KR20160044300A - 생체내에서 나노몰 농도의 헤파린 검출용 화학센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 헤파린 검출방법 - Google Patents

생체내에서 나노몰 농도의 헤파린 검출용 화학센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 헤파린 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체내에서 나노몰 농도의 헤파린 검출용 화학센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 헤파린 검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 생체내에서 나노몰 농도의 헤파린 검출용 화학센서는 다른 화학종이 존재하는 생체내에서도 헤파린에 대한 선택성이 우수하고, pH 1.5에서부터 11.5에서까지 넓은 범위의 pH에서도 작동하여 환경적인 영향이 적어 헤파린의 정량을 쉽게 측정할 수 있는 효과가 있다. 또한 그 검출한계가 수용액상에서는 3pM이며 혈장 혹은 혈청을 포함하는 수용액상에서는 34pM로서, 10-9 M 범위에서 측정이 가능하여 생체 시료인 혈청 및 혈장에서도 헤파린을 민감하게 비례 검출할 수 있으므로 혈액 내 헤파린의 농도을 쉽게 측정할 수 있는 효과가 있다.

Description

생체내에서 나노몰 농도의 헤파린 검출용 화학센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 헤파린 검출방법{Chemosensor for nanomolar concentration of heparin in vivo, preparation method thereof and detection method of heparin using the same}
본 발명은 생체내에서 나노몰 농도의 헤파린 검출용 화학센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 헤파린 검출방법에 관한 것이다.
헤파린은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 일종으로 주로 황산기 및 아세트산기로 이루어진 이당류가 선형적으로 반복되어 이루어져 음의 전하를 띠는 고분자이다. 이 고분자는 혈장중의 안티트롬빈III(antithrombin III)와 결합해서 트롬빈(thrombin)을 불활성화 함으로서 혈액응고 저지작용을 가진다.
임상적으로, 헤파린은 외과 수술 중에 항응고제로서 혈전증을 방지하는 데 쓰여왔다. 헤파린의 과다투여는 출혈 및 저혈소판증으로 이어지기 때문에, 혈장 속의 헤파린의 농도를 정량적으로 분석하는 것은 매우 중요하다.
종래에 헤파린의 농도를 분석하는 방법들이 개발되었는데, 예를 들어 활성응고시간분석(activated clotting time assay)(비특허문헌 1), 활성부분트롬보플라스틴시간분석 (activated partial thromboplastin time assay)(비특허문헌 2), 전기화학적 분석방법(비특허문헌 3) 등이 존재한다. 그러나 상기 분석방법들은 신뢰도가 비교적 낮으며, 다른 화학종에 대한 간섭이 큰 문제가 있다.
한편, 최근 생체 내 주요 물질과 이온들에 대한 새로운 센서의 설계와 연구는 그 동안 활발히 진행되어 왔다. 그 중에서도 초분자(supramolecule) 화학은 선택적으로 이온 또는 여러 가지 다른 종류의 게스트 화합물들과 결합할 수 있는 호스트 화합물의 설계에 대하여 큰 가능성을 보여 왔으며, 이러한 초분자 화합물에 형광물질을 도입함으로써 게스트 화합물과의 결합 시 발생되는 형광변화를 이용하여 보다 손쉽게 검출할 수 있는 형광 화학센서(fluorescent chemosensor)가 연구되고 있다.
형광이란 특정한 광파장(여기파장)을 갖는 광자가 표지분자(indicator molecule)와 충돌하고, 충돌의 결과로 전자가 고에너지 준위로 여기(excitation)되면서 일어나는 광화학적 현상이다. 여러 분석방법 중에서 형광을 이용하는 방법은 비교적 간단하고 또한 매우 뛰어난 감도로 인해 10-9 M 농도에서도 신호를 관찰할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다. 이러한 분석방법을 활용하여 최근 몇 년간 양이온, 음이온 및 중성분자를 검출할 수 있는 형광 화학센서의 연구가 진행 중에 있다(특허문헌 1). Anslyn 연구진이 최초로 헤파린을 모니터링하는 형광화학센서를 개발한 이래로(비특허문헌 4), 여러 헤파린 검출 형광화학센서에 대하여 연구되고 있다.(비특허문헌 5-17)
임상에서, 헤파린은 심혈관계 수술시 2-8 U/mL(17-67 μM), 수술 후의 장기간 치료시 0.2-1.2 U/mL(1.7-10 μM) 의 농도로 투여하는 것이 추천되고 있다. 그러나, 형광화학센서를 헤파린에 활용하기 위해서는 샘플 제조단계에서 혈장을 적어도 10배 묽혀야 한다. 따라서 이러한 묽힘 인자를 고려할 때, 실용적으로 쓰이기 위한 헤파린 검출 형광화학센서의 감도는 10-9 M가 요구된다.
그러나 종래의 대부분의 헤파린 검출 형광화학센서는 수용액 상에서 감도가 10-6 M 농도 정도로 임상에서 실제적으로 활용하기에는 좋지 않은 감도이며, 10-9 M 농도에서 헤파린을 검출하는 형광화학센서가 일부 보고되었지만, 그들 대부분은 혈청 혹은 혈장과 같은 실제의 생리학적인 샘플에서는 측정하지 않았다.
또한, 종래의 대부분의 헤파린 검출 형광화학센서는 단일 파장에서만 변화가 보이는 형광세기 증가형(turn-on) 거동을 보이는데, 이러한 거동은 주변 환경의 pH나 온도, 극성 같은 환경적인 영향에 의해 변하기 때문에 헤파린의 정확한 농도를 정량하기에는 문제가 있다.
한편, 형광화학센서의 수용체 부분에 아미노산을 활용하여 여러 종류의 물질을 검출하는 연구가 활발히 진행되고 있다.(특허문헌 2) 형광 아미노산 센서는 아래에 나와 있는 몇 가지 측면에서 많은 관심을 받고 있다.
천연 아미노산을 포함하는 형광 센서는 고체상 합성법을 이용하여 빠른 시간 내에 비교적 손쉽게 합성을 할 수 있으며, 여러 가지 아미노산의 조합을 이용하여, 원하는 분석물에 대한 선택성과 감도를 조절할 수 있다.
또한, 생리적 조건과 유사한 수용액에 잘 녹기 때문에 유기 용매를 쓰지 않아도 사용이 용이하므로 환경 친화적이며, 그 결합능력이 매우 우수한 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 헤파린을 선택적으로 검출하는 화학센서를 연구하던 중, 헤파린 결합 펩타이드의 서열을 확인하고 이로부터 유래되는 아미노산들의 조합들을 활용하여 헤파린만을 선택적으로 검출할 수 있는 것으로서, 두개의 다른 파장을 이용하여 환경적인 영향을 보정함과 동시에 분석물의 정량이 가능하고 혈장과 혈청에서도 분석할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1031314호 대한민국 등록특허 제10-1178231호
(비특허 문헌 1) Bowers, J.; Ferguson, J. J. Clin. Cardiol. 1994, 17, 357-361. (비특허 문헌 2) Cheng, T. J.; Lin, T. M.; Wu, T. H.; Chang, H. C. Anal. Chim. Acta. 2001, 432, 101-111. (비특허 문헌 3) Ma, S. C.; Yang, V. C.; Fu, B.; Meyerhoff, M. E. Anal. Chem. 1993, 65, 2078-2084. (비특허 문헌 4) Wright, A. T.; Zhong, Z.; Anslyn, E. V. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5679-5682. (비특허 문헌 5) Sun, W.; Bandmann, H.; Schrader, T. Chem. Eur. J. 2007, 13, 7701-7707. (비특허 문헌 6) Sauceda, J. C.; Duke, R. M.; Nitz, M. ChemBioChem 2007, 8, 391-394. (비특허 문헌 7) Wang, S.; Chang, Y. T. Chem. Commun. 2008, 10, 1173-1175. (비특허 문헌 8) Pu, K. Y.; Liu, B. Adv. Funct. Mater. 2009, 19, 277-284. (비특허 문헌 9) Zeng, L.; Wang, P.; Zhang, H.; Zhuang, X.; Dai, Q.; Liu, W. Org. lett. 2009, 11, 4294-4297. (비특허 문헌 10) Dai, Q.; Liu, W.; Zhuang, X.; Wu, J.; Zhang, H.; Wang, P. Anal. Chem. 2011, 83, 6559-6564. (비특허 문헌 11) Cai, L.; Zhan, R.; Pu, K. Y.; Qi, X.; Zhang, H.; Huang, W.; Liu, B. Anal. Chem. 2011, 83, 7849-7855. (비특허 문헌 12) Xu, B.; Wu, X.; Li, H.; Tong, H.; Wang, L. Polymer 2012, 53, 490-494. (비특허 문헌 13) Gu, X.; Zhang, G.; Zhang, D. Analyst 2012, 137, 365-369. (비특허 문헌 14) Liu, H.; Song, P.; Wei, R.; Li, K.; Tong, A. Talanta 2014, 118, 348-352. (비특허 문헌 15) Liu, Z.; Ma, Q.; Wang, X.; Lin, Z.; Zhang, H.; Liu, L.; Su, X. Biosens. Bioelectron. 2014, 54, 617-622. (비특허 문헌 16) Hung, S. Y.; Tseng, W. L. Biosens. Bioelectron. 2014, 57, 186-191. (비특허 문헌 17) Cao, Y.; Shi, S.; Wang, L.; Yao, J.; Yao, T. Biosens. Bioelectron. 2014, 55, 174-179.
