KR20160049601A

KR20160049601A - 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20160049601A
Application number: KR1020140146185A
Authority: KR
Inventors: 한동욱; 김종훈
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2014-10-27
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2016-05-10
Also published as: KR101768451B1

Abstract

본 발명은 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법에 관한 것으로서, 기존의 바이러스성 벡터가 아닌 에피소말벡터(Episomal vector) 를 이용하여 간세포 특이적인 전사인자들을 조합(Hnf4a, Foxa1 / Hnf4a, Foxa3 / Gata4, Hnf1a, Foxa3)해 체세포에 도입하는 것으로, 비-바이러스성 유도 간세포인 e-iHeps을 확립해 외래 유전자의 도입 때문에 임상적용이 어려웠던 한계점을 극복하고, 유도만능줄기세포 단계를 거치지 않는다는 점에서 효율적인 체세포에서 간세포로의 직접 교차분화방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 이렇게 확립된 e-iHeps은 외래 유전자의 삽입을 배제하여 직분화 세포 임상적용 활용의 위험성을 낮추고 기존 유도만능줄기세포 유래 간세포의 문제점들을 해결할 수 있으므로 간이식이 유일한 치료방법인 간질환에 대해 획기적인 치료 방법을 제시할 수 있는 효과가 있다.

Description

비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법{METHOD OF DIRECT CONVERSION OF FIBROBLASTS INTO HEMATOCYTES USING NON-VIRAL VECTORS}

본 발명은 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 비-바이러스성(non-viral) 벡터를 사용함으로써 기존의 바이러스 감염 방식을 사용하지 않으며, 유도만능줄기세포 단계를 거치지 않고 체세포에서 간세포로 직접 교차분화시키는 방법에 관한 것이다.

2006년 일본의 Yamanaka 팀이 체세포에 외래 유전자 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc을 도입하여 배아줄기세포와 유사한 세포주인 유도만능줄기세포(iPSCs) 를 확립했다. 이를 리프로그래밍(Reprogramming)이라고 부른다. 이 기술을 활용하여 윤리문제 등 기존의 배아줄기세포 한계점을 극복하고 더 나아가 분화 및 메커니즘 연구를 통하여 질병모델링, 신약스크리닝 등에 활발한 연구가 진행되고 있다.

그러나 유도만능줄기세포 또한 한계점을 지니고 있다. 첫 번째, 유전자의 도입시 주로 바이러스를 이용하여 리프로그래밍을 유도한다. 둘째, 유도만능줄기세포로부터 원하는 세포로의 분화시 미분화 세포가 잔존할 수 있다. 첫 번째 한계점은 단백질이나 RNA를 통하여 효율은 낮지만 어느 정도 극복할 수 있다. 그러나 두 번째 한계점의 경우 아직까지 임상적용에 있어서 큰 장애물로 사료되고 있다.

이에 유도만능줄기세포 활용의 한계점을 극복하고자, 직분화(Direct conversion) 기술이 각광을 받고 있다. 이는 임의의 세포 A를 전능성을 지닌 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 과정을 거치지 않고 원하는 세포인 B로 직접 전환하는 기술이다.

특히, 2011년 중국 연구팀이 간세포 특이적인 전사인자 Gata4, Hnf1a, Foxa3 그리고 같은 해, 일본 연구팀이 간세포 특이적인 전사인자 Hnf4a와 Foxa1, Foxa2 또는 Foxa3 를 이용하여 각각 체세포로부터 간세포로의 직분화에 성공하였다. (Huang et al, nature, 2011) (Sekiya & Suzuki, nature, 2011)

그러나 위 두 그룹은 체세포로부터 간세포로의 직분화시 바이러스 시스템을 기반으로 하여 전사인자를 도입하였다. 이는 숙주 유전자에 외래 유전자가 삽입되어 추후 임상적용에 있어서 많은 한계점이 존재하게 된다.

따라서, 본 연구진은 바이러스 시스템 기반이 아닌 비-바이러스성 시스템 기반. 즉, 뉴클레오펙션(Nucleofection) 과 숙주에 외래 유전자 삽입이 되지 않는 에피소말벡터(Episomal vector) 를 이용하여 간세포 특이적인 전사인자 Gata4, Hnf1a, Foxa3 를 섬유아세포에 도입하였다. 이를 통해, 본 연구진은 비-바이러스성 유도 간세포주를 확립하였고, 이를 e-iHeps이라고 명명하였다.

