KR20160030729A

KR20160030729A - 폴리믹신 b 화합물을 포함하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20160030729A
Application number: KR1020140120275A
Authority: KR
Inventors: 이병호; 오광석; 이정현; 서호원
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2014-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2016-03-21
Also published as: KR101664106B1

Abstract

본 발명은 폴리믹신 B(polymyxin B) 화합물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 폴리믹신 B 화합물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

폴리믹신 B 화합물을 포함하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 {A pharmaceutical composition comprising polymyxin B as a active ingredient for prevention or treatment of cardiovascular diseases}

심혈관계 질환은 우리나라 뿐만 아니라 전 세계적인 국가의 주요 사망원인으로서 성인병 증가와 고령인구의 증가로 심혈관계 질환자의 수는 계속 늘어날 전망이나, 심부전, 심근경색을 치료하는 치료제는 기저질환 치료제를 제외하고는 거의 전무한 상태이다.

한편, G 단백질 결합 수용체 키나아제(G-protien coupled receptor kinases, GRKs)는 최근까지 7개의 아형이 발견되었으며, 베타 아드레날린 수용체 및 아데노신 수용체의 세포 내 C-말단부위를 인산화 시켜 수용체의 탈감각화(desensitization)을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 이중 GRK5(G-protien coupled receptor kinase 5)는 심장근육에 특이적으로 많이 발현되고 있으며, 심장의 신호전달 및 기능에 주된 조절인자로 인지되고 있다. GRK5 활성 자체는 세포비대반응을 일으키는 자극(예를 들어, 에피네프린(epinephrine), 안지오텐신II(angiotensin II), 엔도텔린(endothelin))에 의하여 직접적으로 항진된다(Huang et al., Front Biosci, 2011, 16, 3047-60). GRK5는 다른 GRK와는 달리 특이적으로 GRK5의 촉매도메인(catalytic domain)내에는 핵 내부 타겟팅 염기서열(Nuclear localization sequence, NLS)이 존재하며, 외부 자극에 따라 활성화된 GRK5는 핵으로 이동, class II HDAC5(Histone deacetylase 5)의 인산화를 유도하고 심부전 관련 유전인자의 전사를 유도함이 확인되었다(Marini et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105, 12457-62).

또한, GRK5의 병리학적 역할을 살펴보면, 심장이식 후 심부전이 진행된 31명의 환자의 INTERMACs profiles을 조사한 결과, GRK5의 mRNA와 단백질의 과발현이 관찰되었으며, 세포비대 및 스트레스 섬유질(Stress fiber) 유발 등의 심혈관 질환의 다양한 병리학적 소인과의 상관관계가 증명되고 있다(Aguero et al, J Card Fail, 2011, 18, 53-61).

따라서, GRK5 저해제 개발의 필요성으로는 GRK5 과발현 유전자 조작 마우스의 경우, 지나친 심근비대 및 심기능 장애가 나타나고, 결국 심부전 및 사망을 유발하였으며, 핵 내부 타겟팅 염기서열이 결핍된 GRK5가 발현된 마우스의 경우에는 GRK5 과발현 유전자 조작 마우스(Tg GRK5 mice)에서 발견된 병리학적 증상이 나타나지 않았다(Marini et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105, 12457-62). 또한 GRK5 유전자 결여 마우스(GRK5-KO) 경우, 전체적으로는 경미한 저체온증상(hypothermia)과 과소활동(hypoactivity)를 보였으며, 심근비대 및 심기능 장애에 강한 내성을 보이는 것으로 확인되었다(Gold et al, Circ Res, 2012, 111, 1048-53). 현재 임상적으로 이용 가능한 GRK5 저해제는 아직 보고된 바 없으며, 최근 연구경향은 다른 AGC kinase family인 PKA, PKC, receptor tyrosine kinase와의 cross-activity가 없는 좀더 selectivity가 높고, GRK5 저해효과가 우수한 저해제 개발을 위한 연구가 진행 중이다.

