KR20160051010A

KR20160051010A - 산모 및 발단자의 dna 서열분석에 의한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법

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Publication number: KR20160051010A
Application number: KR1020140150334A
Authority: KR
Inventors: 남궁정현; 이용선; 박정선; 김종일; 채종희; 임병찬
Original assignee: 에스케이텔레콤 주식회사; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2016-05-11
Also published as: KR102028735B1

Abstract

본 발명은 (1) 단일유전자 유전변이를 갖는 발단자(proband)의 혈구 내에 존재하는 DNA에서, 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위의　서열을 분석하는 단계; (2) 상기 단일유전자 유전변이를 유발하는 유전자를 보유한 보인자 산모의 혈장 내에 존재하는 DNA에서,　상기 단일유전자 유전변이를 갖는　DNA 부위의 서열을 분석하는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 수득한 발단자 및 산모의 DNA 서열을 비교하여 단일유전자 유전변이를 갖는 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)를 확인하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 확인된 이형단일염기변이로부터 단상형(haplotype)을 구축하는 단계; (5) 단계 (2)에서 수득한 산모 DNA 서열로부터, 상기 단계 (4)에서 구축된 단상형 중 단일유전자의 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도(frequency)를 계산하는 단계; 및 (6) 상기 단일유전자 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도가 0.5보다 큰 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 발단자와 보인자 산모의 DNA 서열분석을 통해 태아의 출생 전(임신 6주 이후부터)에 비침습적 방법으로 태아의 단일유전자 유전변이를 예측할 수 있는바, 종래 융모막융모 샘플링 또는 양수천자를 포함하는 비침습적 방법을 대체하여 태아의 산전진단에 응용될 수 있다.

Description

산모 및 발단자의 DNA 서열분석에 의한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법{METHOD FOR PREDICTION OF FETAL GENETIC VARIATIONS BY DNA SEQUENCING OF PREGNANT MOTHER AND PROBAND}

본 발명은 산모 및 발단자의 DNA 서열분석에 의한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 산모 혈장 및 발단자의 혈구 DNA 서열로부터 태아의 단일유전자 유전변이, 및 이로 인한 단일유전자 질환을 비침습적으로 예측 및 진단하는 방법에 관한 것이다.

산모 혈장 내에서의 무세포 태아 DNA(cell-free fetal DNA; cffDNA)의 발견은 비침습적 산전 유전적 진단법을 개발하기 위한 강력한 도구를 제공하였다(Lo YM et al., Lancet 1997;350:485-7). 이러한 cffDNA의 산전 진단에의 응용은 대규모 병렬형 서열분석(massively parallel sequencing) 기술의 도입에 의해 더 가속화되었다(Chiu RW et al., Clinical chemistry and laboratory medicine : CCLM / FESCC 2013;51:197-204; Lo YM et al., Reproductive biomedicine online 2013;27:593-8). cffDNA를 이용하여 높은 민감도와 정확도로 이수성(aneuploidy)을 검출할 수 있는 산전 시험들이 이미 상업화되었다(American College of O, Gynecologists Committee on G. Committee opinion no. 545: Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstetrics and gynecology 2012;120:1532-4). 또한, 몇 가지 연구들은 전체 게놈 서열분석 및 cffDNA의 표적 농축(target enrichment) 후 서열분석에 의해 전체 게놈에 걸쳐 태아와 산모 DNA가 균일하게 분포되어 있음을 입증하였다(Lo YM et al., Science translational medicine 2010;2:61ra91; Liao GJ et al., Clinical chemistry 2011;57:92-101; Kitzman JO et al., Science translational medicine 2012;4:137ra76). 이러한 결과들은 염색체 이수성보다 더 큰 비율을 차지하는 단일유전자 질환(monogenic disorder)으로 확장하기 위한 기초를 제공하였다.

하지만, 이수성 검출은 임상학적 실행에 빠르게 적용될 수 있는 반면, 단일유전자 질환으로의 적용은 훨씬 더 복잡하고 극복될 장애물이 여전히 많다. 기술적으로, cffDNA는 산모 혈장 내에서 그 함량이 적고 그 비율도 다양하므로, 단일 뉴클레오타이드 수준에서 태아 변이체(variant)를 신뢰성있게 검출하는 것은 용이하지 않다. 또한, 알려진 위험성을 증가시키지 않으면서 산모에서 단일유전자 질환의 산전 진단에 비침습적 게놈 전체 검사를 도입하는데 복잡한 윤리적 문제와 사회경제적인 문제들이 여전히 존재한다. 그러므로, 임상학적 응용을 위해서는, 심층적인 범위를 보장하고 발단자, 보인자 및 산전 진단에 동등하게 적용될 수 있는 표적화된 설계를 갖는 이상적인 플랫폼이 필요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 발단자와 보인자 산모의 DNA 서열을 분석함으로써 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 비침습적 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 단일유전자 유전변이를 갖는 발단자(proband)의 혈구 내에 존재하는 DNA에서, 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위의　서열을 분석하는 단계; (2) 상기 단일유전자 유전변이를 유발하는 유전자를 보유한 보인자 산모의 혈장 내에 존재하는 DNA에서,　상기 단일유전자 유전변이를 갖는　DNA 부위의 서열을 분석하는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 수득한 발단자 및 산모의 DNA 서열을 비교하여 단일유전자 유전변이를 갖는 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)를 확인하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 확인된 이형단일염기변이로부터 단상형(haplotype)을 구축하는 단계; (5) 단계 (2)에서 수득한 산모 DNA 서열로부터, 상기 단계 (4)에서 구축된 단상형 중 단일유전자의 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도(frequency)를 계산하는 단계; 및 (6) 상기 단일유전자 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도가 0.5보다 큰 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 발단자와 보인자 산모의 DNA 서열분석을 통해 태아의 출생 전(임신 6주 이후부터)에 비침습적 방법으로 태아의 단일유전자 유전변이를 예측할 수 있는바, 종래 융모막융모 샘플링 또는 양수천자를 포함하는 비침습적 방법을 대체하여 태아의 산전진단에 응용될 수 있다.

