KR20160020669A

KR20160020669A - 솔잎 추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20160020669A
Application number: KR1020140105615A
Authority: KR
Inventors: 손창규
Original assignee: 대전대학교 산학협력단
Priority date: 2014-08-14
Filing date: 2014-08-14
Publication date: 2016-02-24

Abstract

본 발명은 아세틸콜린에스터라제 억제활성을 가진 솔잎(pine needle)의 용매 추출물에 관한 것으로, 상세하게는 아세틸콜린에스터라제 억제활성을 가진 솔잎의 용매 추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 상기 조성물을 통해 치매 및 인지능력장애의 예방 및 치료에 기여할 것으로 기대된다.

Description

솔잎 추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Composition comprising pine needle extract for prevention and treatment of dementia and cognitive impairment}

본 발명은 아세틸콜린에스터라제 억제활성을 가진 솔잎(pine needle)의 용매 추출물에 관한 것으로, 상세하게는 아세틸콜린에스터라제 억제활성을 가진 솔잎의 용매 추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

의학산업의 발달과 급속한 경제성장에 따른 삶의 질이 향상됨과 동시에 각종 질병과 노인 인구가 증가하고 있다. 인간의 평균 수명은 연장되었지만 이에 따른 경제적 부담금이 가중되고 있다. 여러 질병 중, 최근 뇌 기능 관련 질환이 주요 이슈가 되고 있으며, 조절 또는 회피가 불가능한 스트레스를 비롯한 원인들에 의해 피로, 우울증, 불면증, 집중력/기억력 장애 또는 산화적 뇌 손상과 같은 기능 장애가 발생하고 있다. 또한 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 헌팅턴 병 또는 루이체병과 같은 퇴행성 뇌질환(neurodegenerative disorder)과 이로 인한 비가역적 치매의 유병율이 점차 증가하고 있다. 노인성 치매 중 50% 이상이 알츠하이머성(Alzheimer type, AD) 치매이다. 병리학적으로 치매가 어떻게 오는지에 대해서는 완전하게 규명하지 못한 상태이며, 이에 따른 치료제도 없는 실정이다. 그러나, 상기 치매와 같은 질병의 발병학적 기전은 산화적 손상(oxidative damage)에 의한 것으로 잘 알려져 있으며, 이는 활성 산소(reactive oxygen species, ROS)의 과도한 발생, 지질의 과산화(lipid peroxidation, LPO) 및 항산화 체계(glutathione-redox system, superoxide dismutase, catalase)의 기능 이상을 초래하여 뇌의 복합적인 기능 장애 및 신경세포의 퇴화, 뇌 조직의 구조적 변화를 가져온다.

기억력 장애의 주요 병리기전은 콜린성 체계(cholinergic system)의 기능 이상으로 제시되고 있으며, 해마의 뉴런 시냅스(neuron synapse)에서 단기-장기 기억(short-long term memory)에 밀접하게 연관되어 신호를 전달하는 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine, Ach)의 감소와 이를 분해하는 효소인 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase, AChE)의 활성 증가로 인한 것이다. 그로 인해 간접적인 치료방법으로 신경 전달체인 아세틸콜린을 가수분해하는 효소인 콜린에스터라제(ChE)를 억제하는 억제제를 이용하는 연구가 진행되어 왔다. 신경계의 시냅스에 존재하는 아세틸콜린에스터라제는 신경세포와 신경근접합부를 지나는 신경세포간 접합부위 회로 후막 등의 신경전달신경계에서 중요한 효소로 신경전달물질인 아세틸콜린을 아세테이트(acetate)와 콜린(choline)으로 가수분해시키는 역할을 한다. 신경전달물질의 발현으로 각 해당 수용체에 전달되어 유전자 발현, 세포의 분화 및 사멸을 조절하는 전사인자(transcription factor)에 영향을 미친다. 전사인자(cAMP response element-boinding protein, CREB)의 인산화와 신경영향인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)의 낮은 발현이 신경세포분화 억제 및 그 수상돌기의 퇴화를 야기하게 된다.

최근 많은 연구자들이 해마조직의 손상을 억제하고 기억기능 향상을 촉진하는 치료 약물에 초점을 맞추고 있으나, 아직까지 뚜렷한 치료대안이 없으며, 타크린(Tacrine), 도네페질(Donepezil), 갈란타민(Galantamine) 등의 알츠하이머 치료용 제제는 아세틸콜린에스터라제 억제(AChE inhibitor, AChEI) 기전으로 일정 부분 개선 효과를 보인다. 그러나, 예방 효과가 없고 다소 심각한 부작용으로 인해 근본적인 해결방안을 제시하지 못하고 있는 실정이다.