한편, 폴리믹신 B는 1950년대 처음 발견된 펩티드계 항생물질로 Bacillus polymyxa로부터 생산되며, 그람음성균(Gram-negative infections)에 대한 선택적인 항생제로 사용되는 약물이다. 폴리믹신 B의 약물기전은 세포외벽의 negatively charged site에 결합하여 구조의 변화를 유발시키고, 세포벽의 투과성을 증가시키는 역할을 한다. 결국 세포 내 수분유입의 증가를 유발시켜 세포사멸을 유발시키는 항생제이다(Cardoso LS et al., Microb Cell Fact, 2007, 6, 1). 최근에는 다중약제내성 그람-음성균(mutidrug-resistant gram-negative bacteria)에 우수한 치료효과로 주목 받고 있다. 최근 심장수술 이후의 septic shock 방지 혹은 허혈손상 이후에 간기능 향상을 위한 polymyxin B-immobilzed fiber colum에 적용(Murakami et al., Circ J, 2009, 73, 658-661; Sato et al., 2009, 15, 4571-4575)되기는 하지만, 폴리믹신 B의 직접적인 GRK5의 저해작용 및 그에 따른 심근섬유증 완화를 포함한 심혈관질환에 미치는 영향에 대해서는 아직 보고된 바 없다.

이에 본 발명자는 폴리믹신 B가 심장세포에서 GRK5 활성을 저해함으로써 심부전 질환 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있다는 것을 처음 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

KR 제 2009-7004841호

(Marini et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105, 12457-62). (Aguero et al, J Card Fail, 2011, 18, 53-61)

본 발명의 목적은 폴리믹신 B 화합물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리믹신 B 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[상기 화학식 1에서,

R은 (C₁~C₂₀)알킬이고, 상기 알킬은 (C₁~C₁₀)알킬로 더 치환될 수 있다.]

본 발명은 상기 화합물은 GRK5의 활성을 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 화합물은 세포비대를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 R은

또는

인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 화합물이 조성물 총 중량에 대하여 0.003 내지 100μM 의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 심혈관 질환은 심장비대, 심부전, 허열성 심장질환, 협심증, 동맥경화증, 심근경색, 심근섬유증 등에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 그람음성균에 대해 선택적인 항생제인 폴리믹신 B가 세포비대 및 액틴 스트레스 섬유질(actin stress fiber) 유발 등 심혈관 질환의 다양한 병리학적 소인과의 상관관계가 있는 GRK5의 저해제로써 우수한 효과가 있음을 처음으로 발견하여 폴리믹신 B 화합물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서의 가능성을 확인하였다. 상기 화합물이 GRK5 활성을 억제함으로써 심부전의 직접적인 병리학적 소인인 심장세포 비대현상을 억제하고, 심장세포의 액틴 스트레스 섬유질 형성을 억제함으로써 심근경색, 심부전, 심근섬유증과 같은 심혈관계 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적인 치료제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

도 1은 다양한 농도의 폴리믹신 B 에 대한 GRK 억제 활성 효과를 나타낸 결과이다.
도 2는 폴리믹신 B의 GRK5 저해에 따른 억제양식 분석한 결과이다.
도 3은 폴리믹신 B의 농도별 액틴 스트레스 섬유질 형성 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 폴리믹신 B의 농도별 세포비대 억제 효과를 확인한 실험결과이다.

이하, 본 발명에 대해 보다 상세하게 설명하고자 한다.

폴리믹신은 다제내성균(슈퍼박테리아)의 감염질환에 탁월한 치료효과를 나타내는 리포펩티드 계열의 항상제로서, 60여년 전 발견 되었으나 우수한 살균력에도 불구하고 인체에 대한 독성(신장독성 및 신경독성) 때문에 제한적으로 사용되어 오다가 여러 가지 항생제에 내성을 가진 다제내성균이 지구촌의 큰 이슈로 부각되면서 새로이 주목받은 항생제이다.

