KR20160037311A - 형광 표지된 신규 디에콜 유도체 - Google Patents

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KR20160037311A
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김성호
김종승
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한승연
신현철
황혜정
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Abstract

본 발명은 형광 표지된 신규 디에콜 유도체에 관한 것이다.

Description

형광 표지된 신규 디에콜 유도체{A Novel Fluorescence-labeled dieckol derivative}
본 발명은 형광 표지된 신규 디에콜 유도체에 관한 것이다.
소포체(Endoplasmic Reticulum, 이하 ER라 한다)는 단백질 합성, 단백질 폴딩(folding) 및 칼슘이온 저장에 참여하는 주요 장소이다.
소포체 스트레스(ER Stress)란 잘못 접힌(misfolded) 단백질들의 축적 및 응집, 특정단백질의 비정상적인 과다발현, 글라이코실화 반응 등의 정상적인 단백질 번역 후 과정의 억제 등에 의해 세포가 받게 되는 스트레스를 말하며, 이와 같은 ER 스트레스, 혹은 ER의 기능장애가 지속될 경우 알쯔하이머나 파킨슨병의 원인이 될 뿐만 아니라, 당뇨, 비만 등 만성염증성 대사질환을 일으키게 된다. ER 스트레스(Stress) 발생의 원인은 ER 내에 산화스트레스가 발생하기 때문이다. 따라서 ER내에서 항산화활성을 적절히 작용시킬 수 있다면, ER 스트레스(Stress)를 효과적으로 막음으로써 각종 염증성 질환을 치료할 수 있을 것이다.
그러나 아직까지 세포내의 특정 부위, 특히 ER에 선택적으로 약물, 특히 항산화제를 전달하는 기술이 존재하지 않아, 안전성과 효과가 우수한 염증성 질환 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다.
한편, 디에콜은 감태, 대황 등 Ecklonia 및 Eisenia 속의 갈조류에서 생성되는 천연 폴리페놀계 항산화 물질로서 안전성이 검증되어 있을 뿐만 아니라, 항염증, 항당뇨, 항알러지, 항바이러스, 항암 효과 등 다양한 약리활성이 알려져 있다. 따라서 디에콜의 이러한 활성을 가지면서도 ER에 선택적인 작용이 가능하다면, 전술한 질병 치료를 위한 새로운 차원의 의약, 즉, ER을 타겟팅(targeting) 하는 의약 개발 전략이 가능하다.
따라서 본 발명은 ER을 타겟팅(targeting)할 수 있는 신규 형광 표지된 디에콜 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 형광 표지된 디에콜 유도체를 유효성분으로 포함하는 ER-스트레스 매개 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 신규 형광 표지된 디에콜 유도체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 7의 형광 표지된 디에콜 유도체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 7]
Figure pat00002
본 발명은 하기 화학식 2의 프로파질기(propargyl group)를 포함하는 디에콜 (Dieckol)유도체 화합물을 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 2의 프로파질기(propargyl group)를 포함하는 디에콜(Dieckol)유도체 화합물을 하기 화학식 3의 아조기(azo group)를 포함하는 로다민 B 유도체와 반응시켜 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
[화학식 1]
Figure pat00005
본 발명은 하기 화학식 2의 프로파질기(propargyl group)를 포함하는 디에콜 (Dieckol)화합물을 하기 화학식 8의 아조기(azo group)를 포함하는 플루오레세인이소티오시안산염(Fluorescein isothiocyanate, FITC) 유도체와 반응시켜 하기 화학식 7의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00006
[화학식 8]
Figure pat00007
[화학식 7]
Figure pat00008
본 발명은 상기 화학식 1 또는 상기 화학식 7의 형광 표지된 디에콜 유도체를 유효성분으로 포함하는 ER-스트레스(Endoplasmic reticulum stress) 매개 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 ER을 선택적으로 타겟팅 하는 효과가 있으며, 따라서 ER-스트레스 매개 질환의 예방 및 치료에 유용한 신규 형광 표지된 디에콜 유도체를 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 신규 형광 표지된 디에콜 유도체를 포함하는 조성물은 ER-스트레스 매개 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과가 있다.
