之周邊血液淋巴細胞。

經口投與1、3、10及30mg/kg之化合物A(n=8)。將每個時點的血液淋巴細胞表示為總白血球之百分比，且表示為平均值+/-s.e.m.，***p<0.001，相對於基線。

圖5：小獵犬中之周邊血液淋巴細胞。

獲取基線淋巴細胞計數，隨後投與狗3、10及30mg/kg單一口服劑量之化合物A(n=8)，或10mg/kg之BAF-312(n=4)。監測動物7天(圖5-A)，且在BAF-312之情況下，監測至多66天(圖5-B)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，相對於基線。條形圖為平均值+/-s.e.m。註釋：對於3mg/kg劑量，在任何時點量測，化合物A不引起任何明顯的淋巴球減少症。

圖6：健康C57Bl6/J小鼠及Fischer大鼠中之肺血管滲漏。

用化合物A(3及10mg/kg，經口，每天兩次)、BAF-312(1及3mg/kg，經口.，每天兩次)及芬戈莫德(fingolimod)(0.1及1mg/kg，經口，每天兩次)處理小鼠7天(n=5-8)。(圖6-A)：使用伊文氏藍(Evan's blue)溢出方法，評價血管滲透性。(圖6-B)肺重量。用化合物A(1、3、10、30及100mg/kg，經口，每天兩次)及BAF-312(0.03、0.1、0.3、3及30mg/kg，經口，每天兩次)處理大鼠7天。(圖6-C)：使用伊文氏藍溢出方法，評價血管滲透性。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，相對於對照組(無化合物)(對於小鼠)或媒劑(甲基纖維素，0.6%-tween 80，0.5%，在水中)(對於大鼠)。條形圖為平均值+/-s.e.m。

圖7：使用阻抗分析，S1P ₁ 受體在人皮膚微血管內皮細胞(HDMEC)上之靈敏度降低。

用S1P(1μM)、芬戈莫德(100nM)或化合物A(1μM)第一次刺激HDMEC 1小時，隨後進行30分鐘的清除期。使用S1P(3個濃度)進行第二次刺激且量測所得阻抗(n=3次實驗)來評價第一次刺激對受體靈敏度降低的影響。所有第一次刺激之濃度>EC₉₀。條形圖為平均值+/-s.e.m。

圖8：使用阻抗分析，S1P ₁ 受體在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)上之靈敏度降低。

用S1P(1μM)、化合物A(1μM)、芬戈莫德(100nM)或SEW2871(1μM)第一次刺激HUVEC 1小時，隨後進行30分鐘的清除期。使用S1P(4個濃度)進行第二次刺激且測定所得阻抗(n=3次實驗)來評價第一次刺激對受體靈敏度降低的影響。所有第一次刺激之濃度>EC₉₀。條形圖為平均值+/-s.e.m。

圖9：使用FlipR分析，S1P ₁ 受體在過度表現S1P ₁ (G-融合)之CHO細胞上的靈敏度降低。

(圖9-A)：該方案包括用S1P(100nM)、指定濃度的化合物A、芬戈莫德、BAF-312、珀斯莫德(ponesimod)進行第一次刺激5分鐘。選擇所有第一次刺激的濃度>EC₉₀。在不同清除期之後，用S1P(100nM)進行第二次刺激，評價受體靈敏度降低。(圖9-B)：對於具有不同清除期(15至60分鐘，n=4次實驗)之各化合物表現S1P引起的FlipR反應，其表示為基礎反應的百分比。條形圖為平均值+/-s.e.m。

圖10：使用FlipR分析，S1P ₁ 受體在人類肝星形細胞(HSC)上之靈敏度降低。

(圖10-A)：該方案包括用化合物A(10μM)或BAF-312(300nM)進行第一次刺激。選擇所有第一次刺激之濃度>EC₉₀。在1小時或3小時清除期之後，使用相同化合物進行第二次刺激，評價受體靈敏度降低。(圖10-B)：對於具有不同清除期之各化合物而言表現化合物A或BAF-312引起的FlipR反應，其表示為螢光單位(n=3次實驗)。條形圖為平均值+/-s.e.m。

圖11：在C57Bl6/J小鼠中，I/R損傷之後的血漿S1P之時程。

在假手術之後，或在22分鐘雙側腎動脈閉塞接著進行再灌注之後，評價血漿S1P水平(Elisa套組，獲自Echelon)。對照組(CTRL)不進行手術。###p<0.001，相對於假手術組(時間-配對)。*p<0.05；**p<0.001；***p<0.001，相對於對照組(CTRL)。條形圖為平均值+/-s.e.m。

方法

原料：

芬戈莫德及SEW2871為市售的。按照公開之方法，合成BAF-312及珀斯莫德： ●BAF-312：WO04/103306，●珀斯莫德：WO05/054215。

按照WO2011/086079文獻所描述之方法，合成化合物A。

按照European Community Standards on the Careand Use of Laboratory Animals，且經Animal Careand Use Committee of Sanofi Research & Development的批准，進行所有的或體內研究。

統計分析：

為了評價所評定參數之的差別，基於分佈之正態性及方差之同質性(Levene測試)，使用Student測試或Wilcoxon測試，比較假手術/對照組與媒劑處理組。隨後，使用Everst@t V6軟體，進行單向方差分析(ANOVA)或雙向方差分析，比較媒劑處理組與化合物處理組。當合適時，在此初始分析之後，進行Dunnett事後檢驗。在非方差同質性之情況下，使用Kruskal-Wallis測試。若p<0.05，則認為在各組之間的差別為顯著的。

1. 心血管功能安全性

a)hERG分析

按照下列方案，培養表現人類ERG(ether-a-go-go相關基因)鉀通道之重組CHO(中國倉鼠卵巢)細胞株(Cytomyx目錄編號：CYL3002)。必要時，用冷凍的等分試樣重新開始培養。將冷凍細胞之等分試樣(1mL)快速升溫至37℃，且首先重新塗覆於75cm²燒瓶(Corning)中。隨後，使用含有10%胎牛血清之α-極限必需培養基(Gibco 32571-028)，將體積調節至10mL。24小時之後，將培養基更新，且為了防止細胞衍生，加入1%遺傳黴素(G418，Gibco 10131)。兩或三天之後，將細胞1.5×10⁶個細胞播種在T25燒瓶中。將燒瓶置放於37℃、5% CO₂之培養箱中1小時；在此之前，將其置放於28℃、5% CO₂之培養箱中2天。在28℃下培養2天之後，進行細胞分離之程序。用Accumax(Sigma；1：4)或Versene(Gibco)收集細胞，且放入胞外培養基中。

