KR101870178B1 - 모미락톤 b를 포함하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

모미락톤 b를 포함하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모미락톤 B(momilactone B)를 포함하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 모미락톤 B의 케톤바디(keton body)의 생성을 억제하는 기전을 밝힘으로서 모미락톤 B의 케토시스 치료제로서의 개발에 유용하게 활용 될 수 있다.

Description

모미락톤 B를 포함하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물{COMPOSITION COMPRISING MOMILACTONE B FOR PREVENTING AND TREATING KETOSIS}
본 발명은 모미락톤 B(momilactone B)를 포함하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
체내 포도당 농도가 낮을 때 케톤체(ketone body)가 형성되며, 케톤체는 일차 에너지원으로 사용된다. 체내에서 케톤의 농도는 글루카곤(glucagon) 및 인슐린(insulin)과 같은 다양한 호르몬에 의해 조절 된다. 체내에서 케톤체가 과량 생성되어 케톤의 농도가 높을 경우 케토시스(ketosis)를 유발한다. 상기 케토시스는 케톤체의 농도가 0.5mM 이상일 경우로 정의된다. 케톤체는 아세테이트(acetate), 아세토아세테이트(acetoacetate) 및 베타-하이드록시부티레이트(β-hydroxybutylate, BHB)와 같은 세가지 타입이 있다. 세가지 타입의 케톤체 중 아세테이트는 아세토아세트산의 분해 산물이다. 베타-하이드록시부티레이트와 아세토아세테이트는 포도당 결핍 시 뇌의 주요 에너지원이다. 그러나 간은 효소 β-ketoacyl-CoA transferase가 결핍되어 있기 때문에, 케톤체를 에너지원으로 사용할 수 없다. 케톤체는 혈액을 산성화시키기 때문에, 케톤체의 농도가 높을 경우 간과 신장의 기능장애를 유발한다. 케토시스 조건에서 체지방은 방출되고 소비된다. 따라서 이를 지방연소 모드(fat-burning mode)라고 한다.
이러한 케토시스는 주로 젖소에서 발병하여, 원유 생산 저하 및 치료비 증가 등의 문제로 농가에 막대한 경제적 손실을 주고 있다.
종래 케토시스의 예방은 간의 지방화를 예방하기 위하여 판도텐산 또는 메티오닌 제제를 식이 또는 주사하였다. 또한, 케토시스의 치료는 포도당, 호르몬, 간기능 항진제 등을 투여하였다.
모미락톤 B(momilactone B)는 쌀(Oryza sativa L.)의 뿌리에서 분리되었다. 상기 모미락톤 B는 일반적으로 식물의 방어 작용의 일환으로 합성되며, 이종감응물질(allelochemical)로 작용한다. 다양한 조건에서 모미락톤 B는 항산화, 제초(herbcidal), 항진균 및 항균작용을 한다고 알려져 있다. 또한, 치료제로서의 모미락톤 B는 고형암에서 세포독성 및 항종양 활성이 있으며, 인간 유방암에서 저산소증에 의해 유도되는 세포사멸(apoptosis)를 유발한다고 알려져 있다(한국 공개특허공보 제10-2009-0036688호, Animal Biotechnology, Vol. 28, No. 3, pp.189-197).
본 발명의 목적은, 모미락톤 B(momilactone B)를 포함하는 케토시스(ketosis) 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 모미락톤 B를 포함하는 HMGCS2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase-2) 발현 저해제 조성물과 ANGPTL3(angiopoietin-like-3) 발현 촉진제를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 모미락톤 B를 포함하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공함으로서, 천연유래의 성분을 이용하여 케토시스를 예방 및 치료 방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 케토시스(ketosis) 예방 및 치료용 약학 조성물은 모미락톤 B(momilactone B)를 유효성분으로 포함한다.
상기 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물은 모미락톤 B를 1 내지 2μM 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 모미락톤 B는 ANGPTL3(angiopoietin-like-3) 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 한다.
상기 모미락톤B는 HMGCS2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase-2) 발현을 저해시키는 것을 특징으로 한다.