본 발명의 목적은 헤파린 검출용 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 헤파린 검출용 화학센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학센서를 이용하여 헤파린을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001

(상기 화학식 1에 있어서,
R1 은 K 이고(여기서, K 는 라이신이다);
R2 는 R 이고(여기서, R 은 아르기닌이다);
R3 는 LQVQLSIRT 이고(여기서, L 은 류신이고, Q 는 글루타민이고, V 는 발린이고, S 는 세린이고, I 는 이소류신이고, R 은 아르기닌이고, T 는 트레오닌이다);
R4 는 하이드록시, 아민, C1-5 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 알콕시이고;
n 은 0 내지 5의 정수이고;
m 은 0 내지 5의 정수이고;
l 은 0 내지 5의 정수이고; 및
k 는 0 또는 1의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물이다).
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 2로 표시되는 화합물을 화학식 3으로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에서 제조된 화학식 4로 표시되는 화합물을 무기산 조건 하에 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 화합물의 제조방법:
[반응식 1]
Figure pat00002
(상기 반응식 1에 있어서,
R1, R2, R3, R4, n, m, l 및 k 는 앞서 정의한 바와 같고,
X는 트리틸(trityl,Trt), t-부틸옥시카보닐(t-Butyloxycarbonyl, Boc), 2,2,5,7,8-펜타메틸 크로만-6-술포닐 (Pmc) 및 t-부틸(t-butyl, t-Bu)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기이고,
Figure pat00003
은 고체상 기질이다.)
또한, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 헤파린 검출용 화학센서를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학센서를 이용하여 헤파린을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 생체내에서 나노몰 농도의 헤파린 검출용 화학센서는 다른 화학종이 존재하는 생체내에서도 헤파린에 대한 선택성이 우수하고, pH 1.5에서부터 11.5에서까지 넓은 범위의 pH에서도 작동하여 환경적인 영향이 적어 헤파린의 정량을 쉽게 측정할 수 있는 효과가 있다. 또한 그 검출한계가 수용액상에서는 3pM이며 혈장 혹은 혈청을 포함하는 수용액상에서는 34pM로서, 10-9 M 범위에서 측정이 가능하여 생체 시료인 혈청 및 혈장에서도 헤파린을 민감하게 비례 검출할 수 있으므로 혈액 내 헤파린의 농도을 쉽게 측정할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 헤파린 검출용 화학센서의 모식도이고;
도 2는 실시예 1 화합물의 ESI-MS 스펙트럼이고;
도 3의 (a)는 실시예 2 화합물의 HPLC 크로마토그래피, (b)는 실시예 2 화합물의 ESI-MS 스펙트럼이고;
도 4의 (a)는 실시예 4 화합물의 HPLC 크로마토그래피, (b)는 실시예 4 화합물의 ESI-MS 스펙트럼이고;
도 5의 (a)는 실시예 4 화합물의 IR 이고, (b)는 실시예 4 화합물의 UV-Vis 스펙트럼이고;
도 6의 (a)는 실시예 5 화합물의 HPLC 크로마토그래피, (b)는 실시예 5 화합물의 ESI-MS 스펙트럼이고;
도 7의 (a)는 실시예 5 화합물의 IR 이고, (b)는 실시예 5 화합물의 UV-Vis 스펙트럼이고;
도 8의 (a)는 실시예 6 화합물의 HPLC 크로마토그래피, (b)는 실시예 6 화합물의 ESI-MS 스펙트럼이고;
도 9의 (a)는 실시예 6 화합물의 IR 이고, (b)는 실시예 6 화합물의 UV-Vis 스펙트럼이고;
도 10은 실시예 6 화합물의 NMR 이고;
도 11의 (a)는 실시예 1(20μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 실시예 1(100μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 12의 (a)(b)는 실시예 1(20μM)과 비교예 1(20μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (c)(d)는 실시예 1(100μM)과 비교예 1(100μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 13은 (a)실시예 1(20μM) (b)실시예 1(100μM)의 405nm 와 500nm에서의 헤파린 농도 증가에 따른 형광세기를 나타낸 그래프이고;
도 14의 (a)는 실시예 2(100μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 실시예 2(260μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 15은 실시예 3(2μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 16의 (a)는 실시예 4(2μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 실시예 4(5μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 17의 (a)는 실시예 5(5μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 실시예 5(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (c)는 실시예 5(20μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 18의 (a)는 실시예 6(5μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 실시예 6(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 19의 (a)는 실시예 5(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 UV-Vis의 흡광도 변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 실시예 4(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 UV-Vis의 흡광도 변화를 관찰한 그래프이고;
도 20은 실시예 1(20μM)에 대해 다양한 pH 조건 하에서 헤파린에 대한 형광 감응을 관찰한 그래프이고;
도 21는 수용액의 다른 pH 조건 하에서 실시예 5(10μM)의 헤파린의 존재 유무에 따른 형광 감응을 관찰한 그래프이고;
도 22의 (a)는 실시예 1에 대해 다양한 음이온 존재 하에서의 405nm 방출 파장 대비 500nm 방출 파장 값을 관찰한 그래프(x축은 다음과 같다. 1. 대조군, 2. 황산 나트륨, 3.인산 나트륨, 4.아세트산 나트륨, 5.구연산 나트륨, 6. 포도당, 7. 소혈청 알부민, 8. 아데노신 삼인산, 9. 히알루론산, 10.콘드로이틴 황산, 11.헤파린 (각각 0.01 당량))이고, (b)는, 실시예 1에 대해 UV 램프 상에서의 형광 변화를 관찰한 사진이고;
도 23은 실시예 3에 대해 다양한 음이온 존재 하에서의 376nm 방출 파장 대비 484nm 방출 파장 값을 관찰한 그래프(x축은 다음과 같다. 1. 대조군, 2. 헤파린, 3.콘드로이틴황산(ChS), 4.HA, 5.글루코스(glucose), 6. 소혈청알부민(BSA,bovine serum albumin), 7. 아데노신 삼인산(ATP), 8. Na2P2O7(인산염), 9. 구연산염(citrate), 10.옥살산염(oxalate), 11.아세테이트(acetate), 12.황산나트륨(Na2SO4))이고;
도 24은 실시예 4에 대해 다양한 음이온 존재 하에서의 376nm 방출 파장 대비 484nm 방출 파장 값을 관찰한 그래프(x축은 다음과 같다. 1. 대조군, 2. 헤파린, 3.HA, 4.콘드로이틴황산(ChS), 5.소혈청알부민(BSA,bovine serum albumin), 6.아데노신 삼인산(ATP), 7.Na2P2O7(인산염), 8.글루코스(glucose), 9. 구연산염(citrate), 10.옥살산염(oxalate), 11.아세테이트(acetate), 12.황산나트륨(Na2SO4))이고;
도 25의 (a)는 실시예 5에 대해 다양한 음이온 존재 하에서의 376nm 방출 파장 대비 482nm 방출 파장 값을 관찰한 그래프(x축은 다음과 같다. 1. 대조군, 2. 헤파린, 3.Na2P2O7(인산염), 4.Na2HPO4(인산염), 5.아데노신 삼인산(ATP), 6.구연산나트륨(Sodium citrate), 7.옥살산나트륨(Sodium oxalate), 8.소듐 아세테이트(Sodium acetate), 9. 글루코스(glucose), 10.소혈청알부민(BSA,bovine serum albumin), 11.Chs-A, 12.HA)이고, (b)는 다른 이온들 존재하에서의 실시예 5에서 제조된 화합물-헤파린 복합체의 형광 변화를 나타낸 형광 스펙트럼이고, (c)는 다른 음이온, 헤파린 등의 존재 여부에 따른 실시예 5(10μM)의 형광세기 비율을 나타낸 그래프이고 ;