使用胞外溶液PATCH(NaCl，138mM；KCl，4mM；CaCl₂，1.8mM；MgCl₂，1mM；葡萄糖，5.6mM；HEPES，10mM)，使細胞過融合。用NaOH將pH值調節至7.3。將滲透莫耳濃度調節至285 mOsm。內部溶液製備如下：KCl，60mM；KF，70mM；NaCl，15mM；HEPES，5mM；EGTA(K)，5mM；用KOH將pH值調節至7.25。將滲透莫耳濃度調節至290 mOsm。

響應於對從-80mV鉗制電位至+20mV測試電位，而後再極化至-100mV之電位階躍(2s)，hERG電流被激活。以20 s之間隔施加電位階躍。在-100mV下，以拖尾去活化電流形式量測hERG電流。基線量測3分鐘之後，量測溶液改變之後4-6分鐘之化合物A的效果。在各實驗結束時，特異性hERG阻斷劑(亦即利培酮(Risperidone，其顯示約0.7μM之IC₅₀值)在10μM濃度下之過融合使得量測hERG之100%抑制。

使用資料庫及分析軟體DataXpress 1.0(Axon Instruments/Molecular Devices)分析電流。由基線量測時間外推出電流之線性衰減，藥物影響之後的hERG電流抑制百分比計算如下：hERG電流抑制百分比(%)=100-[((I-I利培酮)/(I基線-I利培酮))×100]。

其中，「I」為藥物影響之後所量測之電流，「I_利培酮」為特異性hERG阻斷劑影響之後所量測之電流，「I_基線」為在藥物過融合之前所量測之電流。

b)兔浦肯野纖維分析

經由微電極技術，評定化合物A對從分離出的兔浦肯野纖維(雄性，新西蘭兔子；1.3至1.5kg；9-12週齡)所記錄的靜止膜電位及作用電位參數的影響。量測下列參數：靜止電位(RP，mV)、作用電位幅度(APA，mV)、作用電位升高之最大速率(V_max，V/s)、再極化50%及90%時之作用電位時間(APD₅₀及APD₉₀，ms)。在36±1℃下，將纖維與氧合生理溶液過融合，該生理溶液含有(以mmol/L為單位)：NaCl：120；KCl：4；MgCl₂：1；NaH₂PO₄：1.8；NaHCO₃：25；葡萄糖：11；CaCl₂：1.8；pH=7.4。首先，將化合物A溶解至DMSO中，獲得12mmol/L之儲備溶液。將此溶液進一步稀釋至DMSO中，隨後加入到該生理溶液中，獲得合適的額定濃度：0.3、1、3、10及30μmol/L(亦即活性成分分別為0.1、0.5、1.4、4.5及13.6μg/mL)。在生理溶液中，測試調配物中之DMSO的最終濃度保持0.25%(v/v)不變。首先，用生理溶液將浦肯野纖維(n=4)過融合。經過30分鐘控制階段之後，在施用每30分鐘順序升高之濃度下評價測試化合物。對於各測試濃度，在每秒1個脈衝(1Hz)之基礎速率下刺激纖維。此外，刺激速率從每秒1個脈衝(1Hz)減小至每4秒1個脈衝(0.25Hz)，持續3分鐘，再次升高至每秒1個脈衝，持續1分鐘，且最後升至每秒3個脈衝(3Hz)，再持續2分鐘(在第19與第25分鐘之間)，如下所述：

使用低刺激速率，能夠在作用電位之再極化階段期間有利於出現異常電學事件，且促進形成早期後去極化(EAD)。高刺激速率用於評價使用-依賴性鈉通道阻斷狀況。達到最高濃度之後，將生理溶液再次過融合，評價藥物影響之可逆性(清除)。

c)狗遙測研究

此研究之目的為：在有意識之遙測狗中，經24小時時間後給藥，評價化合物A對心血管功能(血壓、心率及ECG)之電位影響。

使有意識的自由活動之狗(Marshall Farms，n=4，2隻雄性，2隻雌性，體重6.9至10.8kg，44至64個月大)接受口服或靜脈內劑量之陰性對照物(亦即，對於口服途徑，接受0.5%(w/w)羥乙基纖維素/0.6%(w/w)聚山梨醇酯80之水溶液，或20% Captisol之水溶液(pH7.5至8))，接著按照劑量升高研究設計，對於口服途徑，接受30及100mg/kg之化合物A之陰性對照物懸浮液，或對於靜脈內途徑，接受10及30mg/kg之化合物A之陰性對照物溶液，在每次投藥(口服途徑：5mL/kg；或用30分鐘輸入到頸靜脈中)之間，清除時間至少4天。在各治療日，從給藥之前約2小時至給藥之後24小時，連續地記錄動脈血壓及lead II ECG信號(傳感器，獲自Data Science,USA)。在幾個時點處，分析下列參數：動脈血壓(收縮期、舒張期及平均值)、心率、RR之心電圖參數、PQ(=PR)、QT間隔時間及QRS綜合波持續時間以及體溫。按照Fridericia's及van de Water's公式，校正心率變化之QT間隔時間。給藥後30分鐘至6小時，檢驗任何心律紊亂之心跳與心跳間的全部ECG信號，以及波形的形態。在個治療日，進行臨床觀察。回顧視訊記錄，確定電位特性的改變及電位對心血管參數之干擾。給藥之後，分析時間點如下：0.5、1、2、3、4、6、8、12、16及24小時。