도 1은 발단자 및 산모의 게놈 DNA의 커버리지 그래프를 나타낸 것이다. 상기 도에서 빨간색 수직 막대는 뒤센 근이영양증(DMD) 유전자의 79개 엑손을 나타낸다.
도 2는 DMD-04-산모(상부) 및 DMD-04-발단자(하부)의 표적화된 딥 시퀀싱 결과를 Integrative Genomics Viewer에 의해 시각화한 것이다.
도 3은 상기 산모의 혈장 DNA의 커버리지 그래프를 나타낸 것이다. 상기 도에서 NC3은 정상 대조군을 나타내고, 빨간색 수직 막대는 DMD 유전자의 79개 엑손을 나타낸다.
도 4는 bcp(Bayesian change point) 결과에 기초하여 DMD-01 산모 혈장 DNA에서의 재조합 단상형 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 bcp 결과에 기초하여 DMD-02 산모 혈장 DNA에서의 재조합 단상형 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DMD-01-6주, DMD-01-17주, DMD-02-9주 및 DMD-02-12주의 산모 혈장에서의 평균 리드 비율을 나타낸 것이다.

본 발명은 태아의 단일유전자 유전변이, 및 이로 인한 단일유전자 질환을 예측, 진단, 판단, 평가하는 방법에 관한 것이다.

즉, 본 발명은 단일유전자 유전변이로 인한 유전질환 가족력이 있는 산모의 태아가 동일한 유전질환 유발 유전변이를 가지고 있는지를 비침습적 방법으로 예측, 진단, 판단, 평가하는 방법을 제공한다. 종래 태아의 산전진단을 위해 사용되는 융모막융모 샘플링 또는 양수천자와 같은 침습적 방법은 태아의 조산 또는 감염 위험성이 높은데 반해, 본 발명의 방법은 비침습적 방법으로 산모의 혈장을 분석하므로 전술한 위험성이 없다.

본 발명의 방법은 (1) 단일유전자 유전변이를 갖는 발단자(proband)의 혈구 내에 존재하는 DNA에서, 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위의　서열을 분석하는 단계; (2) 상기 단일유전자 유전변이를 유발하는 유전자를 보유한 보인자 산모의 혈장 내에 존재하는 DNA에서,　상기 단일유전자 유전변이를 갖는　DNA 부위의 서열을 분석하는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 수득한 발단자 및 산모의 DNA 서열을 비교하여 단일유전자 유전변이를 갖는 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)를 확인하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 확인된 이형단일염기변이로부터 단상형(haplotype)을 구축하는 단계; (5) 단계 (2)에서 수득한 산모 DNA 서열로부터, 상기 단계 (4)에서 구축된 단상형 중 단일유전자의 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도(frequency)를 계산하는 단계; 및 (6) 상기 단일유전자 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도가 0.5보다 큰 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하는 단계를 포함한다.

본 발명의 실시예에서는 단일유전자 유전변이로 인한 대상 질환으로서 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD)을 중심으로 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법을 기술하고 있으나, 본 발명의 방법이 산모 혈장에서 X-연관된 질환의 유전변이에 따른 유전된 대립유전자(allele)의 단상형(haplotype)을 분석하는 것에 기초하고 있으므로, 본 기술분야의 숙련자라면 본 발명의 방법이 DMD 이외의 X-연관된 질환 또는 상염색체 열성 질환에 적용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.

상기 단일유전자 유전변이로 인한 질환의 예로는 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 근관성 근육병증(Myotubular myopathy), 로웨 증후군(Lowe syndrome), 멘케스 증후군(Menkes syndrome), X-연관된 부신백질이영양증(X-linked adrenoleukodystrophy), 호에랄-레이다슨 증후군(Hoyeraal-Hreidarsson syndrome), 척수성 근위축증(Spinal Muscular atrophy), 이염색 백색질 장애(Metachromatic leukodystrophy) 및 크라베병(Krabbe disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일유전자 질환을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에서 선택된 뒤센 근이영양증은 근육 퇴화 및 이로 인한 사망을 야기하는 열성 X-연관된 질환 중 하나로서, 대한민국에서 3,300명의 남자 아이 당 약 1명꼴로 상기 질환에 걸리는 것으로 보고되어 있다. 상기 뒤센 근이영양증은 X 염색체 상에 위치하는 가장 큰 유전자(2.4 Mb)인 디스트로핀(dystrophin) 유전자의 돌연변이에 의해 유발되며, 디스트로핀 단백질은 근육 조직 내에서 가장 중요한 구조 성분으로서 구조적 안정성에 기여한다.

본 발명의 방법에서 '발단자(proband)'는 유전학적으로 문제가 된 형질의 혈통을 발견하는 계기가 된 개체를 의미하며, 본원에서는 본 발명의 방법에서 예측하고자 하는 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 확인된 산모의 직계가족, 바람직하게는 보인자 산모로부터 출생하여 상기 단일유전자 유전변이로 인한 단일유전자 질환을 갖는 것으로 확인된 환아(남아)를 가리킨다.

