KR20160058408A

KR20160058408A - Msm을 포함하는 angptl3 발현 저해제 및 이를 유효성분으로 포함하는 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20160058408A
Application number: KR1020140159789A
Authority: KR
Inventors: 양영목; 강동영; 프리타 니핀 스리칸탄
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2014-11-17
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2016-05-25
Also published as: KR101666130B1

Abstract

본 발명은 MSM(Methylsulphonylmethane)을 포함하는 ANGPTL3 발현 저해제, 상기 ANGPTL3 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 케토시스와 관련 인자로서 ANGPTL3, GHR, STAT5b 및 IGF-1Rβ의 상관관계를 규명함으로써 케토시스 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보이며, 또한 상기 상관관계를 통해 관련 약물 스크리닝에도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.

Description

MSM을 포함하는 ANGPTL3 발현 저해제 및 이를 유효성분으로 포함하는 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물 {ANGPTL3 EXPRESSION INHIBITOR COMPRISING METHYLSULPHONYLMETHANE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING KETOSIS COMPRISING THE SAME AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 MSM(Methylsulphonylmethane)을 포함하는 ANGPTL3 발현 저해제, 상기 ANGPTL3 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

케토시스(ketosis)는 글루코오스를 에너지원 대신에 케톤체를 사용하는 상태를 말한다. 체내의 지방대사가 증가할 때 고농도의 케토시스로 인체는 위험한 상태가 된다. 글루코오스가 체내에서 줄어들게 되면 간에서는 에너지를 글루코오스로 만들어야 하기 때문에 지방을 태우기 시작한다. 이 결과로 케톤체는 케토시스의 상태에서 만들어지게 되는 것이다.

케토시스는 지방 대사와 탄수화물대사에 많이 연관되어있다. 몸이 빠르게 저농도의 글루코오스를 사용하는 조건이면, 대사는 해당과정으로 바꾸기 위해 인체는 탄수화물이 많은 음식을 섭취할 될 때까지 대사가 케토시스 상태로 변화되어 있는다. 고농도의 케토시스는 매우 위험하며, 혈액의 산도를 높이고 간과 신장의 정상적 기능에 영향을 준다. 이에 케토시스와 관련된 많은 연구가 진행되고 있으며, 일례로서 <Loor et al. 2007>에는 GHR(Growth hormone receptor)의 발현이 케토시스를 하향 조절하는 것을 기재하고 있다.

한편, MSM(Methylsulphonylmethane)은 야채 및 과일과 같은 음식에 주로 존재하는 자연적인 유기황화합물이다. 상기 MSM은 다양한 암에 대한 항암 작용, 항산화 작용, 항 면역성 메커니즘에 주요하게 작용함이 알려져 있다.

Loor et al. Nutrition-induced ketosis alters metabolic and signaling gene networks in liver of periparturient dairy cows, Physiol Genomics. 32(1):105-116, 2007.

본 발명은 분자생물학적으로 케토시스와 관련된 분자들간의 상관관계를 규명함으로써, 케토시스에 대한 분자 표적 치료법 및 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결고자자, 본 발명은 MSM(Methylsulphonylmethane)을 포함하며, STAT5b의 발현을 증가시킴에 따라 ANGPTL3 발현이 저해되는 것을 특징으로 하는, ANGPTL3 발현 저해제를 제공한다.

일 구현예는 30mM 내지 40mM의 MSM을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 ANGPTL3 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

일 구현예는 ANGPTL3 발현 저해제가 30mM 내지 40mM의 MSM을 포함하는 것일 수 있다.

다른 일 구현예는 조성물이 IGF-1Rβ(Insulin-like growth factor 1 receptor)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 조성물이 GHR(Growth hormone receptor)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 케토시스가 당뇨병성 케토시스인 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 환제, 산제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 및 과립제로 이루어진 군에서 선택되는 제제로 제형화된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 케토시스(ketosis) 샘플을 준비하는 단계, 후보 물질을 상기 샘플에 처리하는 단계, 및 상기 샘플에서의 ANGPTL3, GHR, STAT5b 및 IGF-1Rβ의 발현량을 확인하는 단계를 포함하고, 상기 확인하는 단계에서 GHR, STAT5b 및 IGF-1Rβ의 발현량이 후보 물질 처리 전보다 증가하고, ANGPTL3의 발현량이 후보 물질 처리 전보다 감소하는 경우 상기 물질을 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물로 결정하는 것을 특징으로 하는, 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구현예는 케토시스 샘플이 글루코오스가 없거나 3% 이하의 글루코오스가 함유된 배지에서 배양되어 케토시스 상태가 유도되어진 것일 수 있다.