대한민국 등록특허공보 0701798.

본 발명에서는 솔잎의 용매 추출물에서 콜린에스터라제(cholinesterase), 특히 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase, AChE)의 활성을 저해하는 효과가 뛰어남을 확인하고, 이들 물질이 포함된 추출물을 수득하고자 하였다.

본 발명은 솔잎 추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 상기 솔잎 추출물은 제한되지는 않으나 아세틸콜린 에스터라제(acetylcholinesterase, AChE)의 활성을 억제할 수 있다.

아세틸콜린(acetylcholine: ACh)은 중추신경계 및 말초신경계에서의 신경전달물질로 알려져 있으며, 신경세포의 시냅스 크놉의 세포질에서 생합성되어 교감 또는 부교감 신경계의 시냅스 전 섬유 및 시냅스 후 섬유에서 분비되며, 부교감 신경섬유의 신경절후(post ganglion)에 존재하는 무스카린 수용체(muscarin receptor)에 자극(impulse) 신호를 반응시키고, 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase,AChE)에 의하여 분해된다. AChE에 의해 아세틸콜린은 콜린(choline)과 아세테이트(acetate)로 분해되는데, 분해되어진 콜린은 운반자(carrier)에 의해 다시 신경계로 부분 흡수되어진다. 이러한 과정을 콜린성 체계(cholinergic system)이라고 하며 이 과정에 AChE가 결정적 역할을 한다. 치매 환자의 경우는 ACh의 양은 적은데 반해 AChE의 작용은 계속 유지되어 신경전달에 이상이 생기게 되면서 결국 학습 능력 및 기억력 감퇴와 인지력 저하 등과 같은 대표적인 치매의 병리현상이 발생하게 된다.

치매는 기억상실, 지능의 퇴보, 성격의 변화, 행동이상 등 복합 인지장애가 특징인 증후군을 말한다. 이 증상은 중추신경계인 뇌와 관련이 있는 퇴행성 뇌신경질환으로서 중추신경계 퇴행성 질환을 유발시키는 서행적인 신경세포의 사멸에 의해 신경회로망에 비가역적인 기능장애가 초래하게 되고, 결국에는 해당 인체 기능의 영구적인 손실을 초래하게 된다. 퇴행성 뇌신경질환의 공통된 특징은 전반적인 혹은 특정한 세포의 사멸을 가져오는데, 분화된 신경세포는 재생 능력이 없어서 신경세포의 사멸은 결과적으로 비가역적인 뇌 기능의 손실로 나타나게 된다.

치매가 어떻게 발생하는지에 대해서는 완전하게 규명하지 못한 상태이고, 다양한 병인학적, 병태생리학적 요소를 가지고 있으므로 단독으로 투여하는 치매치료제는 없는 실정이다. 그러나 간접적으로 치매환자들의 뇌에서 정상적인 사람보다 아세틸콜린(ACh)을 합성하는 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)가 20∼30%로 감소된 것으로 알려졌으며, 또한 신경 전달체인 아세틸콜린 농도가 16∼30% 정도 감소하는 것으로 알려져 있다. 그로 인해, 간접적인 치료방법으로 신경 전달체인 아세틸콜린을 가수분해하는 효소인 콜린에스테라제(ChE)를 억제하는 저해제를 이용하는 연구가 진행되어 오고 있다. 콜린에스테라제는 아세틸콜린에스테라제(AChE)와 부틸콜린에스테라제(BuChE)의 두 가지 형태를 갖는다. 상기의 아세틸콜린에스테라제는 체내 부교감 신경의 활성을 매개하는 신경전달물질들 중의 하나인 아세틸콜린을 콜린과 아세테이트로 가수분해하는 효소로서, 소포체 막에서 형성되어 세포막으로 이동하여 그 기능을 수행한다. 상기의 효소는 콜린 신경과 그 주위, 특히 근신경 접합부에 가장 많이 분포되어 있고, 혈장, 간 및 다른 조직에서도 발견되는 중요한 효소이다. 따라서 아세틸콜린에스테라제 억제물질(acetylcholinesterase inhibitor)을 사용하여 치매를 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 생각되고 있다. AChE는 신경전달물질 ACh을 퇴화시키는 효소이므로, AChE 억제제는 이 퇴화 과정을 억제함으로써 ACh 신경전달물질을 증가된 시간 동안 신경 클레프트(cleft)에 남게 하고 신경전달물질의 화학적 및 기능적 효과를 상승시켜, 기억력 증진 및 인지 작용을 향상시킬 수 있기 때문이다.