추후 본 시스템을 이용하여 외래 유전자가 삽입된 기존 유도 간세포의 한계점을 극복하고, 외래 유전자 비삽입성(Integration-free) 유도 간세포인 e-iHeps을 임상적용에 활용할 수 있을 것이라고 사료된다.

관련 종래기술로는 미국공개특허 US2013/0071365(INDUCED HEPATOCYTES), 미국등록특허 US8546140(METHODS FOR THE PRODUCTION OF IPS CELLS USINGNON-VIRALAPPROACH) 등이 있다.

본 발명의 목적은, 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키기 위하여 특정 전사인자들의 조합인 조합1(Hnf4a, Foxa1), 조합2(Hnf4a, Foxa3), 조합3(Gata4, Hnf1a, Foxa3) 각각으로 코딩된 비-바이러스성 벡터를 섬유아세포에 도입함으로써, 외래 유전자 도입 없이 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 비-바이러스성 벡터(non-viral vector)에 간세포 특이적 전사인자를 도입하는 단계; (2) 상기 (1)단계에 의해 간세포 특이적 전사인자가 도입된 비-바이러스성 벡터를 체세포에 도입하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에 의해 제조된 체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법을 제공한다.

상기 비-바이러스성 벡터는 에피소말 벡터(episomal vector)인 것을 특징으로 한다.

상기 간세포 특이적 전사인자는 Hnf4a와 Foxa1인 것을 특징으로 한다.

상기 간세포 특이적 전사인자는 Hnf4a와 Foxa3인 것을 특징으로 한다.

상기 간세포 특이적 전사인자는 Gata4, Hnf1a 및 Foxa3인 것을 특징으로 한다.

상기 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법은 유도만능줄기세포 단계를 거치지 않고 진행되는 과정이므로 기존의 방식보다 효율적이며, 비-바이러스성 벡터에 전사인자를 코딩해 세포에 도입함으로써 외래 유전자가 공정에 사용되었을 때의 임상적용상의 한계점을 극복할 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 실험과정에 대한 모식도이다.
도 2a 는 에피소말벡터에 도입된 형광물질 mCherry가 계대배양을 거치며 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 2b 는 에피소말벡터에 도입된 mCherry가 계대배양을 거치며 감소하는 것을 FACs로 확인한 것이다.
도 3a 는 15일 배양한 e-iHeps의 형태학적 특징을 나타낸 것이다.
도 3b 는 세 가지 조합에 의한 상피 세포적 군집의 형성을 육안으로 확인하고 간세포 표지인자인 E-cadherin 염색법으로 재확인한 것이다.
도 3c 는 e-iHeps의 형태가 섬유아세포보다는 체내 유래 간세포와 유사함을 확인한 것이다.
도 3d 는 e-iHeps의 군집을 E-cadherin 염색법으로 확인한 것이다.
도 4 는 면역형광법을 통한 외래 유전자 도입을 확인하고 교차분화 효율을 확인함으로써 각각의 외래 유전자가 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 5a 는 RT-PCR을 통해 e-iHeps와 체내 유래 간세포와의 유사성을 나타낸 것이다.
도 5b 는 qPCR을 통해 e-iHeps와 체내 유래 간세포와의 유사성을 나타낸 것이다.
도 6 은 면역형광법을 통해 e-iHeps가 섬유아세포보다 체내 유래 간세포와 유사하게 간세포 인자들을 발현함을 나타낸 것이다.
도 7a 는 e-iHeps의 기능성 검증을 위해 Periodic acid Schiff(PAS) 염색을 통해 글리코겐 저장능을 확인하고, Indocyanine green(ICG) 염색을 통해 외래 물질 섭취 및 배설 기능을 확인한 것이다.
도 7b 는 e-iHeps의 요소 분비능 검증을 위해 Urea Assay로 확인한 것이다.
도 7c 는 e-iHeps의 Albumin 분비능을 확인하기 위해 ELISA를 통해 확인한 것이다.
도 8a 는 e-iHeps의 증식율을 확인한 것이다.
도 8b 는 e-iHeps가 계대배양을 거치면서 핵형을 유지하는 것을 확인한 것이다.
도 9 는 e-iHeps에서 다른 내배엽 세포의 발현 유무를 RT-PCR을 통해 확인한 것이다.
도 10 은 e-iHeps의 유전자 발현 양상을 Microarray를 통해 확인한 것이다.
도 11a 는 e-iHeps에서 계대배양을 거치며 외래 유전자의 발현이 감소함을 qPCR을 통해 확인한 것이다.
도 11b 는 e-iHeps에서 외래 유전자와 에피소말벡터의 특이적인 시퀀스인 EBNA-1이 계대배양을 거치며 감소함을 gDNA PCR을 통해 확인한 것이다.
도 11c 는 e-iHeps에서 계대배양을 거치며 에피소말벡터의 시퀀스가 감소함을 qPCR을 통해 확인한 것이다.
도 12a 는 성체 섬유아세포에 조합 3(Gata4, Hnf1a, Foxa3)의 구성을 적용하여 제조한 e-iHeps의 상피 세포적 군집 형성을 확인한 것이다.
도 12b 는 RT-PCR을 통한 성체 섬유아세포 유래 e-iHeps의 발현양상이 섬유아세포보다 체내 유래 간세포와 유사함을 확인한 것이다.
도 12c 는 성체 섬유아세포 유래 e-iHeps에서의 면역형광법을 통해 간세포 인자인 Albumin, Ck18의 발현을 확인하고, 또한 PAS, ICG 및 Dil-Ac-LDL 분석을 통해 체내 유래 간세포와의 유사성을 확인한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 (1) 비-바이러스성 벡터(non-viral vector)에 간세포 특이적 전사인자를 도입하는 단계; (2) 상기 (1)단계에 의해 간세포 특이적 전사인자가 도입된 비-바이러스성 벡터를 체세포에 도입하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에 의해 제조된 체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법을 제공한다.