2. 內皮屏障完整性之差別

a)小鼠肺血管滲漏研究

用3及10mg/kg之化合物A、1及3mg/kg之BAF-312、0.1及1mg/kg之芬戈莫德或投藥體積在10mL/kg之內的媒劑物(0.6%甲基纖維素-0.5% tween 80，在水中)處理雄性C57Bl6/J小鼠(n=5-8，25-30g)(Charles River Laboratory,France)，口服投藥，且每天兩次，持續7天。各組所包括的小鼠數目在5與8隻之間。7天之後，使用氯胺酮(100mg/kg)及甲苯噻嗪(xylasine)(10mg/kg)之腹膜內注射劑的混合物，使小鼠麻醉。將15mg/kg(1mL/kg)的伊文氏藍靜脈內注射到頸靜脈中。十分鐘以後，藉由左心室注射生理血清，沖洗殘留的血管內伊文氏藍。收集肺組織且稱重，隨後浸於純甲醯胺溶液中24小時，提取組織伊文氏藍，且因此評價血管滲透性。使用標準曲線，評價630nM下的伊文氏藍濃度，且用肺重量進行歸一化。結果用平均值+/-s.e.m來表示。

b)大鼠肺血管滲漏研究

用化合物A(1、3、10、30及100mg/kg)、BAF-312(0.03、0.1、0.3、3及30mg/kg)或投藥體積在2mL/kg之內的媒劑物(0.6%甲基纖維素-0.5% tween 80，在水中)處理雄性Fischer大鼠(n=4-8，280-350g)(Charles River Laboratory,France)，口服投藥，每天兩次，持續7天。7天之後，使用戊巴比妥(50mg/kg)的腹膜內注射劑，使大鼠麻醉。將30mg/kg(1mL/kg)之伊文氏藍靜脈內注射到眼眶後的靜脈竇中。十五分鐘以後，藉由左心室注射生理血清，沖洗殘留之血管內伊文氏藍。收集肺組織且稱重，隨後浸於純甲醯胺溶液(4mL/g組織重量)中24小時，提取組織伊文氏藍，且因此評價血管滲透性。使用標準曲線，評價630nM下之伊文氏藍濃度。結果用平均值+/-s.e.m來表示。

3. 淋巴球減少性活性之差別

a)大鼠淋巴球減少症研究

使雄性Sprague-Dawley大鼠(n=8，250至350g)(Charles River Laboratory,France)接受3mg/kg之化合物A、BAF-312或投藥體積在2mL/kg之內的媒劑(0.6%甲基纖維素-0.5% tween 80，在水中)之口服投藥。使用兩個方案：在5個連續日期間，單一給藥或每天兩次重複給藥。在投與化合物之後2、6及24小時(重複方案之最後一次給藥)，收集血液，進行血液分析，測定全血淋巴細胞計數。結果用平均值+/-s.e.m來表示。

使雄性Fischer大鼠(n=8，250至350g)(Charles River Laboratory,France)接受化合物A(1、3、10及30mg/kg)、BAF-312(1及10mg/kg)或媒劑(0.6%甲基纖維素-0.5% tween 80，在水中)之單一口服投藥，投藥體積在2mL/kg之內。在投與化合物之後2、6及24小時，收集血液，進行血液分析，測定全血淋巴細胞計數。結果用平均值+/-s.e.m來表示。

b)小鼠淋巴球減少症研究

使雄性C57Bl6/J小鼠(n=8，25-30g)(Charles River Laboratory,France)接受化合物A(1、3、10及30mg/kg)或媒劑(0.6%甲基纖維素-0.5% tween 80，在水中)之單一口服投藥，投藥體積在10mL/kg之內。在投與化合物之後2、6及24小時，收集血液，進行血液分析，測定全血淋巴細胞計數。結果用平均值+/-s.e.m來表示。

c)狗淋巴球減少症研究

按照劑量升高研究設計，使有意識的自由活動之公狗(Marshall Farms，n=8，10.5至14.3kg體重)接受口服劑量之陰性對照物(亦即0.5%(w/w)羥乙基纖維素/0.6%(w/w)聚山梨醇酯80之水溶液)或化合物A(3、10及30mg/kg)或BAF-312(10mg/kg)(陰性對照物中之懸浮液形式)，在每次投藥(5mL/kg)之間，清除期至少為7天。對於兩個化合物，在0.5、1、2、3、4、5、6、24、48及168小時(且對於BAF-312，至多66天)收集血液，進行血液分析，測定全血淋巴細胞計數。結果用平均值+/-s.e.m來表示。

4. 活體外藥理學

a)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Chem細胞及HSC中之鈣動員(FlipR)分析

1. CHO細胞

在CHO細胞(專賣品)中，在Flp-In穩定轉染物(帶有hS1P₁-G-融合構建物)上測試化合物A、BAF-312及芬戈莫德之活性，且測試對於hS1P2-及hS1P3-G-融合構築體(專賣品)之選擇性。WO2011/086079描述細胞株形成。

在使用CHO細胞(人類S1P₁受體在其中穩定地過度表現)之基於細胞的鈣螢光分析中，藉由化合物對S1P₁受體相關鈣釋放之影響，將化合物對S1P₁受體之活化定量(Flp-In系統，Invitrogen)。為了加強G蛋白偶合以及朝向Ca²⁺釋放導引信號傳遞，過度表現之受體另外具有經修飾之G蛋白(G_αi4qi4)之C端序列(WO 02/04665)。在螢光成像讀盤儀(FlipR，Molecular Dynamics)中，藉由對鈣敏感染料fluo-4(Invitrogen)進行螢光量測來測定胞內鈣之變化。

在實驗之前約18-24小時，將穩定地過度表現人類S1P₁受體之CHO細胞播種(每孔40.000個)於黑色透明底之聚-D-離胺酸塗佈之96孔盤(Becton Dickinson,Biocoat cellware)中。在37℃、含有5%二氧化碳及95%濕度之培養箱中，使細胞生長於細胞培養基中，此培養基基於F-12 glutamax培養基(Gibco #31765)，補充有1%(vol/vol)青黴素/鏈黴素(PAN，編號P06-07100)、10%(vol/vol)胎牛血清(FCS；Hyclone炭/葡聚糖處理之FBS編號SH30068)及均黴素B(Invitrogen，編號10687-010)，最後濃度為300mg/L。