도 26의 (a)는 5% 혈청 존재 하에서 실시예 1(20μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 5% 혈장 존재 하에서 실시예 1(20μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 27의 (a)는 1% 혈청 존재 하에서 실시예 4(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고, (b)는 5% 혈청 존재 하에서 실시예 4(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 28는 2% 혈청 존재 하에서 실시예 5(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이고;
도 29의 (a)는 실시예 1의 수용액 상에서의 검출 한계 및 헤파린 농도 변화에 따른 실시예 1의 405nm 형광 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 실시예 1의 혈청 존재 하에서의 검출 한계 및 헤파린 농도 변화에 따른 실시예 1의 405nm 형광 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 실시예 1의 혈장 존재 하에서의 검출 한계 및 헤파린 농도 변화에 따른 화합물 1의 405nm 형광 변화를 나타낸 그래프이고;
도 30은 5% 혈청에서 헤파린 농도 변화에 따른 실시예 4의 376nm 형광 변화를 나타낸 그래프이고;
도 31의 (a)는 실시예 5의 1% 혈청에서의 검출 한계 및 헤파린 농도 변화에 따른 실시예 5의 376nm 형광 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 2% 혈청에서의 헤파린 농도 변화에 따른 실시예 5의 376nm 방출파장 대비 482nm 방출파장의 형광 세기 및 376nm 형광 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00004

상기 화학식 1에 있어서,
R1 은 K 이고(여기서, K 는 라이신이다);
R2 는 R 이고(여기서, R 은 아르기닌이다);
R3 는 LQVQLSIRT 이고(여기서, L 은 류신이고, Q 는 글루타민이고, V 는 발린이고, S 는 세린이고, I 는 이소류신이고, R 은 아르기닌이고, T 는 트레오닌이다);
R4 는 하이드록시, 아민, C1-5 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 알콕시이고;
n 은 0 내지 5의 정수이고;
m 은 0 내지 5의 정수이고;
l 은 0 내지 5의 정수이고; 및
k 는 0 또는 1의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물이다.
바람직하게는, 상기 화합물에 있어서,
상기 R4 는 아민이고;
n 은 0 또는 1의 정수이고;
m 은 0 또는 1의 정수이고;
l 은 0 내지 2의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물일 수 있다.
(1) 파이렌-CO-RKRLQVQLSIRT(서열번호: 1)-NH2;
(2) 파이렌-CO-RKR(서열번호: 2)-NH2;
(3) 파이렌-CH2CO-RKR(서열번호: 2)-NH2;
(4) 파이렌-CH2CO-RRR(서열번호 : 3)-NH2 ;
(5) 파이렌-CH2CO-RR-NH2 ; 및
(6) 파이렌-CH2CO-R-NH2.
상기 파이렌-CO-RKRLQVQLSIRT(서열번호: 1)-NH2 은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표기될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 파이렌-CO-RKR(서열번호: 2)-NH2 은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표기될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 파이렌-CH2CO-RKR(서열번호: 2)-NH2 은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표기될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 파이렌-CH2CO-RRR(서열번호 : 3)-NH2 은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표기될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 2로 표시되는 화합물을 화학식 3으로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에서 제조된 화학식 4로 표시되는 화합물을 무기산 조건 하에 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 화합물의 제조방법:
[반응식 1]
Figure pat00005
상기 반응식 1에 있어서,
R1, R2, R3, R4, n, m, l 및 k 는 앞서 정의한 바와 같고,
X는 트리틸(trityl,Trt), t-부틸옥시카보닐(t-Butyloxycarbonyl, Boc), 2,2,5,7,8-펜타메틸 크로만-6-술포닐 (Pmc) 및 t-부틸(t-butyl, t-Bu)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기이고,
Figure pat00006
은 고체상 기질이다.
이하, 본 발명에 따른 상기 제조방법을 각 단계별로 보다 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 제조방법의 단계 1은 화학식 2로 표시되는 화합물을 화학식 3으로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 아미노 말단이 플루오레닐메틸옥시카보닐기(Fmoc-)에 의해 보호된 아마이드가 연결된 메틸벤조하이드릴아민(MBHA) 수지에 커플링 반응을 수행하여 헤파린에 대하여 선택성과 감도가 높은 아미노산을 조합하여 화학식 2로 표시되는 화합물을 합성한 후, 형광물질인 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계이다.
보다 구체적으로, 아민 염기 존재하에 아민 보호기인 플루오레닐메틸옥시카보닐기(Fmoc-)를 제거하고, 아미노 말단과 반응성 있는 곁사슬이 보호기에 의해 보호된 아미노산을 합성한다.
이때, 상기 단계 1의
Figure pat00007
로 표시되는 고체상 기질은 통상적으로 사용되는 고체상이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으나, 아마이드가 연결된 메틸벤조하이드릴아민(MBHA) 수지, 왕(Wang) 수지, 폴리에틸렌글리콜-폴리스틸렌(PEG-PS) 수지, 실리카 나노입자, 티타늄옥사이드 나노 입자, 키토산 등을 사용하는 것이 바람직하고, 메틸벤조하이드릴아민(MBHA) 수지, 왕(Wang) 수지 등을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 단계 1의 커플링 반응 시약으로는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(다이메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Py-BOP), 1-하이드록시-벤조트리아졸(HBTU), 1-하이드록시-7-아자-벤조트리아졸(HATU), 하이드록시 벤조트리아졸(HOBt), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), 다이이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보이이미드(EDC), 카르보닐디이미다졸(CDI) 등을 사용하는 것이 바람직하고, 다이이소프로필카르보디이미드(DIC)와 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 혼합하여 사용하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 아민 보호기인 플루오레닐메틸옥시카보닐기(Fmoc-)를 제거하는데 사용되는 아민 염기는 통상적으로 플루오레닐메틸옥시카보닐기(Fmoc-)를 제거하는데 사용하는 것이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으나, 피페리딘, 피롤리딘, 몰포린, 피리딘, N,N-다이메틸아미노피리딘 등을 사용하는 것이 바람직하고, 피페리딘을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
나아가, 아미노산을 합성할 때에는 수지 및 아미노산은 1 : 2 ~ 10의 몰비로 결합되어 이루어진 것을 사용하는 것이 좋다. 아미노산이 2미만일 때에는 합성이 잘 이루어지지 않을 수 있으며, 보다 바람직하기로는 경제성을 고려하여, 수지 및 아미노산이 1 : 3 ~ 7의 몰비로 결합되어 이루어진 것을 사용하는 것이 좋다.
다음으로, 본 발명의 따른 제조방법의 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 화학식 4로 표시되는 화합물을 무기산 조건 하에 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 상기 단계 1에서 제조된 화합물을 무기산과 반응시켜 고체상 기질에서 화합물을 분리하고 아미노산 보호기를 제거하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.