본 발명은 ER 을 선택적으로 타겟팅 하는 신규 항염증 물질을 제공함으로써, ER 스트레스에 의해 발생하는 염증성 질환들인 당뇨병 등 각종 만성질환에 사용할 수 있는 새로운 기술을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 형광 표지된 신규 디에콜 유도체(화학식 1) 제조방법의 개요도이다.
도 2는 본 발명의 형광 표지된 신규 디에콜 유도체(화학식 7) 제조방법의 개요도이다.
도 3은 실험예 1의 컨포컬 현미경 이미지이다.
도 4는 실험예 2의 비교 측정한 NO 측정결과 그래프이다.
도 5는 실험예 2의 비교 측정한 TNF-α측정결과 그래프이다.
도 6은 실험예 2에서 비교 측정한 IL-6 측정결과 그래프이다.
도 7은 실험예 3의 컨포컬 현미경 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기의 구체적 설명은 본 발명의 일 실시예에 대한 설명이므로, 비록 한정적 표현이 있더라도 특허청구범위로부터 정해지는 권리범위를 제한하는 것은 아니다.
종래기술에서는 아직까지 세포내의 특정 부위, 특히 ER에 선택적으로 약물, 특히 항산화제를 전달하는 기술이 존재하지 않아, 안전성과 효과가 우수한 염증성 질환 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다.
이에 본 발명자들은 디에콜의 항산화력과 항염증 능력을 유지하면서도 세포내 위치를 추적할 수 있는 형광물질을 도입한 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 7의 신규 디에콜 유도체를 합성하였다.
[화학식 1]
Figure pat00009
[화학식 7]
Figure pat00010
그리고 본 발명은 디에콜에 프로파질기를 도입한 하기 화학식 2의 프로파질기를 포함하는 디에콜 유도체를 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00011
본 발명이 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화학식 2의 프로파질기를 포함하는 디에콜 유도체는 다양한 아조 화합물과의 효과적인 결합에 유용하게 사용될 수 있는 신규 디에콜 유도체를 제공할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 상기 화학식 1 또는 7의 화합물들을 합성하기 위해서, 항산화제인 디에콜 (Dieckol)에 프로파질기(propargyl group)를 도입한 하기 화학식 2의 신규 화합물을 합성한다. 그리고 형광물질인 로다민 B 또는 FITC(Fluorescein isothiocyanate)에 각각 아조기(azo group)를 도입한 하기 화학식 3 및 8의 화합물을 합성한다. 그 후에 하기 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 3 및 8을 각각 결합하여 합성한다.
[화학식 2]
Figure pat00012
[화학식 3]
Figure pat00013
[화학식 8]
Figure pat00014
상기 화학식 1 또는 화학식 7의 화합물에서 디에콜은 감태, 대황 등 Ecklonia 및 Eisenia 속의 갈조류에서 생성되는 천연 폴리페놀계 항산화 물질로서 안전성이 검증되어 있을 뿐만 아니라, 항염증, 항당뇨, 항알러지, 항바이러스, 항암 효과 등 다양한 약리활성이 알려져 있다. 이러한 디에콜에 형광 표지물질인 로다민 B 또는 FITC을 표지한 화학식 1의 화합물 또는 화학식 7의 화합물은 형광기에 의해 체내 추적이 용이하며 특히 ER을 타겟팅(targeting)하는 효과가 월등하다.
본 발명의 다른 태양은 상기 화학식 1 또는 화학식 7로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 ER-스트레스(Endoplasmic reticulum stress) 매개 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 ER-스트레스(Endoplasmic reticulum stress) 매개 질환의 예방 및 치료용 조성물에서 상기 화학식 1의 화합물은 바람직하게는 조성물 총 중량백분율에 대하여 1 내지 50중량 % 포함된다.