본 발명에서 상기 약제학적 조성물의 제형(dosage form)은 제한되지는 않으나 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구용 제형일 수 있다.

본 발명에서 상기 조성물 중 추출물의 양은 제한되지는 않지만 전체 조성물 중량의 0.01 내지 95 중량%로 가할 수 있다. 상기 조성물은 제한되지는 않지만 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한 상기 조성물은 제한되지는 않지만 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 락토오스(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다.

상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환(丸)제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

상기 조성물은 지시된 비율의 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 제한이 없으며 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 추출물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지는 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 솔잎을 분쇄하여 용매로 추출하는 단계를 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서 상기 용매는 제한되지는 않으나 C1-C4의 알콜, n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 클로로포름, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명은 솔잎으로부터 치매 및 인지능력장애 개선에 효과적인 성분을 추출하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하고 아세틸콜린에스터라제의 억제 활성이 있는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물을 통해 치매 및 인지능력장애의 예방 및 치료에 기여할 것으로 기대된다.

도 1은 수중미로 행동관찰 실험내용이다.
도 2는 조성물의 투여여부에 따른 수중미로 행동관찰 결과이다.
도 3은 뇌 해마조직의 산화적 손상 정도를 평가 하기 위한 산화스트레스 지표물질(oxidative stress biomarker) 수준 측정 결과이다.
도 4는 뇌 해마조직의 치상회에서 분포된 신경세포들의 산화정도를 판단하기 위한 4-HNE 면역염색기법이다.
도 5는 신경세포분화의 정도를 판단하기 위한 Ki-67 염색기법이다.
도 6은 기억기능에 밀접하게 관여하는 인자들을 해마조직에서 측정한 것이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

(재료) 솔잎 추출물의 제조

국산 소나무 잎인 솔잎(Pinus densiflora Sieb & Zucc.)은 대한민국 충청북도 청원군의 구룡산에서 확보하였다. 건조된 솔잎 50 g을 분쇄기로 분쇄한 후, 30% 에탄올 500 mL로 25 ℃에서 72 시간 동안 추출하였다. 침전물은 300 메쉬의 필터페이퍼(filter paper; Advantec, Toyo Roshi Kaisah, Tokyo, Japan) 50 mm로 여과하고, 여과된 액체(filtrate)는 순환식 증발기에서 농축한 후 동결건조하였다. 최종 추출물의 수율은 10.46 %(w/w)였으며, 이후 사용을 위해 -80 ℃에 보관하였다.

상기 추출물을 이용하여 스코폴라민(scopolamine)으로 유도된 뇌조직의 산화적 손상과 기억장애 급성 모델을 통해 효과를 측정하였다.

(솔잎 추출물 핑거프린팅(fingerpriting))

솔잎 추출물의 품질 관리를 위하여 액체크로마토그래피-질량 분석기(LC-MS; Thermo Scientific, San Jose, CA, USA)를 5 종의 참고 화합물인 catechin, quercetin, kampferol, astragalin and proanthocyanidin와 함께 사용하였다. LC-MS는 전기분사 이온화(electrospray ionization, ESI) 소스를 구비한 LTQ XL 선형 이온 트랩(Thermo Finnigan, USA)를 이용하여 수행되었다. 상기 선형 이온 트랩은 상기 기술된 바와 같이 동일한 HPLC 조건 하에서 2 용매 시스템(binary solvent system)의 선형 경사(linear gradient)를 이용하여 급속 분리 액체크로마토그래피 (rapid separation LC, RSLC; ultimate 3000, Thermo Finnigan) 시스템 (ESI-LC-MS) HSS T3 column (Waters, UK) (2.1 x 150 mm; 입자크기 2.5 μm )을 사용하였다. 상기 솔잎 추출물 ESI의 양이온 매개변수는 소스 전압(source voltage) +5 KV, 입구 미세관 전압(entrance capillary voltage) +18 V, 입구 미세관 온도(entrance capillary temperature) 275 ℃, 및 튜브 렌즈 전압(tube lens voltage) +120 V으로 설정하였다. 스캔 범위는 m/z 50에서 1000까지로 고정시켰다. 데이터에 의존적인 질량 분석 시험은 Xcalibur system(version 2.2 SP1.48; Thermo Scientific, San Jose, CA, USA)로 제공되는 메뉴 방식의 소프트웨어를 사용하여 제어하였다.