또한, 본 발명의 방법에서, '보인자(carrier) 산모'는 본 발명의 방법이 확인하고자 하는 단일유전자 유전변이를 X 염색체 상에 가지고 있는 산모를 가리키며, 상기 산모는 XX 염색체 중 하나의 X 염색체에만 열성 단일 유전자 변이(X')를 가지고 있으므로 상기 단일유전자 질환을 나타내지 않는다. 본 발명에서 보인자 산모는 태아를 임신하고 있는 산모, 바람직하게는 임신 6주 이상의 산모이다. 상기 보인자 산모의 혈장 또는 혈청은 무세포 태아 DNA(cell-free fetal DNA)를 포함한다.

상기 보인자 산모는 게놈 DNA 시퀀싱 후 참조 DNA 서열, 즉 단일유전자 변이를 갖는 참조 DNA 서열과 서열을 비교함으로써 보인자 여부가 결정될 수 있거나, 본 발명의 방법에서 산모 게놈 DNA를 발단자 게놈 DNA 서열과 비교함으로써 보인자 여부가 결정될 수 있다.

실시예를 참조하면, 본 발명의 방법은 산모가 보인자이면서 태아 유전형 확인이 가능하고, 임신 중 2회 이상 무세포 DNA를 확보할 수 있는 뒤센 근이영양증 가족력이 있는 산모를 대상으로 한다. 상기 산모의 혈장으로부터 수득한 DNA를 시퀀싱하고 발단자의 혈구의 DNA 서열과 비교하여 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)를 확인한다. 상기 DNA 시퀀싱은 차세대 서열분석(Next generation sequencing)에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 DNA 시퀀싱은 표적 농축 및 대규모 병렬 서열분석(massively parallel sequencing)에 의해 수행될 수 있다.

상기 이형단일염기변이의 확인은 염기서열변이정보 추출(variant calling), 구조변이검출(structural variation detection) 및 통계분석에 의해 수행될 수 있다. 상기 염기서열변이정보 추출은 Bowtie2 aligner를 이용한 리드의 정렬, Picard-tool을 이용한 PCR 중복 리드 제거, SAMTools를 이용한 중복이 없는 표준결과 포맷 추출 및 삽입/결실(indel) 재정렬, 염기 재교정(base recalibration), 염기서열변이정보 추출, GATK를 이용한 변이체 여과(variant filtration) 및 ANNOVAR를 이용한 주석달기(annotation) 등의 과정을 포함할 수 있다. 또한 상기 구조변이검출은 브레이크댄서(Breakdancer)를 이용한 구조변이추출(structural variation calling) 및 UCSC 게놈 브라우저에 의해 시각 검사를 포함할 수 있다. 또한, 통계분석은 R 패키지 'extremevalues'를 이용한 이상치(outlier) 리드 비율 검출, 스튜던트 t-검정 및 윌콕손 부호순위 검정(Wilcoxon Signed rank test)을 포함할 수 있다.

이후, 상기 확인된 이형단일염기변이로부터 단상형을 구축한다. 상기 구축시 단일유전자 유전변이를 갖는 부위에서의 재조합 사건(recombination event) 및 재조합 점(recombination point)을 검출하여 이를 단상형에 반영한다. 즉, 재조합 사건이 일어난 부위에서는 대립유전자(allele)의 SNP를 기초로 단상형을 구축한다. 이후, 산모 혈장 DNA 서열에서, 상기 구축된 단상형 중 단일유전자 유전변이를 포함하는 단상형, 즉 발단자와 동일한 단상형의 빈도를 계산한다. 상기 빈도는 발단자와 동일한 단상형의 리드 비율(read fraction)을 계산함으로써 얻어질 수 있다. 이후, 산모의 단상형별 리드 비율을 그래프화하여 단일유전자 유전변이를 갖는 단상형의 비율이 0.5가 넘으면 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측(진단)하고, 0.5를 넘지 않으면 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측한다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 발단자 및 산모의 게놈 DNA 서열분석을 통한 보인자 확인

<1-1> 발단자 및 산모의 게놈 DNA 의 서열분석(표적 농축 및 대규모 병렬 서열분석)

본 실험을 위한 단일유전자 질환으로서 X-연관 열성 형질로 유전되는 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD)을 선택하였다.

발단자(proband)로서 DMD로 진단받은 남자 환아 3명과, 또 다른 태아를 임신하고 있는 상기 환아의 산모 3명을 선택하였다. 또한, 대조군(normal control; NC)으로서 정상 어린이 및 산모를 선택하였다. 각 발단자 및 산모의 쌍을 실험번호 DMD-01 내지 DMD-04로 명명하였다.

상기 발단자 및 산모로부터 얻은 게놈 DNA를 차세대 유전자서열분석(NGS) 기술인 대규모 병렬 시퀀싱(Sequencing technologies - the next generation, nature review genetics, 2010, Michael L. Metzker)에 의해 서열분석하였다. 또한, DMD-01-태아 및 DMD-02-태아의 게놈 DNA를 융모막융모 샘플링 또는 양수천자로부터 얻어 동일한 방식으로 서열분석하였다.

