KR20160012184A

KR20160012184A - 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 타크롤리무스

Info

Publication number: KR20160012184A
Application number: KR1020157036082A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 아콜릿체브; 엘리자베쓰 밀웨이; 엘리자베쓰 제인 멜러; 마이클 유델
Original assignee: 크로노스 테라퓨틱스 리미티드
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2014-05-22
Publication date: 2016-02-02
Also published as: JP2016528171A; EP3003304A1; CA2910006A1; US20160296500A1; JP2019104746A; WO2014188197A1; GB201309375D0; SG11201509665XA

Abstract

본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체의 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 매우 저 용량의 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체의 용도에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 근위축성 측삭 경화증의 치료를 위한 매우 저 용량의 타크롤리무스의 용도에 관한 것이다.

Description

뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 타크롤리무스 {TACROLIMUS FOR USE IN TREATING DISEASES CHARACTERISED BY PROTEIN AGGREGATE DEPOSITION IN NEURONAL CELLS}

타크롤리무스 (후지마이신 또는 FK506으로도 칭해짐)는, 예를 들어 기관 이식을 받은 환자에서, 그리고 궤양성 결장염 또는 특정 피부 병태의 치료를 위해 면역억제제로서 임상적으로 사용된다. 타크롤리무스는 프로그라프(Prograf)®, 아드바그라프(Advagraf)® 및 프로토픽(Protopic)®과 같은 상표명으로 입수가능하다. 타크롤리무스의 시판되는 투여 형태는 0.5 mg, 1 mg, 3 mg 및 5 mg을 함유하는 캡슐 및 피부 병태를 위한 연고 (여기서 농도는 0.05% 내지 0.19%임)를 포함한다. 타크롤리무스는 가장 통상적으로는 이식된 조직의 거부를 예방하기 위한 면역억제를 위해 1일 2회 투여된다. 임상적으로 사용되는 용량은 일반적으로 거부를 예방하고자 하는 경우 4 mg/mL 이상의 전혈 최저 농도를 생성하도록 조정된다. 이는 평균 70 kg 환자의 경우 약 2.5 mg 내지 14 mg의 2회의 1일 용량을 필요로 하는 0.075 mg/kg/일 내지 0.2 mg/kg/일의 범위인 권장 초회 경구 용량 (12시간 마다 2회 분할 용량)을 사용함으로써 달성된다. 타크롤리무스는 또한 일반적으로 1일에 3 mg으로 관절염의 치료에 사용되어 왔다. 아마도 중증 근무력증의 치료용으로 기록된 통상의 임상적인 면역억제에 사용되는 최저 용량은 1일에 2-3 mg이었지만 (Kanshi et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2005; 76: 448-450) 이는 1일에 50 mg 이하의 프레드니솔론과 함께 이었다 (그리고 저체중을 가질 수 있었을 여성에게 투여되었다). 류마티스 관절염을 치료하는데 타크롤리무스의 저 용량을 사용하는 임상 시험은 문헌 [Rheumatology, 2004, 43; 946-948]의 사설에 기재되어 있었고 여기서 1일에 1 mg, 3 mg 및 5 mg의 타크롤리무스 임상 II 용량을 사용하였고 임상 II 연구로부터의 데이터의 관점에서, 임상 III 연구는 1일에 2 mg 및 3 mg의 타크롤리무스를 사용하여 수행하였다.

타크롤리무스에 관한 이들 확립된 임상적 용도는 칼모듈린을 통해 작용하여 칼시뉴린을 활성화하는 메카니즘을 통해 작동하여 T-림프구 신호 전달 및 IL-2 전사 둘 다를 억제하는 것으로 여겨진다. 이들은 용량 의존적 메카니즘이어서 투여되는 타크롤리무스의 양이 많을수록 면역억제도 더 커진다. 이 메카니즘은 본 발명에 관련되지 않으며 이는 다행스러운데 그 이유는 상기에 설명된 병태를 치료하는 경우 면역억제가 바람직하기 때문이지만, 이는 면역각성에서의 감소를 야기하기 때문에, 감염 또는 림프종의 증가된 위험과 같은 그의 단점이 없는 것은 아니다.