또한, 상기 ER-스트레스(Endoplasmic reticulum stress) 매개 질환의 예방 및 치료용 조성물에서 상기 화학식 7의 화합물은 바람직하게는 조성물 총 중량백분율에 대하여 1 내지 50중량% 포함된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 ER-스트레스 매개 질환은 제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 면역글로블린 경쇄 아밀로이드증(immunoglobulin light chain amyloidosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 혈액투석 연관성 아밀로이드증 (haemodialysis-related amyloidosis), 활동성 아밀로이드증(reactive amyloidosis), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 크로이츠펠트-야콥 질환 및 관련 질환(Kreutzfeldt-Jakob disease and related disorders (prion encephalopathies)), 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolaemia), 알파1-항트립신 결핍증(Alpha1-antitrypsin deficiency), 경변(cirrhosis), 전신성 폐기종(emphysema systemic), 뇌성 유전성 아밀로이드증(cerebral hereditary amyloidoses), 울콧-랠리슨 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 울프람 증후군(Wolfram syndrome), 염증성 장질환, 크론씨 병, 궤양성 대장염, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 그 중에서도 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease) 및 비만에는 본 발명의 조성물의 예방 및 치료가 특히 효과적이다.
이하 본 발명의 상기 화학식 1의 형광 표지된 신규 디에콜 유도체 제조방법을 도 1을 참고하여 설명한다.
화학식 6의 로다민 B 화합물을 디에콜에 도입하기 위하여 피페라진기를 도입한 로다민 B 유도체(화학식 4)를 합성하고 이로부터 아조기가 도입된 하기 화학식 3의 로다민 B 유도체를 합성하였다.
[화학식 3]
Figure pat00015
이와 별개로 화학식 5의 디에콜에 프로파질기를 도입한 하기 화학식 2의 화합물을 합성하고, 이를 상기 화학식 3의 로다민 B 유도체와 반응시켜 하기 화학식 1의 화합물을 합성할 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00016
[화학식 1]
Figure pat00017
또한, 본 발명의 하기 화학식 7의 형광 표지된 신규 디에콜 유도체 제조방법을 도 2를 참고하여 설명한다.
화학식 9의 플루오레세인이소티오시안산염(Fluorescein isothiocyanate, FITC)을 디에콜에 도입하기 위하여 3-아지도프로필 아민(3-azidopropyl amine)과 반응시켜 아조기(azo group)가 도입된 하기 화학식 8의 FITC 유도체를 합성하였다.
[화학식 8]
Figure pat00018
이와 별개로 화학식 5의 디에콜에 프로파질기를 도입한 하기 화학식 2의 화합물과 상기 화학식 8의 FITC 유도체와 반응시켜 하기 화학식 7의 화합물을 합성할 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00019
[화학식 7]
Figure pat00020

이하 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 상세하게 설명하지만, 하기에 개시되는 본 발명의 실시 형태는 어디까지 예시로써, 본 발명의 범위는 이들의 실시형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 범위는 특허청구범위에 표시되었고, 더욱이 특허 청구범위 기록과 균등한 의미 및 범위 내에서의 모든 변경을 함유하고 있다.
합성예 1: 상기 화학식 2 로 표시되는 화합물 합성
습기가 제거된 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)(5 mL)에 하기 화학식 5로 표시되는 디에콜(50 mg, 0.067 mmol)과 무수 탄산칼슘(potassium carbonate)(14 mg, 0.1 mmol)을 혼합한 후, 상온, 교반 조건 하에서 프로파질기 브로마이드(propargyl bromide)(0.04 ml, 0.08 mmol)를 8시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 반응 용매를 진공 하에서 제거한 후, 얻어진 혼합물을 증류수(5 mL)로 세척한 후, 원심분리하여 수용액을 제거하였다. 이렇게 얻어진 고체상 물질을 아세톤(acetone)으로 세척하여 물기를 제거한 후, 진공 건조하였다. 건조된 고체상 물질을 HPLC(acetonitrile-water binary gradient solvent system)를 사용하여 갈색 고체상의 순수한 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 (20mg, 수율 38%)을 분리하였다.
제조한 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 1H-NMR로 확인하여, 하기에 나타내었다.