구체적으로, DNA 라이브러리 구축을 위해, SureSelectXT 시약 키트(Agilent) 및 0.5-1μg 혈장 DNA를 사용하였다. Agilent Technologies의 SureSelect 프로토콜에서 라이브러리-준비 항목이 주로 게놈 DNA용으로 고안된 것이기 때문에, SureSelectXT 키트 내의 모든 시약을 희석하여 혈장 DNA 라이브러리를 제조하였다. 어댑터-라이게이션된 DNA를 추가 크기 선별없이 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen) 내에 제공된 스핀 컬럼으로 직접 정제하였다. 그리고 나서, 4-주기 PCR 및 SureSelect 프라이머(Agilent)를 사용하여 상기 어댑터-라이게이션된 DNA를 증폭시켰다. Qubit 2.0 형광계(Invitrogen)를 이용하여 DNA 라이브러리를 정량하고 2100 Bioanalyzer(Agilent)와 DNA 1000 키트를 사용하여 라이브러리의 크기 분포를 확인하였다. 각 샘플에 대해 대략 270 bp의 평균 크기를 갖는 0.3-0.5μg의 증폭된 혈장 DNA 라이브러리를 생성하였다. SureSelect Custom 키트(Agilent)를 사용하여 표적 서열 농축(enrichment)을 수행하였다. 4개의 유전자 데이터베이스(RefSeq, Ensembl, CCDS, and Gencode)에 따른 전사된 DMD 부위 전체를 표적화하는 커스텀 포획 프로브(custom capture probe)를 Agilent SureDesign(https://earray.chem.agilent.com/suredesign)에서 제작하였다. 또한, 상기 프로브 제작에 하기 변수들을 고려하였다(밀도: 2x, 마스킹(Masking): 중간 엄격성, 부스팅(Boosting): 균형을 이룸). 제조사 지침에 따라, 300 ng의 증폭된 혈장 DNA 라이브러리를 상기 포획 프로브와 65℃에서 24시간 동안 배양하여 혼성화하였다. 그리고 나서, 상기 혼성화된 바이오틴화된 프로브/표적을 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin; Invitrogen)를 이용하여 모은 후, 상기 포획된 표적을 MinElute PCR 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 마지막으로, SureSelect PCR 프라이머(Agilent)를 이용하여 12-주기 PCR 증폭에 의해 상기 표적화된-DNA 라이브러리를 농축시켰다. PCR 산물을 QIAquick PCR 정제 키트에 의해 정제하였다. 상기 라이브러리를 Illumina HiSeq 2000 상에서 페어드 앤드(paired-end) 시퀀싱하였다.

<1-2> 염기서열변이정보 추출( Variant Calling )

상기 페어드-엔드 시퀀싱 리드(read)를 Bowtie2 aligner(v.2.1.0)를 이용하여 인간 게놈(Genome Reference Consortium Human Reference 37)에 대해 정렬하였다(Langmead B et al., Nat Methods 2012;9:357-9). Picard-tool로 PCR 중복된 리드를 제외시키고(http://picard.sourceforge.net), SAMtools(v.0.1.19)로 중복 리드가 없는 표준결과 포맷(Binary Alignment/Map format; BAM)을 추출하였다(Li H et al., Bioinformatics 2009;25:2078-9). 이후, 게놈 분석 툴키트(GATK, v.2.7-2)를 이용하여 삽입/결실(indel) 주위의 로컬 재정렬(Local realignment) 및 염기 품질 스코어 재교정(base quality score recalibration)을 수행하였고, GATK의 UnifiedGenotyper를 이용하여 염기서열변이정보 추출(variant calling)을 수행하였다. 나아가, GATK best practice에 기술된 변수를 이용하여 GATK VariantFiltration에 의해 저품질의 데이터 추출값을 걸러내었다(http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices; DePristo MA et al., Nat Genet 2011;43:491-8). 내부 스크립터를 이용하여, 유전형 품질 ≤ 30, 및 리드 깊이 ≤ 100인 변이를 더 걸러내었다. 마지막으로, ANNOVAR로 RefSeqGene 세트를 이용하여 걸러지지 않은 변이에 주석달기(annotation)를 수행하였다(Wang K et al., Nucleic Acids Res 2010;38:e164).

<1-3> 구조 변이 검출( Structural variation detection )

예측되지 않은 메이트 분리 또는 방향(unexpected mate separation or orientation)으로 맵핑된 페어드-엔드 시퀀싱 리드로부터 브레이크댄서(Breakdancer)-1.3.6을 이용하여 구조 변이를 검출하였다(Chen K et al., Nat Methods 2009;6:677-81). DMD 유전자에 대해 신뢰 점수 ≥ 90, 최소 길이 ≥ 1000, 및 지지 리드 수(supportive read counts) ≥ 10인 구조 변이만을 발병 후보로서 선택하였다. UCSC 게놈 브라우저에 의해 시각화된 커버리지 그래프(coverage plot)와 비교하여 큰 결실/중복을 검출하였다(Kent WJ et al., Genome Res 2002;12:996-1006).

<1-4> 단상형( haplotype ) 구축

남성에서의 반접합성(hemizygosity)으로 인해, DMD 부위의 산모 단상형을 직접 페이징(phasing)하였다. 게놈 DNA 시퀀싱으로부터 보인자 산모 및 발단자의 이형(heterozygous) 단일 뉴클레오타이드 변이(SNV)를 이용하여, 해로운 돌연변이를 함유하는 단상형을 단상형 A(HapA)로서 분류하고, 돌연변이가 없는 다른 단상형을 단상형 B(HapB)로서 분류하였다.