다른 일 구현예는 케토시스 샘플이 글루코오스를 함유하지 않거나 3% 이하의 글루코오스가 함유된 배지에서 배양되어진 FL83B 세포인 것일 수 있다.

본 발명은 케토시스와 관련 분자로서 ANGPTL3, GHR, STAT5b 및 IGF-1Rβ의 상관관계를 규명함으로써 케토시스 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보이며, 또한 상기 상관관계를 통해 관련 약물 스크리닝에도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.

도 1은 MSM 처리 농도에 따른 대조군(MSM 비처리군) 대비 세포 활성도를 나타낸 것이다.
도 2는 BHB의 스탠더드 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 저농도 글루코오스 조건, 고농도 글로코오스 조건, 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리 조건, 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리 조건에서의 BHB 수준을 나타낸 것이다.
도 4는 비처리군과 비교하여 저농도 글루코오스 조건, 고농도 글로코오스 조건, 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건, 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건에서의 BHB 수준을 나타낸 것이다.
도 5는 3%의 저농도 글루코오스 조건, 9%의 고농도 글로코오스 조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건에서의 GHR의 발현을 웨스턴 블롯팅 결과로 나타낸 것이다.
도 6은 β-action을 기준으로 GHR의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 3%의 저농도 글루코오스 조건, 9%의 고농도 글로코오스 조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건에서의 ANGPTLS의 발현량을 웨스턴 블롯팅 결과를 통해 나타낸 것이다.
도 8은 18s를 기준으로 ANGPTLS의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 3%의 저농도 글루코오스 조건, 9%의 고농도 글로코오스 조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건에서의 ANGPTLS의 발현량을 웨스턴 블롯팅 결과를 통해 나타낸 것이다.
도 10은 β-action을 기준으로 ANGPTLS의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 3%의 저농도 글루코오스 조건, 9%의 고농도 글로코오스 조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건에서의 pSTAT5b(인산화된), STAT5b, IGF-1Rβ, pIGF-1Rβ(인산화된)의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 실시예 6에 따른 EMSA 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 3%의 저농도 글루코오스 조건, 9%의 고농도 글로코오스 조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건, 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건에서의 pSTAT5b, STAT5b의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.
도 14는 실시예 7에 따른 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 β-action을 기준으로 STAT5b과 ANGPTL3의 발현 정도를 나타낸 것이다.

본 발명은 MSM(Methylsulphonylmethane)을 포함하는 ANGPTL3 발현 저해제, 상기 ANGPTL3 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 MSM 처리 시, ANGPTL3의 전사인자인 STAT5b와 하류 표적 분자인 IGF-1Rβ, GHR의 발현이 증가하는 반면, ANGPTL3의 발현이 감소함을 확인함으로써, 케토시스 관련 분자 조절을 통해 케토시스의 치료 방법을 제시하는 것에 특징이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 MSM(Methylsulphonylmethane)을 포함하며, STAT5b의 발현을 증가시킴에 따라 ANGPTL3 발현이 저해되는 것을 특징으로 하는 ANGPTL3 발현 저해제를 제공한다.

상기 ANGPTL3 발현 저해제는 30mM 내지 40mM의 MSM을 포함할 수 있다. 30 mM 미만의 MSM이 포함되는 경우 ANGPTL3의 발현 저해가 효과적으로 이루어지지 않을 수 있으며, 40mM 초과의 MSM이 포함되는 경우 독성으로 인한 부작용이 발생할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 ANGPTL3 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 케토시스(ketosis, 케톤증이라고도 알려짐) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 STAT5b의 하류 표적 분자로서 IGF-1Rβ(Insulin-like growth factor 1 receptor)의 발현을 증가시키는 것일 수 있으며, GHR(Growth hormone receptor)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 케토시스는 당뇨병성 케토시스(당뇨병성 케톤증)일 수 있다. 당뇨병성 케토시스는 당뇨병(제1유형 당뇨병, 제2유형 당뇨병 등)을 앓는 환자에게서 관찰되는 케토시스를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 세포독성이 없으면서도 케토시스 관련 분자들을 조절하여 케토시스를 억제하는 작용이 매우 우수한 것이 특징이다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 케토시스 샘플은 글루코오스가 없거나 3%(1.26g/L) 이하의 글루코오스가 함유된 배지에서 배양되어 케토시스 상태가 유도되어진 것일 수 있다. 상기 샘플은 사람을 포함하는 영장류, 설치류 등으로부터 유래하는 것으로 바람직하게 사람에서 채취한 샘플일 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물의 생체 또는 생체로부터 분리된 조직 또는 세포일 수 있다. 예컨대, 상기 케토시스 샘플은 글루코오스를 함유하지 않거나 3% 이하의 글루코오스가 함유된 배지에서 배양되어진 FL83B 세포일 수 있다.