상기 케토시스는 케토산증(ketoacidosis, ketoazidose)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 HMGCS2 발현 저해제 조성물은 모미락톤 B를 유효성분으로 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 ANGPTL3 발현 촉진제 조성물은 모미락톤 B를 유효성분으로 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 모미락톤 B의 케톤바디(keton body)의 생성을 억제하는 기전을 밝힘으로서 모미락톤 B의 케토시스 치료제로서의 개발에 유용하게 활용 될 수 있다.
모미락톤 B를 포함하는 케토시스 예방 및 치료용 조성물을 제공함으로써, 천연물을 이용하여 케토시스를 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 천연물을 이용하여 케토시스를 치료하므로 부작용이 적으며, 종래의 치료방법보다 경제적이고 간단한 방법으로 경우 케토시스를 치료할 수 있다. 또한 케토시스가 있는 젖소와 같은 가축은 상기 케토시스 예방 및 치료용 조성물을 사료와 함께 먹임으로써 간단한 방법으로 케토시스를 예방 및 치료할 수 있다.
도 1은 모미락톤 B(momilactone B)의 화학식이다.
도 2는 FL83B 세포주의 세포증식 및 시험관 내 케토시스 모델에 대한 모미락톤 B영향을 도시한 것이다. 도 2-A는 모미락톤 B를 처리한 세포주의 MTT 분석결과이며, 도 2-B는 BHB(β-hydroxybutyrate) 비색분석 결과(B)이다.
도 3은 모미락톤 B가 ANGPTL3-LPL 경로를 변경함으로써 케토시스를 억제하는 작용을 도시하였다. 도 3-A는 모미락톤 B을 24시간 동안 처리한 후 ANGPTL3 및 LPL의 RNA 발현을 분석한 RT-PCR 결과이며, 도 3-B는 모미락톤 B에 의한 전사수준에서의 케토시스 억제 활성을 도시한 것이다. 또한, 도 3-C는 모미락톤 B를 24시간 저리한 후 ANGPTL3-LPL의 발현 패턴을 웨스턴블롯으로 분석한 결과이며, 도 3-D는 ANGPTL3-LPL 경로에서 단백질의 상대적인 발현을 분석한 결과이다. (statistical analysis : student’s t-test(**P<0.01 and ***P<0.001))
도 4는 마우스 간세포에서 모미락톤 B의 STAT5b 핵전좌와 DNA 결합 활성을 분석결과를 도시한 것이다. 도 4-A는 각 조건에 따른 전체 세포 용해물(whole cell lysate)의 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 도 4-B는 각 조건에 따른 세포핵에서 추출한 단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 또한, 도 4-C는 각 조건에 따른 세포핵 추출물의 gel shift analysis결과이다.
도 5는 케톤증 모델에서 STAT5b가 HMGCS2의 발현에 미치는 영향을 분석한 것이다. 도 5-A는 비표적 SiRNA와 비교하여 siSTAT5b를 이용한 표적 STAT5b의 억제능 분석 결과이다. 도 5-B는 β-actin에 대한 STAT5b와 HMGCS2의 상대적인 발현을 그래프로 도시한 것이다.(statistical analysis : Student’s t-test(***P<0.001))
도 6은 케톤증 모델에서 STAT5b가 HMGCS2의 발현에 미치는 영향을 분석한 것이다. 도 6-A는 STAT5b가 과발현 된 세포에서 ANGPTL3, LPL 및 HMGCS2의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 결과이며, 도 6-B는 β-actin에 대한 ANGPTL3, LPL 및 HMGCS2의 상대적인 발현을 그래프로 도시한 것이다.(statistical analysis : student’s t-test(***P<0.001))
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따른 케토시스(ketosis) 예방 및 치료용 약학 조성물은 모미락톤 B(momilactone B)를 유효성분으로 포함한다.
상기 모미락톤 B는 쌀(Oryza sativa L.)의 뿌리에서 분리 된 이종감응물질(allelochemical)이다. 또한, 모미락톤 B는 아세포 진균(Pyricularia oryzae)의 감염 또는 자외선(UV light)에 의해 생성된다.