WO 2011/004194는 타크롤리무스를 특정 장애의 치료에 사용할 수 있음을 개시한다. 그러나, WO 2011/004194는 타크롤리무스의 통상적인 면역억제제 용량과 상이한 용량을 사용하여 이러한 질환을 치료하여야 함을 개시하지는 않았다.

WO 2000/15208은 타크롤리무스가 특정 질환의 치료에 사용될 수 있음을 개시하고 만성적 사용을 위한 1일 용량이 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg이어서 70 kg 사람의 경우 1일 용량은 7.5 mg 내지 210 mg일 것임을 언급한다. 이 범위는 면역억제제로서의 타크롤리무스의 사용을 위해 적어도 정상 용량 만큼 높다. US 2004/007767은 타크롤리무스에 존재하는 프로페닐 기 대신에 C₂₁에서 메틸 기를 갖는 변형 타크롤리무스의 용도에 관한 것이고 이는 또한 만성적 사용을 위한 1일 용량이 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg임을 개시한다.

문헌 [Gerard et al., J. Neurosciences, 2010, 30(7): 2454-2463]은 타크롤리무스를 포함한 이뮤노필린 리간드가 FKBP의 억제를 통해 신경보호 효과를 나타낼 수 있으며 관찰은 FKBP가 파킨슨병에 대한 신규 약물 표적임을 입증하였음을 밝혀냈다. 비-면역억제성 이뮤노필린 리간드를 개발하기 위해 착수된 다른 이들에 의한 연구 (그로 인해 바람직하지 않은 효과를 피함)가 참조되었고 타크롤리무스의 이러한 비-면역억제성 유사체 중 하나인 GP1-1485는 파킨슨병을 갖는 환자에게 유익하지 않았다.

WO 2010/056754는 mTOR, 특히 라파마이신의 미세캡슐화 억제제를 개시하였고, 이는 연령 관련 장애의 범위에 사용될 수 있다. 0.001 mg 내지 100 mg 또는 그 초과의 범위 내에 있는 개개 용량이 개시되었고 5 mg/kg 내지 100 mg/kg의 특정화된 용량 범위를 언급하였다. 단지 라파마이신의 효과를 예시하였다.

문헌 [Pong et al., Current Drug Targets, 2003, 2: 349-356]은 이뮤노필린 리간드가 신경변성 질환의 치료용으로 간주될 수 있음을 개시한다. 이 문헌은 타크롤리무스가 칼시뉴린을 억제할 수 있고 신경보호에서의 비-면역억제성 리간드의 작용 메카니즘은 공지되어 있지 않음을 밝힌다. 그러나 이 문헌은 면역원성 분자로부터 벗어나고 사용하기 위한 상이한 구조의 비-면역억제 리간드를 제공하기 위한 시도가 이루어졌음을 밝힌다. 이 문헌은 추가로 타크롤리무스가 ALS의 치료에서는 효과가 없는 것으로 확인되었음을 밝힌다.

문헌 [Chattapadhanga et al., Current Medicinal Chemistry, 2011, 18: 5380-5397]은 뉴로이뮤노필린 리간드의 역할을 논의하고 타크롤리무스 및 그의 C₂₁에틸 및 C₁₈ 히드록실 유사체를 제1 세대 리간드로서 지칭한다. 그 다음에 이 문헌은 통상의 기술자가 신경변성 장애를 위한 효과적인 의약을 발견하려는 희망을 갖고 어떻게 제2 및 제3 세대 리간드로 넘어갔는지를 기재한다.

US 2010/0081681 및 US 2013/0102569는 TOR, 예컨대 라파마이신 및 유사체의 억제제를 사용하여 연령 관련 질환을 억제할 수 있음을 개시하고 라파마이신, 시클로스포린 A 및 타크롤리무스의 면역억제 효과를 언급한다. 실험 데이터는 라파마이신에 국한되었으며 면역억제제 용량 미만인 용량이 요법에서 사용될 수 있다는 어떤 시사도 이루어지지 않았다.