솔잎 추출물에서 추정되는 두 가지 터페노이드(terpenoids)인 α-pinene, β-pinene을 기체크로마토그래피-질량분석기(GC-MS; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 추가분석하였다. 100 mg의 솔잎 추출물을 3 mL의 디에틸에테르(diethyl ether)로 침전시키고, 상기 용액 2.5 μL를 GC-MS 장치에 분사시켰다. GC 분석은 30 m x 250 μm x 0.25 μm 미세 컬럼(capillary column)을 장착한 Agilent 7890A 장치를 사용하여 수행하였다. 40 ℃의 초기 컬럼 온도를 1분간 유지한 후 분당 8 ℃씩 300 ℃까지 상승시켰다. 컬럼의 분사기(injector), 검출기(detector) 및 인터페이스(interface) 온도는 250 ℃로 유지하였다. GC-MS는 컬럼을 장착한 Agilent 5975C 질량분석기를 이용하여 분석하였다. 전자 충돌 질량 스펙트럼은 70 eV에서 기록하였다. NIST 5.0 질량 스펙트럼 라이브러리와의 비교를 통한 피크의 변화(향상)을 기반으로 물질을 규명하였다.

(화학물질 및 시약)

다음 시약은 Sigma사(St. Loius, MO. USA)에서 구입하여 사용하였다: 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (Purpald), 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), N,N-diethyl-p-phenylendiamine (DEPPD), 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH), 5,5-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB), ferrous sulfate, potassium phosphate, reduced glutathione (GSH), myoglobin, glutathione reductase (GSH-Rd), L-glutathione oxidized disodium salt (GSSG), guanidine hydrochloride, lipopolysaccharide (LPS), potassium phosphate reduced form of β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (β-NADPH), scopolamine hydrobromide, 9-Amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine hydrochloride hydrate (tacrine), trichloroacetic acid (TCA), 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP), and tert-butyl hydroperoxide.

다른 시약의 경우는 다음과 같다.

웨스턴 블롯 항체(western blot antibodies): extracellular signal-regulated kinase (ERK), phosphor-ERK, beta-actin, 및 secondary HRP-conjugated (Cell Signaling; Danvers, MA; 및 Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA), Thiobarbituric acid (TBA; Lancaster Co.; Lancashire, England), H₂O₂, (Junsei Chemical Co., Ltd.; Tokyo, Japan), n-butanol (J.T.Baker; Mexico City, Mexico), 1M Tris-HCl solution (pH 7.4) 및 500mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) solution (pH 8.0; Bioneer; Daejeon, Republic of Korea).

(통계분석(statistical analysis))

모든 데이터는 평균 ㅁ 표준편차(SDs)로 표현하였다. 그룹 간에 통계적으로 중요한 차이점이 있는 경우, ANOVA(analysis of variance) 분석에 이어 IBM SPSS statistics 20.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용한 Fisher's LSD t-test와의 post hoc 다중 비교방법으로 분석하였다. 이 때, P<0.05, P<0.01 또는 P<0.001에서의 차이를 통계학적으로 중요한 것으로 간주하였다.

(시험예 1) 실험군

24 내지 27g 무게의 12주령 수컷 마우스 (C57BL/6N; Koatech, 경기도, 대한민국) 60 마리를 그룹당 10 마리씩 6개의 그룹으로 나누어 각각 정상군, 대조군, PNE 투여군 1, PNE 투여군 2, PNE 투여군 3 및 양성대조군으로 설정하였다. 정상군을 제외한 나머지 5개의 군에 대하여 스코폴라민 유도 전 7일 동안 하루에 1회, 증류수, PNE 25 mg/kg, PNE 50 mg/kg, PNE 100 mg/kg, 타크린(tacrine) 10 mg/kg으로 경구투여하였다.