상기 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물은 모미락톤 B를 1 내지 2μM 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물에 있어서, 모미락톤 B를 1μM 미만을 포함할 경우 유효성분의 효과가 미미하며, 2μM을 초과하여 포함할 경우 세포 독성이 나타나므로 바람직하지 않다.
상기 모미락톤 B는 단백질 ANGPTL3(angiopoietin-like-3) 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 한다. 상기 ANGPTL3는 안지오포이에틴(angiopoietin)의 특징이 되는 구조를 가지고 있으며, 일반적으로 간에서 발현된다. 상기 ANGPTL3은 내피세포(endothelial cell)의 부착 및 이동(migration)을 가능하게 한다. 또한 ANGPTL3은 신생혈관생성(angiogenesis)과정에서 중요한 역할을 한다. LPL(lipoprotein lipase)는 트리글리세라이드(triglyceride) 형태로 저장된 지방을 분해하는 과정에서 중요하다. 지단백질(lipoprotein)은 트리글리세라이드를 혈액에서 장기 또는 장기에서 혈액으로 운반하는 거대분자이다. LPL은 지질대사 및 지질 수송에 관여한다. ANGPTL3는 LPL의 활성을 억제함으로써 지단백질 대사를 조절한다. 따라서, 상기 ANGPTL3은 지질 및 탄수화물 대사에서 중요한 기능을 한다. 그 결과, ANGPTL3-LPL 경로는 케토시스 치료를 위한 약학적인 타겟으로 여겨진다.
상기 모미락톤 B는 단백질 HMGCS2(3-hydroxy-3- methylglutryl-CoA synthase-2) 발현을 저해시키는 것을 특징으로 한다. STAT5b(signal transducer and activator of transcription 5b)는 세포성장에 관여하며, ANGPTL3의 발현을 음성조절(negative regulation)하므로, 케토시스 치료에서 중요한 역할을 한다. 미토콘드리아 효소(mitochondrial enzyme)인 HMGCS2는 유전자 HMGCS2에 의해 암호화 되어 있으며, 아세틸 CoA(acetyl-CoA)를 케톤체로 변환시킨다. 탄수화물 결핍 조건에서 HMGCS2는 케톤체생성(ketogenesis)과정의 첫 번째 과정인 지방산의 β-산화(β-oxidation)를 촉매한다. 포도당 결핍동안 간의 케톤체생성은 빠르게 증가된다. STAT5b 및 HMGCS2는 중요한 역할을 하지만, 상기 STAT5b 및 HMGCS2 사이의 관계는 밝혀지지 않았다.
상기 케토시스는 케토산증(ketoacidosis, ketoazidose)인 것을 특징으로 한다. 상기 케토산증은 혈중에 강산인 케톤체가 축적되어 산증을 나타나는 상태이다. 당질의 공급부족이나 이용 장애가 있으면 에너지원으로서 지방분해가 촉진되고, 케톤체의 생성이 증가한다. 장시간의 절식이나 소아의 아세톤혈성구토증 등에서도 케토산증이 나타나는데, 임상적으로 가장 중요한 것은 당뇨병성 케토산증이다. 상기 당뇨병성 케토산증은 고혈당, 케톤뇨, 이산화탄소 결합능력 저하 및 여러 정도의 의식장애를 나타내며, 인슐린 부족으로 인해 발생한다.
또한, 본 발명의 다른 일 형태에 따른 단백질 HMGCS2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase-2) 발현 저해제 조성물은 모미락톤 B를 유효성분으로 포함한다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 형태에 따른 단백질 ANGPTL3(angiopoietin-like-3) 발현 촉진제 조성물은 모미락톤 B를 유효성분으로 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
참조예 1. 항체 및 시약(antibodies and reagent)
실시예에 사용된 항체 및 시약은 표 1과 같다.
항체 및 시약 입수처
colorimetric assay kit for detecting BHB (a ketone body) Cayman Chemical Co.