<1-5> 태아 DNA 농도 비율의 측정

DMD 유전자 외에도, 실시예 <1-1>의 과정과 유사하게 ZFX(X-linked zinc finger protein) 및 ZFY(Y-linked zinc finger protein) 부위를 표적화하는 커스텀 포획 프로브(custom capture probe)를 이용하여 ZFX 및 ZFY 유전자를 포획하여 태아 DNA 농도 비율을 측정하였다. 최소 맵핑 품질 = 20, 및 염기 품질 = 20을 갖는 2개의 징크 핑거 유전자의 평균 리드 깊이(

및

)를 이용하여, 하기와 같이 태아 DNA 농도의 비율을 측정하였다:

<1-6> 결과

발단자 및 산모의 커버리지 그래프를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이 각 발단자 및 산모의 DMD 유전자에 대한 커버리지 그래프로부터 DMD 유전자의 결실/중복이 확인되었다.

구체적으로, DMD-01 발단자는 엑손 49-52가 결실된 DMD 돌연변이를 가지고 있었고, DMD-02 발단자는 엑손 2가 중복된 DMD 돌연변이를 가지고 있었으며, DMD-03 발단자는 엑손 8-25가 결실된 DMD 돌연변이를 가지고 있었고, 이들의 DMD-01 내지 DMD-03의 산모들은 상기 돌연변이를 보유하고 있는 보인자(carrier)인 것으로 확인되었다. 한편, DMD-04 발단자는 DMD 돌연변이가 없었고, DMD-04 산모 역시 정상이었다.

또한, 결실 돌연변이를 갖는 발단자들은 결실 부위에 거의 0 리드 깊이를 가진 반면, 결실 돌연변이를 갖는 보인자 산모는 결실된 부위 밖에서의 기저 리드 깊이와 비교하여 대략 절반의 리드 깊이를 나타내었다(DMD-01 및 DMD-03). 중복 돌연변이를 갖는 보인자 산모의 리드 깊이는 기저선과 중복 돌연변이를 갖는 발단자(DMD-02) 사이에 위치하였다.

또한, 표적화된 딥 시퀀싱 결과를 Integrative Genomics Viewer에 의해 시각화하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 도에서 상부 세션 및 하부 세션은 DMD-04-산모 및 DMD-04-발단자의 리드 정렬을 나타낸다. 상기 도에서 보는 바와 같이, DMD-04-산모 및 DMD-04-발단자는 염색체 변이가 없었으나, DMD-04-발단자의 경우 DMD 유전자 내에 드 노보 넌센스 돌연변이(de novo nonsense SNV)를 가지고 있었다.

이후, 강력한 구조 변이 검출 소프트웨어인 브레이크댄서(breakdancer)를 이용하여 중단점(breakpoint)을 예측하였다. 상기 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

샘플	유형	엑손	중단점	크기	브레이크댄서 스코어	지지 리드(supportive read)
DMD-01-산모	결실	49-52	31,745,203-31,855,797	110,734	99	106
DMD-01-발단자	결실	49-52	31,745,188-31,855,795	110,716	99	142
DMD-02-산모	중복	2	33,025,794-33,084,354	54,843	99	140
DMD-02-발단자	중복	2	33,025,822-33,084,346	57,584	99	190
DMD-03-산모	결실	8-25	32,480,293-32,729,412	249,264	99	138
DMD-03-발단자	결실	8-25	32,480,294-32,729,455	249,255	99	165
DMD-04-산모	-	-	-	-	-	-
DMD-04-발단자	-	-	-	-	-	-
DMD-01-태아	-	-	-	-	-	-
DMD-02-태아	중복	2	33,025,782-33,084,311	57,720	99	132

또한, 각 샘플의 중복된 리드 비율을 하기 표 2에 나타내었다.

샘플	총 리드	중복된 리드를 갖는 총 리드	중복된 리드	중복된 리드(%)
DMD-01-산모	67,913,739	73,055,256	5,141,517	7.03
DMD-01-발단자	68,111,501	72,365,082	4,253,581	5.87
DMD-02-산모	63,394,802	67,051,900	3,657,098	5.45
DMD-02-발단자	69,840,025	74,232,768	4,392,743	5.91
DMD-03-산모	45,896,979	48,104,446	2,207,467	4.58
DMD-03-발단자	44,309,908	46,319,782	2,009,874	4.33
DMD-04-산모	50,495,606	52,946,358	2,450,752	4.62
DMD-04-발단자	45,282,130	47,793,858	2,511,728	5.25
DMD-01-태아	62,140,727	69,473,676	7,332,949	10.55
DMD-02-태아	53,482,707	59,063,358	5,580,651	9.44

나아가, 보인자와 발단자 내의 변이체 수를 확인한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

샘플	총 변이	SNV	삽입/결실	이형접합 SNV	동형접합 SNV
DMD-01-산모	1,926	1,654	272	907	747
DMD-01-발단자	1,322	1,152	170	-	-
DMD-02-산모	2,222	1,950	272	1,226	724
DMD-02-발단자	1,515	1,311	204	-	885
DMD-03-산모	2,056	1,805	251	920	681
DMD-03-발단자	1,312	1,152	160	1,133	-
DMD-04-산모	2,086	1,814	272	-	-
DMD-04-발단자	1,361	1,189	172	-	-
DMD-01-태아	1,305	1,124	181	-	-
DMD-02-태아	1,491	1,308	183	-	-

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 보인자와 발단자 내의 이형접합 또는 동형접합 SNV의 수는 900 내지 1200의 범위였다.

또한, 게놈 및 산모 혈장 DNA 서열분석의 표적화된 대규모 병렬 서열분석 결과를 하기 표 4에 요약하여 나타내었다.