1H-NMR (700 MHz, DMSO-d6): δ 9.14~9.68 (ArOH, 10H, m), 6.21(ArH, 1H, s), 6.19 (ArH, 1H, d, J = 2,7Hz), 6.16(ArH, 1H, s), 6.05 (ArH, 1H, d, J = 2.7Hz), 6.04 (ArH, 1H, d, J = 2.8Hz), 5.97 (ArH, 2H, s), 5.81 (ArH, 1H, t, J = 2.0Hz), 5.80 (ArH, 1H, d, J = 2.9Hz), 5.73 (ArH, 2H, d, J = 2.0Hz), 4.68 (CH2, 2H, d, J = 2.2Hz), 3.57 (CH, 1H, t, J = 2.3Hz); 13C-NMR (176 MHz, DMSO-d6): δ 160.27, 158.79, 155.83, 154.17, 153.15, 151.19, 146.11, 146.06, 145.93, 145.81, 142.45, 142.37, 142.03, 141.86, 137.03, 136.81, 124.24, 124.02, 124.00, 123.09, 123.05, 122.25, 122.15, 98.49, 98.28, 98.18, 98.13, 96.32, 96.18, 94.42, 93.60, 93.39, 78.91, 78.83. 56.54; ESI-MS: m/z 781.07 [M+H]+ (781.10, calcd for C39H25O18).
[화학식 5]
Figure pat00021
합성예 2: 화학식 3으로 표시되는 화합물의 합성
2-1. 화학식 3으로 표시되는 화합물의 전구체인 하기 화학식 4로 표시되는 화합물의 합성
디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)(6 mL)에 피페라진(piperazine)(194 mg, 2.25 mmol)을 넣고 교반하는 상태에서 HATU(1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate, 198 mg, 0.52 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA,N,N-Diisopropylethylamine, 0.17 mL, 1.0 mmol) 및 하기 화학식 6으로 표시되는 로다민(rhodamine)B(200 mg, 0.45 mmol)를 첨가하였다. 반응용액은 상온에서 3시간 동안 교반한 후 묽은 염산으로 반응을 중지시켰다. 유기용액층을 묽은염산 및 염화나트륨용액으로 철저히 세척한 후 황산나트륨(Na2SO4)을 사용하여 수분을 제거한 후 진공 농축하였다. 얻어진 반응생성물은 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하여(CH2Cl2-MeOH, 30:1) 하기 화학식 4로 표시되는 화합물(163 mg, 71% 수율)을 흑자주색 고체로 얻었다.
제조한 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 1H-NMR로 확인하여, 하기에 나타내었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.66 (ArH, 2H, m); 7.54 (ArH, 1H, m), 7.32 (ArH, 1H, m), 7.27 (ArH, 1H, s), 7.23 (ArH, 1H, s), 6.93 (ArH, 2H, m), 6.76 (ArH, 2H, d, J = 4 Hz), 3.61 (CH2, 8H, m), 3.35 (CH2, 4H, m), 2.69 (CH2, 4H, t, J = 8 Hz), 1.32 (CH3, 12H, t, J = 8 Hz); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 167.63, 157.94, 156.28, 155.82, 135.91, 132.34, 130.75, 130.35, 130.28, 129.89, 127.87, 114.25, 113.93, 96.41, 49.05, 46.25, 43.10, 12.77.
[화학식 6]
Figure pat00022
[화학식 4]
Figure pat00023

2-2. 화학식 3으로 표시되는 화합물의 합성
DMF (5 mL)에 상기 합성예 2-1에서 제조한 상기 화학식 4의 화합물(150 mg, 0.294 mmol)을 넣고 교반하는 상태에서 HATU(128 mg, 0.34 mmol), DIPEA(0.12 mL, 0.66 mmol) 및 2-아지도아세틱산(2-azidoacetic acid)(33 mg, 0.32 mmol)을 첨가하였다. 반응용액은 상온에서 하룻밤(overnight) 동안 교반한 후 진공 하에서 용매를 제거하였다. 얻어진 반응생성물은 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하여(CH2Cl2-MeOH, 35:1) 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물(131 mg, 75% 수율)을 흑자주색 고체로 얻었다.
제조한 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 1H-NMR로 확인하여, 하기에 나타내었다.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.70 (ArH, 3H, m), 7.50 (ArH, 1H, s), 7.10 (ArH, 4H, m), 6.91 (ArH, 2H, s), 4.09 (CH2, 2H, s), 3.62 (CH2, 8H, m), 3.13 (CH2, 4H, m), 2.65 (CH2, 4H, m), 1.17 (CH3, 12H, m); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 167.27, 166.69, 157.73, 156.24, 155.77, 135.78, 132.40, 131.39, 131.03, 130.54, 128.24, 128.04, 114.91, 113.70, 96.56, 50.32, 47.31, 46.06, 38.94, 13.10; ESI-MS: m/z 594.50 (M+) (594.32, calcd for C34H40N7O3 +).
