KR20160025347A - 천궁 식물 유래 신규한 천궁 모틀 바이러스 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천궁 식물에서 발견된 신규한 천궁 모틀 바이러스 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자, 상기 천궁 모틀 바이러스 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

Description

천궁 식물 유래 신규한 천궁 모틀 바이러스 유전자{Novel Cnidium mottle virus gene from cnidium plant}

본 발명은 천궁 식물에서 발견된 신규한 천궁 모틀 바이러스 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천궁 식물 유래의 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자, 상기 천궁 모틀 바이러스 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

기후 온난화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화 및 변이, 그리고 농산물 교역 확대에 따라 돌발 바이러스 및 새로운 바이러스 병의 출현 및 위험도는 점차 높아지고 있다. 지금까지 보고된 식물 바이러스는 전 세계적으로 약 1,000여 종이 알려져 있으며, 아직까지도 여러 가지 식물에서 새로운 바이러스들이 지속적으로 보고되고 있다. 현재 우리나라에서는 약 100여 종의 바이러스가 여러 가지 식물에서 보고되어 있다. 그러나 발생하는 바이러스에 대한 상세한 조사가 일부 작물에서만 이루어졌고, 대부분의 작물에서는 단편적인 조사만 이루어져 있다. 그리하여 아직까지 많은 주요 작물에서 어떤 바이러스 병이 발생하고 있는지 구체적으로 파악되지 못하고 있는 실정이다.

식물병이란 식물기주에 대한 병원균 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 나타난 기주세포와 조직의 기능이상으로서, 식물의 형태, 생리 등에 비정상적인 변화가 나타난 상태를 말하며, 그 결과 나타난 경제적 가치의 감소를 포함하기도 한다. 이러한 식물병을 일으키는 원인으로는 곰팡이(Fungi), 박테리아(Bacteria), 선충(Nematode), 마이코플라스마(Mycoplasma), 원생동물(Protozoa) 및 바이러스(Virus)가 있다. 그러나, 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다. 이에 따라 바이러스를 진단하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 사용되고 있다. 특히, 천궁 식물에 병을 일으키는 바이러스에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한편, 한국등록특허 제10-0961156호에는 식물 바이러스를 검출하기 위한 프로브 세트가 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1153458호에서는 ＩＮＳＶ 및 ＴＳＷＶ의 동시 진단용 듀플렉스 프라이머 및 이의 용도가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '천궁 식물 유래 신규한 천궁 모틀 바이러스 유전자'에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 식물 바이러스가 감염되었을 것으로 의심되는 138개 식물 샘플을 대상으로 cDNA 라이브러리를 제작하였고, 이의 콘티그들을 근거로 제작된 프라이머 세트의 PCR 결과를 통해 염기서열을 확보하였는데, 이는 최종적으로 천궁에서 병을 유발하는 약 7.3 kb 및 약 3.1 kb의 크기의 신규한 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천궁 식물 유래의 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 바이러스로 인해 병증은 나타내지만, 그 원인 바이러스가 아직 밝혀지지 않았던 천궁 식물로부터 신규한 천궁 모틀 바이러스 유전자를 분리한 내용에 관한 것이다. 본 발명의 천궁 모틀 바이러스 유전자를 이용하여 바이러스 감염 진단이 가능하기 때문에 국내 농작물에 발생하는 바이러스 병 발생 양상을 모니터링 또는 조사에 투입하여 병 발생 예찰에 활용할 수 있고, 특히 천궁을 포함하는 숙주 식물체에 발생하는 병해에 대한 실체를 밝히고, 천궁을 포함하는 숙주 식물 무병주 보급 및 품질 향상에 기여할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천궁 식물 유래의 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자를 제공한다.

상기 천궁 식물 유래의 천궁 모틀 바이러스 유전자는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 천궁 모틀 바이러스 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 천궁 모틀 바이러스 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.