Momilactone B Dr. Il Min Chung
(Konkuk University, Korea)
D-glucose Life Technologies
F-12K medium Life Technologies
anti-β-actin antibody Life Technologies
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone
penicillin-streptomycin solution Hyclone
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco-BRL
Anti-STAT5b antibody Santa Cruz Biotechnology
anti-ANGPTL3 antibody Santa Cruz Biotechnology
secondary antibodies (goat anti-mouse and rabbit IgG-horseradish peroxidase) Santa Cruz Biotechnology
Anti-LPL antibody Abcam
anti-HMGCS2 antibody Abcam
anti-TBP antibody Abcam
Phosphorylated STAT5 Upstate Biotechnology
enhanced chemiluminescence (ECL plus) detection kit Amersham Pharmacia Biotech
NE-PER kit and Restore™ Western Blot Stripping Buffer Pierce
Qiaprep spin miniprep kit Qiagen
RNeasy mini kit Qiagen
RT-PCR Premix kit Bioneer
Primers specific for amplifying ANGPTL3, LPL, and 18s RNA transcripts Integrated DNA Technologies
Oligonucleotide probes (STAT5b) Promega Corp
electrophoretic mobility shift assay (EMSA) kit Promega Corp
참조예 2. 세포배양 및 처리(cell culture and treatment)
마우스 간세포인 FL83B 세포주를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 F-12 배지에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였으며, 상기 세포는 밀폐된 챔버에 두었다. 실험의 각 초기에는 상기 세포를 2.5 ×105cells/ml로 하여 배지에 재현탁하였다. 고-포도당(high-glucose) 배지는 9% D-glucose를 추가하였다.
참조예 3. 세포 증식 저해 (cell proliferation inhibition)
세포 활성은 MTT assay를 통해 분석하였다. 구체적으로, 세포는 모미락톤 B 처리 전, 96-웰(well) 플레이트에 3x103cells/well로 재현탁하였으며, 대조를 위해 액상 배지는 교환하였다. 세포에는 모미락톤 B(momilactone B) 여러 농도(1 내지 5μM)로 처리하여 배양하였다. 배양된 세포에 MTT (5mg/ml)를 각 웰에 첨가하였고, 37℃ 조건에서 4시간 배양하였다. 포르마잔(formazan) 생성물은 200ul DMSO(dimethylsulfoxide)를 각 웰에 첨가함으로써 용해시켰고, Ultra Multifunction Microplate Reader(TECAN)를 이용하여 흡광도는 550nm에서 측정하였다.
참조예 4. 베타히드록시부티레이트 비색분석법(β- hydroxybutyrate colorimetric assay, BHB assay)
BHB의 측정은 베타히드록시부티레이트 (케톤체) 비색분석법 키트를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, FL83B 세포(~18x106)는 콜드 다이루티드 어세이 버퍼(cold diluted assay buffer)에서 초음파로 분쇄한 후 원심분리기를 통해 수집하였으며, 상등액을 제거하고 콜드 다이루티드 어세이 버퍼에서 재현탁하였다. 베타히드록시부티레이트 기준 웰과 샘플 웰을 준비하여 디벨로퍼 용액(developer solution)을 첨가함으로써 반응을 시작하였고, 배양은 빛이 없는 25℃ 조건에서 30분간 배양하였으며, 흡광도는 450nm에서 측정하였다.
참조예 5. 웨스턴 블롯팅 (western blotting)
FL83B 세포주에 30mM 고농도(9%)의 글루코오스와 모미락톤 B(1μM　또는 2μM)을 24시간동안 처리하였다. 전체 세포들은 포스포타아제와 프로테아제 저해제를 포함하는 RIPA(radioimmunoprecipitation) 용해 버퍼로 용해시켰으며, 23 구경(gauge)의 바늘로 용해된 세포를 풀어주었고, 세포 잔해물을 제거하기 위하여 4℃, 15,000rpm 조건에서 10분간 원심 분리하였다.