상기 간세포 특이적 전사인자는 조합 1(4a1)(Hnf4a, Foxa1), 조합 2(4a3)(Hnf4a, Foxa3), 조합 3(GHF)(Gata4, Hnf1a, Foxa3)인 것을 특징으로 한다.

상기 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 한다.

면역형광법

세포를 4% PFA를 이용하여 상온에서 20분간 고정시킨 후, PBS로 세 번 씻어낸다. 그 후 0.3% Triton X-100(Sigma)와 5% FBS가 포함된 PBS를 이용하여 상온에서 2시간동안 인큐베이션 시킨다. 2시간 후, 1차 안티바디를 넣고 4도씨에서 오버나잇 동안 인큐베이션 시킨다. mouse anti-albumin (R&D Systems, 1:100), mouse anti-CK18 (Abcam, 1:200), rabbit anti-ZO-1 (Invitrogen, 1:200), rabbit anti-E-cadherin (Cell Signaling, 1:200) and mouse anti-Vimentin (Abcam, 1:200)

그 후, PBS로 세 번 씻어내고 형광이 부착된 2차 안티바디를 넣고 상온에서 2시간동안 인큐베이션 시킨다. 인큐베이션 후, PBS로 세 번 씻어내고 Hoechst33342 (Invitrogen)를 이용하여 세포핵을 염색한다.

Flow Cytometry(FACs)

세포에 0.25% Trypsin/EDTA 과 70um cell strainer를 이용하여 단일 세포 단위로 만든다. 단일화된 세포는 FACS Aria I 기계장치의 적색파장을 이용하여 분석한다. 본 실험에서는 형광물질인 mCherry를 배아섬유아세포에 도입한 후, 지속적인 배양을 진행하였다. FACs 실험은 4주에 걸쳐 진행되었으며, 분석은 각각 1, 2, 3, 4주에 실행되었다.

Dil-Ac-LDL, PAS, ICG 분석

10μg/ml의 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate가 부착된 acetylated LDL (Dil-Ac-LDL, Invitrogen)을 세포에 투입하고 4시간 동안 37도씨에서 인큐베이션 시킨다. 그 후 Hoechst33342 (Invitrogen)를 이용하여 세포핵을 염색한다. PAS 염색의 경우 Periodic acid-schiff kit (Invitrogen)를 이용하고, 먼저 10% Formalin이 첨가된 95% Ethanol을 이용하여 고정시킨 후, DW로 1분간 씻어낸다. 그 후, periodic acid solution을 넣고 상온에서 5분간 인큐베이션 시킨다. 5분 후, DW로 세 번 씻어내고 Schiff's reagent를 넣고 15분 상온에서 인큐베이션 시킨다. 15분 후, DW로 세 번 씻어낸다. ICG의 경우 ICG solution (Sigma)를 넣고 1시간 동안 37도씨에서 인큐베이션 시킨다. 그 후, PBS로 세 번 씻어낸다.