이러한 폴리믹신은 Bacillus polymyxa가 생산하는 그람음성간균, 녹농균에 유효한 펩티드계 항생물질 A, B, C, D, E 등의 성분이 있다.

B₁(C₅₆H₉₈N₁₆O₁₃. 분자량 1203.49)과 B₂(C₅₅H₉₆N₁₆O₁₃. 분자량 1189.47)를 주성분으로 하는 폴리믹신B가 실용화되어 토양 중의 호기성균이 생성하는 항생물질로 폴리펩티드의 구조를 가지며, 항균 스펙트럼이 좁고 거의 선택적으로 그람음성균에만 작용하는 것이 특색이며, 페니실린과 같은 살균력에 작용한다. 또한 경구 및 근육주사로 신속하게 인체 내로 흡수되는 반면 배설은 비교적 늦다. 임상적으로는 다른 항생물질의 거의 대부분이 무효인 녹농균에 의한 감염에 대해서 유용하며 부작용으로는 신장장애, 지각장애, 신경장애 등이 있다.

본 발명은 상기 서술한 항생제로서 사용하는 폴리믹신 B가 심장세포에서 GRK5 활성을 저해함으로써 그에 따른 심근섬유증 완화 또는 심부전 질환 치료제 등의 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용도로 사용할 수 있음을 밝혀 폴리믹신 B 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 본 발명을 완성하였다.

[화학식 1]

[상기 화학식 1에서,

본 발명의 일 양태로는 상기 화학식 1로 표시되는 폴리믹신 B 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

보다 바람직하게는, 상기 화학식 1에서 상기 R은

또는

인 것이 가장 바람직하다.

본 발명자들은 심근 섬유증 또는 심부전 등의 심혈관계 질환을 예방 또는 치료제를 개발하고자 연구한 결과, 심장 이식 후 심부전이 진행된 환자를 조사한 결과, GRK5의 mRNA와 단백질의 과발현이 관찰되었으며, 이는 세포비대 및 stress fiber 유발 등 심혈관 질환의 다양한 병리학적 소인과의 상관관계가 있음을 확인하고, 상기 항생제로서의 폴리믹신 B가 GRK5에 직접적인 저해작용을 함으로써, 이에 따른 심부전 또는 심근섬유증 완화를 포함한 심혈관 질환에 효과적인 예방 또는 치료제로서의 가능성을 확인하였다.

상기 폴리믹신 B 화합물은 GKR5 활성을 직접적으로 억제하며, GRK5의 활성으로 인한 심장세포 내 액틴 스트레스 섬유질(actin stress fiber)이 과도하게 발생하는 것을 억제함을 확인함으로써 상기 폴리믹신 B 화합물이 GRK5 저해제로써, 심혈관계 질환의 예방 또는 치료목적으로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기 GRK5의 과잉 활성이 심혈관계 질환 중 하나인 심부전의 직접적인 병리학적 소인인 심장세포비대의 주된 인자 중의 하나로 인지되고 있으므로 본 발명에 따른 폴리믹신 B 화합물의 세포비대 억제능을 확인함으로써 상기 폴리믹신 B 화합물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료제로서의 탁월한 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명은 폴리믹신 B 화합물을 유효성분으로 포함하여 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화합물의 치료목적으로써의 유효농도가 0.003 내지 10μM 의 농도로 포함되는 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는 0.1 내지 3μM 의 농도로 포함되는 것이 보다 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 폴리믹신 B 화합물의 상기 유효농도일 경우 유의적으로 액틴 스트레스 섬유질 형성이 보다 많이 억제되어 심부전, 심근섬유증 또는 심근경색과 같은 심혈관계 질환의 치료효능이 보다 탁월할 수 있다.