단백질의 농도는 브래드포드 정량법(Bradford assay)를 통해 측정하였다. 웨스턴 블롯팅은 STAT5b, pSTAT5, ANGPTL3, LPL, HMGCS2, TBP alc β-actin을 탐지하기 위해 수행하였다. 단백질의 동일량을 SDS-PAGE에 리졸브시키고 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)에 옮겼으며, 블랏들을 5% 탈지유(skim milk)에 1시간동안 블락(block)시켰다. 상기 막은 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 둠으로써 탐지하였다. 상기 막을 T-TBS버퍼로 3회 워싱하였고, 2차 항체(anti-mouse or anti-rabbit IgG HRP-conjugate (1:1000))와 함께 배양하였다. 상기 배양된 막을 T-TBS 버퍼로 3회 워싱한 후 ECL PLUS kit을 이용하여 현상하였다.
참조예 6. RT- PCR
FL83B 세포주에 24시간 동안 30mM 고농도(9%)의 글루코오스와 모미락톤 B(momilactone B)(1μM 또는 2μM)을 처리하였다. 총 RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 수행하였고, 정량은 260nm에서 분광분석에 의해 이루어졌다. ANGPTL3, LPL 및 18s RNA의 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하였는데, first strand cDNA synthesis kit (Bioneer)를 이용하여 42℃에서 1시간 및 80℃에서 15분간의 조건에서 총 RNA로부터 cDNA의 역전사가 이루어졌다.
PCR은 cDNA를 이용하여 수행하였고, PCR 조건은 하기와 같다.
<PCR 조건>
ANGPTL3 : 95℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃에서 50초->30 사이클
LPL : 95℃에서 30초, 57℃에서 45초, 72℃에서 50초-> 30사이클
18S : 95℃에서 1분, 58℃ 1분, 72℃에서 1분-> 28사이클
PCR 산물은 브롬화에티듐(ethidium bromide, EtBr)으로 염색된 1% 아가로스 겔로 분석하였다.
참조예 7. EMSA( Electrophoretic mobility shift assay)
STAT5b의 DNA 결합 활성은 EMSA를 통해 측정하였는데, 라벨된 2중 가닥 DNA를 핵 추출물에서 활성 STAT5b 단백질과 결합하는 DNA 프로브로 사용하였다. 핵 추출물은 Nuclear Extract Kit (Panomics)로 준비하였고, EMSA는 TF-STAT5b 프로브(biotin-labeled transcription factor)가 처리 및 처리가 안된 핵 추출물을 가지고 실험하였다. 단백질을 비 변성된 상태로 6% PAGE 겔에 리졸브 시켰고, 겔에서의 단백질들은 나일론 막으로 이동시켰으며, 스트렙타비딘-HRP와 화학발광 기질(chemiluminescent substrate)을 이용하여 검출하였다.
참조예 8. siRNA (small interference RNA) analysis
FL83B 세포(1x105)는 6웰 플레이트에 배양하였으며 50% 컨플루언스(confluence)가 되도록 성장시켰다. Fugene-6 (Roche)를 통해 상기 세포를 ON-TARGET plus SMARTpool siRNA targeting STAT5b 또는 ON-TARGETplus Non-targeting siRNA(Dharmacon)로 형질주입하였다. 형질주입 후, 세포에 40 mM MSM을 24시간동안 처리하였고, 단백질을 분리한 후 웨스턴 블롯팅을 통해 HMGCS2 및 STAT5b의 발현을 분석하였다.
참조예 9. STAT5b 과발현 분석
FL83B 세포(1x105)는 6웰 플레이트에 배양하였으며 60% 컨플루언스(confluence)가 되도록 성장시켰다. 상기 6웰 플레이트에 배양된 세포는 wild-STAT5b vector (pMX/STAT5b; kindly provided by Dr. Koichi Ikuta, Kyoto University, Japan)와 DharmaFECT transfection reagent를 24시간동안 함께 배양하여 형질주입하였다. 이어서, 2 μM의 모미락톤 B를 함유하는 고 포도당 배지 또는 저 포도당 배지를 사용하여 형질 감염된 세포를 추가로 24 시간 동안 처리 하였다. 상기 세포의 단백질을 분리하고 참조예 5에 기재된 방법으로 웨스턴 블롯으로 분석하여 STAT5b, ANGPTL3, LPL 및 HMGCS2 발현 수준을 결정 하였다.
