KR20160042631A - 조직 재생을 촉진하는 탄화된 폴리아크릴로니트릴 성분의 3차원 지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본원은 조직 재생 촉진능을 갖는 탄화된 폴리아크릴로니트릴 파이버로 형성된 3차원 지지체 및 그 제조방법을 개시한다. 본원에 따른 지지체는 기존 탄소소재 재료와 비교하여 3차원 구조로 형성이 가능함을 물론 세포 분화 촉진을 통한 조직재생 효과로 인해 인체에 다양한 부위에 이식 가능한 모형 및 크기로 제작되어 조직 재생 지지체로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 치료 약물과 함께 사용될 경우, 효과적인 약물 전달체로도 사용될 수 있어 상승된 치료효과를 기대할 수 있다.

Description

조직 재생을 촉진하는 탄화된 폴리아크릴로니트릴 성분의 3차원 지지체 및 그 제조방법 {Three-dimensional scaffolds of carbonized polyacrylonitrile promoting tissue regeneration and method of fabricating the same}

조직 재생용 지지체 및 이의 제조와 관련된 것이다.

조직 예를 들면 골과 같은 조직의 손상을 치료하기 위해 다양한 골 이식재가 사용되고 있다. 기존에 주로 콜라겐 스펀지와 같은 생체적합한 소재가 사용되었으며, 골형성 촉진을 위해 그 위에 골형성촉진제가 코팅되어 사용되는 것이 일반적이다.

그러나 골형성촉진제로 코팅된 이식재 보다는, 다른 외부 인자 없이도 줄기세포 골분화능을 향상 시킬 수 있음은 물론, 골형성촉진제와 상호작용을 하여 이를 서방형으로 지속적으로 방출할 수 있는 이식재가 개발될 경우 보다 효과적인 치료가 가능하다.

이를 해결할 수 있는 소재 중의 하나가 바로 탄소 소재이다. 기존 연구에 따르면 CNT의 탄소 원소간 소수성 육각형 sp2 혼성 pi-pi 구조가 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 단백질 흡착이 우수해 줄기세포내 신호전달에 영향을 미쳐 줄기세포의 골분화 유도에 효과적이다. 피브로넥틴 뿐만 아니라, 골형성단백질 2 (BMP-2)와 같이 소수성 아미노산을 가진 단백질과 pi-pi 스태킹 (stacking) 결합을 해, 약물 전달체로 적용될 수 있다. 그러나 인체는 3차원 구조로 되어있는 반면, CNT와 같이 기존의 탄소소재들은 제작 과정의 특성상 나노 크기로 획득되기 때문에, 조직에 이식 가능한 3차원 지지체로 제작이 어렵다.

따라서, 탄소나노튜브를 대체할 수 있으며, 줄기세포의 분화능은 물론 약물 전달체로서도 사용가능한 이식재의 개발이 필요하다.

대한민국 공개특허공보 2014-0094305

본원에서는 탄소나노튜브를 대체할 수 있으며, 줄기세포의 분화능을 촉진하는 것은 몰론 3차원으로 제조가 가능하고, 약물 전달체로서도 사용가능한 이식재를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 조직 재생 촉진능을 갖는 탄화된 폴리아크릴로니트릴 파이버로 형성된 3차원 지지체를 제공한다.

본원에 따른 3차원 지지체는 상기 파이버 사이에 의해 형성된 마이크로기공을 가지며, 이러한 상기 마이크로기공은 75 내지 100μm의 크기로 줄기세포 등의 배양 및 성장에 적합한 크기이다.

본원에 따른 3차원 지지체는 조직 재생용 이식재 또는 약물 전달체로 사용될 수 있다.

본원에 따른 3차원 지지체는 기존의 치료제를 추가로 포함하여 이와 함께 사용되어 조직 재생능을 더욱 촉진 시킬 수 있다. 예를 들면 골 이식재로서, 치료제로서 골형성촉진인자와 함께 사용되어 효과를 극대화할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 DMF에 용해된 폴리아크릴로니트릴 용액을 수면에 전기방사하여 복수의 폴리아크로니트릴 섬유로 구성된 2D 매트를 형성한 후, 이를 흔들어 2D 매트를 물과 혼합한 후, 이를 폴리아크릴로니트릴 매트를 동결건조하는 단계로, 상기 동결건조에 의해 상기 섬유간 마이크로기공을 갖는 3차원 구조가 형성되며; 그리고 상기 동결건조된 3차원 구조를 탄화하는 단계를 포함하는, 3차원 지지체 제조 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에서 DMF에 용해된 폴리아크릴로니트릴 용액은 DMF 100 중량부 대비 PAN 12 내지 16 중량%의 혼합용액이고, 상기 물에 방사되는 폴리아크릴로니트릴은 0.05 내지 1 중량 %로 포함될 수 있으며, 이러한 농도 조절을 통해 기공의 크기를 조절할 수 있으며 세포가 성장을 촉진 할 수 있어, 이식재로서 유용하게 사용될 수 있다. 일 구현예에서 상기 물에 방사되는 폴리아크릴로니트릴은 0.25 내지 0.5 중량%로 포함되며, 이 경우 상기 마이크로기공의 크기는 75 내지 100μm이다.