본 발명의 폴리믹신 B 화합물을 유효성분으로 포함하여 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 첨가제로서는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 배합하여 투여 목적에 따라 정제, 경질 또는 연질 캡슐제, 과립제, 츄잉정, 환제, 분말, 엘릭시트, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽과 경구 투여용 제제 또는 에어로졸, 멸균 주사용액 또는 멸균 분말 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 비경구투여 제제로서 주사용 용액 또는 현탁액 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 주사용 제제 또는 연고제 등의 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 습윤제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 인산이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제를 함께 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리믹신 B를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 치료제로서 사용하고자 하는 경우, 유효용량은 대상의 연령, 성별, 건강상태, 질환의 종류 및 중증도 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 하루에 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 폴리믹신 B 화합물을 유효성분으로 포함하여 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있어서, 상기 심혈관 질환은 구체적으로 심장비대, 심부전, 허혈성 심장질환, 협심증, 동맥경화증, 심근경색, 심근섬유증 등에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로는 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: G 단백질 결합 수용체 키나아제 5(G-protein coulped receptor kinase 5(GRK5) 억제 효과

하기 화학식 2 를 만족하는 폴리믹신 B를 사용하여 폴리믹신 B의 GRK5 (G-protein coupled receptor kinase 5)에 대한 억제 활성 확인 실험을 수행하였다. 상기 실험은 시차성 형광분석법(LANCE kinase system, Perkin-Elmer사)을 이용하여 실시하였다.

[화학식 2]

완충용액인 인산화 반응용액(50 mM HEPES pH7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0.01% Tween20, Perkin-Elmer사)과, 인산화 반응 정지와 시차성 형광반응유도 하기 위한 형광검출용액(Perkin-Elmer)을 준비하고, 기질인 5μM의Ulight-histone H3(Thr3) peptide(AR T KQTARK S TG, Perkin-Elmer)와 260μg/ml의 GRK5(#PV3824, Invitrogen) 및 10 mM ATP(Sigma-aldrich)를 준비하였다.

260μg/ml GRK5(#PV3824, Invitrogen)와 5μM 기질 Ulight-H3(Thr3) peptide(AR T KQTARK S TG, Perkin-Elmer)및 10mM ATP를 각각 5μg/ml(최종 반응농도: 0.5μg/ml), 400nM(최종 반응농도: 80nM)과 40μM (최종 반응농도: 20μM)이 되도록 상기 인산화 반응용액을 이용하여 희석하였다. 음성 대조군 (negative control)으로는 5% DMSO 2㎕, 기질액 2㎕, 인산화 완충용액 1㎕를 사용하였으며, 양성 대조군 (positive control)으로는 5% DMSO 2㎕, 기질액 2㎕, GRK5용액 1㎕를 사용하였다. 실험 군으로는 상기 화학식 2 의 폴리믹신 B 2㎕, 기질액 2㎕, GRK5용액 1㎕를 사용하였다. 인산화 반응 전에 약 10분간 화합물과 효소간의 전처리를 실시한 후, ATP 5㎕를 첨가하여 인산화 반응을 유도하였다. 각 시험물질, 효소, 기질 및 ATP는 반응 시 전체부피의 각기 10%, 20%, 50 %씩을 차지하게 되므로, 첨가 직전에는 각기 10배, 5배 그리고 2배의 고농도로 준비하였다. 이후, 3분간 약하게 흔들어 주고 상온에서 1시간 인산화 반응을 유도하였다. 그 후, 인산화 반응 정지액(40 mM EDTA) 5㎕ 와 시차성 형광반응을 유도하기 위한 형광검출용액(8 nM europium이 표지된 anti-phospho H3-antibody) 5㎕를 연속적으로 첨가하여 시차성 형광반응을 유도하였다. 상기 형광검출용액 내에는 형광물질인 Europium(Eu)이 표지 되어 있는 항인산화 항체(anti-phospho H3 antibody)가 희석되어 있어서 기질의 Thr잔기에 인산화된 부위와 항인산화 항체와의 결합반응을 통해 시차성 형광반응이 유도되었다. 상온에서 그대로 1시간 방치시킨 후 시차성 형광반응(Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET) 값을 다기능 형광측정기(multilabel counter, Envision, Perkin-Elmer)를 이용하여 측정하였으며(방출파장: 615 nm, 665 nm, 여기파장: 320 nm), 하기 수학식 1과 2에 따라 시차성 형광 반응율 및 억제율을 계산하고, 그 결과를 in vitro 에서 GRK5를 50% 저해한 폴리믹신 B의 농도인 IC₅₀값으로 표시하였다(도 1).