在FlipR實驗之前，在37℃、含有5%二氧化碳及95%濕度之培養箱中，在由Hanks'平衡鹽液(HBSS；Invitrogen編號14065049)(補充有fluo-4 AM：2μM(給出的所有數據均為最後濃度)；Pluronic® F-127：0.05%(vol/vol)(Invitrogen，編號P-3000MP)；HEPES：20mM(Gibco編號15630)；本尼米德(probenecid)：2.5mM(Sigma編號P-8761)；牛血清白蛋白(BSA)：0.05%(Sigma編號A-6003)，用氫氧化鈉調節至pH 7.5)組成的染料荷載緩衝液中，將細胞與fluo-4乙醯氧基甲酯(fluo-4 AM，Invitrogen，#F14202)一起荷載60分鐘。在細胞荷載期間，胞內酯酶使fluo-4 AM裂解，導致在細胞內捕集染料fluo-4。在細胞洗滌器(Tecan Power洗滌器)中，用先前列舉之緩衝液洗滌細胞三次，但不用fluo-4 AM及BSA，使荷載終止。後面此種緩衝液在隨後的細胞螢光量測中亦用作緩衝液。

隨後，用各種濃度之各別化合物刺激經染料荷載及洗滌之細胞，以DMSO溶液(DMSO之最大最終濃度為0.3% vol/vol)形式加入該等化合物，或僅用各別濃度之S1P(最終濃度100nM)(在DMSO中)刺激(陽性對照)。激活S1P受體之化合物引起胞內鈣從內部儲備中釋放，導致fluo-4螢光信號極大地暫時升高，經約3分鐘監測該信號。與反應於S1P陽性對照之最大螢光相比較，由最大螢光反應來測定由試驗化合物所引起之百分比活化。用基線螢光值校正所有螢光值，由僅用DMSO預培養且未用S1P處理之細胞獲得基線螢光值(基線對照)。一式三份地進行所有量測。由各種濃度下之活化計算EC₅₀值。

2. Chem細胞

GPCRProfiler®分析(源於Millipore)用於測定化合物A、BAF-312及芬戈莫德對於S1P₁、S1P₂、S1P₃、S1P₄或S1P₅受體之EC₅₀活性。此等分析使用ChemiScreen GPCR穩定的細胞株。

3. HSC

將人類HSC(Sciencell)以每孔25×10³個細胞播種於96孔多孔盤中，100μL/孔，且在含有1%補充物(Sciencell SC5352)及2% FCS之完全培養基(Sciencell SC5301)中附著24小時。用含有2% FCS但不含補充物之Sciencell培養基替換培養基，另外培養24小時。洗滌細胞，且放入100μL分析緩衝液(HBSS，0.8mM MgSO₄，20mM Hepes，3.3mM Na₂CO₃，1mM CaCl₂，10% BSA)中。在普朗尼克酸(pluronic acid)存在下，在暗處於37℃下將細胞與Fluo4-AM一起荷載1小時。除去荷載培養基，且用200μL/孔之分析緩衝液替換。在室溫下，在暗處，使細胞穩定20分鐘。將培養盤置放於FlipR器具中，加入50μl體積(5×溶液，最後濃度10μM)之化合物A或BAF-312，連續地記錄鈣螢光6分鐘。對於靈敏度降低實驗，第一次注入化合物A或BAF-312之後，將培養盤洗滌一次，且在分析緩衝液中恢復1或3小時，而後，第二次加入化合物A或BAF-312。對於對照實驗，用分析緩衝液替換第一次注入之化合物A或BAF-312，且第二次注入之化合物A或BAF-312作為參考。結果用螢光單位(FU)來表示。

b)β-抑制蛋白分析

來自DiscoverX之PathHunter® β-抑制蛋白分析用於測定化合物A、BAF-312及芬戈莫德對S1P₁、S1P₂、S1P₃、S1P₄或S1P₅受體之EC₅₀活性。在含有0.5% FBS之分析培養基中測試化合物。

c)GTPγS分析

WO2011/086079描述此方法。

d)內化作用分析

來自DiscoverX之PathHunter®激活GPCR內化作用分析用於測定化合物A、BAF-312及芬戈莫德對S1P₁受體之EC₅₀活性。在含有0.5% FBS之分析培養基中測試化合物。

e)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及HUVEC中之cAMP分析

1. CHO細胞

來自DiscoverX之Hit Hunter® cAMP分析用於測定化合物A、BAF-312及芬戈莫德對S1P₁受體之EC₅₀活性。在含有0.5% FBS之分析培養基中測試化合物。

2. HUVEC(人臍帶靜脈內皮細胞)

在毛喉素(Forskolin)處理之HUVEC細胞中，藉助於cAMP HTRF®套組(Cisbio)，評價環化AMP對化合物A、BAF-312或芬戈莫德之反應。簡言之，將HUVEC(Lonza)以每孔5×10³個細胞播種在白色96孔多孔盤(半體積)中之EGM2培養基(Lonza)中24小時。在實驗開始時，用含有Hepes(10mM)、BSA(0.1%)及IBMX(0.5mM)的存在於HBSS中之分析緩衝液替換EGM2培養基。使細胞恢復15分鐘。將化合物A、BAF-312或芬戈莫德(10nM-100μM)加入至細胞中15分鐘，而後加入毛喉素(FSK，10μM)。在用FSK處理45分鐘之後，藉由持續1小時加入MAb抗cAMP穴合物及cAMP-D2使反應終止。在培養結束時，讀取螢光(Envision，Perkin Elmer)，且按照分析套組方案計算FRET比例。按照邏輯斯諦(logistic)方程模型，使用Sanofi BIOST@T-SPEED軟體，計算化合物A、BAF-312或芬戈莫德之效能(EC₅₀值)。

f)在RPTEC細胞分析中之Akt及ERK_1/2磷酸化(在基線條件下，或在衣黴素刺激之後)