샘플	총 리드	HG19에 맵핑된 총 리드	HG19에 맵핑된 총 리드(%)	표적에 맵핑된 총 리드	표적에 맵핑된 총 리드(%)	커버된 바이트(bait) 염기 ≥ 30	평균 리드 깊이
DMD-01-산모	67,913,739	67,040,115	98.71	26,014,464	38.8	97.7	1210.96
DMD-01-발단자	68,111,501	67,032,441	98.42	17,064,121	25.45	94.9	810.09
DMD-02-산모	63,394,802	62,700,359	98.9	25,734,326	41.04	97.7	1196.63
DMD-02-발단자	69,840,025	68,993,974	98.79	18,602,653	26.96	99.6	880.56
DMD-03-산모	45,896,979	45,384,745	98.88	17,985,738	39.62	97.6	835.91
DMD-03-발단자	44,309,908	43,765,253	98.77	10,319,646	23.57	88.6	490.65
DMD-04-산모	50,495,606	49,940,946	98.9	20,748,990	41.54	97.6	964.92
DMD-04-발단자	45,282,130	44,741,065	98.8	12,296,748	27.48	99.3	582.65
DMD-01-태아	62,140,727	61,254,483	98.57	14,649,008	23.91	99.7	693.69
DMD-02-태아	53,482,707	52,826,508	98.77	11,116,631	21.04	99.7	527.36

본 발명자들은 이형접합 SNV 및 발단자 단상형을 이용하여 DMD 유전자 내의 2개의 산모 단상형을 성공적으로 구축할 수 있었다.

또한, ZFY 대 ZFX 의 평균 리드 깊이 비율을 하기 표 5에 나타내었다.

샘플	평균 리드 깊이		ZFY 대 ZFX 비율
샘플	ZFX	ZFY	ZFY 대 ZFX 비율
DMD-01-산모	1150.06	0.92	0
DMD-01-발단자	779.27	759.14	0.97
DMD-02-산모	1105.32	0.91	0
DMD-02-발단자	794.58	770.91	0.97
DMD-03-산모	808.16	0.2	0
DMD-03-발단자	485.98	490.58	1
DMD-04-산모	899.65	0.15	0
DMD-04-발단자	526.51	517.92	0.98
DMD-01-태아	637.27	621.54	0.98
DMD-02-태아	504.52	491.97	0.98

상기 표에서 보는 바와 같이, 남성 발단자에서의 ZFY 대 ZFX의 평균 리드 깊이 비율이 1.0에 가까웠고, 여성 보인자에서는 0에 가까웠다. 이는 이들 징크 핑거 유전자들이 산모 혈장을 이용한 후속 연구에서 태아 DNA 비율을 측정하기 위한 믿을만한 지시자로서 사용될 수 있음을 제시한다

전술한 결과들은 발단자와 산모의 게놈 DNA를 표적화된 대규모 병렬 시퀀싱 방법을 통해 분석함으로써 산모가 보인자임을 확인할 수 있음을 보여준다.

실시예 2: 발단자 및 산모의 혈구 및 혈장 DNA 서열분석

<2-1> DNA 서열분석 및 유전변이 확인

2명의 보인자 산모로부터 다른 임신 기간(DMD-01-6주, DMD-01-17주, DMD-02-9주, 및 DMD-02-12주)에 종래 기술된 표준 방법에 따라 혈장(8-10ml)을 수집하였다(Tsui NB et al., Blood 2011;117:3684-91). 또한, 비교를 위해 대조군(NC3)으로서 정상적인 임신하지 않은 여성 혈장 DNA도 동일한 방식으로 수집하였다.

상기 수집한 혈장을 대상으로 실시예 <1-1> 내지 <1-5>에서와 동일한 방식으로 DNA 서열을 분석한 후 발단자 서열 리드 자료를 이용하여 유전변이 종류 및 부위를 확인하였다.

상기 산모의 커버리지 그래프를 도 3에 나타내었다.

이후, 강력한 구조 변이 검출 소프트웨어인 브레이크댄서(breakdancer)를 이용하여 중단점(breakpoint)을 예측하였다. 상기 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

샘플	유형	엑손	중단점	크기	브레이크댄서 스코어	지지 리드(supportive read)
NC3	-	-	-	-	-	-
DMD-01-6주	결실	49-52	31,745,183-31,855,798	110,795	99	28
DMD-01-17주	결실	49-52	31,745,398-31,855,798	110,768	99	19
DMD-02-9주	중복	2	33,025,776-33,084,342	53,305	99	24
DMD-02-12주	중복	2	33,025,822-33,084,325	56,709	99	40

또한, 보인자와 발단자 내의 변이체 수를 확인한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

샘플	총 변이	SNV	삽입/결실	이형접합 SNV	동형접합 SNV
NC3	2,116	1,867	249	1,065	802
DMD-01-6주	1,882	1,627	255	898	729
DMD-01-17주	1,881	1,627	254	1,205	711
DMD-02-9주	2,174	1,916	258	1,205	711
DMD-02-12주	2,201	1,936	265	1,218	718

나아가, 표적화된 대규모 병렬 시퀀싱의 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

샘플	총 리드	HG19에 맵핑된 총 리드	HG19에 맵핑된 총 리드(%)	표적에 맵팅된 총 리드	표적에 맵핑된 총 리드(%)	커버된 바이트(bait) 염기 ≥ 30	평균 리드 깊이
NC3	55,887,598	54,584,963	97.67	12,664,873	23.2	97.7	500
DMD-01-6주	54,828,497	53,911,589	98.33	9,928,251	18.45	97.7	465.49
DMD-01-17주	53,776,065	52,978,281	98.52	11,285,056	21.31	98	529.27
DMD-02-9주	50,421,216	49,643,621	98.46	9,388,234	18.91	98	440.29
DMD-02-12주	65,047,677	64,179,880	98.67	16,944,550	26.4	98.6	792.20

서열분석 결과, DMD 유전자에 대한 균일하고 높은 커버리지를 보였다.