참조예 10. 통계분석(statistical analysis)
모든 실험을 3 회 반복하였고, 결과는 ‘평균 ± 평균의 표준오차‘으로 나타내었다. 통계분석은 SAS 9.3 프로그램으로 수행하였다. 그룹을 Student 's t-test 또는 one-way analysis of variance (ANOVA)와 Duncan의 다중 범위 테스트를 적절히 비교하였으며, P <0.05의 값은 유의 한 것으로 간주하였다.
실시예 1. FL83B 세포주에서의 모미락톤 B의 세포증식 억제
FL83B 세포주에서 모미락톤 B의 세포증식 억제는 상기 참조예 3.에 기재한 방법으로 분석하였다. 상기 모미락톤 B의 세포증식 억제효과는 도 2에 도시하였다.
모미락톤 B의 농도에 따른 FL83B의 세포생존률은 도2-a에 도시하였다. 상기 결과에 따르면, 모미락톤 B 처리군 중 1μM(~94% 생존) 및 2μM(~87% 생존)를 처리한 군에서 세포생존률이 높았으며, 그 이상의 농도에서는 세포생존율이 감소하였다. 이는 모미락톤 B는 1 내지 2μM의 범위에서 세포 생존률에 미치는 영향이 적다는 것을 의미한다.
실시예 2. 시험관 내 케톤증 모델 제조 및 모미락톤 B의 베타-하이드록시부티레이트( BHB ) 저해 활성
FL83B 세포주는 시험관 내(in vitro) 케톤증 모델을 제조하였다. 상기 세포에서 케톤증을 유도하기 위하여 저포도당(3%) 배지에서 배양하였다. 양성 대조군은 고 포도당(9%)를 첨가한 배지에서 배양하였다. 상기 케톤증 모델 세포군과 양성 대조군에 모미락톤 B(1μM 또는 2μM)를 처리하였으며, BHB의 농도 변화를 측정하였다. 상기 BHB의 농도 변화 측정은 참조예 4의 방법으로 측정하였다.
상기 BHB 농도변화 측정 결과는 도 2-b에 도시하였다. 상기 결과에 따르면, 모미락톤 B는 시험관 내 케톤증 모델에서 케토시스를 억제한다는 것을 알수 있다. 모미락톤 B 1μM 처리군은 BHB의 농도가 약 15%감소하였으며, 2μM 처리군은 약 25% 감소하였다. 또한, 고 포도당 배지에서 배양한 양성대조군은 BHB의 농도는 최대 40% 감소하였다. 상기 결과는 모미락톤 B는 케토시스 조건에서 케톤체의 생성을 저해한다는 것을 의미한다.
실시예 3. 모미락톤 B가 ANGPTL3 - LPL 경로에 미치는 영향
ANGPTL3-LPL 경로는 케톤증 치료에 중요한 타겟으로 여겨진다. 항케토시스 약물은 ANGPTL3의 발현을 감소시키고(down-regulation), LPL의 발현을 증가(up-regulation)시키도록 설계되어야한다. 따라서, 모미락톤 B 처리에 따른 ANGPTL3 및 LPL의 발현수준을 웨스턴 블롯팅(도 3-c,d) 및 RT-PCR(도 3-a,b)으로 분석하였다. 웨스턴 블롯팅 및 RT-PCR은 각각 참조예 5 및 6에 기재된 방법으로 수행하였다. 또한, 상기 발현수준 분석은 저 포도당 배지에서 배양한 케톤증 모델인 음성대조군, 고 포도당배지에서 배양한 양성대조군 및 저 포도당 배지에서 배양하고 모미락톤 B(1μM 또는 2μM)를 처리한 모미락톤 B 처리군으로 실험하였다.