본원에 따른 방법은 동결건조 과정을 통해 3차원 지지체의 수득이 가능하며 이러한 동결건조는 약 48시간 내지 72시간 동안 수행되고, 상기 전기 방사는 섭씨 600도에서 1000도의 온도에서 불활성기체 하에서 1시간에서 6시간 동안 수행될 수 있다.

본원에 따른 탄화된 폴리아크릴로니트릴 파이버로 형성된 3차원 지지체는 기존 탄소소재 재료와 비교하여 줄기세포의 분화에 미치는 영향이 월등히 우수한 것은 물론, 3차원 구조로 형성이 가능하여, 인체에 다양한 부위에 이식 가능한 모형 및 크기로 제작되어 이식재로 사용될 경우 효과적인 조직 재생효과를 기대할 수 있다. 또한 본원에 따른 3차원 지지체는 그 자체만으로도 효과적인 조직 재생 지지체로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 조직 재생 예를 들면 골조직 재생에 효과가 뛰어난, BMP-2와 같은 약물과 함께 사용될 경우, 지속적 약물 방출이 가능한 약물전달체로서도 사용될 수 있어, 치료에 있어 상승효과를 기대할 수 있다.

도 1a은 본원의 일 구현예에 따른 cPAN 지지체의 제조 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 도 1a에서 제조된 2D cPAN 매트 (Mat)의 사진 (i)과 SEM 영상 (ii) 그리고 도 1a에서 제조된 3D cPAN의 윗면 (iii). 측면 (iv) 및 SEM 영상 (v)이다.
도 1c는 물에 포함된 PAN의 중량을 i) 1, ii) 0.75, iii) 0.5, iv) 0.25, v) 0.1, 및 vi) 0.05 wt% 로 달리하여 기공크기가 조절되도록 제조된 3D cPAN 지지체의 SEM 영상이다.
도 1d는 용매 캐스팅/염 침출 법으로 제조된 상이한 기공크기 i) 50­100 μm, ii) 100­200 μm, 및 iii) 200­300 μm의 cPAN 지지체의 SEM 영상이다.
도 2a는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 cPAN의 생체적합성을 인비트로에서 MSC를 cPAN에 배양한 후 생존능 측면에서 분석한 결과로, 생존 세포는 배양 1일째 유리지지체 상의 생존 세포에 대한 상대적인 세포수로 나타냈으며, 스케일바는 200μm이다.
도 2b는 도 2a와 동일하나, 세포의 증식능 측면에서 분석한 결과로, 배양 5일째에 PCNA에 대한 면역염색과 핵에 대하여 DAPI (청색)로 카운터 염색하였으며 DAPI 양성세포에 대한 PCNA 세포의 비를 계산하였으며, 스케일바는 100μm이다.
도 2c는 각 지지체에 대한 FN 흡착 정도를 정량한 것으로, 각 밴드는 동일한 면적 (2x2cm)에 흡착된 피브로넥틴을 나타낸다.
도 2d는 향세포사멸인자 (pro-apoptotic factor)인 caspase-3의 mRNA 발현여부를 근거로 측정된 MSC의 세포사멸 정도를 나타내는 결과이다. 도면 2a 내지 2d에서 n=3, *P<0.05 vs. glass. #P<0.05 vs. 유리 또는 CNT이다.
도 3a는 cPAN의 골유도성 및 cPAN 상의 MSC의 골분화 기전을 분석하기 위한 것으로, MSC 액틴 세포골격을 관찰한 사진으로, 액틴 필라멘트는 팔로이딘 (초록)으로, 핵은 DAPI (청색)로 염색하였으며, 스케일바는 50μm이다.
도 3b는 cPAN의 골유도성 및 cPAN 상의 MSC의 골분화 기전을 분석하기 위한 것으로, MSC에서 알칼린 포스파타제의 활성을 분석한 결과이다.
도 3c는 cPAN의 골유도성 및 cPAN 상의 MSC의 골분화 기전을 분석하기 위한 것으로, MSC의 Runx2 (초록)를 면역염색하고, 핵은 DAPI (청색)로 염색한 사진으로, 스케일바는 100μm이다.
도 3d는 cPAN의 골유도성 및 cPAN 상의 MSC의 골분화 기전을 분석하기 위한 것으로, MSC에 침적된 칼슘의 양을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3e는 cPAN의 골유도성 및 cPAN 상의 MSC의 골분화 기전을 분석하기 위한 것으로, MSC에서 골형성 마커로 (ALP, Runx2, type 1 collagen, osteocalcin, 및 osteopontin)의 mRNA 발현을 2주 및 3주째 분석한 결과이다.
도 3f는 인테그린 피브로넥틴 결합에 의해 유도된 골분화에 대한 신호전달 경로를 도식적으로 나타낸 것이다. 피브로넥틴은 포칼 접착 단백질 (즉, FAK 및 빈쿨린)을 활성 또는 발현을 촉진하며, 그 결과 ROCK2 및 ERK1/2와 같은 세포내 신호전달 분자를 촉발시킨다. 이러한 세포내 신호전달 분자의 활성화는 MSC의 골분화로 이어진다.
도 3g는 MSC의 신호전달 경로에 관여하는 분자의 단백질 발현 수준을 나타내는 결과이다. 도 3b, 3d, 3e, 및 3g에서 n=3, *P<0.05 vs. 유리이고, #P<0.05 vs. 유리 또는 CNT 이다.
도 4a는 골형성 유도인자인 BMP-2로 탑재 또는 탑재되지 않은 3D cPAN 지지체의 인비보 골 재생의 효능을 두개골 결함 마우스 모델을 이용하여 분석한 결과로, cPAN으로부터 BMP-2의 지속적 방출능을 분석한 결과이다 (n=3, *P<0.05 vs. PLLA).
도 4b는 골형성 유도인자인 BMP-2로 하적 또는 하적되지 않은 3D cPAN 지지체의 인비보 골 재생의 효능을 두개골 결함 마우스 모델을 이용하여 분석한 결과로, 결함이 있는 두개골에서 골 재생이 되었음을 나타낸다. 재생된 골 부피는 micro-CT 분석 프로그램으로 측정하였으며, 골 형성 부피는 초기 결함 두개골 부피에 대한 새로 형성된 미네랄화된 골 부피의 비를 계산하여 퍼센트로 나타냈다.
도 4c는 골형성 유도인자인 BMP-2로 하적 또는 하적되지 않은 3D cPAN 지지체의 인비보 골 재생의 효능을 두개골 결함 마우스 모델을 이용하여 조직형태계측 (histomorphometric) 으로 분석한 결과로, 이를 위해 조직에 대하여 Goldner의 트리크롬 염색을 수행하였다. 어두운 색이 미네랄화된 골을 나타낸다. 재생된 골의 면적은 조직형태계측 분석을 사용하여 결정하였다.
도 4d는 오스테오칼신에 대하여 면역조직염색을 수행한 결과 (적색)로 핵은 DAPI (청색)로 카운터 염색되었다. 도 4b 및 4c에서 n=4, *P<0.05 vs. 비처리군 (NT), #P<0.05이고, 도 4c 및 4d에서 화살표는 두개골 결함 가장자리를 나타내고, 스케일바는 1mm이다.