이때, 상기 무기산으로는 트라이플루오로아세트산, 염산, 불산, 포름산 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 트라이플루오로아세트산, 싸이오아니졸, 3,6-다이옥사-1,8-옥탄다이싸이올(혹은 1,2-에탄다이싸오올) 및 증류수를 부피 대비 80-95:1-4:3-7:1-4 로 혼합한 무기산 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
일례로, 하기 반응식 2와 같이, 아미노산으로 트레오닌, 아르기닌, 이소류신, 세린, 류신, 글구타민, 발린, 글루타민, 류신, 아르기닌, 라이신 및 아르기닌을 순차적으로 반응시켜서 실시예 1의 파이렌-CO-RKRLQVQLSIRT(서열번호: 1)-NH2 를 제조할 수 있다.
[반응식 2]
Figure pat00008
Figure pat00009
(상기 반응식 2에서, PIP는 피페라진(piperazine)이고, DMF는 디메틸포름아미드(Dimethylformamide)이고, tBu는 t-부틸이고, Thr는 트레오닌(threonine)이고, HOBr는 하이포아브롬산이고, DIC는 다이이소프로필카르보디이미드이고, Arg는 아르기닌이고, Pmc는 2,2,5,7,8-펜타메틸 크로만-6-술포닐이고, Ile는 이소루이신이고, Ser은 세린이고, Leu은 류신이고, Gln은 글루타민이고,tBuO는 t-부톡시이고, Trt는 트리틸이고, Val은 발린이고, Boc는 t-부톡시카르보닐이고, TFA는 트라이플루오로아세트산이고, thioanisole는 싸이오아니졸이고, 3,6-diaxa-1,8-octanedithiol은 3,6-다이옥사-1,8-옥탄다이싸이올이다.)
또는, 일례로 하기 반응식 3과 같이, 아미노산으로 아르기닌, 라이신 및 아르기닌을 순차적으로 반응시켜서 실시예 3의 파이렌-CH2CO-RKR(서열번호: 2)-NH2를 제조할 수 있고, 하기 반응식 3에서 PyAc-OH 대신에 Py-COOH를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 실시예 2의 파이렌-CO-RKR(서열번호: 2)-NH2 를 제조할 수 있다.
[반응식 3]
Figure pat00010
(상기 반응식 3에서, Alloc는 알리옥시카보닐이고, EDT는 에틸렌옥시티오펜이고, PyAc는 파이렌아세트산이다.)
나아가, 일례로 하기 반응식 4와 같이, 아미노산으로 아르기닌을 3개 반응시켜서 실시예 4의 파이렌-CH2CO-RRR(서열번호: 3)-NH2 을 제조할 수 있다.
[반응식 4]
Figure pat00011

일례로, 하기 반응식 5와 같이, 아미노산으로 아르기닌을 2개 반응시켜서 실시예 5의 , 파이렌-CH2CO-RR-NH2를 제조할 수 있다.
[반응식 5]
Figure pat00012
일례로, 하기 반응식 6과 같이, 아미노산으로 아르기닌을 1개 반응시켜서 실시예 6의 파이렌-CH2CO-R-NH2를 제조할 수 있다.
[반응식 6]
Figure pat00013

또한, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 헤파린 검출용 화학센서를 제공한다.
도 1의 모식도에서 보이는 바와 같이, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 아미노산서열 중에서 일부 아미노산(R:아르기닌 및 K:라이신)은 양전하를 띄고 있으며, 이때 헤파린을 넣어주면, 음전하를 띄는 헤파린이 상기 화합물의 양전하와 결합하여 복합체를 이룰 수 있다.
이와 같이 본 발명의 화합물은 헤파린과 쉽게 결합하여 복합체를 형성하고 이에 따라, 헤파린과 결합하기 전의 방출파장의 형광세기는 감소하는 반면, 복합체가 방출하는 파장의 세기는 점점 증가한다. 이와 같이 파장에 따른 형광세기 각각의 변화를 통하여 헤파린을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 파장 비율(ratio)을 측정하여 헤파린을 검출할 수 있다. 이때, 파장의 비율을 이용하는 것이 헤파린의 정량분석에 있어서 좀 더 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 헤파린 검출용 화학센서의 pH에 따른 영향을 확인한 실험결과를 참조하면, pH 1.5 내지 11.5 의 전 범위에 걸쳐서 실시예 1의 화합물이 헤파린과 복합체를 형성하여 형광 세기에 변화를 가지는 것을 확인할 수 있다.(실험예 2)
따라서, 본 발명에 따른 헤파린 검출용 화학센서는 넓은 pH 범위에서 헤파린 검출이 용이하다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 헤파린 검출용 화학센서의 헤파린에 대한 선택성을 확인한 실험결과를 참조하면, 생체내에 존재하는 다른 음이온들에서와 달리 405nm 방출 파장 대비 500nm 방출 파장 값이 매우 큰 값을 나타내는 것을 확인할 수 있다.(실험예 3 참조)
따라서, 생체내에 존재하는 다른 화학종에 의한 간섭을 받지 않고 헤파린에 대하여 높은 선택성을 가지고 결합하여 생체내에서 헤파린 검출이 용이하다.
나아가, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 헤파린 검출용 화학센서의 헤파린 농도에 따른 검출력을 확인한 실험결과를 참조하면, 검출한계가 수용액 상에서 3pM, 5% 혈청 존재 하에서는 34pM, 5% 혈장 존재 하에서는 33pM인 것을 확인할 수 있다.(실험예 5 참조)
상기 검출 한계는 임상적으로 요구되는 헤파린 검출 민감도 보다 매우 낮은 값으로서, 본 발명은 나노 몰 농도의 헤파린 검출이 가능하다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 헤파린 검출용 화학센서는 pH 또는 다른 화학종의 간섭 등의 환경적인 영향을 받지 않고, 검출한계 값이 낮으므로 생체시료 중의 헤파린 검출에 사용할 수 있다.
다음으로, 본 발명은 상기 화학센서를 이용하여 헤파린을 검출하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 화학센서를 헤파린을 검출하고자 하는 대상시료에 투입하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 대상시료 내에 존재하는 헤파린과 상기 화학센서의 반응 생성물로부터 발생하는 형광 신호를 측정하여 헤파린을 검출하는 단계(단계2);를 포함하는 헤파린 검출방법이다.
종래의 헤파린 검출 형광 화학센서는 수용액 상에서 감도가 10-6M 농도 정도로 실제적으로 활용하기에는 감도가 좋지 않은 문제가 있었다.
반면, 본 발명의 화학센서는 10-9M 농도 범위의 측정이 가능하므로, 화학센서를 생체시료에 투입하여 헤파린을 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시할 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 파이렌-CO-RKRLQVQLSIRT(서열번호: 1)-NH 2 화합물 제조
Figure pat00014
단계 1:
먼저, 아미노 말단이 Fmoc-기로 보호화된 링크 아마이드 메틸벤조하이드릴아민 수지(Rink amide MBHA resin, 200 mg, 0.1 mmol)를 무수 다이메틸포름아마이드와 함께 주입하여 약 15분간 미리 팽윤시켰다. 다음으로, 상기 수지에 25 %의 피페리딘/다이메틸포름아마이드 용액을 첨가하고 15분간 반응시켜 용해된 수지의 아미노 말단 Fmoc-기가 제거된 활성화 용액을 제조하였다. 무수 다이메틸포름아마이드에 Fmoc-Thr(tBu)-OH, 다이이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 첨가하고, 상기에서 아미노 말단의 Fmoc-기가 제거된 링크 아마이드 메틸벤조하이드릴아민 수지 용액(활성화 용액)과 약 4시간 정도 반응시켰다.
상기와 같은 방법으로, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile)-OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, 및 Fmoc-Arg(Pmc)-OH 을 순차적으로 첨가하였다.