상기 결과에 따르면, 저포도당 배지에서 배양한 음성 대조군과 비교하여, 모미락톤 B 처리군은 ANGPTL3의 발현을 저해하는 것을 알 수 있다. 또한, ANGPTL3의 발현은 고 포도당 배지에서 배양한 양성 대조군에서 감소하였고, 모미락톤 B 처리군에서 관찰 된 것과 유사 하였다. 이와 반대로 모미락톤 B는 양성 대조군에서 고 포도당의 효과와 유사하게 LPL의 발현을 증가시켰다. 상기 결과는 모미락톤 B가 케톤증 모델에서 ANGPTL3-LPL 경로를 조절할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 4. 모미락톤 B에 의한 STAT5b 및 HMGCS2 의 조절
참조예 5에 기재 된 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하여, 모미락톤 B이 STAT5b 및 HMGCS2의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 음성대조군(ketotic group), 양성대조군 및 모미락톤 B(1μM 또는 2μM)처리군에서 total cell protein을 분리하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 도4-a에 도시하였으며, 상기 결과에 따르면 모미락톤 B는 STAT5b의 발현 및 인산화를 증가시키고, HMGCS2의 발현을 억제한다는 것을 알 수 있다. 양성대조군에서 STAT5b의 발현 증가는 케토시스 치료 조건에 대한 발현 양상을 나타낸다. 상기 결과는 모미락톤 B가 FL83B 세포에서 케톤 생성을 억제하는 효과가 있음을 의미한다.
실시예 5. 모미락톤 B에 의한 STAT5b 의 핵 전좌 및 DNA 결합 활성
모미락톤 B 처리에 따른 STAT5b 핵 전좌에 미치는 영향을 조사하였다. STAT5b의 전사 조절 기능은 핵으로의 전좌에 의존한다. 음성대조군(ketotic group), 양성대조군(high glucose) 및 모미락톤 B 처리군의 핵 추출물을 분석하기 위하여 참조예 5에 기재된 방법으로 웨스턴블롯을 수행하였다. 웨스턴 블롯 결과는 도 4-b에 도시하였으며, STAT5b의 핵 전좌 및 인산화는 모미락톤 B를 처리함으로서 증가되었다.
또한 모미락톤 B에 의한 STAT5b의 DNA 결합 활성 측정을 위하여 참조예 7에 기재 된 방법으로 EMSA를 수행하였다. EMSA 수행 결과는 도 4-c에 도시하였으며, 모미락톤 B는 STAT5b/DNA 복합체 생성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 또한 양성대조군(high glucose)에 의한 STAT5b/DNA 복합체 형성은 모미락톤 B 처리군과 비슷한 양상으로 증가된 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 모미락톤 B에 의한 케토시스 메커니즘에 STAR5b가 기여한다는 것을 의미한다.
실시예 6. 케톤증 모델에서 STAT5b 가 HMGCS2 의 발현에 미치는 영향
siSTAT5b RNA를 이용하여 STAT5b를 침묵시킴으로써 STAT5b와 HMGCS2의 관계를 참조예 8에 기재된 방법으로 분석하였다. STAT5b를 침묵시킨 후, 세포에 저 포도당, 고 포도당 또는 모미락톤B를 각각 처리하였다. 상기 각 처리군으로부터 전체 단백질을 분리하여 참조예 5에 기재된 방법으로 웨스턴블롯팅을 수행하였다. 상기 웨스턴 블롯팅 결과는 도 5-a, b에 도시하였으며, siSTAT5b는 HMGCS2의 발현 증가를 유도한다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 결과에 따르면, STAT5b는 모미락톤 B의 처리와 관계없이 HMGCS2의 발현억제에 중요한 역할을 한다.
STAT5b와 HMGCS2의 관계는 참조예 9에 기재 된 방법으로 STAT5b 과발현 분석 방법으로 확인하였다. 분석결과는 도 6-a에 도시하였으며, STAT5b의 과발현은 ANGPTL3 및 HMGCS2 발현을 감소시키고, LPL의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 STAT5b가 케토시스 치료에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 모미락톤 B(momilactone B)를 유효성분으로 포함하는 케토시스(ketosis) 예방 및 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 모미락톤 B를 1 내지 2μM 포함하는 것을 특징으로 하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 모미락톤 B는 단백질 ANGPTL3(angiopoietin-like-3) 발현을 저해시키는 것을 특징으로 하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 모미락톤 B는 단백질 HMGCS2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase-2) 발현을 저해시키는 것을 특징으로 하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 케토시스는 케토산증(ketoacidosis, ketoazidose)인 것을 특징으로 하는 케토시스 예방 및 치료용 약학 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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