본원은 탄화된 폴리아크릴로니트릴 (polyacrylonitrile)로 3차원 형상을 제작하여, 이를 약물 전달체, 조직 재생 등을 위한 생체 이식재로서 유용하게 사용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 줄기세포 분화 촉진능을 갖는 탄화된 폴리아크릴로니트릴 파이버로 형성된 3차원 지지체에 관한 것이다.

탄화된 폴리아크릴로니트릴은 CNT (carbon nanotube)와 같은 탄소소재의 대안으로 전기화학, 센서, 광촉매, 에너지 저장 장치 등으로 많이 사용되어 왔다. 특히 폴리아크릴로니트릴은 탄화에 의해 질소가 제거되면서 탄소 원소간 소수성 육각형의 pi-pi 구조를 형성되며, 이러한 탄화된 폴리아크릴로니트릴이 의학 소재로 사용된 예는 없다.

본원에 따른 일 구현예에서, 폴리아크릴로니트릴 파이버는 물의 표면에 전기방사된 것이다. 본원의 3차원 형상의 지지체는, 일 구현예에서 물 표면에서 전기방사되어 복수의 폴리아크로니트릴 섬유로 구성된 2D 매트가 형성된 후, 물과 혼합되며, 혼합은 예를 들면 수면에 형성된 2D 매트를 흔들어 수행될 수 있다. 이어 물에 혼합된 매트를 동결건조한 후 고온에서 탄화시켜 형성된다.

본원에 사용된 용어 지지체 (scaffold)는 세포의 증식 및/또는 부착에 적합한 표면을 제공하는 생체 적합성 물질로 형성된 구조물을 일컫는 것이다. 이러한 지지체는 추가적으로 기계적 안정성 및 지지체로 작용할 수 있다.

본원에 따른 지지체는 3차원의 형상이면 특별한 모양으로 제한되는 것은 아니며, 제조된 3차원 형상의 지지체를 생체의 사용되는 부위의 모양에 맞추어 다양한 모양으로 만들 수 있으며, 예를 들면 이로 제한되는 것은 아니나, 실린더, 구, 무정형의 3차원 형상을 가질 수 있다.

본원에 따른 3차원 지지체는 파이버간에 형성된 마이크로기공을 가진다. 본원에 따른 지지체에서 마이크로기공은 목적에 따라 적절한 크기 예를 들면 수 마이크로미터 내지 수백 마이크로미터를 가질 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 마이크로기공은 줄기세포 예를 들면 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)의 부착, 증식 및/또는 분화에 적합한 크기로 예를 들면 약 75 내지 100 마이크로미터 이다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 3차원 지지체가 갖는 마이크로기공의 크기는 물에 전기방사되는 폴리아크릴로니트릴의 양을 달리하여 조절될 수 있으며, 후술하는 제조 방법을 참조할 수 있다.