놀랍게도 매우 저 용량의 타크롤리무스가, 특정 유전자 활성을 조절하고, 예를 들어 특정 유전자 (예를 들어 산화성 스트레스에 대한 저항성에 대한 밀도)를 스위치 온 또는 상향조절하는 후성적 메카니즘을 통해 작용하기 때문에, 매우 낮은 수준에서 ALS의 치료에서 유익성을 제공할 수 있음을 밝혀냈다.

타크롤리무스의 일반 독성 효과는 그의 면역억제제 메카니즘에 관련되는 것으로 여겨져서 (Dumant et al., J. Exp. Med. 1992, 176: 751-760), 그보다 적은 용량의 사용은 면역억제를 유발하고 유사하게 일반 독성을 배제하도록 한다. 매우 저 용량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 사용에 의한 산화성 스트레스의 감소는 산화성 스트레스가 많은 신경변성 병태에서의 인자인 것으로 여겨지기 때문에 유리하다 (Smith et al., Neurochemistry International, 2013, 62: 764-775). 이는 상기 언급된 것들과 같은 부작용 및 다른 부작용, 예컨대 고혈당증 및 제II형 당뇨병을 피하는데 이점이 있다.

근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 특히 운동 피질, 척추 및 뇌간에서 운동 뉴런 사로 인해 진행성 마비를 유발하는 치명적인 신경변성 질환이다. 상기 질환은 호흡에 필요한 근육, 예를 들어 횡경막의 위축으로 인해 흔히 3년 이내에 치명적이다. 흔히 ALS는 중추 신경계의 척추 또는 안구 영역에 집중되어 있고 여기서 운동 뉴런의 손실이 가장 확연하고 운동 뉴런의 손실은 그 부위로부터의 거리에 따라 감소하는 경향이 있다. 상당한 양의 증거는 옥시다제, 예컨대 슈퍼옥시드 디스뮤타제 1 (SOD1)이, 가능하게는 그의 돌연변이체 형태를 통해, 질환의 발생에 역할을 한다는 것을 시사한다. 산화성 스트레스의 결과로서 응집체가 형성되고 이는 세포 기능 장애 또는 세포사를 동반하는 것으로 보인다. 어떤 치료도 진행 또는 질환을 둔화 또는 반전시키는 통상적인 임상 용도에서 이용가능하지 않다.

본 발명에 이르러 놀랍게도 정확한 매우 저 용량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 사용함으로써 옥시다제, 예컨대 SOD1 및/또는 SOD2의 발현을 후성적으로 제어하는 것이 가능함이 밝혀졌다. 추가로 놀랍게도 이는 산화성 효소의 발현이 정상화 (손상 감소)된다는 점에서 산화성 스트레스로부터 생긴 뉴런 손상에 관여하는 메카니즘에 유익한 효과를 나타내고 세포 건강을 증진시키는 것에 관여하는 메카니즘이 증가된다는 것 (예를 들어, 자가포식을 증진시킴으로써)이 밝혀졌다

이는 ALS에 대하여 가장 즉시 사용가능하긴 하지만, 이는 또한 세포 손상이 단백질 응집체의 형성과 관련되어 있는 다른 질환의 치료에 유익할 것으로 여겨진다.

사용된 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 용량은 기관 거부 또는 질환, 예컨대 관절염 또는 중증 근무력증을 치료하는 경우 그의 임상적 면역억제제 효과를 나타내는데 사용된 용량 미만이다.

본원에 기재된 치료 목적을 위한 타크롤리무스의 사용은 밀접한 구조적 유사체의 사용에 비해 현재 바람직하다.

타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체가 본 발명에서 바람직한 효과를 제공하는 메카니즘은 면역억제를 달성하는 메카니즘과 관련이 없다. 사실, 통상적인 면역억제제 용량에서의 사용은 기껏해야 저조하게 효과가 없는 것으로 여겨진다. 타크롤리무스 및 그의 밀접한 구조적 유사체는 본 발명에 이르러 통상적인 면역억제제 용량 훨씬 미만의 상부 컷 오프를 갖는 확연한 종 형상을 갖는 용량 반응 곡선을 갖는 것으로 밝혀졌다.