將RPTEC細胞(Lonza)以每孔0.3×10⁶個細胞播種在6孔多孔盤中之完全REBM/REGM培養基(Lonza)中24小時，每孔2mL。在900μL靜態培養基中，用血清使細胞額外饑餓24小時。在37℃下，在100μL體積下，將高濃度的化合物A(10×)加入到各孔中，持續10分鐘。當使用時，在加入化合物A之前30分鐘，加入衣黴素(100μl)。除去培養基之後，用冷PBS沖洗細胞，且在冰上、在含有1% triton、蛋白酶及磷酸酶抑制劑之100μL冷RIPA緩衝液中溶解。為了進行西方墨點法，將30μg總蛋白溶解產物裝填至4%-12% bis-tris凝膠(Invitrogen)中。在遷移及轉移之後，用抗磷酸Akt(Phospho-Ser473，Cst編號9271)及抗磷酸Erk_1/2(phopsho-Tyr202/Tyr204，Cst編號4377)探查硝化纖維膜。對膜進行光密度分析之後，抗α-Tubuline(Cst編號2144)標記之Tubuline用於歸一化。

g)在HUVEC細胞分析中之Akt及ERK_1/2磷酸化(在饑餓條件下)

將HUVEC細胞(Lonza)以每孔0.3×10⁶個細胞播種在6孔多孔盤中之完全EGM2培養基(Lonza)中24小時，每孔2mL。在900μL靜態培養基中，用血清使細胞額外饑餓24小時。在37℃下，在100μL體積下，將高濃度的化合物A、BAF-312或芬戈莫德(10×)加入到各孔中，持續10分鐘。除去培養基之後，用冷PBS沖洗細胞，且將細胞在冰上、在含有1% triton、蛋白酶及磷酸酶抑制劑之100μL RIPA緩衝液中溶解。為了進行西方墨點法，將30μg總蛋白溶解產物裝填至4%-12% bis-tris凝膠(Invitrogen)中。在遷移及轉移之後，用抗磷酸Akt(Phospho-Ser473，Cst編號2965)及抗磷酸Erk_1/2(phopsho-Tyr202/Tyr204，Cst編號4377)探查硝化纖維膜。對膜進行光密度分析之後，抗α-Tubuline(Cst編號2144)標記之Tubuline用於歸一化。

h)衣黴素引起的細胞凋亡分析

藉助於Caspase-Glo 3/7分析套組(Promega)，在RPTEC中量測化合物A對衣黴素(TN)引起之細胞凋亡的影響。簡言之，將RPTEC細胞(Lonza)以每孔30×10³個細胞播種在白色96孔多孔盤中之REGM(REBM培養基加上0.5% FCS加上Single quots，Lonza)培養基中，且附著24小時。24小時之後，用血清及不含補充物之培養基替換完全培養基(56微升/孔)。將細胞用化合物A(最終濃度0.3-30μM，7μL)預處理30分鐘，而後加入衣黴素(TN，最終濃度0.1μg/mL，7μL)。在37℃、5% CO₂下保持24小時之後，加入卡斯蛋白酶-Glo試劑，且將培養盤在搖動下置放1小時。藉助於Envision讀數器(Perkin Elmer)記錄螢光。結果用TN引起的細胞凋亡之百分比抑制來表示。

i)黏附分子分析之TNFα引起的過度表現

利用ELISA，在HUVEC中量測ICAM-1、VCAM-1及P/E-選擇蛋白表現。在100μL之體積下，將HUVEC細胞以每孔25×10³個細胞播種在96孔多孔盤中之EGM2培養基(Lonza)中，且附著24小時。24小時之後，用靜態培養基(不含補充物及血清之EGM2)替換完全培養基，持續3小時。隨後，將細胞用化合物A或BAF-312(1-30μM)預處理18 小時。然後，在不含生長因子之培養基中，將細胞用TNF-α(3ng/mL)再處理6小時。除去培養基，洗滌細胞，且在4℃下，用100μL RLC2溶液(Alphelys編號01-RLC2-RTU30)將各孔固定20分鐘。將固定的細胞用100μL HBSS洗滌兩次，而後加入抗體抗ICAM-1(編號BBA3，R&D System)、抗VCAM-1(編號BBA5，R&D System)及抗P/E-選擇蛋白(編號BBA1，R&D system)，持續1小時。充分洗滌之後，加入抗小鼠IgG HRP(編號NA931，Amersham)，持續2小時。洗滌且加入HRP基質(OPD，Sigma編號P9187)之後，讀取450nm(Envision)下之光密度。結果用TNF-α引起的黏附分子表現之百分比抑制來表示。

j)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及內皮細胞中之阻抗量測分析

1. CHO細胞

來自CEREP之阻抗分析用於測定化合物A、BAF-312及芬戈莫德對S1P₁之EC₅₀活性。

2. 內皮細胞

濃度依賴性測試化合物A、BAF-312、芬戈莫德、SEW2871及S1P(用作陽性對照)對形變之影響，利用電阻抗(X-celligence system)之變化偵測此形變，以監測S1P₁受體在人皮膚微血管內皮細胞(HDMEC)及人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)上的靈敏度降低狀況。在第1天，將初生細胞以每孔20,000個細胞播種到預先塗有膠原-I之96孔E-盤中，。黏附且繁殖24小時之後，用S1P(1μM)、化合物A(對於HDMEC：1μM；對於HUVEC：0.1、1、10μM)、BAF-312(僅在HUVEC中，1、10、100nM)、芬戈莫德(對於HDMEC：100nM；對於HUVEC：1、10、100nM)或SEW2871(僅在HUVEC中，0.1、1、10μM)第一次刺激HDMEC及HUVEC 1小時。用S1PR激動劑培養之後，將細胞用培養基小心地洗滌兩次，而後恢復5.5小時。然後，使用增加濃度之S1P(0.1、1及10μM)進行第二次刺激，評價前面第一次刺激對受體靈敏度降低之影響，且測定所得阻抗。至少一式三份地進行所有測定。在HDMEC中，所有第一次刺激之濃度大於EC₉₀。結果用平均值+/-s.e.m形式之隨機阻抗單位來表示。