Albumin and Urea 분비 분석

48시간 동안 세포를 배양한 배양액을 수거하여 mouse albumin ELISA kit (Bethyl Laboratory)와 QuantiChrom Urea Assay Kit (BioAssay Systems)를 이용하여 Albumin과 Urea의 양을 각각 측정한다.

Microarray

Affymetrix 3'IVT kit을 이용하여 100ng 의 RNA를 16시간 동안 In Vitro transcription 시킨다. 정제과정을 거친 후, Mouse Genome 430 PM Array Strip (Affymetrix)에 샘플을 16시간 동안 하이브리다이제이션 시킨다. 그 후, Array Strip의 염색과 이미지 과정을 진행한다. Robust Microarray Analysis (RMA) algorithm을 이용하여 최초의 데이터를 산출하고, MEFs과 체내 유래 간세포와의 2배 이상 발현의 차이를 기준으로 3,276개의 유전자를 선별한다. 선별된 유전자 발현을 바탕으로 MeV software를 이용하여 Heat map을 작성한다.

gDNA 분리 및 Copy number 확인

세포를 수거하여 300ul의 roteinase K가 첨가된 lysis buffer를 넣고 16시간 동안 56도씨에서 인큐베이션 시킨다. 그 후, 동량의 phenol chloroform isoamylalcohol을 넣고 섞는다. 원심분리기를 이용하여 (13,000rpm, 10분) 물층을 분리해낸다. 분리된 물층에 동량의 chloroform isoamylalcohol를 넣고 섞는다. 다음으로 총 볼륨의 10분의 1만큼 3M NaOAc와 3배 만큼의 100% ehtanol을 넣고 원심분리기를 이용하여 펠렛을 바닥으로 가라앉힌다. 그 후 70% ethanol을 이용하여 씻어낸 후, 자연 건조시킨다. 자연 건조 후 펠렛을 RNase/DNase free water를 이용하여 일루션 한다. 에피소말벡터의 copy number를 확인하기 위해, 먼저 순차적으로 희석된 벡터와 gDNA를 바탕으로 스탠다드 커브를 그린다. EBNA-1의 발현을 바탕으로 copy number와 2^-ΔΔ ^Ct 값을 결정하고, Fbxo15의 발현을 바탕으로 Cell number와 2^-ΔΔCt 값을 결정한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 사용한 생쥐와 섬유아세포의 분리방법

(1) 배아섬유아세포 :

C57/B6 생쥐의 수정 후 13.5일 (E13.5)의 배아를 꺼내 배아의 머리와 모든 내장을 제거한다. 남아있는 조직은 가위를 이용하여 잘게 자른 후 0.25% Trypsin/EDTA를 이용하여 5분간 37도씨에서 인큐베이션 시킨다. 그 후, 동량의 10% FBS DMEM을 넣고 파이펫을 이용하여 분해시킨다. 분해된 조직은 원심분리기를 이용하여 펠렛으로 만들고, 상층액을 제거한 후 펠렛을 새로운 10% FBS DMEM으로 리서스펜션 시켜 15cm 젤라틴 코팅 접시에 뿌린다. 실험에는 계대배양 2~3번 후의 배아섬유아세포를 사용하였다.

(2) 성체섬유아세포 :

8~10주의 C57/B6 생쥐의 꼬리를 약 2cm 잘라낸다. 잘라낸 후, 겉에 있는 진피(dermis)를 벗겨내고, 남아있는 조직을 메스를 이용하여 1mm 정도로 자른다. 자른 조직을 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트의 한 웰에 놓는다. 조직들은10%FBS DMEM을 이용하여 배양하고, 조직으로부터 뻗어 나온 세포는 0.25% Trypsin/EDTA를 이용하여 계대 배양한다.

실시예 2 : 비-바이러스성 유도 간세포 생산 및 배양

1x10⁶ 개의 생쥐배아섬유아세포(MEFs; mouse embryonic fibroblasts) 에 P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X kit 를 사용하여 혼합물을 만든 후, 4D-Nucleofector (Lonza) 기계를 통하여 에피소말벡터(pCXLE-gw) 에 구축된 조합1 (4a1) : Hnf4a, Foxa1 , 조합2 (4a3) : Hnf4a, Foxa3 , 조합3 (GHF) : Gata4, Hnf1a, Foxa3 을 각각 1.5 μg 씩 도입시킨다. 도입된 세포를 콜라겐 코팅 접시에 뿌리고 48시간 후, 간세포 특이적인 배양액(HCM; Hepatocyte culture medium - DMEM/F-12 (Invitrogen) + 10% FBS, 0.1μM dexamethasone (Sigma), 10mM nicotinamide (Sigma), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS) premix (Gibco), 1x PSG (Invitrogen), 10ng/ml fibroblast growth factor 4 (FGF4, Peprotech), 10ng/ml hepatocyte growth factor (HGF, Peprotech) and 10ng/ml epidermal growth factor (EGF, Peprotech)) 으로 교체한다. 도입 후, 약 15일 째 상피 세포적 군집을 확인한다. 이후 콜로니 피킹과 계대배양을 통해 비-바이러스성 유도 간세포주를 확립한다.