그 후, 25 %의 피페리딘/다이메틸포름아마이드 용액을 첨가하고 15분간 반응시켜 용해된 수지의 아미노 말단 Fmoc-기를 제거하였다. 그런 다음, 파이렌카르복시산을 녹인 다이메틸포름아마이드 용액에 다이이소프로필카르보다이이미드(DIC) 및 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 첨가하고 15분 동안 활성시키고, 수지용액에 넣어 약 4시간 교반시켰다. 교반이 종료되면 반응용액을 여과하고 여과된 수지를 다이메틸포름아마이드와 메탄올로 수차례 세척하였다.
단계 2:
상기 단계 1에서 제조된 화합물을 트라이플루오로아세트산 : 싸이오아니졸, 3,6-다이옥사-1,8-옥탄다이싸이올 : 증류수(87.5:2.5:5:2.5, v/v/v/v) 용액과 상온에서 밤새 반응시켜 수지로부터 형광 아미노산을 분리하고 아미노산 보호기를 제거한 다음, 반응혼합물을 여과하여 수지와 용액에 녹아있는 형광 아미노산을 분리하고, 목적화합물를 얻었다.
상기 얻은 형광 아미노산의 분자량은 ESI 질량분석기를 이용하여 확인하였다. 이를 도 2에 나타내었다.
ESI-Mass(m/z): 계산값 863.00, 측정값 862.76 [M+H+].
<실시예 2> Pyrene-CO-RKR(서열번호: 2)-NH 2 화합물 제조
Figure pat00015
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
다만, 상기 단계 1에 있어서, 아미노 말단 Fmoc-기가 제거된 활성화 용액을 제조한 후, 무수 다이메틸포름아마이드에 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, 다이이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 첨가하고, 상기에서 아미노 말단의 Fmoc-기가 제거된 링크 아마이드 메틸벤조하이드릴아민 수지 용액(활성화 용액)과 약 4시간 정도 반응시켰다.
상기와 같은 방법으로, Fmoc-Lys(Boc)-OH 및 Fmoc-Arg(Pmc)-OH 을 순차적으로 첨가하였다.
상기 얻은 형광 아미노산의 분자량은 ESI 질량분석기를 이용하여 확인하였다. 이를 도 3에 나타내었다.
ESI-Mass(m/z): 계산값 686.38, 측정값 686.32 [M+H+].
<실시예 3> Pyrene-CH 2 CO-RKR(서열번호: 2)-NH 2 화합물 제조
Figure pat00016
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
다만, 상기 단계 1에 있어서, 아미노 말단 Fmoc-기가 제거된 활성화 용액을 제조한 후, 무수 다이메틸포름아마이드에 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, 다이이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 첨가하고, 상기에서 아미노 말단의 Fmoc-기가 제거된 링크 아마이드 메틸벤조하이드릴아민 수지 용액(활성화 용액)과 약 4시간 정도 반응시켰다. 상기와 같은 방법으로, Fmoc-Lys(Alloc)-OH 및 Fmoc-Arg(Pmc)-OH 을 추가로 첨가하였다.
또한, 형광물질로 파이렌카르복시산 대신 파이렌아세트산을 녹인 다이메틸포름아마이드 용액에 다이이소프로필카르보다이이미드(DIC) 및 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 첨가하고 15분 동안 활성시키고, 수지용액에 넣어 약 4시간 교반시켰다. 교반이 종료되면 반응용액을 여과하고 여과된 수지를 다이메틸포름아마이드와 메탄올로 수차례 세척하였다.
또한, 상기 단계 2의 무기산으로 TFA : EDT : Thianisole : H2O : Tis (86.5:2.5:5:5:1, v/v/v/v/v) 을 사용하여, 수지로부터 형광 아미노산을 분리하고, 아미노산 보호기를 제거한 다음, 역상 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC, C-18 칼럼 delta pak C18-300A, 1.9 X 30 cm)로 정제하여 목적화합물을 얻었다.
상기 얻은 형광 아미노산의 분자량은 ESI 질량분석기를 이용하여 확인하였다.
ESI-Mass(m/z): 계산값 700.38, 측정값 700.26 [M+H+].
<실시예 4> 파이렌-CH 2 CO-RRR(서열번호: 3)-NH 2 화합물 제조
Figure pat00017
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.
다만, 상기 단계 1에 있어서, 아미노 말단 Fmoc-기가 제거된 활성화 용액을 제조한 후, 무수 다이메틸포름아마이드에 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, 다이이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 첨가하고, 상기에서 아미노 말단의 Fmoc-기가 제거된 링크 아마이드 메틸벤조하이드릴아민 수지 용액(활성화 용액)과 약 4시간 정도 반응시켰다. 상기와 같은 방법으로, Fmoc-Arg(Pmc)-OH 을 2번 더 첨가하였다.
상기 실시예 4의 mp 는 170 -171 ℃이고, HPLC, ESI-Mass, IR스펙트럼 및 UV-Vis 스펙트럼(pH 7.4)을 측정하여 도 4 및 5에 나타내었으며, ESI-Mass(m/z)는 계산값 728.40, 측정값 728.36 [M+H+]으로 이론값과 유사한 값을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, IR 스펙트럼을 통해 파수 3194, 1668, 1541, 1202, 1134㎝-1가 측정되었으며, 이를 통해 실시예 4의 구조를 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 파이렌-CH 2 CO-RR-NH 2 화합물 제조
Figure pat00018
상기 실시예 4과 동일한 방법으로 제조하였다.
다만, 상기 단계 1에 있어서, 아미노 말단 Fmoc-기가 제거된 활성화 용액을 제조한 후, 무수 다이메틸포름아마이드에 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, 다이이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 하이드록시 벤조트라이아졸(HOBt)을 첨가하고, 상기에서 아미노 말단의 Fmoc-기가 제거된 링크 아마이드 메틸벤조하이드릴아민 수지 용액(활성화 용액)과 약 4시간 정도 반응시켰다. 상기와 같은 방법으로, Fmoc-Arg(Pmc)-OH 을 1번 더 첨가하였다.
또한, 역상 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC, C-18 칼럼 delta pak C18-300A, 1.9 X 30 cm)로 정제하여 목적화합물을 얻었다. 실시예 5의 mp 는 79 - 80 ℃이고, ESI-Mass, IR스펙트럼 및 UV-Vis 스펙트럼(pH7.4)을 측정하여 도 6 및 7에 나타내었으며, ESI-Mass(m/z)는 계산값 572.31, 측정값 572.34 [M+H+]으로 이론값과 유사한 값을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, IR 스펙트럼을 통해 파수 2942, 1668, 1541, 1200, 1134㎝-1가 측정되었으며, 이를 통해 실시예 5의 구조를 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 파이렌-CH2CO-R-NH2 화합물 제조
Figure pat00019
상시 실시예 4과 동일한 방법으로 제조하였다.
다만, 상기 단계 1에 있어서 Fmoc-Arg(Pmc)-OH을 한번만 첨가하여 목적화합물을 얻었다.
역상 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC, C-18 칼럼 delta pak C18-300A, 1.9 X 30 cm)로 정제하여 목적화합물을 얻었다. 실시예 6의 mp 는 207 - 208 ℃이고, ESI-Mass, IR스펙트럼, UV-Vis 스펙트럼(pH7.4) 및 NMR을 측정하여 도 8 내지 10에 나타내었으며, ESI-Mass(m/z)는 계산값 416.20, 측정값 416.20 [M+H+]으로 이론값과 동일한 값을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, IR 스펙트럼을 통해 파수 3192, 1670, 1541, 1203, 1133㎝-1가 측정되었으며, 이를 통해 실시예 6의 구조를 확인할 수 있었다.
<비교예 1> 파리렌-CO-LQVQLSIR-NH 2 화합물 제조
Figure pat00020
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
다만, 상기 단계 1에 있어서,
Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH 및 Fmoc-Leu-OH 을 순차적으로 첨가하였다.