[화학식 3]
Figure pat00024

합성예 3: 화학식 8로 표시되는 화합물의 합성
무수 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)(500uL)에 하기 화학식 9의 화합물(FITC, Fluorescein isothiocyanate, 100mg, 0.257 mmol)을 넣고 교반하는 상태에서 TEA (Triethylamine, 400 ul)를 첨가 하였다. 여기에 3-아지도 프로필아민 (3-azidopropyl amine, 27 mg, 0.27 mmol)을 무수 DMF (200ul) 에 녹여서 ice bath하에서 첨가 하였다. 반응용액은 상온에서 2시간 동안 교반한 후 진공 하에서 용매를 제거하였다. 얻어진 반응생성물은 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하여(CH2Cl2-MeOH, 95:5) 하기 화학식 8의 화합물(108 mg, 86% 수율)을 연황색 고체로 얻었다.
제조한 하기 화학식 8의 화합물을 1H-NMR로 확인하여, 하기에 나타내었다.
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ10.73 (COOH, 1H, s); 8.83 (1H, s); 8.31 (ArH, 1H, s); 7.72 (ArH, 1H, d, J = 8 Hz); 7.09 (ArH, 1H, d, J = 8 Hz); 6.66 (ArH, 2H, d, J = 8 Hz); 6.51 (ArH, 4H, m); 3.50 (CH2, 2H, m); 3.37 (CH2, 2H, t, J = 8 Hz); 1.75 (CH2, 2H, m). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 181.27, 169.84, 165.62, 154.15, 141.95, 130.21, 127.84, 126.13, 119.11, 116.02, 111.34, 103.13, 102.98, 49.25, 49.20, 41.73, 28.39 ppm.
[화학식 9]
Figure pat00025
[화학식 8]
Figure pat00026

실시예 1: 화학식 1의 화합물의 합성
합성예 1에서 제조한 화학식 2로 표시되는 화합물(52 mg, 0.067 mmol)과 합성예 2에서 제조한 화학식 3으로 표시되는 화합물(40 mg, 0.067 mmol)를 DMF(5 mL)에 용해시킨 후, 용액을 아르곤으로 1시간 버블링(bubbling) 하여 용존 기체를 제거하였다.
별도로 구리 퍼클로레이트(copper perchlorate, (Cu(ClO4)(5.3 mg, 0.02 mmol) 및 아스코르브산 나트륨(soduim L-ascorbate)(7.9 mg, 0.04 mmol)를 3 mL의 DMF에 녹인 후, 위와 같이 아르곤으로 1시간 버블링(bubbling)하여 용존 기체를 제거하였다.
구리 용액의 색이 갈색에서 연황색으로 변하면 copper (I) 용액을 주사기로 준비된 반응용액에 주입하였다. 이렇게 얻어진 반응 혼합물을 상온에서 48시간 교반한 후, 반응용액을 다량의 디에틸에테르에 부어 서스펜션을 만든후, 원심분리를 이용하여 고체를 분리하였다. 얻어진 고체를 물(5 ml, 3회), 메탄올(methanol)(15 mL, 3회), 아세톤(acetone)(10 mL, 3회) 및 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)(15 mL, 3회)으로 세척한 후 진공에서 건조하여 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(32 mg, 35 %수율)을 자주색 고체로 얻었다.
제조한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 1H-NMR로 확인하여, 하기에 나타내었다.
1H-NMR (700 MHz, DMSO-d6): δ 9.12~9.7 (dieckol), 6.54~7.75 (rhodamine), 5.41~6.2 (dieckol), 1.1~4.36 (rhodamine); 13C-NMR (176 MHz, DMSO-d6): δ 206.57, 204.58, 172.77, 166.66, 158.86, 158.74, 157.03, 155.46, 155.08, 146.02, 135.06, 131.75, 130.40, 129.83, 127.51, 126.40, 124.60, 124.17, 123.83, 123.11, 122.10, 121.84, 121.28, 119.76, 115.59, 114.23, 112.99, 111.65, 105.39, 98.25, 95.87, 94.00, 93.55, 91.28, 87.86, 74.77, 73.22, 62.74, 45.36, 35.77, 31.26, 30.67, 18.53, 18.21, 12.41; MALDI-TOF-MS: m/z 1374.507 (M+).