5. 活體內藥理學

a)腎臟缺血再灌注(I/R)損傷之大鼠模型

在腎臟缺血之前一個小時，使雄性Fischer大鼠(n=3-9，250至300g)(Charles River Laboratory,France)接受化合物A(0.3、1及3mg/kg)或BAF-312(3、10及30mg/kg)或每日及(0.6%甲基纖維素-0.5% tween 80，在水中)之口服投藥，投藥體積在2mL/kg之內。在第二組實驗中，在5天期間每天兩次投與化合物A，以評價潛在的快速減敏性。簡言之，在戊巴比妥(50mg/kg，腹膜內)麻醉下，對動物進行假手術(亦即剖腹手術，腎動脈分離)或進行25分鐘雙側腎動脈閉塞。為了使手術過程標準化且限制個體差異，小心地監測體溫(37℃-38℃)及水化狀況(腹膜注射生理血清)。在缺血時間結束時，除去夾鉗，使腎臟再灌注，且控制再灌注之特性，而後縫合肌肉及皮膚(將再灌注差之動物立即排除)。二十四小時後，收集血液及腎臟。將血液離心(3000g，10分鐘)，將肝素化血漿冷凍，且使用生物化學分析器(P400，Horiba，France)評價肌酸酐。將一個腎冷凍，進行西方墨點法分析，評價組織白蛋白(抗白蛋白，Santa Cruz)及組織HSP70(單株抗HSP70抗體，獲自Santa Cruz，編號SC32239)，將第二個腎固定(10%中性-緩衝的福爾馬林)且用石蠟包埋，在5μm厚切片上進行組織分析(急性腎小管壞死定量，使用傳統的蘇木精-紅螢素-Saffran，改質之Masson's三色(trichrome)及過碘酸-希夫氏(Schiff)相關阿新藍(blue alcine))及免疫組織化學分析(用單株抗CD68抗體染色之巨噬細胞，獲自Acris，編號BM4000，用單株抗PECAM抗體染色之毛細管，獲自Santa Cruz，編號SC1506，使用Ventana robot，VMS Inc.)。用腎皮質延髓區域之12-15區域中所呈現之細胞壞死之腎小管的百分比來表示急性腎小管壞死。用正圖像數(Aperio算法)占全部之百分比來表示CD68及PECAM免疫標記。血漿肌酸酐用平均值+/-s.e.m來表示。

b)橫紋肌溶解引起的腎損傷之小鼠模型

在注射甘油之前一個小時，使Swiss(CD1)雄性小鼠(n=5-15，13-14週大)(Charles River Laboratory,France)接受化合物A(0.3、1、3及10mg/kg)或媒劑(0.6%甲基纖維素-0.5% tween 80，在水中)之口服投藥，投藥體積在10mL/kg之內。在戊巴比妥(33mg/kg)及氯胺酮(40mg/kg)麻醉下，將8mL/kg之甘油(50% v/v，在PBS中)或媒劑(PBS)肌內注射到後肢中(每個腿、腓腸肌及股直肌注射2次)。二十四小時後，收集血液，離心(3000g，10分鐘)，將肝素化血漿冷凍，且使用生物化學分析器(P400，Horiba，France)評價肌酸酐。結果用平均值+/-s.e.m來表示。

結果

為了證明根據本發明之化合物(即化合物A)在AKI環境下之活性及其相對於S1P₁功能性拮抗劑之差別，對其進行各種活體外及活體內實驗。

1- 心血管功能安全性

雖然化合物A為沒有功能性拮抗作用之S1P₁激動劑，但是，潛在的靶向可能與S1P₁功能性拮抗劑相似。迄今為止，對於S1P_1/3/4/5化合物、芬戈莫德之混合物，已獲得最多的臨床經驗，其引起房室阻滯及心動過緩(Schmouder等人2006,J Clin Pharmacol 46：895-904)。還有很多臨床前證據，證明S1P₃涉及此等心臟毒性，由此，為了克服此等限制，該領域已開始鑑定選擇性S1P₁化合物。然而，進入到臨床階段的選擇性S1P₁化合物似乎亦引起心動過緩(Gergely等人2012,BJP 167：1035-1047)，但目前其對房室阻滯之影響仍為未知的。由此，為了評價化合物A之潛在心臟中毒，除了常規研究之外，還進行了許多研究。在hERG試驗中，化合物A之IC₅₀值大於30μM。在兔浦肯野纖維試驗中，0.3至10μM之試驗化合物無顯著影響，不過，在26μM時觀察到作用電位減小。

在狗遙測研究中，在30或100mg/kg經口及10或30mg/kg靜脈內(輸液30分鐘)時，未觀察到對心率或房室傳導阻滯或任何其他ECG參數之影響。在兩個劑量下，血壓無顯著變化。

2- 體內腎臟藥理學

腎臟缺血再灌注(I/R)損傷之大鼠模型用於模擬患者進行心臟手術之後引起的腎臟損傷。在該模型中，化合物A顯著降低(85-90%)AKI之嚴重程度，此可藉由限制血清肌酸酐(臨床上有效的生物標誌)之升高而得到反映(圖1A代表5個獨立的研究)。影響為劑量依賴性的，且在1及3mg/kg經口時為統計上顯著的(圖1A)。組織分析表明，化合物A藉由防止白蛋白溢出(圖1C)及保護毛細管而對血管系統具有直接影響。化合物A還防止腎臟近端小管壞死、降低巨噬細胞滲透及升高腎臟HSP70蛋白(與腎臟缺血性損傷之後的修復相關之標誌)。化合物A未顯示快速減敏之跡象，相比於單一給藥，在每天兩次重複給藥5天之後仍保持相似活性(圖1D)。

在患者中，橫紋肌溶解為AKI的另一種顯著病因，且藉由肌內注射甘油而在小鼠中再現。甘油引起漸進性肌肉損傷，同時釋放肌紅蛋白，隨後產生腎臟功能障礙。正如在I/R模型中所觀察到的，在該模型中，化合物A防止顯著(在10mg/kg經口時，約85%)及劑量依賴性腎功能惡化(n=3個獨立的研究)(圖2)。

在腎臟缺血再灌注模型中，化合物A之影響類似於S1P₁-選擇性功能性拮抗劑BAF-312之影響。在活體外分析(包括內皮試驗，參見表1) 中，BAF-312對於大部分S1P₁之效果至少為10倍以上，且在大鼠中具有與化合物A相似之血漿/腎接觸量。然而，儘管BAF-312之效能/接觸性能提高，但是，在缺血再灌注模型中，其未使血清肌酸酐降低40%以上，即使在高達30mg/kg經口之劑量下(圖1B)。