<실험예 1> 비례감응형 형광 화학센서의 헤파린에 대한 형광변화 분석
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 헤파린의 정량분석능을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로, 헤파린 기준용액과 실시예 1 내지 6 화합물 및 비교예 1의 기준용액을 각각 제조하였다. 각각의 10 mM HEPES 완충용액(pH 7.4)에 실시예 1 내지 6 및 비교예 1의 화합물을 각각 첨가한 후, 헤파린의 농도를 증가시켜서 헤파린과 실시예 1 내지 6 화합물의 반응을 통해 헤파린을 검출하였다. 형광 스펙트럼의 측정 시, 일반적으로, 여기 파장은 342 nm를 이용하였고, 상기 제조된 시험용액에 대하여 방출파장 약 360nm 에서 약 600nm까지를 지정하여 형광 스펙트럼을 측정하였고, 그 결과를 도 11 내지 18에 나타내었다.
도 11의 (a)는 실시예 1(20μM), (b)는 실시예 1(100μM)에 따른 화합물과 헤파린 농도에 따른 형광세기 변화를 나타낸 형광 스펙트럼이고; 도 12는 실시예 1과 비교예 1 화합물의 헤파린 농도에 따른 형광세기 변화를 나타낸 형광 스펙트럼이고; 도 14의 (a)는 실시예 2(100μM), (b)는 실시예 2(260μM)에 따른 화합물과 헤파린 농도에 따른 형광세기 변화를 나타낸 형광 스펙트럼이다.
도 11 및 14에 나타난 바와 같이, 헤파린의 농도 증가에 따라서 실시예 1 및 2의 화합물과의 반응에 의해 비례적으로 405 nm 의 형광세기는 감소하며 500 nm 의 형광세기는 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 헤파린 농도 증가에 따라 실시예 1 및 2의 화합물이 레이셔메트릭(ratiometric) 형광세기 변화를 나타냄을 알 수 있다.
또한, 도 11의 (a)(b)를 비교하면 20μM의 실시예 1에 비하여, 실시예 1 화합물의 농도가 100μM일때, 단량체 방출파장의 상당한 감소와 함께, 액시머 방출파장의 상당한 증가가 관찰되었다.
또한, 실시예 1(20μM)은 약 300nM(0.015당량)의 헤파린 존재 하에서, 실시예 1(100μM)은 약1000nM (0.01당량)의 헤파린 존재 하에서 형광변화가 포화됨이 관찰되었다. 실시예 2(100μM)은 약 3000nM(0.03당량)의 헤파린 존재 하에서, 실시예 2(260μM)은 약60nM (0.00022당량)의 헤파린 존재 하에서 형광변화가 포화됨이 관찰되었다.
반면, 도 12에 나타난 바와 같이, 비교예 1 화합물은 파이렌 - 파이렌 상호작용으로 440 nm - 470 nm에서 약한 전형적인 액시머 방출을 나타내어, 실시예 1 화합물과 다른 스펙트럼을 보였다. 또한, 비교예 1 화합물은 헤파린을 추가하여도 형광세기가 변화하지 않았다.
즉, 상기와 같이 특정 아미노산 서열을 가지는 실시예 1 화합물이 헤파린과 결합하고, 파이렌- 파이렌의 상호작용은 헤파린과 결합한 펩타이드 사이에서 일어나는 것을 알 수 있다.
도 15은 실시예 3(2μM)에 따른 화합물과 헤파린 농도에 따른 형광세기 변화를 나타낸 형광 스펙트럼으로, 상기와 같은 농도(2μM)의 화합물에서도 헤파린의 농도 증가에 따라 실시예 3 화합물과의 반응에 의해 비례적으로 376 nm 의 형광세기는 감소하며 482 nm 의 형광세기는 증가하는 레이셔메트릭(ratiometric) 형광세기 변화를 나타냄을 알 수 있다.
도 16의 (a)(b)는 실시예 4(2 및 5 μM )에 따른 화합물과 헤파린 농도에 따른 형광세기 변화를 나타낸 형광 스펙트럼이고, 헤파린의 농도 증가에 따라 실시예 3 화합물과의 반응에 의해 비례적으로 376 nm 의 형광세기는 감소하며 484 nm 의 형광세기는 증가하는 레이셔메트릭(ratiometric) 형광세기 변화를 나타냄을 알 수 있다.
도17의 (a)(b)(c)는 실시예 5의 5, 10 및 20 μM에 따른 화합물과 헤파린 농도에 따른 형광세기 변화를 나타낸 형광 스펙트럼이고, (a)(c)는 헤파린 농도 증가에 따라 실시예 5 화합물과의 반응에 의해 비례적으로 405 nm 의 형광세기는 감소하며 500 nm 의 형광세기는 증가하였다. (b)는 376 nm 의 형광세기는 감소하며 482 nm의 형광세기는 증가하였다. 또한 실시예 5(5μM)은 약 150nM(0.03당량)의 헤파린 존재 하에서, 실시예 5(10μM)은 약16nM 의 헤파린 존재 하에서, 실시예 5(20μM)은 약600nM(0.03당량) 의 헤파린 존재 하에서 형광변화가 포화됨이 관찰되었다.
도 18의 (a)(b)는 실시예 6의 5μM 및 10μM에 따른 화합물과 헤파린 농도에 따른 형광세기 변화를 나타낸 형광 스펙트럼으로 헤파린이 결합함에 따라 형광세기는 감소하였다.
한편, 도 19는 실시예 5 및 4(10μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 UV-Vis 흡광도를 관할한 그래프로서, 농도가 증가함에 따라 흡광도가 감소하는 것을 관찰하였다. 이는 펩타이드가 헤파린과 결합하고, 서로 인접한 파이렌 형광은 이당체를 이룰 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 헤파린 농도에 따라 비례적으로 형광세기가 변화하는 특징을 이용하여 헤파린을 정량적으로 검출 할 수 있으므로, 헤파린을 검출할 수 있는 형광 감응 화학센서로 유용할 수 있다.
<실험예 2> 비례감응형 형광 화학센서의 시료 내의 pH에 따른 검출력 평가
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 시료 내의 pH에 따른 헤파린 검출력을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
pH에 따른 헤파린 검출력을 평가하기 위하여 pH 1.5-6.5의 20 mM MES 완충용액, pH 7.4의 20 mM PBS 완충용액, pH 8.5-11.5의 20 mM CHES 완충용액을 사용하였고, 센서는 실시예 1을 사용하였다. 이때, 테스트 튜브에 각각의 pH에 해당하는 20mM 완충용액(1ml)을 넣고, 형광 감응 화학센서 시약을 첨가한 다음, 헤파린 용액을 첨가하고, 증류수로 전체 용액의 양이 2ml가 되도록 각각의 테스트 용액을 희석하였다. 이때 완충용액의 농도는10 mM 이다. 이후, 상기 제조된 테스트 용액을 여기 파장은 342 nm, 여기 슬릿과 방출 슬릿은 각각 15 nm, 2.5 nm로 조절하여 형광 스펙트럼을 측정하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타난 바와 같이, 시료 내의 다양한 pH에서 헤파린을 측정한 결과, pH 1.5 내지 pH 11.5의 범위에서 실시예 1의 화합물은 헤파린과 복합체를 형성하여 405nm의 방출파장의 형광세기에 대한 500nm의 방출파장의 형광세기가 큰 값을 나타내어, 민감한 레이셔메트릭(ratiometric) 형광 세기 변화를 가지는 것을 관찰할 수 있다. 이로부터, 본 발명에 따른 실시예 1은 pH 1.5 내지 pH 11.5의 넓은 범위에서 헤파린의 농도에 따른 비례 검출이 용이하다는 것을 알 수 있다.
또한, 생체 내의 pH는 6.5 내지 7.5로서, 실시예 1의 화합물이 생체 내의 헤파린을 검출할 수 있는 pH 범위 내에 포함이 되므로, 혈청 및 혈장과 같은 실제 샘플에서도 적용 가능하다는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 5(10μM)의 화합물에 대한 pH에 따른 검출력도 측정하여 도 21에 나타내었다. pH 6 내지 9에서 376 nm 의 방출파장의 형광세기에 대한 482 nm 의방출파장의 형광세기가 가장 크게 나타나는 바, 혈청 및 혈장에서 측정이 용이할 수 있음을 확인하였다.