수학식 1

수학식 2

도 1에서 볼 수 있듯이, 다양한 농도의 폴리믹신 B(0.003μM ~ 100μM )에대한 GRK5 저해제로서의 약효평가 결과, 농도 의존적으로 GRK5의 활성을 억제하였으며, IC₅₀값이 1.1 μM로 분석되었다(도 1).

상기 GRK5의 과발현 증상은 심혈관계 질환 환자들에게서 흔하게 관찰되어, 심혈관 질환의 다양한 병리학적 소인과의 상관관계가 있어, GRK5 발현 정도는 질환의 증상을 나타내는 척도로 사용할 수 있으므로, 상기 폴리믹신 B 화합물의 직접적인 GRK5 발현 억제효과를 통해 폴리믹신 B의 심혈관계 질환의 치료용도로 유용하게 사용할 수 있음을 나타내는 결과이다.

실시예 2: 폴리믹신 B의 GRK5 저해효과에 따른 억제양식분석

본 발명의 실시예 1에 따른 폴리믹신 B의 GRK5 저해에 따른 억제양식을 분석하기 위하여 5μg/ml GRK5(최종 반응농도: 0.5μg/ml), 400 nM 기질(최종 반응농도: 80nM)과 다양한 농도의 ATP(최종 반응농도: 2.5 ~ 40μM) 그리고 폴리믹신 B (최종반응 농도: 0. 1.5, 3μM)을 상기 실시예１의 방법과 동일하게 인산화 반응을 유도하였고, 인산화 반응속도를 측정하기 위하여 0, 20, 40, 60분에서의 시차성 형광반응율을 측정하였다. 시차성 형광반응율과 인산화된 기질양 간의 회귀 직선을 이용하여 분당 생성되는 인산화된 기질의 양, 즉 초기반응속도를 산출하였으며, 초기반응속도(분당 인산화된 기질의 양; nM/min)와 적용된 ATP의 양(μM)을 기준으로 이중역수분포(double reciprocal plots)에 적용하여 폴리믹신 B의 GRK5 저해에 따른 억제양식을 분석하였다.

상기 방법으로 분석한 폴리믹신 B의 GRK5 저해에 따른 억제양식은 도 2에서 보는 바와 같이, ATP에 비경쟁적 저해제 (ATP-non competitive inhibitor)로 분석되었으며, 이는 폴리믹신 B가 ATP 결합부위가 아닌 다른 부위에 결합, 구조변형을 유도하여 GRK5의 활성을 억제하는 양식으로 분석되었다(도 2).

실시예 3: 액틴 스트레스 섬유질 형성(Actin stress fiber formation) 억제 확인 실험

액틴 스트레스 섬유질 형성은 미오신 L 사슬 인산화 반응 이후 발생하는 심장세포 및 혈관수축의 직접적인 세포의 형태학적 현상으로 최근 GRK5의 활성으로 인한 베타-아레스틴(β-arrestin) 소환, RhoA-ROCK(Rho 인산화 효소) 신호전달의 활성을 통하여 심장세포 내 액틴 스트레스 섬유질 형성이 과도하게 발생하는 기전이 보고되었다. 따라서 폴리믹신 B의 GRK5 저해능을 검증하기 위하여 심장세포 내의 액틴 스트레스 섬유질 형성 억제능 실험을 하기와 같이 실시하였다.