[화학식 1]
Figure pat00027
실시예 2: 화학식 7의 화합물 합성
합성예 1에서 제조한 화학식 2로 표시되는 화합물(20 mg, 0.064 mmol)와 합성예 3에서 제조한 화학식 8의 화합물(31 mg, 0.064 mmol)를 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)(5 mL)에 용해시킨 후, 용액을 아르곤으로 1시간 버블링(bubbling) 하여 용존 기체를 제거하였다.
별도로 구리 퍼클로레이트(copper perchlorate, (Cu(ClO4)2(5.3 mg, 0.02 mmol) 및 아스코르브산 나트륨(soduim L-ascorbate)(7.9 mg, 0.04 mmol)를 3 mL의 DMF에 녹인 후, 위와 같이 아르곤으로 1시간 버블링(bubbling)하여 용존 기체를 제거하였다.
구리 용액의 색이 갈색에서 연황색으로 변하면 copper (I) 용액을 주사기로 준비된 반응용액에 주입하였다. 이렇게 얻어진 반응 혼합물을 상온에서 72시간 교반한 후, 반응용액을 다량의 메탄올 (50 ml)에 부어 서스펜션을 만든후, 원심분리를 이용하여 고체를 분리하였다. 얻어진 고체를 물(5 ml, 3회), 메탄올(methanol)(15 mL, 3회), 아세톤(acetone)(10 mL, 3회) 및 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)(15 mL, 3회)으로 세척한 후 진공에서 건조하여 하기 화학식 7의 화합물(20 mg, 24.5 % 수율)을 갈색 고체로 얻었다.
제조한 하기 화학식 7의 화합물을 1H-NMR로 확인하여, 하기에 나타내었다.
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ8.9~9.91 dieckol; 8.2 ~7.07 FITC; 6.38~6.66 FITC and dieckol; 1.1~3.5 FITC; 13C-NMR (176 MHz, DMSO-d6): 168.89, 168.45, 159.45, 159.35, 158.87, 155.17, 155.14, 152.57 151.88, 151.85, 144.78, 142.20, 134.70, 129.82, 129.04, 126.93, 126.61, 126.37, 125.18, 124.54, 124.18, 124.13, 123.29, 121.82, 121.27, 116.85, 112.55, 112.49, 11.61, 109.95, 109.63, 102.21, 102.15, 95.02, 83.01, 82.84, 48.58, 48.47, 47.27, 41.43, 41.31, 41.19, 36.63, 36.38, 31.28, 30.38, 28.96, 27.72, 27.48, 26.89 ppm.
[화학식 7]
Figure pat00028

실험예 1: 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 합성예 2에서 제조한 화학식 3으로 표시되는 화합물의 세포 내 분포 확인
화합물 1의 세포내 분포를 확인하기 위하여 RAW 264.7 cells에서 컨포칼 레이져 현미경(confocal laser microscopy)을 이용하여 ER 트랙커(Endoplasmic Reticulum tracker, 1.0 μM), 미토 트랙커(Mitochondria tracker, 0.2 μM) 및 리소트랙커(Lysosome tracker, 2.0 μM)와 코로칼리제이션 (co-localization)실험을 실시하였다. 즉, RAW 264.7 cell에 실시예 1에서 합성한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물(2 μM) 단독 처리, 각 트랙커 단독 처리 및 동시 처리(모든 경우, 37℃에서 20분간 처리)하여 컨포칼 현미경(Confocal microscopy)이미지(이미지 크기: 75×75μm2)를 얻어 비교하였다(도 3). 코로칼리제이션 실험에서의 여기(excitaton) 주파수는 488nm 이었으며, 560~620 nm 영역에서 방출 (emission) 되는 빛을 수집하였다. 또한 각각의 트랙커(tracker) 단독의 여기(Excitation) 및 이미션(emission) 주파수는 녹색(Green)인 ER 트랙커(Tracker)는 488 nm 및 500 ~ 540 nm이고, 짙은 빨강(Deep Red)인 미토 트랙커(Mito Tracker)는 488 nm 및 660 ~ 750 nm 이다. 그리고 파랑(Blue)인 리소 트랙커(Lyso tracker blue DND-22)는 740 nm 및 360 ~ 520 nm 이었다.