또한, SNV 및 삽입-결실의 수를 확인한 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

샘플	총 변이	SNV	삽입/결실	이형접합 SNV	동형접합 SNV
NC3	2,116	1,867	249	1,065	802
DMD-01-6주	1,882	1,627	255	898	729
DMD-01-17주	1,881	1,627	254	895	732
DMD-02-9주	2,174	1,916	258	1,2-5	711
DMD-02-12주	2,201	1,916	265	1,218	718

상기 표에서 보는 바와 같이 SNV 및 삽입-결실의 수는 게놈 DNA 서열분석 데이터와 일치하였다.

또한, ZFX 및 ZFY 의 평균 리드 깊이를 계산함으로써 예측된 cffDNA 농도 비율을 하기 표 10에 나타내었다.

샘플	평균 리드 깊이		ZFY 대 ZFX 비율	태아 DNA 농도 비율(%)
샘플	ZFX	ZFY	ZFY 대 ZFX 비율	태아 DNA 농도 비율(%)
NC3	540.92	0	0	-
DMD-01-6주	442.57	12.88	0.058	5.8
DMD-01-17주	502.61	20.25	0.08	8
DMD-02-9주	412.21	20.01	0.097	9.7
DMD-02-12주	751.59	26.66	0.071	7.1

상기 표에서 보는 바와 같이, 산모 혈장 내 cffDNA의 농도 비율은 5.8% 내지 9.7%의 범위였다

또한, 샘플의 중복된 리드 비율을 계산하여, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

샘플	총 리드	중복된 리드를 갖는 총 리드	중복된 리드	중복된 리드(%)
NC3	55,887,598	77,764,396	21,876,798	28.13
DMD-01-6주	54,828,497	74,741,546	19,913,049	26.64
DMD-01-17주	53,776,065	72,911,708	19,135,643	26.24
DMD-02-9주	50,421,216	69,319,082	18,897,866	27.26
DMD-02-12주	65,047,677	80,532,264	15,484,587	19.22

더 높은 중복된 리드 비율 (19-28%)이 5개의 혈장 DNA 서열분석 데이터에 나타났는데, 이 차이는 라이브러리 제조 중 추가 PCR 주기로 인한 것일 수 있다.

<2-2> 태아 유전형 예측

보인자 검출 후, 산모 혈장 시퀀싱으로부터 2개의 페이징(phasing)된 대립유전자 사이에 단상형 불균형(haplotype imbalance)을 구별함으로써 태아 유전형을 예측하였다. 유전된 대립유전자가 산모 혈장 내 태아 DNA 비율에 비례하여 지나치게 많을 것이므로, 태아 유전형은 어떤 단상형이 지나치게 많은지를 예측함으로써 결정될 수 있다. 만약 지나치게 많은 단상형이 DMD 돌연변이를 갖는 것이라면, 태아는 DMD 돌연변이가 유전된 것으로 예측될 수 있을 것이다. 단상형 불균형의 통계적 유의성을 정규성 가정에 의존하는 단측 스튜던트 대응표본 t-검정(one tailed Student's paired t-test) 및 윌콕손 부호순위 검정(Wilcoxon Signed rank test)에 의해 추정하였다. DMD 유전자는 높은 재조합 비를 갖는 것으로 알려져 있으므로, 재조합 사건(recombination event) 및 재조합 점(recombination point)을 검출하기 위한 시험을 태아 유전형 예측에 앞서 수행하였다. 이상치(outlier value)로 인한 재조합 점의 예측 오차를 막기 위해, R 패키지 'extremevalues'를 이용한 분포-기반 이상치 검출 접근법을 사용하였다(Loo MPJvd. Extremevalues, an r package for outlier detection in univariate data, r package version 2.1. 2010). 이상치 검출 후, R 패키지 'bcp(Bayesian change point)'에 의해 리드 비율값의 변화점을 예측하였다(Erdman C et al., Bioinformatics 2008;24:2143-8). 재조합 사건의 검출 후, 단상형을 재구축하고 해로운 DMD 돌연변이를 갖는 단상형을 HapA*로, 상기 돌연변이를 갖지 않는 단상형을 HapB*로 분류하였다.

DMD-01 산모 혈장 DNA에서의 재조합 단상형 검출 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, Bcp 결과에 따른 두 단상형에서 이상(aberration)이 관찰되지 않았다. 평균 0.5를 넘는 큰 세그먼트 및 0.5 미만의 큰 세그먼트를 각각 단상형 A 및 B로 나타내었다. X축의 위치는 염색체 배위(coordinate)를 가리키지 않으며 상대적인 개별적인 SNV 위치를 가리킨다.

또한, DMD-02 산모 혈장 DNA에서의 재조합 단상형 검출 결과를 도 5에 나타내었다.