본원에서 용어 생체 적합성은 특정 물체가 생체에 사용되는 경우, 이로 인한 반응 (예를 들면 면역, 염증, 혈전형성 등과 같은 생체 반응)을 유발하지 않으면서, 생체에서 목적하는 바대로 사용될 수 있는 것을 말한다.

본원에 따른 3차원 지지체는 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이 기존 탄소소재 재료보다 줄기세포 분화 촉진능이 우수하면서도 이식 가능한 모형 및 크기로 제작되어, 더 효과적인 골 재생 효과를 나타낸다. 또한 약물과 함께 사용되어 상승효과를 나타낼 수 있다.

본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 본원에 따른 cPAN으로 형성된 3차원 지지체는 탄소소재 고유의 화학적 구조로 인해 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 단백질 흡착이 우수하여 줄기세포내 신호전달에 영향을 미쳐 줄기세포의 골분화 유도에 효과적이다. 피브로넥틴 뿐만 아니라, 탄화된 폴리아크릴로니트릴은 sp2 혼성을 구조를 이룸으로써, 예를 들면 골 형성 단백질2 (BMP-2)과 같은 물질과 소수성 pi-pi stacking 결합을 해, 약물 전달체로 적용될 수 있다. 또 한 본 발명에서는 작은 기공크기를 보이는 기존 전기방사의 한계를 뛰어넘어 기공크기를 조절할 수 있는 기술을 구현해 보다 효과적인 3차원 지지체를 제작할 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 3차원 지지체는 줄기세포의 분화를 촉진하여, 조직재생용, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 골 결함의 재생에 사용될 수 있다.

또한 다른 측면에서 본원의 따른 3차원 지지체는 치료 효과가 있는 약물과 함께 사용되어 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 약물 전달체로 사용되는 경우, 후술하는 본원 실시예에 나타난 바와 같이 부착된 약물을 지속적으로 서방형으로 전달할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 3차원 지지체의 제조 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서 본원에 따른 방법은 폴리아크릴로니트릴을 수면에 전기 방사하여, 복수의 폴리아크릴로니트릴 섬유로 구성된 2D 매트를 형성하는 단계, 상기 매트를 물과 혼합하는 단계, 상기 물에 혼합된 매트를 동결건조하는 단계로, 상기 동결건조에 의해 상기 섬유간 마이크로기공을 갖는 3차 구조가 형성되며, 상기 동결건조된 3차 구조를 탄화하는 단계를 포함한다.

전기방사는 일반적으로 기공의 크기를 조절할 수 없고, 이로 인해 효과적인, 세포의 안으로의 성장 (ingrowth)이 저해된다. 하지만 본원에 따른 방법에서와 같이, 탄화전에, 동결건조에 의해 이런 문제점을 극복하였으며, 그 결과 전기 방사된 섬유간에 생성되는 마이크로 크기의 기공의 생성이 가능하였다.

본원에 따른 방법에서는 전기 방사 시간을 조절하여 물 대비 전기방사되는 폴리아크릴로니트릴의 양을 조절하여 기공 크기를 조절할 수 있다. 일 구현예에서는 방사되는 폴리아크릴로니트릴은 0.05 내지 1 중량 %로 포함되나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서, 물에 방사되는 폴리아크릴로니트릴은 0.25 내지 0.5 중량%로 포함되며, 이 경우 상기 마이크로기공의 크기는 75 내지 100μm이다.

본원에 따른 방법에서 방사된 파이버는 동결건조 과정을 거친다. 이 동결건조 과정에서 물이 얼어 빙정이 생기면서 전기방사로 받아낸 파이버가 3차원으로 팽창하게 된다. 3차원으로 팽창된 PAN 섬유간의 간격은 상술한 바와 같이 물과 받아진 PAN 섬유의 비율에 따라 조절이 가능하다. 동결건조 조건은 시료내 얼음이 모두 승화하도록 하는 것으로 이를 만족하는 조건하에서 수행된다. 이러한 조건은 동결건조에 사용되는 시스템에 따라 달라질 수 있다. 일 구현예에서는 동결건조는 본원에 따른 시료가 완전히 건조되는 조건으로 영하 50도 이하의 온도, 20 Pa 이하의 진공 상태에서 48시간 내지 72시간 동안 수행된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 폴리아크릴로니트릴 스캐폴드 제조

cPAN 지지체의 제조는 도 1a에 도식적으로 표시된 바와 같이 제조하였다.