(시험예 2) 수중미로 행동관찰(Morris water maze)

수중미로 행동 관찰은 100 cm의 직경과 50 cm 높이를 갖는 원형의 아크릴 풀에서 실시하였다. 풀을 동일한 크기를 갖는 네 개의 구역으로 나누고, 그 중 한 곳에 10 cm의 직경과 35 cm의 높이를 갖는 도피대(platform)를 수면 1 cm 아래에 설치하였다. 행동관찰 영상은 소프트웨어(Smart Junior, Panlab SL, Barcelona, Spain)에 연결된 비디오 카메라를 이용하여 촬영하였다. 마지막 7일째 약물투여 1 시간 후, 0.9% 생리식염수에 용해시킨 2 mg/kg 스코폴라민을 복강 내 주사하여 급성 기억장애를 유도하였다. 정상군의 경우 동일한 부피의 생리식염수를 투여하였다. 모든 마우스는 도피대에 10초간 위치시켜다가 풀에서 제거하였다.

주사 30분 후부터 학습 및 기억능력을 판단하기 위해 수중미로 행동관찰을 5일간 실시하였다. 도 1에서와 같이 처음 4일간은 학습기간(aquisition trail)으로 각 마우스가 도피대를 찾아가는데까지 소요된 시간을 측정하였다. 마지막 5일 째에 인식된 도피대를 제거하여 도피대가 존재하던 목표지점에 머무른 시간을 측정하였다.

상기 결과, 학습기간 3, 4일째에서 대조군의 마우스가 수중미로에서 탈출하는 시간이 현저하게 증가하였으며, 상기 제조예와 같이 제조한 솔잎 추출물(PNE)을 투여한 실험군의 경우 그림 2A에서와 같이 정상군에 거의 근접하는 수준으로 수중미로 탈출 시간이 감소하였다. 그림 2B의 탈출 이동거리의 경우, 대조군에서 크게 연장되었으며, 솔잎 추출물을 투여한 실험군의 경우 정상군에 가깝도록 감소하였다. 학습 및 기억능력 평가에 있어 가장 중요한 5일째의 경우, 그림 2C와 같이 대조군은 목표지점(도피대)에서 머무른 시간이 정상군에 비해 현저하게 적었으며, 솔잎 추출물을 투여한 군에서 대조군에 비해 크게 개선되어, 정상군과 유사한 결과를 나타내는 것을 확인하였다.

(시험예 3) 뇌 해마조직의 산화적 손상 정도 측정

상기 시험예 2의 최종 행동관찰을 마친 후 각 마우스의 부검을 통해 뇌 조직 및 혈액을 분리하였다. 혈청은 4 ℃, 3000 rpm에서 15 분간 원심분리하였고, 해마 지역은 바로 적출하여 분리시켰다. 해마 조직과 혈청은 추후 활용을 위해 -80 ℃ 또는 RNA(Ambion, TX, USA)에 저장하였다. 각 시험군에 대하여 3개의 마우스 뇌를 면역화학염색법을 위해 4% 파라포름알데히드 용액에 저장하였다.

혈청 및 해마 조직에서의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 수준 측정은 하야시 방법(Hayashi et al., 2007)을 이용하여 결정하였다. 샘플 또는 표준 용액 5 μL을 pH 4.8, 0.1 M 아세트산나트륨(sodium acetate) 버퍼 140 μL와 혼합한 후, 37 ℃에서 5분간 배양하였다. 이어서 1:25의 부피비로 10 mM DEPPD와 4.37 μM 황산제일철을 혼합한 용액 100 μL를 첨가하였다. 상기 용액에 대해 자외선 분광광도계(UV spectrophotometer; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 505 nm에서 흡광을 측정하였다. 활성산소종의 수준(level of ROS)는 과산화수소를 표준물질로 하여 측정한 후 unit/mL로 표시하였다.

지질과산화로서 해마 조직에서 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)의 수준은 미하라 및 우치야마가 사용한 티오바르비투르산 활성 물질(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS) 방법을 사용하여 측정하였다(Mihara and Uchiyama, 1978). 10 %(w/v) 해마 조직 균질현탁액을 1.15 % KCl 얼음물과 함께 준비하였다. 0.13 mL의 균질현탁액을 1 % 인산(phosphoric acid) 0.08 mL 및 0.67 % 티오바르비투르산(TBA) 용액 0.26 mL과 혼합하였다. 100 ℃에서 45분간 배양한 후, n-부탄올 1.03 mL을 부가하였다. 그리고, 혼합물은 볼텍싱한 후 4 ℃, 3000 x g에서 15분간 원심분리시켰다. 535 및 520 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. TBARS의 농도는 표준 TEP를 이용하여 계산되었고, 결과는 μmol/mg 단백질의 단위로 표시하였다.