Bcp 알고리즘은 두 가지 단상형의 chrX: 32,321,115에서 변화점을 명확히 검출하였다. 리드 비율은 변화점에서 2개의 큰 세그먼트로 분류되었다. Bcp에 따르면, 재조합 사건은 chrX: 32,321,115-32,346,373에서 일어났다. 변화점 후 리드 비율값의 조정 이후, bcp 알고리즘은 하나의 큰 세그먼트에서 이상을 야기하지 않는다.

DMD-01-6주 및 DMD-01-17주의 시퀀싱 데이터의 분석이 DMD 부위 내의 재조합 점의 부재를 가리키는 2개의 단상형의 하나의 큰 세그먼트를 밝혀내었음에도 불구하고(도 4 참조), bcp 알고리즘은 DMD-02-9주 및 DMD-02-12주 서열 데이터에서 리드 비율의 현저한 변화점을 예측하였다(도 5 참조). 이후 분석은 bcp 알고리즘에 기초하여 염색체 X 위치 32,321,115 및 32,346,373 사이에 재조합 점을 예측하였다. DMD-02-9주 및 DMD-02-12주 서열분석 데이터의 단상형을 재조합 점 정보를 이용하여 재구축하였다(도 5C 및 5D 참조).

그리고 나서, 본 발명자들은 산모 혈장에서 2개의 단상형 사이의 평균 리드 비율을 비교함으로써 태아 유전형을 예측하고자 하였다. 상기 태아 유전형 예측 결과를 도 6에 나타내었다.

DMD-01-6주 및 DMD-01-17주에서, HapB의 평균 리드 비율은 5% 및 5.8% 정도 유의하게 높았는데, 이는 돌연변이되지 않은 단상형이 태아로 유전되었음을 보여준다(도 6A). 반면, HapA*(재조합 사건에 기초한 돌연변이를 갖는 재구축된 단상형)는 DMD-02-9주 및 DMD-02-12주에서 4.5% 및 2.8% 정도 유의하게 많았는데, 이는 돌연변이된 단상형이 태아로 유전되었음을 보여준다(도 6B).

산모 혈장 DNA 시퀀싱 데이터에서 2개의 페이징된 단상형의 평균 리드 비율을 하기 표 12에 나타내었다.

샘플	평균 리드 비율		평균 차이(%)	태아 DNA 농도 비율(%)	짝을 이룬 값들의 차이 검정(paired difference test)
샘플	단상형 A	단상형 B	평균 차이(%)	태아 DNA 농도 비율(%)	스튜던트의 짝을 이룬 t-검정	윌콕손의 부호순위 검정
DMD-01-6주	0.475	0.525	5.0	5.8	<2.2e-16	<2.2e-16
DMD-01-17주	0.471	0.529	5.8	8.0	<2.2e-16	<2.2e-16
DMD-01-9주*	0.522	0.477	4.5	9.7	<2.2e-16	<2.2e-16
DMD-02-12주*	0.514	0.485	2.9	7.1	<2.2e-16	<2.2e-16

* DMD-02-9주 및 DMD-02-12주의 단상형은 재조합 단상형을 의미한다.

DMD-01 및 DMD-02에서 상기 예측된 태아 유전형은 태아 게놈 DNA 서열분석 데이터와 정확히 일치하였다(도 6 및 표 1 및 7 참조). 산모 혈장 샘플을 이용한 예측된 재조합 점 후 재조합 단상형의 유전은 DMD-02-태아에서도 확인되었다.

Claims

(1) 단일유전자 유전변이를 갖는 발단자(proband)의 혈구 내에 존재하는 DNA에서, 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위의　서열을 분석하는 단계;
(2) 상기 단일유전자 유전변이를 유발하는 유전자를 보유한 보인자 산모의 혈장 내에 존재하는 DNA에서,　상기 단일유전자 유전변이를 갖는　DNA 부위의 서열을 분석하는 단계;
(3) 상기 단계 (2)에서 수득한 발단자 및 산모의 DNA 서열을 비교하여 단일유전자 유전변이를 갖는 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)를 확인하는 단계;
(4) 상기 단계 (3)에서 확인된 이형단일염기변이로부터 단상형(haplotype)을 구축하는 단계;
(5) 단계 (2)에서 수득한 산모 DNA 서열로부터, 상기 단계 (4)에서 구축된 단상형 중 단일유전자의 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도(frequency)를 계산하는 단계; 및
(6) 상기 단일유전자 유전변이를 포함하는 단상형의 빈도가 0.5보다 큰 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하는 단계
를 포함하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단일유전자 유전변이가 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 근관성 근육병증(Myotubular myopathy), 로웨 증후군(Lowe syndrome), 멘케스 증후군(Menkes syndrome), X-연관된 부신백질이영양증(X-linked adrenoleukodystrophy), 호에랄-레이다슨 증후군(Hoyeraal-Hreidarsson syndrome), 척수성 근위축증(Spinal Muscular atrophy), 이염색 백색질 장애(Metachromatic leukodystrophy) 및 크라베병(Krabbe disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일유전자 질환을 야기하는 유전변이인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 발단자가 보인자 산모로부터 태어나 단일유전자 유전변이로 인한 단일유전자 질환을 갖는 남아인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 보인자 산모가 임신 6주 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 보인자 산모의 혈장이 무세포(cell-free) 태아 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)의 서열분석이 차세대 서열분석(Next generation sequencing)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)의 서열분석이 표적 농축 및 대규모 병렬 서열분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (4)의 단상형 구축에 앞서 단일유전자 유전변이를 갖는　DNA 부위에서의 재조합 점(recombination point)을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (5)의 단상형의 빈도가 단상형의 리드 비율(read fraction)인 것을 특징으로 하는 방법.