구체적으로 2D 전기 방사 PAN 매트 (Mat)는 수정 플레이트에 전기방사하여 2cm x 2cm 크기로 종전에 개시된 바와 같이 제조하였다 (J. S. Lee, et al., ACS Nano 2011, 5, 7992 - 8001; J. S. Lee, et al, J. Mater. Chem. A 2013, 1, 9099 - 9106.). 이렇게 제조된 2D 매트는 CNT 단층과 비교하여 cPAN의 생물학적 활성 분석을 위한 인비트로 분석에 사용되었다. 구체적으로 폴리아크릴로니트릴 PAN (M.W. 150000, Sigma Aldrich)을 DMF (N,N-Dimethylformamide 99.5 %, Junsei Chemical Co., Japan)에 12 내지 16 중량% 농도로 용해하였다. 이어, 18게이지 노즐이 장착된 주사기를 펌프에 장착하여 수집기 표면의 앞쪽 판에서 15cm 떨어진 거리에 위치하게 한 후 분당 15 마이크로리터의 유속으로 10kV로 수정 플레이트에 2cm x 2cm 크기로 전기방사 한 후 800℃에서 아르곤 대기하에서 1시간 동안 탄화하였다. 탄화 후, PAN-유래 탄소 섬유 웹(web)을 PDMS 접착제로 수정 플레이트에 붙인 후 인비트로 분석을 위해 알코올 및 자외선으로 멸균 처리하였다.

인비보 분석을 위해서는 다음과 같이 3D 지지체를 제조하였다. 상술한 바와 같은 DMF 중에 용해된 PAN 용액을 상기와 같은 조건에서 16분 내지 160분에 걸쳐 30ml의 물에 전기 방사하였다. 기공크기의 조절을 위해 폴리아크릴로니트릴 PAN (M.W. 150000, Sigma Aldrich)을 i) 1, ii) 0.75, iii) 0.5, iv) 0.25, v) 0.1, 및 vi) 0.05 중량% 의 다양한 농도로 물이 들어있는 페트리디쉬에 전기방사하였다. 물에 들어있는 PAN 매트를 액화 질소에서 얼리고, 이를 48시간 동안 영하 50도, 20 Pa의 진공 상태에서 동결건조 하였다. 동결건조는 Eyela 동결건조기 FD-1000에서 수행되었다. 동결건조 후 코튼 볼과 유사한 형상의 PAN 파이버로 형성된 3D 지지체를 수득하였다. 이어 이 지지체를 아르곤 대기하에서 800℃에서 1시간 동안 탄화를 진행하였다. 인비보 분석을 위해서는 탄화된 지지체를 실린더 형상 (직경 4mm, 높이 2mm)으로 펀치아웃하여, 인비보 골이식재로서 사용하였다.

제조된 3D cPAN 및 PLLA의 압축 모듈러스, 표면적, 다공은 다음 표와 같다.

[표 1]

제조된 3차원 지지체는 도 1b 내지 도 1d에 기재되어 있다. 도면에 기재된 바와 같이 3D cPAN의 SEM 촬영결과, 전기방사된 cPAN 섬유의 평균 직경은 탄화 후에도 그대로 유지되는 것으로 나타났다. 또한 기공의 크기는 75μm~100μm 인 것으로 나타났다 (도 1b), 도 1c는 물의 PAN의 중량을 i) 1, ii) 0.75, iii) 0.5, iv) 0.25, v) 0.1, 및 vi) 0.05 wt% 로 달리하여 기공크기가 조절되도록 제조된 3D cPAN 지지체의 SEM 영상으로, 인비보 상3차원 지지체는 75μm~100μm 크기의 기공을 형성하는 조건 (iv)의 농도로 제작하였다.

아울러 cPAN의 조작의 용이성을 증명하기 위해 용매 캐스팅/염-침탈 (SCSL) 방법으로 제조하고 탄화하였다. 도 1d SEM 영상에 나타난 바와 같이 염의 크기를 조절하여 상이한 기공크기 i) 50­100 μm, ii) 100­200 μm, 및 iii) 200­300 μm의 cPAN 지지체 제조가 가능하며, 이는 cPAN 우수한 가공성을 나타내는 것이다.

단층의 CNT 기판 (substrate, 순도 95%)와 폴리 (L-락트산) 스캐폴드는 종전에 기재된 바와 같이 제조하였다 (CNT : K. Y. Baik et al, Small 2011, 7, 741 - 745; 및 PLLA : P. Dinarvand et al, ACS Appl. Mater. Interfaces 2011, 3, 4518 - 4524 )

실시예 2 cPAN 3차원 지지체가 MSC의 생존능, 증식 및 세포사멸에 미치는 영향

본원에 따른 제조된 cPAN의 생체 적합성을 MSC를 이용하여 생존능, 증식 및세포사멸에 미치는 영향 측면에서 다음과 같이 실험을 수행하였다.

본 실험에 사용된 세포는 미국 LONZA사에서 구입한 인간 골수유래 MSC로, 미국 Gibco사에서 구입한 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) High Glucose, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) PS (페니실린 스트렙토마이신)가 포함된 배양액으로, 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양했다.

생존능을 보기 위해서 Live/Dead assay kit (Molecular Probes사, 미국)를 제조사의 방법대로 사용하였다. PCNA (Proliferating cel nuclear antigen)에 대한 항체(1ug/ml Abcam사, 영국)를 4% 파라포름알데하이드에 고정된 세포에 붙여, 형광 발광체 RITC가 결합된 2차 항체(Jackson Immuno Research Laboratories사, 미국)와 반응시켜 관찰하였다. 핵은 DAPI (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 관찰하였다. 피브로넥틴 흡착성을 보기 위해 각 지지체를 상기 세포 배양액에서 24시간 담근 후 SDS(sodium dodecyl-sulfate) 버퍼로 떼어내어 웨스턴블랏 검사를 통해 확인하였다. 세포 사멸에 관여하는 캐스페이즈-3 유전자를 qRT-PCR (quantitative Reverse Transcription PCR)로 관찰하였다.