상기 ANGPTL3, GHR, STAT5b 및 IGF-1Rβ의 발현량은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용 되어지는 단백질 정량 분석 방법에 따라 수행될 수 있으며, 바람직하게는 웨스턴 블롯팅으로 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

[ 참조예 ]

1. 항체 및 시약 ( Antibodies and reagents )

실시예에 사용된 시약 및 항체는 하기 표 1과 같다:

시약 및 항체	입수처
F-12K 배지	Life Technologies
D-glucose	Sigma Chemical
MSM(methylsulfonylmethane)	Sigma Chemical
페니실린-스트렙토마이신 용액(Penicillin-streptomycin solution)	Hyclone
FBS(Fetal bovine serum)	Hyclone
0.05% trypsin-EDTA	Gibco-BRL
STAT5b 항체	Santa Cruz Biotechnology
IGF-1Rβ항체
GHR 항체
ANGPTL3 항체
2차 항체(goat anti mouse 및 rabbit IgG-horseradish peroxidase)
인산화된 IGF-1Rβ항체	Cell Signalling Technology
인산화된 STAT5	Upstate Biotechnology
β-actin	Sigma Chemical Co.
ECL plus(The enhanced chemiluminescence) 검출 키트	Amersham Pharmacia Biotech
Restore™Western Blot Stripping Buffer	Pierce
NE-PER kit	Pierce
RNeasy mini kit	Qiagen
Qiaprep spin miniprep kit	Qiagen
RT-PCR Premix kit	Bioneer
18s 프라이머(RT-PCR)	Bioneer
ANGPTL3 프라이머	Integrated DNA Technologies
EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) kit	Promega Corp
STAT5b (oligonucleotide probes)	Promega Corp
β-hydroxybutyrate (ketone body) colorimetric assay kit	Cayman Chemical Co.

2. 세포 배양 및 처리( Cell culture and treatment )

마우스 간세포인 FL83B 세포주를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 F-12 배지에서 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양하였으며, 상기 세포는 밀폐된 챔버에 두었다. 실험의 각 초기에는 상기 세포를 2.5 ×10⁵ cells/ml로 하여 배지에 재현탁하였으며, 세포에는 30 mM의 9% D-글루코오스와 40 mM의 MSM로 처리하였다.

3. 세포 증식 저해( Cell proliferation inhibition )

세포 활성은 MTT assay를 통해 분석하였다.

구체적으로, 세포는 MSM 처리 전, 96-웰(well) 플레이트에 3x10³ cells/well로 재현탁하였으며, 대조를 위해 액상 배지는 교환하여 주었고, 세포는 여러 농도의 MSM 처리 상태에서 배양하였다. MTT (5mg/ml)를 각 웰에 첨가하였고, 37℃ 조건에서 4시간 배양하였다. 포르마잔(formazan) 생성물은 200ul DMSO(dimethylsulfoxide)를 각 웰에 첨가함으로써 용해시켰고, 흡광도는 Ultra Multifunction Microplate Reader(TECAN)를 이용하여 550nm에서 측정하였다.

4. 베타히드록시부티레이트 비색분석법(β- hydroxybutyrate colorimetric assay )

BHB의 측정은 베타히드록시부티레이트 (케톤체) 비색분석법 키트를 이용하여 수행하였다.