대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

천궁 식물 유래의 천궁 모틀 바이러스 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 샘플의 채집 및 총 RNA 추출

식물 바이러스가 감염되었을 것으로 의심되는 138개 식물 샘플을 채집하였고, 모든 샘플을 각각 액체 질소를 이용하여 마쇄하였다. 마쇄한 모든 샘플은 초저온에서 보관하였다. 마쇄한 각각의 샘플을 동량으로 섞은 후 총 RNA를 추출하였으며, 총 RNA 추출은 트리 용액(Tri Reagent, MRC)을 이용하였다.

2. 리보솜 RNA 제거, 이중 가닥 cDNA 합성, 라이브러리 제작 및 시퀀싱

추출된 총 RNA에서 Ribo-ZeroTM Magnetic Kit (plant leaf) (Epicentre)를 이용하여 리보솜 RNA를 제거하였다. 준비된 RNA는 짧은 단편으로 파쇄한 후, 이중 가닥 cDNA로 합성하였고, 합성된 이중 가닥 cDNA는 말단 수정(end-repair)하여 라이브러리 제작에 요구되는 클로닝을 위해서 어댑터(adapter)를 붙였다. 이러한 일련의 과정은 TrueqRNA 샘플 프렙 키트 (Illumina)를 이용하여 진행하였다. BluePippin™ 2% 아가로스 겔 카세트(Sage Science)를 이용하여 정제된 적당한 크기의 삽입 DNA(insert DNA)를 PCR 증폭을 위해서 선발하였다. 최종적으로 라이브러리 제작에 적합한 삽입 DNA의 크기 및 양/질을 Agilent 2100 BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies)를 이용하여 측정하였다. 라이브러리 제작이 완성되었으며, 라이브러리 절편 크기는 대략 350-450bp라는 것을 확인하였다. Illumina HiSeq2500을 이용하여 라이브러리를 시퀀싱 하였으며, 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing) 방법을 이용하여 약 40Gbp의 로우 데이터(raw data)를 생성하였다.

3. 시퀀싱한 로우 데이터( raw data )의 가공 및 식물 바이러스 관련 콘티그( contig )의 제작

로우 데이터에서 양질의 데이터를 선발한 후, 식물 바이러스 관련 리드(reads)를 확보하여 콘티그를 만들었다. 이러한 일련의 과정은 데노보 합성 전사체 분석(de novo transcriptome analysis, SG-de novo Assembler) 방법을 통해서 진행되었다. 식물 바이러스 관련 염기서열을 갖는 약 7,000여개의 콘티그를 확보하였다. 콘티그의 길이가 너무 짧거나(<500bp), 바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)에서 비교했을 때 적용범위(coverage)가 낮은 데이터는 제거하여 최종 약 700여개의 콘티그를 확보하였다.

4. 프라이머 제작 및 전체 지놈 규명

바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)에서 비교했을 때, 약 85-90% 이상의 상동성을 보이는 콘티그를 제거하여 약 150 여개의 콘티그를 확보하였고, 이들 각각을 데이터베이스를 통해서 가장 상동성이 높은 바이러스를 확인하였으며, 같은 바이러스에 높은 상동성을 보이는 콘티그들을 그룹으로 각각 만들었다. 각각의 그룹에 속하는 콘티그들은 해당 식물 바이러스 게놈을 레퍼런스 시퀀스(reference sequence)로 해서 정렬하여 그 위치를 확인하였다.

이들 콘티그의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작하였고, 제작된 프라이머를 이용하여 138개의 식물 샘플을 대상으로 PCR을 수행하였다. PCR 결과는 아가로스 겔 전기영동을 통해서 밴드를 확인하거나 밴드가 확인된 PCR 산물은 시퀀싱하여 염기서열을 확인하였다. 콘티그를 근거로 제작된 프라이머 세트의 PCR 결과를 통해서 얻어진 염기서열을 바탕으로 다시 프라이머를 제작하여 추가의 염기서열을 확보하였다.