결과는 도 2에 기재되어 있다. 도 2에 기재된 바와 같이 cPAN 상의 세포는 배양 1, 3 및 5일째에 대부분의 세포가 생존하고 있는 것으로 나타났다 (도 2a). 또한 증식마커인 PCNA 염색결과 CNT 및 유리 지지체와 비교하여 증가한 것으로 나타났다 (도 2b). 피브로넥틴에의 흡착성을 실험한 결과, cPAN은 유리는 물론 CNT 지지체 보다 뛰어난 흡착성을 갖는 것으로 나타났다 (도 2c). 이러한 결과는 cPAN이 생체 적합성 지지체로서 골형성 유도에 CNT 보다 우수함을 나타내는 것이다. 또한 세포사멸인자인 캐스페이즈-3의 발현을 조사한 결과 유리와 비교하여 그 발현이 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 cPAN이 생체적합성 지지체로서 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 3 cPAN에 의한 골형성 유도 효과 및 MSC의 골형성 분화 기전

cPAN이 그 자체로 골형성 유도 효능을 갖는 지를 조사하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

세포의 액틴 필라멘트를 관찰하기 위해서 고정된 세포를 alexa 488이 결합된 phalloidin (Molecular Probes사, 미국)로 염색을 하였다. 알칼린 포스파타제 성분을 검출하기 위해서 p-nitrophenol phosphate (Anaspec, USA)을 이용하여 검출하였다. Runx2( Runt related transcription factor 2) 전사인자 발현을 검출하기 위해서 Runx2에 대한 항체(Abcam사, 영국)를 고정된 세포에 붙여, 형광 발광체 FITC가 결합된 2차 항체(Jackson Immuno Research Laboratories사, 미국)와 반응시켜 관찰하였다. 핵은 DAPI를 사용하여 관찰하였다. 세포내 칼슘 함량을 검출하기 위해 4℃에서 세포를 4시간동안 흔들어서 원심분리기로 분리한 다음, 상청액을 따 cresolphthalein complexone (Sigma Aldrich Co., 미국)와 반응 시켜 마이크로플레이트 판독기로 검출하였다. 또한 각종 골분화 관련 마커(Runx2, type 1 콜라겐, 오스테오칼신 및 오스테오폰틴)의 유전자 발현을 확인하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열을 다음 표 2와 같다.

[표 2]

cPAN에 의한 골분화 기전을 확인하기 위해 세포내 골형성 신호전달 경로에 관여하는 빈쿨린, FAK, p-FAK, ROCK2, ERK, 그리고 p-ERK의 단백질(모두 Abcam사, 영국) 발현을 웨스턴 블랏 검사를 통해 확인하였다. 하우스키핑 단백질으로는 베타-액틴 단백질(Abcam사, 영국)을 사용하였다.

결과는 도 3에 기재되어 있다. 이에 기재된 바와 같이 지지체로 유리를 사용한 경우, MSC는 전형적으로 평행으로 배열된 얇은 액틴 필라멘트를 구조를 나타냈다 (도 3a). CNT 상의 MSC는 세포 경계에 유리보다는 두꺼운, 서로 겹친 액틴 파이버 구조를 형성하였다. 이와 비교하여, 본원에 따른 3차원 지지체 상의 MSC는 CNT 보다 두꺼우며, 서로 교차하는 액틴 필라멘트로 형성된 보다 잘 형성된 곡률반경을 갖는 서브세포 구조를 나타냈다. 위와 같은 형태적 변화에 추가하여, 골형성 초기에 나타나는 중요한 마커인 알칼린 포스파타제 활성, 골형성세포 관련 전사 인자인 Runx2( Runt related transcription factor 2) 단백질 발현 및 골형성의 지표인 칼슘량을 배양 17일째에 조사하고, 추가로 골형성의 마커인 Runx2, type 1 콜라겐 (Col 1), 오스테오칼신 (OC) 및 오스테오폰틴 (OP) 발현도 배양 2 주 및 3주째 조사한 결과, 이러한 골형성 마커는 CNT 및 cPAN 지지체에서 발현이 증가되었으며, 특히 cPAN 지지체에서 발현이 높은 것으로 나타났다 (도 3b-3d). 이러한 결과는 본원에 따른 cPAN이 외부 인자의 도움이 없이도, 골분화를 유도할 수 있음을 나타내는 것이다.

또한 cPAN 상에서 MSC의 향상된 골분화 유도의 기전을 규명하였다.