상기 결과, 기억 기능을 담당하는 해마 조직과 혈정에서 활성산소종인 ROS의 수치가 대조군에서 크게 증가하였다. 또한 다중불포화 지방산과 지질단백질에서 활성산소와 연쇄반응하여 생성된 최종산물인 MDA 역시 대조군에서 크게 증가하였다. 반면, 솔잎 추출물 투여군에서는 도 3에서와 같이 ROS 및 MDA가 감소하였다. 이를 통해 본원 발명의 솔잎 추출물이 항산화 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

(시험예 4) 항산화 비효소 및 효소의 활성정도 측정

해마 조직에서 총항산화 능력(total antioxidant capacity, TAC)은 캄바야시 방법에 의해 결정하였다(Kambayashi et al., 2009). TAC의 수준은 갈릭산 등가 항산화 용량(gallic acid equivalent antioxidant capacity, GEAC)으로 표현된다. 10 mM, pH 7.2의 PBS(phosphate-buffered-saline) 90 μL, 18 μM 미오글로빈(myoglobin) 용액 50 μL, 3 mM의 ABTS 용액 20 μL 및 표준 또는 희석된 균일현탁액 20 μL을 혼합하여 96-웰 플레이트에 가하고, 25 ℃에서 3분간 배양하였다. 그후 과산화수소 20 μL을 각 웰에 가하고 5분간 배양하였다. 600 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

해마 조직에서 글루타티온 함량은 엘만 방법으로 결정하였다(Ellman, 1959). 0.4 mM의 NADPH와 4 mM DTNB 7:1 부피비 혼합물 80 μL를 96-웰 플레이트에 균질현탁액 또는 글루타티온 표준 50 μL과 혼합하였다. 그후, 20 μL (0.06 unit)의 글루타티온 환원효소(glutathione reductase, GSH-Rd)를 각 셀에 첨가하고 405 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

해마 조직에서 글루타티온 환원호소의 활성은 스미스 방법에 의하여 결정하였다(Smith et al., 1988). 2 mM의 GSSG 150 μL와 GSH-Rd 시험 버퍼(1 mM EDTA를 포함하는 100 mM, pH 7.5의 인산칼륨 버퍼) 30 μL을 희석된 균질현탁액(1 mM EDTA 및 1 mg/mL BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 100 mM, pH 7.5의 인산칼륨 버퍼) 30 μL에 가하였다. 3 mM DTNB 75 μL에 2 mM NADPH 15 μL를 섞은 후, 412 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 효소 활성은 다음 식에 의하여 계산하였다.

[수학식 1]

효소 활성(unit/mL) = [(Δa_sample -Δa_blank) x (dilution factor)] / [14.15 mM^-1cm^-1 x 샘플의 부피(mL)].

해마 조직에서 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)의 활성은 GST 시험 키트(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 결정하였다. 기질 용액(DPBS 980 μL, 200 mM GSH 10 μL 및 100 mM CDNB 10 μL) 196 μL를 해마 조직 균질현탁액 또는 표준(GST 용액 125 μg/mL) 96-웰 플레이트에서 4 μL와 혼합하였다. 340 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 효소 활성은 다음 식에 의하여 계산하였다.

[수학식 2]

효소 활성(unit/mL) = [(ΔA₃₄₀/min) x 0.2 x dilution factor] / [5.3 mM^-1cm^-1 x 샘플의 부피(mL)].

해마 조직에서 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD)의 활성은 SOD 시험 키트(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 사용하여 결정하였다. 균질현탁액 20 μL을 96-웰 플레이트에서 WST-1 작업 용액 200 μL와 혼합하였다. 이어서, 효소 작업 용액 20 μL을 부가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 20분간 배양하고, 450 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준값으로는 소 적혈구 희석액의 SOD를 이용하였다.

해마 조직에서 과산화수소 분해효소(catalase)의 활성은 휠러의 방법을 사용하였다(Wheeler et al., 1990). 250 mM, pH 7.0의 포스페이트 버퍼 50 μL, 12 mM의 메탄올 50 μL 및 44 mM의 과산화수소 10 μL을 차례로 1.5 mL 튜브에 10 내지 20분 동안 100 μL 샘플 또는 표준 용액과 혼합하였다. 그후, Purpald 용액(2 N 수산화칼륨에 22.8 mM purpald) 150 μL을 가하여 반응을 중지시키고 25 ℃에서 20분간 배양하였다. 마지막으로, 상기 혼합물에 0.5 N pottasium hydrate에 65.2 mM pottasium periodate를 섞은 용액 150 μL을 가하였다. 550 nm에서 분광광도계를 이용하여 자주색 포름알데히드 산물의 흡광도를 측정하였다.