3- 淋巴球減少性活性之差別

通過S1P₁活化S1P決定淋巴細胞從淋巴結流出到血液中。此S1P₁活化引起受體內化作用，而後受體再循環回到細胞表面，進行重新活化。然而，S1P₁功能性拮抗劑(芬戈莫德、BAF-312)引起內化S1P₁之降解，由此導致細胞表面S1P₁之顯著及持續減少。因此，正如臨床前及臨床上所觀察到的，S1P₁功能性拮抗劑使血液淋巴細胞大量及持續減少。(Mandala等人2002,Science 296：346-349；Gergely等人2012,BJP 167：1035-1047)。

果然，在大鼠中，BAF-312引起極度(約80%)及持續的淋巴球減少(圖3A、圖3B)。此狀況即使在劑量低至1mg/kg經口(最低檢驗劑量)時仍很明顯。在大鼠AKI模型中部分有效的2個劑量為高劑量(10及30mg/kg經口，圖1B)，且代表高度淋巴球減少性劑量。與此相反，1及3mg/kg經口之化合物A未顯示淋巴球減少狀況，即使在大鼠中每天兩次重複給藥(3mg/kg p.o)5天之後(圖3C)。高劑量的化合物A顯示出劑量依賴性淋巴球減少狀況，但是，此等劑量代表比充分AKI保護作用所需要劑量更高的劑量。

類似地，在3及10mg/kg時，未在小鼠中觀察到化合物A之淋巴球減少性活性(圖4)，該劑量為在甘油引起的橫紋肌溶解模型中具有活性之劑量(圖2)。

在狗中，在3mg/kg經口時，化合物A為非淋巴球減少性的(圖5A)。在狗中，此非淋巴球減少性劑量已提供接觸量(Cmax及AUC)，此接觸量超過在大鼠中充分AKI保護作用所需之接觸量(3mg/kg)(表 4)。在狗中，在10及30mg/kg經口之高劑量下，化合物A僅引起短暫的淋巴球減少(圖5A)。與此相反，3mg/kg經口之BAF-312引起淋巴細胞之極度(I_max，約80%)降低，此需要至少60天才可恢復(圖5B)。

化合物A為獨特的S1P₁激動劑，因為其在非淋巴球減少性劑量下第一次顯示出強烈AKI保護作用(圖3D)。雖然其他S1P₁化合物(例如芬戈莫德及SEW2871)在AKI模型中亦具有活性，但其僅在淋巴球減少性劑量下才有效果(Awad等人2006,Am J Physiol Renal Physiol 290：F1516-F1524；Sanna等人2004,JBC 279：13839-13848；Lai等人2007,Kidney Int 71：1223-1231)。

此等體內數據證明，化合物A可用作在非淋巴球減少性劑量下產生AKI保護作用之S1P₁激動劑。化合物A尤其不同於本文描述之BAF-312，以及特別用於淋巴球減少劑(例如，用於自身免疫疾病)之其他S1P₁功能性拮抗劑。

4- 內皮屏障完整性之差別

S1P₁功能性拮抗作用與內皮破壞作用有關。在用芬戈莫德治療之多發性硬化患者中，黃斑及肺水腫為突出的不利狀況(Jain及Bhatti,2012,78：672-680)。

吾人發現，長期口服投與健康小鼠芬戈莫德，能夠產生顯著的血管滲漏(圖6A、6B)，此與臨床發現一致。在1及3mg/kg每天兩次時，選擇性S1P₁激動劑BAF-312甚至在肺中引起更大的血管滲漏(圖6A、6B)。此等發現與先前的報道相符，先前的報道指出，在肺中，S1P₁功能性拮抗劑改變內皮屏障完整性，且促進血管蛋白溢出(Shea等人2010,Am J Respir Cell Mol Biol43：662-673)。與此相反，化合物A未增加血管滲漏(在3及10mg/kg時，在小鼠中提供充分的AKI保護作用的代表性劑量)(圖6A、6B)。類似地，在Fisher大鼠中，在1及3mg/kg(代表AKI有效劑量)或甚至更高劑量(10mg/kg)時，化合物A未引起肺血管滲漏。與此相反，在3mg/kg(無效的AKI劑量)以及30mg/kg(部分有效的AKI劑量)時，BAF-312引起大鼠的血管滲漏。

考慮到所觀察到的BAF-312的內皮損傷性能(圖6)，BAF-312的保護性能可以被其內皮有害影響抵消，產生所觀察到的部分保護作用(圖1B)。內皮損傷為許多S1P₁功能性拮抗劑的顯著特徵(圖6及公開的數據)。因此，在內皮保護性劑量而非內皮損傷劑量下，化合物A之新特性提供防止急性腎損傷的機會。

5- 活體外藥理學

化合物A顯示為有效的S1P₁激動劑。在過表達人類S1P₁的CHO細胞中(G-融合)，鈣動員分析中之EC₅₀值為31nM，β-抑制蛋白分析中之EC₅₀值為656nM，GTPγS分析中之EC₅₀值為206nM，內化作用分析中之EC₅₀值為213nM(表1)。

化合物A未顯示功能性拮抗性能，亦未引起受體靈敏度降低(圖7至圖10)。在四個獨立的活體外系統中表明此差別，其中兩個系統使用在內皮細胞HDMEC(人皮膚微血管內皮細胞)及HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)中進行之阻抗測量，兩個系統使用在CHO細胞及HSC細胞(肝星形細胞)中進行的FlipR分析。用化合物A預培養(而後為洗滌步驟)，用S1P(圖7至圖9)或化合物A(圖10)幾乎完成第二次刺激。然而，用功能性拮抗劑預培養，阻礙用S1P(圖7至圖9)或BAF-312(圖10)進行充分的第二次刺激。在HUVEC阻抗試驗中，將各化合物開始鈍化S1P₁引起的阻抗反應時之濃度與該分析之絕對EC₅₀值進行比較。BAF-312在5×EC₅₀值時開始靈敏度降低，SEW2871在20×EC₅₀值時開始靈敏度降低，而對於化合物A，在高達60×EC₅₀值時仍未觀察到靈敏度降低。