구체적으로, FL83B 세포(~18x10⁶)는 콜드 다이루티드 어세이 버퍼(cold diluted assay buffer)에서 초음파로 분쇄한 후 원심분리기를 통해 수집하였으며, 상등액을 제거하고 콜드 다이루티드 어세이 버퍼에서 재현탁하였다. 베타히드록시부티레이트 기준 웰과 샘플 웰을 준비하여 디벨로퍼 용액(developer solution)을 첨가함으로써 반응을 시작하였고, 배양은 빛이 없는 25℃ 조건에서 30분간 배양하였으며, 흡광도는 450nm에서 측정하였다.

5. 웨스턴 블랏팅( western blotting )

정해진 시간에 FL83B 세포주에 30mM 고농도(9%)의 글루코오스와 40mM MSM을 처리하였다. 전체 세포들은 포스포타아제와 프로테아제 저해제를 포함하는 RIPA(radioimmunoprecipitation) 용해 버퍼로 용해시켰으며, 23 구경(gauge)의 바늘로 용해된 세포를 풀어주었고, 세포 잔해물을 제거하기 위하여 4℃, 15,000rpm 조건에서 10분간 원심분리하였다.

단백질의 농도는 브래드포드 정량법(Bradford assay)를 통해 측정하였다. 단백질의 동일량을 SDS-PAGE에 리졸브시키고 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)에 옮겼으며, 블랏들을 5% 탈지유(skim milk)에 1시간동안 블락(block)시켰다. 상기 막은 HRP 컨쥬게이티드 2차 항체가 연결된 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 둠으로써 탐지하였으며, 검출은 ECLplus detection kit 및 LAS-4000 imaging device(Fujifilm)을 이용하여 수행하였다.

6. RT - PCR

FL83B 세포주에 24시간 동안 30mM 고농도(9%)의 글루코오스와 40mM MSM을 처리하였다. 총 RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 수행하였고, 정량은 260nm에서 분광분석에 의해 이루어졌다.

ANGPTL3 및 18s RNA의 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하였는데, first strand cDNA synthesis kit (Bioneer)를 이용하여 42℃에서 1시간 및 80℃에서 15분간의 조건에서 총 RNA로부터 cDNA의 역전사가 이루어졌다.

PCR은 cDNA를 이용하여 수행하였는데, ANGPTL3의 PCR 조건은 하기와 같으며, PCR 산물은 브롬화에티듐(ethidium bromide)으로 염색된 1% 아가로스 겔로 분석하였다.

50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초와 60℃에서 40초의 40 싸이클

7. EMSA( Electrophoretic mobility shift assay )

STAT5b의 DNA 결합 활성은 EMSA를 통해 측정하였는데, 라벨된 2중 가닥 DNA를 핵 추출물에서 활성 STAT5b 단백질과 결합하는 DNA 프로브로 사용하였다. 핵 추출물은 Nuclear Extract Kit (Panomics)로 준비하였고, EMSA는 TF-STAT5b 프로브(biotin-labeled transcription factor)가 처리 및 처리가 안된 핵 추출물을 가지고 실험하였다. 단백질을 비 변성된 상태로 6% PAGE 겔에 리졸브 시켰고, 겔에서의 단백질들은 나일론 막으로 이동시켰으며, 스트렙타비딘-HRP와 화학발광 기질을 이용하여 검출하였다.

8. siRNA 분석

FL83B 세포는 (1x10⁵) 6 웰 플레이트에 배양하였으며 60% 컨플루언스(confluence)가 되도록 성장시켰다. Fugene-6 (Roche)를 통해 상기 세포를 ON-TARGET plus SMARTpool siRNA targeting STAT5b 또는 ON-TARGETplus Non-targeting siRNA(Dharmacon)로 형질주입하였다. 형질주입 후, 세포에 40 mM MSM을 24시간동안 처리하였고, 단백질을 분리한 후 웨스턴 블롯팅을 통해 ANGPTL3 및 STAT5b의 발현을 분석하였다.

[ 실시예 ]

실시예 1

상기 참조예에 기재된 MTT assay에 따라 MSM 처리에 따른 FL83B 세포의 세포 활성도를 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 MSM 처리 농도(concentration of MSM)에 따른 대조군(MSM 비처리군) 대비 세포 활성도(Percentage cell viablility)를 나타낸 것이다.

도 1에 나타난 바와 같이, MSM은 마우스 간세포인 FL83B 세포의 세포 활성도를 농도 의존적으로 저해함을 확인하였다.