챔버 슬라이드(chamber slide; 16 well)에서 배양된 심장세포 H9c2 cell에 1 시간 동안 실시예 1에 따른 폴리믹신 B의 시험물질을 전처리 하고, 2 시간 동안 앤지오텐신 II(300 nM)로 세포내 신호전달을 활성화 시켜, F-액틴 스트레스 섬유질 형성을 유도하였다. PBS (phosphate buffered saline)로 세척 후 4% paraformaldehyde(Sigma-aldrich)로 30분간 세포를 고정시켰다. 고정시킨 세포를 0.5% triton X-100 용액에 5분간 재고정 시킨 후, 1% BSA(bovine serum albumin)가 함유된 저지용액(blocking solution)으로 30분간 상온에서 처리 하였다. Alexa fluor 586 phalloidin 및 Hoechst 염색시약을 사용하여 F-액틴 스트레스 섬유질 및 핵을 염색하고, 광학현미경으로 세포 이미지를 수집하였다.

상기 실험결과로는 도 3에서 보는 바와 같이, 앤지오텐신 II(300 nM)에 의하여 강하게 발생하는 액틴 스트레스 섬유질형성이 폴리믹신 B의 2시간 전처리를 통하여 농도 의존적으로 억제되었으며, 특히 폴리믹신B 화합물 3μM 이상의 농도에서는 통계 유의적으로 액틴 스트레스 섬유질형성이 억제됨이 관찰되었다. 이와 같은 결과를 통해 폴리믹신 B화합물의 심혈관 질환 환자에게서 관찰되는 심장세포 내의 액틴 스트레스 섬유질 형성을 효과적으로 억제하는 효능을 보여줌으로써 폴리믹신 B의 심혈관 질환용 치료제로서 유용하게 사용 가능성을 확인하였다.

실시예 4: 세포비대(Celluar hypertrophy) 억제 확인 실험

심부전의 직접적인 병리학적 소인인 심장세포비대의 주된 인자 중의 하나로 GRK5의 과잉 활성이 인지되고 있다. 따라서 폴리믹신 B의 세포비대 억제능을 통해 GRK5 저해능을 검증하기 위한 실험을 하기와 같이 실시하였다.

심장세포 H9c2 cell에 1시간 동안 실시예 1에 따른 폴리믹신B의 시험물질을 전처리 하고, 심장세포 비대의 유발인자인 앤지오텐신 II(300 nM)를 4일간 지속적으로 투여하였다. PBS(phosphate buffered saline)로 세척 후 1% glutaraldehyde 로 30분간 세포를 고정시켰다. 고정시킨 세포를 0.1% Crystal viole (Sigma-aldrich)로 10분간 염색을 한 후, 디지털 카메라가 장착되어있는 현미경(Nikon)으로 세포 이미지를 수집하였고, Image-Pro PLUS software(MediaCybernetics, Silver Spring)를 이용하여 세포의 수 및 크기를 분석하였다. 심장세포비대의 유발인자인 엔지오텐신 II를 4일간 지속적으로 투여함으로써 약 44%정도의 심장세포비대를 유발됨을 확인하였고, 엔지오텐신 II에 의해 유발된 심장세포상태를 기준으로 하여 심장비대 억제되는 정도를 퍼센트(%)로 나타냈으며, 각각의 농도별 심장비대 억제효과를 그래프로써 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 폴리믹신 B가 앤지오텐신 II에 의하여 유발되는 심장비대를 농도 의존적으로 억제시킴을 확인 할 수 있었고 특히, 폴리믹신 B의 농도가 1μM 이상부터는 통계학적으로 유의성 있는 억제능을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 폴리믹신 B 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[상기 화학식 1에서,
R은 (C₁~C₂₀)알킬이고, 상기 알킬은 (C₁~C₁₀)알킬로 더 치환될 수 있다.]
제 1항에 있어서,
상기 화합물은 GRK5의 활성을 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 화합물은 세포비대를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 R은
또는
인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 화합물이 조성물 총 중량에 대하여 0.003 내지 100μM 의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 심혈관 질환은 심장비대, 심부전, 허혈성 심장질환, 협심증, 동맥경화증, 심근경색, 심근섬유증 등에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.