한편, 화학식 1의 전구체 중 형광체인 화학식 3으로 표시되는 화합물 (2 μM)에 대해서도 위와 동일한 방법으로 컨포칼 현미경 (Confocal microscopy) 이미지를 얻어 화학식 1의 경우와 비교하였다 (도 3).
도 3에서 머지(merge)된 이미지에 의하면 실시예 1의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 대부분 ER에 존재하는 반면, 합성예 2의 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 순수 로다민 B의 경우와 마찬가지로 미토콘드리아에만 존재함을 알 수 있다. 따라서 원래 다른 영역에 가던 화합물이 디에콜이 연결됨으로써 ER에 가게 된다는 것을 발견하였다.
실험예 2: 활성 비교 평가
상기 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물, 합성예 2의 화학식 3으로 표시되는 화합물, 디에콜(Dieckol, 화학식 5) 및 로다민 B(Rhodamine B, 화학식 6)의 활성을 확인하기 위하여 LPS-stimulated RAW264.7 macrophages에서 염증 매개인자들인 NO, TNF-α and IL-6 를 억제하는 효과를 평가하였다.
상기 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물, 합성예 2의 화학식 3으로 표시되는 화합물, 디에콜(Dieckol, 화학식 5) 및 로다민 B (Rhodamine B, 화학식 6)의 각각에 LPS 처리 후 24시간 후에 세포배양액에서의 NO, TNF-α 및 IL-6 의 농도를 측정하였다. 그리고 그 결과를 각각 도 4, 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 4를 설명하면, 디에콜(dieckol, 화학식 5)과 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 경우, 모두 LPS에 의한 NO의 발생을 감소시킴을 알 수 있었다.
그러나 화학식 1 로 표시되는 화합물(IC50=2.5μM)이 디에콜의 경우(IC50=20μM) 보다 8배 강력한 억제력을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
도 5를 설명하면, 상기 NO의 결과와 유사하게, LPS에 의한 TNF-α발생 억제력에 있어서도, 화학식 1로 표시되는 화합물은 디에콜 보다 뛰어난 효과를 보였다.
또한, 도 6을 설명하면, 1.25 uM의 화학식 1로 표시되는 화합물은 20μM 디에콜의 경우에 비해 우수한 IL-6 발생 억제력을 나타낸다. 이는 화학식 1로 표시되는 화합물이 디에콜보다 최소 16배 이상의 뛰어난 효과를 보임을 알 수 있다.
한편, 화학식 1로 표시되는 화합물의 합성에 이용된 로다민 B(화학식 6) 및 합성예 1의 화학식 3으로 표시되는 화합물의 경우 NO, TNF-α 및 IL-6 모두에서 전혀 효과가 나타나지 않았다.
결론적으로, 화학식 1로 표시되는 화합물의 활성은 디에콜(Dieckol)에서 기인되며, 로다민 B(Rhodamine B) 디에콜(Dieckol)의 결합에 의해 ER로 들어가는 것이 확인되었다.
따라, 화학식 1로 표시되는 화합물은 디에콜보다 ER스트레스(stress)를 보다 효과적으로 낮춤으로써 항염증 활성이 증폭된 것임을 알 수 있다.