가능한 기전으로 cPAN의 MSC의 ECM 단백질에 대한 흡착력으로 흡착력이 증가하는 경우, 세포내 골형성 신호전달 경로를 자극할 수 있다 (도 3f). 액틴 필라멘트의 클러스터링과 이로 인한 세포골격 재구축은 빈쿨린 (vinculin) 및 국소부착카이나제 (Focal adhesion kinase, FAK)와 같은 국소 부착 단백질의 활성에 의해 촉진되며, 이는 궁극적으로 인테그린-피브로넥틴 결합의 수와 비례한다. 향상된 국소 흡착 형성은 세포외 신호조절 카이나제 (Extracellular signaling regulated kinase, ERK) 신호전달 경로를 촉발하고, 이는 골형성 분화를 촉진한다 (R. M. Salasznyk, et al., Exp. Cell Res. 2007, 313, 22 - 37). 부가하여 FAK은 ROCK (Rho associated coiled coil protein kinase) 단백질을 활성화시키고, 그 결과 세포골격 텐션이 증가된다. ROCK 경로는 궁극적으로 ERK 신호전달 활성화를 통해 골형성 분화를 촉진하는 것이다 (M. A. Wozniak, C. S. Chen, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 34 - 43). 도 2c에 기재된 바와 같이 cPAN은 CNT와 비교하여 피브로넥틴에 높은 흡착력을 나타냈고, 따라서, 상술한 기전에 의해 골형성을 촉진하는 것이 가능하다.

이러한 기전의 확인을 위해, 유리 및 CNT와 비교하여 cPAN에서 배양된 MSC의 신호전달 경로가 활성화되었는지 여부를 웨스턴블랏으로 분석한 결과, 빈쿨린, FAK, 인산화 FAK (FAK의 활성화 형태), 및 ROCK2 단백질 발현이 cPAN에서 높은 것으로 나타났다 (도 3g). 이러한 결과는 cPAN에서 배양된 MSC에서 FAK 신호전달이 상향조절되었고, 그 결과 FAK의 자가 인산화도 증가되었음을 나타낸다. 이어 cPAN에서 배양된 MSC에서 ERK1/2의 인산화 정도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 cPAN이 FAK-ERK 경로를 통해 기계적자극(mechanotransduction) 이 화학적 활성으로 이어지는 신호전달을 상향조절하고, 이로 인해 MSC의 골형성 세포로의 분화가 촉진되는 기전을 나타내는 것이다.

실시예 4 3차원 cPAN 지지체의 인비보 골재생 효능

3D 지지체의 골형성 단백질 2 (bone morphogenic protein 2, BMP-2) 흡착능을 관찰하기 위해 500μg의 인간 유래 BMP-2(Cowell Medi CO., 한국)가 흡착된 지지체를 1.5ml 인산완충식염수에 담근 후 37℃ 조건에서 교반기로 흔들어 관찰하였다. 방출된 BMP-2농도를 측정하기 위해 각 제 시점에서 상청액을 따 인간 유래 BMP-2 Quantikine ELISA(R&D Systems, USA)를 이용해 측정하였다. 동물실험에 사용된 동물 모델은 6주차 마우스 ICR(Orient Bio Co., 한국)종이다. 동물마취는 xylazine (20mg/kg)와 ketamine (100mg/kg)으로 하였다. 마우스 두개골 위에 위치한 피부 조직을 절개한 다음, 마우스 두개골 결손 모델의 임계 결함 크기인 직경 4mm의 두개골 결손을 수술용 드릴(Ace Surfical Supply Co., USA) 유도하였다. 결손된 뼈막을 깨끗이 들어낸다음, 결손크기에 맞는 3D PLLA 지지체 또는 3D cPAN 지지체를 이식하여 피부 조직을 봉합하였다. 이식 8주 후, 실험동물들은 CO2를 이용해 안락사를 시켜 두개골 부위를 수집하였다. 수집된 두개골 부위는 마이크로 계산 토모그라피 스캐너(Skycan사, 벨기에)로 관찰하였다. 새로 생성된 뼈의 부피는계산 토모그라피 관찰 프로그램 CT-An (Skyscan, 벨기에)로 측정하였다. 그 후 두개골은 4% 파라포름알데하이드에 고정시킨후 알코올 및 자일렌으로 탈수 시킨후 파라핀 고정을 시켜 4um 크기로 박편하였다. 슬라이드 유리 위에 박편된 두개골 조직들을 수화시켜 조직염색을 하였다. 조직염색을 위해 Goldner’s Trichrome 염색법으로 염색을 시켰고, 면역조직염색은 오스테오칼신에 대한 항체(Abcam사, 영국)를 사용하여, 형광 발광체 RITC가 결합된 2차 항체(Jackson Immuno Research Laboratories사, 미국)와 반응시켜 관찰하였다. 핵은 DAPI를 사용하여 염색하였다.

본 실시예에서는 본원에 따른 골유도성 3D cPAN 지지체를 골이식재로 사용하여 성능을 인비보에서 조사하였다. 이를 위해 실시예 1에서 제조된 실린더 모양의 cPAN 지지체를 전 단락에서 설명한 바와 같이 마우스의 임계크기의 두개골 결함부위에 이식하였다.