실시예 2

마우스 간세포에서 글루코오스 결핍을 이용하여 케토시스 세포 모델(ketosis cell model)을 제조하였으며, 케톤체의 형성으로 케토시스의 수준을 분석하였고, 케토시스의 분석은 상기 참조예에 기재된 베타히드록시부티레이트 비색분석법에 따라 수행하였다.

음성대조군으로 9%의 고농도 글루코오스 조건을 유지하여 BHB 수준을 측정하였고, 3%의 저농도 글루코오스 조건은 케토시스 군으로 사용하였다. 저농도 글루코오스 조건에서의 30mM 및 40mM MSM를 처리하였으며, BHB의 수준은 하기 수학식 1에 따라 계산하였고, 그 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

[수학식 1]

베타히드록시부티레이트(mM) = [보정된 흡광도(corrected absorbance)-(y-인터셉트)/슬로프(slope)] x 다이루션(dilution)

도 2는 BHB의 스탠더드 그래프를 나타낸 것이며, 도 3은 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리 조건(L Glc + MSM 30mM), 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리 조건(L Glc + MSM 40mM)에서의 BHB 수준을 나타낸 것이고, 도 4는 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)에서의 BHB 수준을 나타낸 것이다.

도 2 내지 도 4에 나타난 바와 같이, 고농도의 글루코오스 조건에서 BHB 수준이 50% 저해되었으며, 40mM MSM의 처리 유무에 따라 BHB 수준이 32% 정도 차이가 남을 확인하였다. 이는 MSM이 케토시스 상태에서 케톤체의 형성을 방해하는 것을 의미한다.

실시예 3

GHR 발현 수준은 무증상의(subclinical) 케토시스 상태에서 중요한 역할을 하므로, MSM 처리에 따른 케토시스로 유도된 세포에서의 GHR의 수준을 분석하였다. 상기 참조예에 기재된 바와 같이, 3%의 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리 조건L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리 조건(L Glc + MSM 40mM)에서 24시간동안 FL83B 세포를 배양한 후, 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5는 3%의 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)에서의 GHR의 발현을 웨스턴 블롯팅 결과로 나타낸 것이며, 도 6은 β-action을 기준으로 GHR의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다.

도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않는 것과 MSM을 처리한 조건에서의 GHR 발현이 비슷한 수준으로 나타남을 확인하였다. 이는 MSM 처리로 인해 항 케토시스가 나타남을 의미한다.

실시예 4

ANGPTL3(Angiopoetin like protein-3)는 케토시스를 치료하는 중요한 표적 분자이다. 이에, 참조예에 기재된 바와 같이, ANGPTL3 발현량을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 실험은 3%의 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)으로 진행하였으며, RNA 및 단백질은 MSM을 처리하고 24시간 뒤에 세포에서 분리하였고, 그 결과를 도 7 내지 도 10에 나타내었다.

도 7 및 9는 3%의 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)에서의 ANGPTLS 의 발현량을 웨스턴 블롯팅 결과를 통해 나타낸 것이며, 도 8은 18s를 기준으로 ANGPTLS의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이고, 도 10은 β-action을 기준으로 ANGPTLS의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다.

도 7 내지 도 10에 나타난 바와 같이, ANGPTL3 발현은 케토시스 상태에서 상향조절됨을 확인하였다. 저농도 글루코오스 조건과 비교하였을 때, 고농도 글루코오스 조건에서의 ANGPTL3 발현량은 감소하였고, MSM을 30 mM과 40 mM 처리한 그룹에서도 또한 ANGPTL3의 발현이 감소하였음을 확인하였다. 이는 MSM에 의한 ANGPTL3 억제능이 케토시스를 억제함을 의미한다.

실시예 5

STAT5b는 ANGPTL3의 전사인자이다. 이에, 활성화된 STAT5b와 이의 하류 표적 분자인 IGF-1Rβ에 대해 분석하였다. 실험은 3%의 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)으로 진행하였으며, 단백질은 전체 세포의 용해물로부터 분리하여 참조예에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 수행하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11은 3%의 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)에서의 pSTAT5(인산화된), STAT5b, IGF-1Rβ, pIGF-1Rβ(인산화된)의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.