圖7至圖10中之數據表明，功能性拮抗劑(芬戈莫德、BAF-312、SEW2871及珀斯莫德)引起持續的受體靈敏度降低。

相比於BAF-312或芬戈莫德，化合物A對S1P₁信號途徑顯示不同相對效能(表1)。就蛋白而言，由於試驗之間的試驗條件不同，藉由在CHO試驗中對於cAMP、β抑制蛋白及內化效能進行比較(使用相同培養基條件)，吾人排除蛋白結合對相對效能的可能影響。如表2所示，相比於內化或β-抑制蛋白，化合物A(相對於BAF-312及S1P)更偏向於cAMP之活化。

在人腎小管上皮細胞(RPTEC)中，化合物A以濃度依賴性方式產生存活標誌pERK及pAKt，在基礎條件下之EC₅₀值為約3μM，或在衣黴素損傷之後，EC₅₀值為約10μM。此促存活效果在血清饑餓之後的人類內皮細胞中更有效，對於P-Akt，EC₅₀值為101nM，對於P-ERK_1/2，EC₅₀值為190nM。此外，在藉由卡斯蛋白酶3/7活性評價之RPTEC中，化合物A抑制衣黴素引起的細胞凋亡，EC₅₀值為約3-10μM。

對於三個人類內皮細胞類型(HPAEC、HUVEC及HRGEC)，不同於BAF-312，化合物A使TNFα引起的黏附分子(包括ICAM-I、VCAM-I及P/E選擇蛋白)的過度表現降低。已知的是，在AKI患者之血漿樣品中，此等內皮功能障礙標誌被上調(Sadik等人2012,Mol Cell Biochem 359：73-81)，且參與炎性細胞進入到腎小管間質空間中之滲透過程。

化合物A對於S1PR家族中之其他受體(表3)、CEREP中之110個以上的標靶、超過216種激酶及離子通道中之5個以上的標靶具有誘人的選擇特性。如表3所示，相比於芬戈莫德，化合物A為更具選擇性之S1P₁激動劑。對S1P₂及S1P₃缺乏活性為特別重要的，因為，據報導，這些受體對抗S1P₁在內皮細胞上之功能。

「-」意謂未測定。

化合物A對一些信號途徑(例如cAMP)的優先活化，同時對其他途徑(例如內化、β-抑制蛋白)之效能較弱，提供AKI所需之特性(亦即受體靈敏度降低最小、無持續淋巴球減少狀況、內皮保護作用)。此與S1P₁功能性拮抗劑BAF-312及芬戈莫德在多發性硬化中之表現形成對比(高受體靈敏度降低、強烈的淋巴球減少-內皮損傷為非所需副作用)。此特性明確說明化合物A可作為新類別的偏向S1P₁之激動劑。

結論

此等臨床前數據表明，化合物A對於AKI的許多機制終點具有極大影響，包括：明顯保持內皮屏障功能，以及降低腎小管壞死及巨噬細胞炎症。化合物A之所有AKI保護性劑量(在小鼠及大鼠中)為非淋巴球減少性劑量，且當在狗中達到相應接觸量時，化合物A仍為非淋巴球減少性的。由於化合物A在所有AKI保護性劑量下是為非淋巴球減少性的，所以，其AKI保護作用之機理與淋巴球減少無關。化合物A對於內皮及上皮細胞具有直接保護作用，此可能為其在AKI中之作用機理。

這與具有不同信號特性的S1P₁化合物存在的狀況形成對比，且為：i)S1P₁功能性拮抗劑，ii)內皮損傷，以及iii)在淋巴球減少性劑量下，在I/R引起的AKI中僅具有有限的活性。

化合物A為治療AKI患者提供新機會，不引起淋巴球減少，且由此避免相應的副作用(包括感染)。因此，在目前對患者無合適藥物的領域中，該化合物具有改變治療的潛力。

圖1：在大鼠缺血-再灌注(I/R)模型中，單次或重複投與化合物A 及/或BAF-312之效果。

圖2：化合物A對於小鼠中橫紋肌溶解引起之AKI損傷的影響。

圖3：單一給藥之後的Fischer大鼠中之周邊血液淋巴細胞(圖3-A)或(圖3-B)單一給藥或(圖3-C)重複給藥之後的Sprague-Dawley大鼠中之周邊血液淋巴細胞。

圖4：C57Bl6/J小鼠中之周邊血液淋巴細胞。

圖5：小獵犬中之周邊血液淋巴細胞。

圖6：健康C57Bl6/J小鼠及Fischer大鼠中之肺血管滲漏。

圖7：使用阻抗分析，S1P₁受體在人皮膚微血管內皮細胞(HDMEC)上之靈敏度降低。

圖8：使用阻抗分析，S1P₁受體在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)上之靈敏度降低。

圖9：使用FlipR分析，S1P₁受體在過度表現S1P₁(G-融合)之CHO細胞上的靈敏度降低。

圖10：使用FlipR分析，S1P₁受體在人類肝星形細胞(HSC)上之靈敏度降低。

圖11：在C57Bl6/J小鼠中，I/R損傷之後的血漿S1P之時程。

Claims

一種{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療AKI(急性腎損傷)。
如請求項1之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸當投與AKI保護劑量時不引起淋巴球減少症，且當投與較高劑量時，引起有限的淋巴球減少症。
如請求項1或2之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其用作非淋巴球減少劑。
如請求項1或2之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中當投與AKI保護劑量時，其無淋巴球減少性效果。
如請求項1之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸當投與非淋巴球減少性劑量時為AKI保護性的。
一種{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療AKI(急性腎損傷)，其中，{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸為不引起受體靈敏度降低之選擇性S1P₁激動劑。
一種{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，其在無淋巴球減少效果之情況下用於預防或治療AKI。
一種藥物，其含有作為活性成分的{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽。
一種醫藥組合物，其包含作為活性成分的如請求項1至7中任一項所用之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種在需要之患者中治療AKI之方法，其包含：向該患者投與治療有效量之{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項10之方法，其中該治療為預防性的。
一種製品，其包含：包裝材料；醫藥組合物，其包含作為活性成分的{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之賦形劑；及包含於包裝材料內之標籤或包裝說明書，其表明可用該醫藥組合物治療患者之AKI。
如請求項12之製品，其中，包含於包裝材料內之標籤或包裝說明書表明可在無淋巴球減少性效果之情況下用該醫藥組合物治療患者之AKI。
如請求項12或13之製品，其中，該治療為預防性的。