실험예 3: 상기 화학식 7로 표시되는 화합물과 합성예 3에서 제조한 화학식 8로 표시되는 화합물의 세포 내 분포 확인
화합물 7의 세포내 분포를 확인하기 위하여 BV-2 cell 에서 컨포칼 레이져 현미경(confocal laser microscopy)을 이용하여 ER 트랙커 (Endoplasmic Reticulum tracker, 1.0 μM), 미토 트랙커(Mitochondria tracker, 0.2 μM) 및 리소트랙커(Lysosome tracker, 2.0 μM)와 코로칼리제이션 (co-localization) 실험을 실시하였다. 즉, RAW BV-2 cell에 실시예 2에서 합성한 상기 화학식 7로 표시되는 화합물 (5 μM) 단독 처리, 각 트랙커 단독 처리 및 동시 처리 (모든 경우, 37℃에서 20분간 처리) 하여 컨포칼 현미경 (Confocal microscopy) 이미지 (이미지 크기: 75×75μm2)를 얻어 비교하였다 (도 7). 코로칼리제이션 실험에서의 여기(excitaton) 주파수는 514nm이었으며, 530 ~ 600 nm 영역에서 방출(emission)되는 빛을 수집하였다. 또한 각각의 트랙커(tracker) 단독의 여기(Excitation) 및 이미션(emission) 주파수는 빨강(Red)인 ER 트랙커(Tracker)는 514 nm 및 600 ~ 700 nm이고, 짙은 빨강(Deep Red)인 미토 트랙커(Mito Tracker)는 633 nm 및 650 ~ 750 nm 이다. 그리고 파랑(Blue)인 리소 트랙커(Lyso tracker)는 740 nm 및 400 ~ 500 nm 이었다. 한편, 화학식 7의 전구체 중 형광체인 화학식 8로 표시되는 화합물 (5 μM)에 대해서도 위와 동일한 방법으로 컨포칼 현미경(Confocal microscopy)이미지를 얻어 화학식 7의 경우와 비교하였다 (도 7).
도 7의 머지(merge)된 이미지에 의하면 실시예 2의 상기 화학식 7로 표시되는 화합물은 ER에만 존재하는 반면, 합성예 3의 상기 화학식 8로 표시되는 화합물은 미토콘드리아와 ER의 구분없이 산재되어 존재함을 알 수 있다. 따라서 화학식 7의 경우도 화학식 1의 경우와 마찬가지로 디에콜과의 결합을 통하여 ER에 선택적으로 진입한다는 것을 발견하였다. 따라서 항산화력과 항염증력이 우수한 디에콜과 형광 기능을 갖는 로다민 B 또는 FITC 를 화학적으로 결합함으로써 ER에 선택적으로 진입하는 신규의 형광성 디에콜 유도체를 제공할 수 있게 되었다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 7의 형광 표지된 디에콜 유도체.
    [화학식 1]
    Figure pat00029

    [화학식 7]
    Figure pat00030
  2. 하기 화학식 2의 프로파질기(propargyl group)를 포함하는 디에콜(Dieckol) 유도체.
    [화학식 2]
    Figure pat00031
  3. 하기 화학식 2의 프로파질기(propargyl group)를 포함하는 디에콜 (Dieckol) 유도체를 하기 화학식 3의 아조기(azo group)를 포함하는 로다민 B 유도체와 반응시키는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 형광 표지된 디에콜 유도체 제조 방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00032

    [화학식 2]
    Figure pat00033

    [화학식 3]
    Figure pat00034
  4. 하기 화학식 2의 프로파질기(propargyl group)를 포함하는 디에콜 (Dieckol)유도체를 하기 화학식 8의 아조기(azo group)를 포함하는 FITC 유도체와 반응시키는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 7의 형광 표지된 디에콜 유도체 제조 방법.
    [화학식 7]
    Figure pat00035

    [화학식 2]
    Figure pat00036

    [화학식 8]
    Figure pat00037
  5. 청구항 1의 상기 화학식 1 또는 상기 화학식 7의 형광 표지된 디에콜 유도체를 유효성분으로 포함하는 ER-스트레스(Endoplasmic reticulum stress) 매개 질환의 예방 및 치료용 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 ER-스트레스 매개 질환은
    제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 면역글로블린 경쇄 아밀로이드증(immunoglobulin light chain amyloidosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 혈액투석 연관성 아밀로이드증 (haemodialysis-related amyloidosis), 활동성 아밀로이드증(reactive amyloidosis), 낭포성 섬유증(cystic
    fibrosis), 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 크로이츠펠트-야콥 질환 및 관련 질환(Kreutzfeldt-Jakob disease and related disorders (prion encephalopathies)), 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolaemia), 알파1-항트립신 결핍증(Alpha1-antitrypsin deficiency), 경변(cirrhosis), 전신성 폐기종(emphysema systemic), 뇌성 유전성 아밀로이드증(cerebral hereditary amyloidoses), 울콧-랠리슨 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 울프람 증후군(Wolfram syndrome), 염증성 장
    질환, 크론씨 병, 궤양성 대장염, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 ER-스트레스(Endoplasmic reticulum stress) 매개 질환의 예방 및 치료용 조성물.
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