실시예 1. 새로운 식물 바이러스의 염기서열 동정

콘티그들을 근거로 제작된 프라이머 세트의 PCR 결과를 통해서 얻어진 염기서열을 통해 최종적으로 천궁에서 신종으로 예상되는 식물 바이러스의 전체 염기서열 정보를 규명하였는데(서열번호 1 및 서열번호 2), 게놈 정보는 약 7.3 kb 및 약 3.1 kb의 (+) 단일-가닥 RNA 게놈((+) single-stranded RNA genome)이며, 각각의 유전자는 기존에 알려진 바이러스 유전자 대비 최대 염기서열 동일성(identity)이 76% 및 67%였다. 본 발명에서는 상기 바이러스의 이름을 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus)로 명명하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Cnidium mottle virus gene from cnidium plant <130> PN14228 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7281 <212> DNA <213> Cnidium mottle virus <400> 1 ttgaaaagca atctgcgaac tttgtcacta tttgtttcct caactagtta ttggacttat 60 ccaattccct tcgttttcgc acttactagc accgggctta tccggattct ctctttgttt 120 tcttttgttg tactgtggtc atacagtttt ccttttggaa ttcaagtctt aacttgaaca 180 acaacttttc tctttgttat ttctcttctc tagtaaccac tttaattttc tatgggttac 240 tcaagaggtt ctcgcggcaa ggctgacaaa gccaagctgt gcggcatctg ctttgcccct 300 tttcctgatg ctcaggaaag aaaggtccac tatcgaaaat ataactgccg tgactcgtcc 360 ggtcagttgg gtgggctggt tagcacaggg cgctgtgctg ggatgaagga gaagaatctg 420 caagttgaac gtgatcgatg tgccatgagg gagtttgagg aggaggagct gcttgaagct 480 gatgtggaaa tggagttcat gtcagagttg atggacttca tagccccttt tccttttcca 540 ggtatctcct ttggtactgt ttcaatgact gttcccaaaa ttgggagctc ttatgctgga 600 aggaaaattc ttaaggctaa ggggcttgat gttgaggagt acgctaagtt ccaggcaccc 660 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60 tccaatttct ctcgtttccg caatcactag caccgggctt atccggatct ctttttgttt 120 tctttgttac ctctgttctg tgcgcgcttt aattttcctt tgcgttcttt acagcagtca 180 caacgtttac attaagtaat ctcgcttccc cgatttgtca agttaggggt ttttgttttt 240 cttttttcgt ttcacagcaa acttttgctc ttttcctttt ctttctgctc ctctgctata 300 tagttcttcc ccctttgatt tctaacatgt cttcctttgg cagacgctca acacaagaga 360 tgccaaatgt tccttcatat tcccctgagg aaatggaagt tctgaaggct gccatcactg 420 aatatggaat tagttatgtt gatgtggtga gagcagctca aactgaaagt gggaagatgg 480 caattcttac tgcagtaagc acgaaccaac tggaaagtct agtagcaact actgctacta 540 gcaactcctt ggtgtgtttg cgtaagaagc ctgaagccac cgtccatgtt tctgagggtg 600 taagacgaca ggttctttgt gatgatgttc ctgcttttga ggaggatcag gcacaaagtg 660 gagaggctag agcctctttt tcctctgcaa acgcttctta tggacagcag gatagagtgg 720 ccctccccag cctacctccc caggagtgcc aatttcacaa taaagttggc tgcctctgta 780 ctcagcacac gagtggctcc gaagccagtg gtcatcatca tgaggagtta gttccagctt 840 cggagggagg tactgagggc cagttctttt ctccccaacc cattgcccat ccacaagact 900 cccgattcgt 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Claims (3)

1. 천궁 식물 유래의 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자.
2. 제1항의 천궁 식물 유래의 천궁 모틀 바이러스(Cnidium mottle virus) 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
3. 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.