<실험예 3> 비례감응형 형광 화학센서의 헤파린에 대한 선택성 평가
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 헤파린 선택성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 헤파린에 대한 선택성을 평가하기 위하여, 생체 내 존재하는 음이온을 대상으로 실험하였다. 실시예 1의 화합물의 경우, 실험에 사용된 음이온은 헤파린, 황산 나트륨, 인산 나트륨, 아세트산 나트륨, 구연산 나트륨, 포도당, 소혈청 알부민, 아데노신 삼인산, 히알루론산(HA), 콘드로이틴황산(ChS)으로 상기 음이온을 증류수에 각각 용해시켜 음이온 기준용액을 제조하였다.
테스트 용액은 형광 감응 화학센서 시약을 첨가한 다음, 헤파린을 포함한 음이온을 첨가하였다. 이때 완충용액의 농도는10 mM이 되도록 농도 조절하였다. 제조된 테스트 용액을 여기 파장은 342 nm, 여기 슬릿과 방출 슬릿의 폭은 각각 15 nm 및 3 nm가 되도록 조절하여 형광 스펙트럼을 측정하였으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22 (a)에 나타난 바와 같이, 콘드로이틴황산을 제외한 어느 것도 반응이 일어나지 않았다. 반면, 본 발명에 따른 실시예 1은 헤파린에 대하여 405nm 방출 파장 대비 500nm 방출 파장 값이 다른 음이온과 달리 매우 큰 값을 나타내어, 실시예 1의 화합물은 헤파린과 복합체를 이루어 매우 민감한 레시셔메트릭(ratiometric) 형광 변화를 일으키는 것을 알 수 있다. 이로부터 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물은 헤파린 검출시, 시료 내에 다른 이온이 존재하여도 선택적으로 헤파린과 복합체를 형성하여 형광 변화를 일으키는 것을 알 수 있다.
도 22 (b)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물은 UV 램프 상에서 청색을 띄는 것을 알 수 있으며, 다른 음이온의 존재 하에서와 달리 헤파린, 혈장속의 헤파린, 혈청 속의 헤파린 존재 하에서는 옅은 청색을 나타내어 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물은 헤파린과 복합체를 이룸으로써 형광 발색이 변화한 것을 눈으로 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 실시예 3 화합물의 헤파린에 대한 선택성을 평가하기 위하여, 음이온을 대상으로 실험하였다. 실험에 사용된 음이온은 1. 대조군, 2. 헤파린, 3.콘드로이틴황산(ChS), 4.히알루론산(HA), 5.글루코스(glucose), 6. 소혈청알부민(BSA,bovine serum albumin), 7. 아데노신 삼인산(ATP), 8. Na2P2O7(인산염), 9. 구연산염(citrate), 10.옥살산염(oxalate), 11.아세테이트(acetate), 12.황산나트륨(Na2SO4) 이다.
테스트 용액은 센서의 농도가 10 μM, 헤파린, Chs-A,히알루론산(HA) 및 BSA의 농도는 10mM의 HEPES 완충용액에 대하여 0.25당량, 다른 음이온의 농도는 5당량이 되도록 농도 조절하였다. 제조된 테스트 용액을 여기 파장은 342 nm, 여기 슬릿과 방출 슬릿의 폭은 각각 15 nm 및 0.5 nm가 되도록 조절하여 형광 스펙트럼을 측정하였으며, 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 3은 헤파린에 대하여 376nm 방출 파장 대비 484nm 방출 파장 값이 다른 음이온과 달리 매우 큰 값이 나타났다.(0.0142 - 14.122, 994.5-fold enhancement) 이로써, 본 발명에 따른 실시예 3의 화합물은 헤파린에 대하여 선택적으로 결합하는 것으로 선택성이 매우 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 실시예 4 화합물의 헤파린에 대한 선택성을 평가하기 위하여, 음이온을 대상으로 실험하였다. 실험에 사용된 음이온은 1. 대조군, 2. 헤파린, 3.히알루론산(HA), 4.콘드로이틴황산(ChS), 5.소혈청알부민(BSA,bovine serum albumin), 6.아데노신 삼인산(ATP), 7.Na2P2O7(인산염), 8.글루코스(glucose), 9. 구연산염(citrate), 10.옥살산염(oxalate), 11.아세테이트(acetate), 12.황산나트륨(Na2SO4) 이다.
테스트 용액은 센서의 농도가 10 μM, 헤파린, Chs-A,히알루론산(HA) 및 BSA는 10mM 의 완충용액에서 0.25당량이고, 다른 음이온의 농도는 5당량이 되도록 농도 조절하였다. 제조된 테스트 용액을 여기 파장은 342 nm, 여기 슬릿과 방출 슬릿의 폭은 각각 15 nm 및 2.5 nm가 되도록 조절하여 형광 스펙트럼을 측정하였으며, 그 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 4은 헤파린에 대하여 376nm 방출 파장 대비 484nm 방출 파장 값이 다른 음이온과 비교시 매우 큰 값이 나타났다. 구체적으로, 0.0056에서 36.8311로 6576.9-fold enhancement 가 나타나서 실시예 3보다 6.64 배 높게 나타났다. 이로써, 본 발명에 따른 실시예 4는 헤파린에 대하여 높은 선택성을 가지고 결합하는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 실시예 5 화합물의 헤파린에 대한 선택성을 평가하기 위하여, 생체내에 존재하는 음이온을 대상으로 실험하였다. 실험에 사용된 음이온은 1. 대조군, 2. 헤파린, 3.Na2P2O7(인산염), 4.Na2HPO4(인산염), 5.아데노신 삼인산(ATP), 6.구연산나트륨(Sodium citrate), 7.옥살산나트륨(Sodium oxalate), 8.소듐 아세테이트(Sodium acetate), 9. 글루코스(glucose), 10.소혈청알부민(BSA,bovine serum albumin), 11.Chs-A, 12.히알루론산(HA) 이다.
제조된 테스트 용액을 여기 파장은 342 nm, 여기 슬릿과 방출 슬릿의 폭은 각각 15 nm 및 2.5 nm가 되도록 조절하여 형광 스펙트럼을 측정하였으며, 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25의 (a)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 5은 헤파린에 대하여 376nm 방출 파장 대비 482nm 방출 파장 값이 다른 음이온과 달리 매우 큰 값이 나타났다. 이로써, 본 발명에 따른 실시예 5는 헤파린에 대하여 선택적으로 결합하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 25 (b)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 5에서 제조된 화합물은 헤파린과 복합체를 형성함으로써, 350 - 400 nm 범위의 형광은 감소하는 동시에, 475nm 범위 대의 파이렌의 액시머 밴드(excimer band)는 증가된 것이 확인되었다.
이로부터, 본 발명에 따른 실시예 5의 화합물은 헤파린 검출시, 시료 내의 다른 이온이 존재하여도 높은 선택성을 가지고 헤파린과 복합체를 형성하여 형광 변화를 일으키는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 실시예 5의 화합물은 UV 램프 상에서 청색을 띄는 것을 알 수 있으며, 헤파린 존재 하에서는 옅은 청색을 띠었으며 본 발명에 따른 실시예 5의 화합물은 헤파린과 복합체를 이루어 형광 발색이 변화한 것을 눈으로 확인할 수 있다.
<실험예 4> 혈청 및 혈장 존재 하에서의 헤파린 검출력 평가
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 혈청 및 혈장 존재 하에서의 헤파린 농도에 따른 형광변화를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
형광 스펙트럼의 측정 시, 일반적으로, 여기 파장은 342 nm를 이용하였다. 여기와 방출 슬릿 폭은 각각 15nm, 3nm 이었다. 상기 제조된 테스트 용액들은 pH 7.4 조건에서(PBS 혹은 HEPES 완충용액 이용) 형광 스펙트럼을 측정하였다.