실험예 1 : 에피소말 벡터의 체세포 도입 및 발현 확인

에피소말벡터에 구축된 형광물질 mCherry를 도입하여 본 시스템을 통하여 에피소말벡터가 섬유아세포에 정상적으로 도입되어 발현하는 것을 확인했고, 또한 계속적인 계대배양을 거치면서 숙주에 외래 유전자 삽입이 되지 않는 것을 FACs를 통해 간접적으로 확인했다(도 2).

실험예 2 : 비-바이러스성 유도 간세포의 형태 및 군집 확인

세 가지의 조합 중 조합3 (Gata4, Hnf1a, Foxa3) 에서만 (도 3a)과 같은 상피 세포적 군집이 확인되었고, 육안으로 군집을 확인해본 결과 바이러스 시스템 기반 유전자 도입 방법에 비해 군집 생성 효율이 비교적 낮은 것을 확인했다(도 3b). 이 후 확립된 유도 간세포는 e-iHeps (episomal-mediated induced hepatocytes) 라 명명했고, 이는 체내 유래 간세포와 유사한 형태를 지니고 있다. 특히, 간세포 특유의 다각형 형태와 세포간의 강한 접합 형태를 나타내고 있다(도 3c). 또한, 간세포 표지인자인 E-cadherin 염색을 통하여 군집 생성을 다시 확인했다(도 3d).

실험예 3 : 외래 유전자 도입 및 교차분화 효율 확인

면역형광법을 통해 효율을 확인해본 결과, 도입된 외래 유전자의 효율은 각각 30.37 ± 5.64 (Gata4) , 33.23 ± 3.55 (Hnf1a) , 32.21 ± 4.53 (Foxa3) 로 3.25 % (0.3037 x 0.3323 x 0.3221 x 100 = 3.25 %) 의 세포에 모든 외래 유전자가 도입된 것을 확인했다. 이를 통해 교차분화 효율이 약 0.12 % (5.67 / 4875 x 100 = 0.1163) (E-cadherin 양성 군집 / 최초 세포의 수 중 3개의 모든 외래 유전자가 도입된 세포의 수 x 100 ) 임을 확인했다. 또한, 간세포 특이적인 배양액이 아닌 기본 배양액에서 배양을 했을 때, 도입된 각각의 유전자가 1.10 ± 0.50 (Gata4) , 2.39 ± 1.53 (Hnf1a) , 0.44 ± 0.88 (Foxa3)로 감소하는 것을 확인했다(도 4).

실험예 4 : e-iHeps와 체내 유래 간세포의 유전자 발현 유사성 확인

RT-PCR을 통해 e-iHeps와 체내 유래 간세포와의 유사성을 검증한 결과, e-iHeps은 이미 보고된 바이러스 시스템 기반의 방법을 이용한 r-iHeps (retrovirus-mediated induced hepatocytes) 과 유사하게 간세포 인자를 발현하는 동시에 섬유아세포 인자는 발현하지 않는 것을 확인했다(도 5a). 또한, qPCR을 통해 e-iHeps와 체내 유래 간세포의 유사한 유전자 발현 양상을 검증했다(도 5b).

실험예 5 : e-iHeps의 간세포 인자 발현 확인

면역형광법을 통해 유도 간세포와 체내 유래 간세포와의 유사성을 검증한 결과, e-iHeps이 체내 유래 간세포와 유사하게 Albumin, CK18, E-cadherin, Zo-1 을 발현하는 것을 확인했고, 섬유아세포 인자인 vimentin은 발현하지 않는 것을 확인했다(도 6).