상기 결과, 표 1에서와 같이 스코폴라민으로 유도된 대조군의 뇌 해마조직에서 총항산화 능력, 글루타티온, 항산화효소의 활성이 정상군과 비교하였을 때 감소하였으며, 솔잎 추출물 투여군에서 훨씬 개선된 효과를 보였다. 특히 솔잎 추출물 투여군에서 과산화물 제거효소(superoxide dismutase, SOD)의 활성의 경우 정상군 대비 높은 결과를 나타냄을 확인하였다.

[표 1]

(시험예 5) 신경세포의 산화정도 측정

뇌 해마조직의 치상회(dentate gyrus, DG)에 분포된 신경세포의 산화정도를 판단하기 위해 4-HNE(4-hydroxynonenal) 면역염색기법을 이용하였다. 체내의 세포막을 구성하고 있는 불포화 지방산과 활성산소의 반응으로 생성된 부산물인 4-HNE을 통해 신경세포의 산화 손상 정도를 파악하고 솔잎 추출물의 항지질과산화 효과를 측정하였다. 뇌 조직은 동일한 정착액에 4 시간 동안 담가두었다. 상기 뇌는 액체질소와 함께 조직을 얼리도록 하는 30 % 수크로즈에서 동결보호하였다. 이후 Leica CM3050 저온유지장치를 사용하여 관상의 동결 부분 (35 mm)를 절단하였다. 뇌의 동결 부분은 항 동결 버퍼하에 저장하였다. 자유롭게 부유된 부분(parallel free-floating section)은 PBS에서 1% 과산화수소 1%와 함께 섞인 퍼록시다제 처리된 후 블로킹 버퍼(4 ℃, PBS에서 5%의 일반 닭 혈청과 0.3% Triton X-100로 오버나이트)로 처리하고 primary 4HNE(1:200, ab48506, Abcam)과 Ki67(1:200, ab15580, Abcam) 항체와 함께 배양하였다. PBS로 세척한 후, 조직은 바이오틴화된 염소 항-토끼(1:400, Vector, BA-1000) 및 염소 항-마우스(1:400, Vector, BA-9200) 2차 항체와 함께 배양하였다. 조직 부분은 이후 아비딘-바이오틴 퍼록시다제 복합체(avidin-biotin peroxidase complex, ABC)에 2 시간 동안 노출하였다. 퍼록시다제의 활성은 안정된 디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 용액으로 시각화하였다. 모든 면역 반응은 Axio-phot microscope(Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 관찰하였다.

상기 결과, 도 4에서와 같이 정상군과 비교하여 대조군의 해마 속 치상회의 과립구층(granullar cell layer, GL)과 과립하지역(subgranular zone, SGZ)에 존재하는 신경세포는 과산화지질의 정도가 매우 높아졌다. 반면, 솔잎 추출물 투여군에서는 이를 정상군과 대등한 수준으로 개선하였다.

(실시예 6) 신경세포 분화 정도 측정

성체 신경발생(adult neurogenesis)이 이루어지는 공간은 과립하지역(SGZ)과 뇌실하지역(subventricular zone, SVZ)의 두 군데에서만 이루어진다. 신경세포 분화의 정도를 판단하기 위해 Ki-67 면역염색기법을 이용하여 측정하였다.

상기 결과, 도 5에서와 같이 정상군과 비교하여 대조군의 해마 속 치상회의 과립하지역에서 새로 생성된 신경세포는 크게 감소하였다. 반면 솔잎 추출물 투여군에서는 오히려 정상군보다 더 많은 신경세포가 분화된 것을 확인하였다.