도 11에 나타난 바와 같이, 고농도 글루코오스 조건에서 STAT5b 및 IGF-1Rβ의 발현 수준이 증가하였고, MSM 처리군도 같은 결과를 보임을 확인하였다. 이러한 결과는 GHR 발현을 상향조절 시키는 패턴과 유사한 결과를 보였고, 이는 STAT5b가 ANGPTL3로 작용함을 의미한다.

실시예 6

상기 실시예 5와 같이 세포 용해물에서 확인한 STAT5b의 발현은 MSM의 처리에 의해서 상향조절 됨을 확인하였다. 이에, TAT5b/DNA(GAS element) 결합 활성을 상기 참조예에 기재된 바와 같이 EMSA를 통해 확인하였으며, 세포핵 추출물은 추출 키트를 사용하여 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 12는 상기 EMSA 결과를 나타낸 것이며, 도 13은 3%의 저농도 글루코오스 조건(L Glc), 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)에서의 pSTAT5b, STAT5b의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.

도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 9%의 고농도 글로코오스 조건(H Glc), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 30mM), 3%의 저농도 글루코오스 및 30mM MSM를 처리조건(L Glc + MSM 40mM)에서의 DNA 결합 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, TBP 대비 인산화된 STAT5b와 STAT5b의 발현 정도를 통해 DNA 결합 현상이 유사하게 나타남을 확인하였다. 이는 in vitro에서 MSM이 케토시스 상태를 억제하는 것을 확인한 것에 의의가 있다.

실시예 7

STAT5b과 ANGPTL3 사이의 관계를 분석하였다. 구체적으로, 상기 참조예에 기재된 바와 같이, siSTAT5b RNA(STAT5 siRNA)를 사용하여 STAT5b의 활성을 막음에 따른 웨스턴 블롯팅을 사용하여 ANGPTL3의 발현을 분석하였고, 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14는 상기 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 것이며, 도 15는 β-action을 기준으로 STAT5b과 ANGPTL3의 발현 정도를 나타낸 것이다.

도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, ANGPTL3의 전사에서 STAT5b의 역할을 확인하였으며, STAT5b siRNA에서는 MSM 미처리 대조군과 40mM MSM 처리군에서 모두 ANGPTL3의 발현량이 증가하였다. Non-target siRNA에서는 대조군(control)과 40mM MSM 처리군에서의 발현 결과는 유사한 결과를 보였다. 이는 케토시스 상태에서 STAT5b가 중요한 역할을 함을 의미한다.

Claims

ANGPTL3(Angiopoietin-like 3) 발현 저해제로서,
MSM(Methylsulphonylmethane)을 포함하며, STAT5b의 발현을 증가시킴에 따라 ANGPTL3 발현이 저해되는 것을 특징으로 하는, ANGPTL3 발현 저해제.
청구항 1에 있어서,
30mM 내지 40mM의 MSM을 포함하는 것을 특징으로 하는, ANGPTL3 발현 저해제.
청구항 1의 ANGPTL3 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는, 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 ANGPTL3 발현 저해제는 30mM 내지 40mM의 MSM을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 약학 조성물은 IGF-1Rβ(Insulin-like growth factor 1 receptor)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 약학 조성물은 GHR(Growth hormone receptor)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 케토시스는 당뇨병성 케토시스인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 약학 조성물은 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 환제, 산제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 및 과립제로 이루어진 군에서 선택되는 제제로 제형화된 것인, 약학 조성물.
케토시스(ketosis) 샘플을 준비하는 단계,
후보 물질을 상기 샘플에 처리하는 단계, 및
상기 샘플에서의 ANGPTL3, GHR, STAT5b 및 IGF-1Rβ의 발현량을 확인하는 단계를 포함하고,
상기 확인하는 단계에서 GHR, STAT5b 및 IGF-1Rβ의 발현량이 후보 물질 처리 전보다 증가하고, ANGPTL3의 발현량이 후보 물질 처리 전보다 감소하는 경우 상기 물질을 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물로 결정하는 것을 특징으로 하는, 케토시스 예방 또는 치료용 약학 조성물의 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 케토시스 샘플은 글루코오스가 없거나 3% 이하의 글루코오스가 함유된 배지에서 배양되어 케토시스 상태가 유도되어진 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 케토시스 샘플은 글루코오스를 함유하지 않거나 3% 이하의 글루코오스가 함유된 배지에서 배양되어진 FL83B 세포인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.