골유도성 물질의 도움으로, 줄기세포 및/또는 골전구세포는 주변 조직으로부터 임계크기의 결함부위로 이동을 하여 골형성세포로 분화하여 골을 생성할 수 있다 (E. M. Bueno, J. Glowacki, Nat. Rev. Rheumatol. 2009, 5, 685 - 697.). CNT는 3D 지지체로 제작될 수 없기 때문에 본 실험에서는 사용되지 않았으며, 그 대신, 골유도성이 없는 대조군으로 PLLA (폴리(L-락트산)을 3D cPAN 지지체와 동일한 방법으로 제조하여 인비보 실험에 사용하였다. 3D PLLA는 3D cPAN 지지체에 필적하는 모듈러스, 표면적 및 다공성을 나타냈다 (결과는 나타내지 않음). 또한 골형성 단백질 2 (bone morphogenic protein 2, BMP-2)를 3D cPAN에 결합한 것을 사용하였다. BMP-2 의 cPAN에의 결합은 cPAN의 파이 전자 구름이 파이-파이 스태킹을 통해 BMP-2의 소수성 아미노산 잔기와 상화작용을 통해 달성될 것으로 생각되며, 이로 인해, 본원에 따른 지지체는 약물전달체로서도 기능할 수 있음을 나타내는 것이다.

도 4a에 나타난 바와 같이, ELISA를 통해 이식재당 500ng의 BMP-2를 사용하여 이의 방출을 분석한 결과 , 3D cPAN 지지체는 인비트로에서 21일에 걸쳐 지속적으로 BMP-2를 방출하는 것으로 나타났다. 반면 PLLA는 처음 4일 동안에 80%의 약물을 방출하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 cPAN이 골 재생은 물론 약물 전달체로서도 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

또한 3D cPAN 지지체에 의해 형성된 새롭게 형성된 골을, 마우스 이식 8주 후에 희생하여 마이크로 계산 토모그라피 (micro-CT)로 측정한 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이 골재생이 증가된 것으로 나타났다. 즉, 원래 결함부위의 52.7%를 골로 채웠으며, 이는 PLLA 군과 비교하여 2.3배가 높은 수치이다. 또한 본원에 따른 골 이식재를 BMP-2와 사용한 결과, 기존의 사용량 (동일 부피에 대하여 1μg, 2.5μg) (H. S. Yang, et al., Tissue Eng. Part A 2011, 17, 2153 - 2164; W. G. La, et al., Artif. Organs 2010, 34, 1150 - 1153; K. Tachi, et al., Tissue Eng. Part A 2011, 17, 597 - 606) 과 비교하여 500ng의 적은 사용량으로 골 결함을 완전히 재생할 수 있었다. 조직 염색결과 cPAN 이식재를 사용한 경우에 BMP-2의 존재 및 부재 모두의 경우에 PLLA와 비교하여, 월등이 높은 치료 효과를 나타냈다 (도 4c 및 4d). 이러한 인비보 결과는 그라파이트 구조의 cPAN이 직접적 골 유도 인자로 작용할 수 있을 뿐 아니라, 약물 전달체로서도 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

1. 조직 재생 촉진능을 갖는 탄화된 폴리아크릴로니트릴 파이버로 형성된 3차원 지지체.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 지지체는 상기 파이버 사이에 의해 형성된 마이크로기공을 갖는 것인, 3차원 지지체.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 마이크로기공은 75 내지 100μm인, 3차원 지지체.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 3차원 지지체는 조직 재생용 이식재 또는 약물 전달체로 사용되는 것인, 3차원 지지체.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 3차원 지지체는 치료제를 추가로 포함하는 것인, 3차원 지지체.
   
6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 조직은 골이며, 상기 치료제는 골형성촉진인자인, 3차원 지지체.
   
7. DMF에 용해된 폴리아크릴로니트릴 용액을 수면에 전기 방사하여 복수의 폴리아크로니트릴 섬유로 구성된 2D 매트를 형성하는 단계;
   상기 매트를 물과 혼합하는 단계;
   상기 물과 혼합된 폴리아크릴로니트릴 매트를 동결건조하는 단계로, 상기 동결건조에 의해 상기 섬유간 마이크로기공을 갖는 3차원 구조가 형성되며; 그리고
   상기 동결건조된 3차원 구조를 탄화하는 단계를 포함하는, 3차원 지지체 제조 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 DMF에 용해된 폴리아크릴로니트릴 용액은 DMF 100 중량부 대비 PAN 12 내지 16 중량 %의 혼합용액이고, 상기 수면에 방사되는 폴리아크릴로니트릴은 0.05 내지 1 중량 %로 포함되는 것인, 3차원 지지체의 제조 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 수면에 방사되는 폴리아크릴로니트릴은 0.25 내지 0.5 중량%로 포함되며, 이 경우 상기 마이크로기공의 크기는 75 내지 100μm인, 3차원 지지체의 제조 방법.
   
10. 제 7 항에 있어서, 상기 동결건조는 48시간 내지 72시간 동안 수행되고, 상기 전기 방사는 섭씨 600도에서 1000도의 온도에서 불활성기체 하에서 1시간에서 6시간 동안 수행되는 것인, 3차원 지지체의 제조방법.

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