(실시예 7) 기억기능 관여 인자의 활성 측정

해마 조직에서 아세틸콜린에스터라제의 활성은 상용으로 구입가능한 AChE 활성 시험 키트(AAT Bioquest, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 결정하였다. 570 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

단백질 발현 분석

해마 조직에서 BDNF와 CREB/phospho-CREB 단백질의 발현은 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 평가하였다. 해마 조직은 방사선면역촉진 분석(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 버퍼를 사용하여 얼음에서 균질화하였다. 조직 균질현탁액으로부터 단백질은 10 % PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 전달하였다. 5 % 탈지우유(skim milk)에서 블로킹한 후, 멤브레인은 1차 항체(CREB, p-CREB, BDNF 및 beta-actin_과 함께 4 ℃과 함께 오버나이트시켰다. 멤브레인을 세척한 후 서양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)와 결합된 항-토끼 항체와 함께 실온에서 2 시간동안 배양하였다. ECL advanced kit을 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 통한 유전자 발현 분석

해마 조직에서 CREB1, mAChR1, BDNF, CBP(CREB binding protein) 및 iNOS(inducible nitric oxide synthase)를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현은 정량적 실시간 PCR을 이용하여 확인하였다. 전체 RNA는 RNeasy Mini Kit(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 해마 조직으로부터 분리하였다. High-Capacity cDNA reverse transcription kit(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR은 SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 수행하였고, PCR 증폭은 IQ5 PCR Thermal Cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 하기 표 2에는 상기 유전자 시험에 사용된 프라이머 서열, 산물의 크기 및 어닐링 온도를 요약하여 기재하였다.

[표 2]

iNOS 수준 측정

해마 조직에서 일산화질소(nitric oxide, NO)의 수준은 그리에스 방법(Green et al., 1982)을 사용하여 결정하였다. 40 μL의 균질현탁액을 트랜스퍼하고, 160 μL의 그리에스 시약((1 % sulfanilamide, 0.1 % N-(1-naphthyl) ethylenediamine hydrochloride, 2.5 % 인산)을 첨가하였다. 37 ℃에서 20분간 배양한 후, 자주색 아조 염료(purple azo dye) 산물에 대해 540 nm에서 자외선 분광광도계로 측정하였다.

상기 결과, 도 6A에서와 같이 정상군과 비교하여 대조군의 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase, AChE)의 활성이 크게 증가하였고, 솔잎 추출물 투여군에서는 정상군보다 약간 증가한 수준으로 AChE의 활성을 억제하였다. 도 6B-6C에서와 같이 신경전달물질에 의해 조절되는 CREB-BDNF 작용기전을 조사하였을 때, 해마조직에서 인산화된 CREB이 대조군에서는 감소하였으며, 솔잎 추출물 투여군에서는 는 증가하였다. 해마에서 CREB 신호에 의해 유리되는 BDNF 단백질 발현이 대조군에서 정상군과 비슷한 수준을 보였으나, 솔잎 추출물 처리군에서 매우 현저하게 증가하였고, 유전자 발현 결과에서도 일치하는 결과를 나타냈다. 유전자 발현 결과에서는 도 6C에서와 같이, 아세틸콜린(ACh)이 결합하는 수용체인 무스카린성 수용체(muscarinic acetylcholine receptor 1, mAChR1), CREB에 밀접하게 관여하는 공통전사인자인 CBP의 유전자 발현이, 대조군에서 매우 크게 감소하였으며, 솔잎 추출물 처리군에서는 발현이 크게 상승하였다. 반면 NO(nitric oxide)를 합성하는데 관여하는 효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 유전자 발현은 대조군에서 크게 증가하였으며, 솔잎 추출물 처리군에서 매우 크게 감소함을 확인하였다.

<110> Daejeon University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pini folium extract with colinesterase suppression activity and extraction method thereof <130> P14040470423 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1 forward primer <400> 1 acagtgccaa cccccattta 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1 reverse primer <400> 2 gtaccccatc cgtaccattg tt 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAChR1 forward primer <400> 3 agtggcattc atcgggatca 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAChR1 reverse primer <400> 4 cttgagctct gtgttgacct tga 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF forward primer <400> 5 cacttttgag cacgtcatcg aa 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF reverse primer <400> 6 cacccgggaa gtgtacaagt c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP forward primer <400> 7 ctggcagacc tcggaaagaa 20 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP reverse primer <400> 8 ctggcgccgc aaaaact 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 9 ggcagcctgt gagacctttg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 10 tgcattggaa gtgaagcgtt t 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 11 ggcaccacac cttctacaat ga 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 12 atcttttcac ggttggcctt ag 22

Claims

솔잎 추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 솔잎 추출물은 아세틸콜린 에스터라제(acetylcholinesterase, AChE)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약제학적 조성물의 제형이 (dosage form)이 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구용 제형인 것을 특징으로 하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
솔잎을 분쇄하여 용매로 추출하는 단계를 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법.
제 4항에 있어서,
상기 용매는 C1-C4의 알콜, n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 클로로포름, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서,
상기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조방법.