실험예 6 : e-iHeps의 간세포 기능성 확인

e-iHeps의 기능성 검증을 위해, Periodic acid-Schiff (PAS) 염색을 통한 세포질 내 글리코겐 저장능 및 Indocyanine green (ICG) 처리능을 확인한 결과, 체내 유래 간세포와 유사하게 글리코겐 저장 및 외래 물질 섭취, 배설을 할 수 있는 기능성을 확인했다(도 7a). 또한, 간세포의 중요한 기능인 요소 (Urea) 분비능과 Albumin 분비능을 Elisa를 통해 확인해본 결과, 요소와 Albumin을 분비하는 것을 확인했다(도 7b, 도 7c).

실험예 7 : 계대배양을 통한 e-iHeps의 증식율과 핵형 분석

e-iHeps은 바이러스 시스템 기반의 r-iHeps과 비슷한 증식율을 보였으며(도 8a), 계속적인 계대배양 후에도 정상 핵형을 유지하는 것을 확인했다(도 8b).

실험예 8 : 간세포로의 직분화 여부 확인

e-iHeps은 다른 내배엽 세포의 특이적인 유전자를 발현하지 않음으로 다른 세포 종류를 거치지 않고 간세포로 직분화가 되었음을 증명했다(도 9).

실험예 9 : e-iHeps의 전체 유전자 발현 양상 확인

Microarray를 통해 전체적인 유전자 발현 양상을 확인해본 결과, e-iHeps이 섬유아세포와는 달리 체내 유래 간세포와 유사한 유전자 발현 양상을 띠는 것을 확인했고, 간세포는 체내의 많은 대사에 관여하기 때문에 이에 관련된 유전자를 분류하여 확인해본 결과, 각각의 대사 관련 유전자 발현 양상도 체내 유래 간세포와 유사한 것을 확인했다(도 10).

실험예 10 : 계대배양을 통한 외래 유전자 유??무 확인

외래 유전자 발현을 qPCR을 통해 확인해본 결과, 도입 후 5일째 각각의 외래 유전자가 발현하다가 계속적인 계대배양을 통해 외래 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인했다(도 11a). 또한, gDNA PCR을 통해 각각의 외래 유전자와 에피소말벡터(pCXLE-gw)의 특이적인 시퀀스인 EBNA-1이 점차 감소하는 것을 확인했다(도 11b). 마지막으로 에피소말벡터의 copy 수를 qPCR을 통해 확인한 결과, 도입 후 5일째에는 약 16개의 copy 수가 발견된 반면 계대배양을 거칠수록 대조군인 섬유아세포와 마찬가지로 에피소말벡터 시퀀스가 발견되지 않는 것을 확인했다(도 11c). 이를 통해, e-iHeps이 외래 유전자 비삽입성 유도 간세포임을 증명했다.

실험예 11 : 성체 섬유아세포로부터의 e-iHeps 생산 확인

배아 섬유아세포의 경우 세포의 오염에 대한 가능성이 존재하기 때문에, 이를 배제하고자 성체 섬유아세포인 꼬리 섬유아세포를 이용하여 비-바이러스성 유도 간세포를 생산했다. 먼저, 종전과 동일한 방법으로 각각의 외래 유전자 (Gata4, Hnf1a, Foxa3) 를 도입했다. 도입 후 약 20일 째 상피 세포적 군집을 확인했다(도 12a). 이 군집을 피킹 및 계대배양을 통하여 세포주를 확립한 후 분석해 본 결과, RT-PCR을 통해 간세포 인자는 발현하는 반면 섬유아세포 인자는 발현하지 않는 것을 확인했고(도 12b), 면역형광법을 통해 간세포 인자인 Albumin, Ck18 발현을 확인했다. 또한, PAS 염색법, ICG 및 low density lipoprotein (LDL) 섭취를 통해 성체 섬유아세포 유래의 e-iHeps 또한 체내 유래 간세포와 유사한 기능을 가지는 것을 확인했다(도 12c).

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

(1) 비-바이러스성 벡터(non-viral vector)에 간세포 특이적 전사인자를 도입하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 간세포 특이적 전사인자가 도입된 비-바이러스성 벡터를 체세포에 도입하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계에 의해 제조된 체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 (1)단계에서 사용되는 비-바이러스성 벡터는 에피소말 벡터(episomal vector)인 것을 특징으로 하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 (1)단계에서 간세포 특이적 전사인자는 Hnf4a와 Foxa1인 것을 특징으로 하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 (1)단계에서 간세포 특이적 전사인자는 Hnf4a와 Foxa3인 것을 특징으로 하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 (1)단계에서 간세포 특이적 전사인자는 Gata4, Hnf1a 및 Foxa3인 것을 특징으로 하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (2)단계의 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법.