혈청을 얻기 위하여, 젊은 성인 남성의 혈액을 채취한 후 상온에서 1시간 동안 두어 혈구가 바닥에 침전하여 혈병이 생기도록 하였다. 10분동안 원심분리하여 혈병을 제거한 후에 얻어진 혈청은 4°C에서 보관하였다. 혈청을 3차 증류수 및 PBS 완충용액으로 묽히여 최종 테스트 용액은 센서의 농도가 20 μl, 혈청의 농도는 5%, 완충용액의 농도는 10 mM, DMSO의 농도는 1%가 되도록 농도 조절하였다.
도 26의 (a)는 상기 제조된 테스트 용액을 이용하여 5% 혈청 존재 하에 실시예 1(20μM) 화합물에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이다.
혈장을 얻기 위하여, 젊은 성인 남성의 혈액을 채취한 후 바로 항응고제로서 EDTA를 처리하였다. 이 때, EDTA의 최종 농도는 0.25mM가 되도록 조절하였다. 그 후에, 10분동안 원심분리하여 최종적으로 혈장을 얻었다. 혈장을 3차 증류수 및 PBS 완충용액으로 묽히여 최종 테스트 용액은 센서의 농도가 센서의 농도가 20 μl, 혈청의 농도는 5%, 완충용액의 농도는 10 mM, DMSO의 농도는 1%가 되도록 농도 조절하였다.
도 26의 (b)는 상기 제조된 테스트 용액을 이용하여 5% 혈장 존재 하에 실시예 1(20μM)에 대해 헤파린의 농도를 증가시키며 형광변화를 관찰한 그래프이다.
혈청 및 혈장에서도, 수용액에서와 마찬가지로 헤파린의 농도 증가에 따라서 실시예 1 화합물과의 반응에 의해 비례적으로 405 nm 의 형광세기는 감소하며 500 nm 의 형광세기는 증가하는 것을 알 수 있었다.
이는 헤파린 농도 증가에 따라 실시예 1 화합물이 레이셔메트릭(ratiometric) 형광세기 변화를 나타냄을 알 수 있다.
따라서, 혈청 및 혈장에서도 헤파린의 농도에 따라 비례적으로 형광세기가 변화하는 특성을 이용하여 헤파린을 정량적으로 검출할 수 있다.
또한, 혈청 및 혈장에서 실시예 1(20μM)은 약 200 nM (0.01당량)의 헤파린 존재하에서 형광변화가 포화됨이 관찰되었는바, 이 역시 수용액 완충용액에서 측정된 값과 유사하므로, 상기 실시예 1의 민감도는 혈청 존재하에서도 크게 달라지지 않는 것을 알 수 있다.(도13 참조)
실시예 4(10μM)를 1% 및 5% 혈청 존재하에서 측정한 값을 도 27 에 나타내고, 실시예 5(10μM)를 2% 혈청 존재하에서 측정한 값을 도 28에 나타내었다.
실시예 4의 화합물은 혈청에서도, 수용액에서와 마찬가지로 헤파린과의 반응에 의해 비례적으로 약 376nm 의 형광세기는 감소하며 484nm의 형광세기는 증가하고, 실시예 5의 화합물 역시, 헤파린과의 반응에 의해 비례적으로 약376nm의 형광세기는 감소하며, 482 nm의 형광세기는 증가하여 수용액에서와 마찬가지로 헤파린의 농도에 따라 비례적으로 형광세기가 변화하였다.
따라서, 화학식 1 로 표시되는 화합물은 혈청 및 혈장에서도 헤파린을 정량적으로 검출할 수 있다.
<실험예 5> 헤파린 농도에 따른 검출한계 평가
도 29에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물은 헤파린의 농도가 증가함에 따라 형광세기가 감소하며 변화 정도가 커지므로, 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물은 헤파린에 대하여 감응하는 것을 알 수 있다.
나아가, 검출한계는 다음의 식을 이용하여 계산하였다.
검출한계=3σ/m
(여기서, σ는 헤파린과 결합하지 않은 화학식 1로 표시되는 화합물의 형광세기의 표준편차이고, m은 헤파린 농도와 특정파장의 형광세기 사이의 기울기이다.)
본 발명에 따른 실시예 1 화합물의 헤파린의 농도 변화에 따른 405 nm의 형광 변화를 통하여 헤파린 검출 한계를 계산한 결과, 실시예 1의 헤파린 검출 한계는 수용액 상에서 3pM, 5% 혈청 존재 하에서는 34pM, 5% 혈장 존재 하에서는 33pM 인 것으로 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 실시예 5 화합물의 헤파린 농도 변화에 따른 376nm의 형광 변화량을 통하여 헤파린 검출 한계를 계산환 결과, 실시예 5의 헤파린 검출 한계는 1% 혈청에서 15.495nM 인 것으로 확인되었다.
이와 같은 검출 한계는 임상적으로 요구되는 헤파린 검출 민감도보다 매우 낮은 값으로서, 이 결과를 통해 화학식 1로 표시되는 화합물은 나노 몰 농도의 헤파린 검출이 가능함을 알 수 있다.
<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Chemosensor for nanomolar concentration of heparin in vivo, preparation method thereof and detection method of heparin using the same <130> 2014P-08-046 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide for binding heparin <400> 1 Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide for binding heparin <400> 2 Arg Lys Arg 1 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide for binding heparin <400> 3 Arg Arg Arg 1

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00021


    (상기 화학식 1에 있어서,
    R1 은 K 이고(여기서, K 는 라이신이다);
    R2 는 R 이고(여기서, R 은 아르기닌이다);
    R3 는 LQVQLSIRT 이고(여기서, L 은 류신이고, Q 는 글루타민이고, V 는 발린이고, S 는 세린이고, I 는 이소류신이고, R 은 아르기닌이고, T 는 트레오닌이다);
    R4 는 하이드록시, 아민, C1-5 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 알콕시이고;
    n 은 0 내지 5의 정수이고;
    m 은 0 내지 5의 정수이고;
    l 은 0 내지 5의 정수이고; 및
    k 는 0 또는 1의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물이다).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R4 는 아민이고;
    n 은 0 또는 1의 정수이고;
    m 은 0 또는 1의 정수이고;
    l 은 0 내지 2의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물:
    (1) 파이렌-CO-RKRLQVQLSIRT(서열번호: 1)-NH2;
    (2) 파이렌-CO-RKR(서열번호: 2)-NH2;
    (3) 파이렌-CH2CO-RKR(서열번호: 2)-NH2;
    (4) 파이렌-CH2CO-RRR(서열번호 : 3)-NH2 ;
    (5) 파이렌-CH2CO-RR-NH2 ; 및
    (6) 파이렌-CH2CO-R-NH2.
  4. 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
    화학식 2로 표시되는 화합물을 화학식 3으로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
    상기 단계 1에서 제조된 화학식 4로 표시되는 화합물을 무기산 조건 하에 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure pat00022


    (상기 반응식 1에 있어서,
    R1, R2, R3, R4, n, m, l 및 k 는 제1항에서 정의한 바와 같고,
    X는 트리틸(trityl,Trt), t-부틸옥시카보닐(t-Butyloxycarbonyl, Boc), 2,2,5,7,8-펜타메틸 크로만-6-술포닐 (Pmc) 및 t-부틸(t-butyl, t-Bu)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기이고,
    Figure pat00023
    은 고체상 기질이다.)
  5. 제4항에 있어서,
    상기 고체상 기질은 아마이드가 연결된 메틸벤조하이드릴아민(MBHA) 수지, 왕(Wang) 수지, 폴리에틸렌글리콜-폴리스틸렌(PEG-PS), 실리카 나노입자, 티타늄옥사이드 나노 입자 및 키노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법
  6. 제4항에 있어서,
    상기 단계 2의 무기산은 트라이플루오로아세트산, 염산, 불산 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  7. 제1항의 화합물을 포함하는 헤파린 검출용 화학센서.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화학센서는 생체시료 중의 헤파린 검출에 사용하는 것을 특징으로 하는 화학센서.
  9. 제7항의 화학센서를 이용하여 헤파린을 검출하는 방법.
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