발명의 간단한 개요

본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간에게 면역억제를 유발하지 않으며 적어도 0.05 ng/mL의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 최저 전혈 수준을 생성하는 용량으로 유효량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

이러한 방법에 의한 치료에 적절한 질환은 특히 ALS, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 헌팅톤병을 포함한다.

적합하게는 본원에 기재된 방법은 0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg의 용량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함한다.

본원에 기재된 방법은 자가포식의 증가 및/또는 산화성 스트레스의 개선을 야기할 수 있고 후성적 변형을 포함할 수 있다.

도 1은 타크롤리무스가 알파-시누클레인 발현 효모에서 평균 수명에 미치는 효과를 도시한다.
도 2는 효모가 타크롤리무스로 처리시 그의 출발 생존율의 50%에 이르는데 걸리는 시간을 도시한다.
도 3은 가시적인 p-GFP-asyn-A30P 응집체를 갖는 효모 세포의 비율에서 타크롤리무스의 효과를 도시한다.
도 4는 타크롤리무스가 웜 (씨. 엘레간스(C. elegans))의 생존율에 미치는 효과를 도시한다.
도 5는 타크롤리무스가 웜 (씨. 엘레간스)에서 폴리 Q-YFP의 제제화에 미치는 효과를 도시한다.
도 6은 타크롤리무스가 잠재적으로 신경독성인 알파-시누클레인 발현 웜의 평균 수명에 미치는 효과를 도시한다.
도 7은 타크롤리무스가 SOD1의 독성 응집체 발현 웜의 평균 및 최대 수명에 미치는 효과를 도시한다.
도 8은 타크롤리무스가 SOD1 돌연변이체 AM263 발현 웜의 평균 및 최대 수명에 미치는 효과를 도시한다.
도 9는 가족성 ALS와 연관된 SOD1-G93A 돌연변이 발현 포유동물 세포에서 타크롤리무스의 효과를 도시한다.
도 10은 타크롤리무스가 과산화수소로 처리된 효모 세포에 미치는 효과를 도시한다.
도 11은 타크롤리무스가 과산화수소로 처리된 효모 세포에서 유전자 발현에 미치는 효과를 도시한다.
도 12는 타크롤리무스가 SOD1 및 SOD2 전사체의 수준에 대해 인간 세포에 미치는 효과를 도시한다.
도 13은 타크롤리무스가 노화 마우스 뇌에서 타우(Tau) 및 알파-시누클레인의 내인성 응집체의 자연 축적에 미치는 효과를 도시한다.
도 14는 타크롤리무스가 마우스 뇌의 영역에서 포스포-타우 및 알파-시누클레인 병소에 미치는 효과를 도시한다.
도 15는 타크롤리무스 및 아스코마이신이 웜의 수명을 연장시키는데 미치는 효과를 도시한다.
도 16은 타크롤리무스 및 디히드로타크롤리무스가 웜의 수명을 연장시키는데 미치는 효과를 도시한다.
도 17은 뉴런 재생의 촉진을 나타내는, 타크롤리무스가 래트에서 6개월 이하에서 암페타민 유도 회전 비대칭 검정에 미치는 효과를 도시한다.
도 18은 신경변성 장애, 예컨대 파킨슨병 및 알츠하이머병의 치료에 대한 유효성을 나타내는, 래트 뇌에서 타크롤리무스가 알파-시누클레인 및 p-타우에 대해 미치는 효과를 도시한다.
도 19는 보다 저 용량에서 보다 큰 유효성을 나타내는, 타크롤리무스로 처리된 웜에서의 용량 반응 범위를 도시한다.
도 20은 보다 저 용량이 보다 고 용량보다 더 효과적임을 나타내는, Bus5 웜에 대한 타크롤리무스의 용량 반응을 도시한다.
도 21은 타크롤리무스의 투여로부터 생긴 에스. 세레비지아에(S. Cerevisiae)의 수명 프로파일에 대한 연장을 도시한다.
도 22는 타크롤리무스에 기인한 Bu8 배경에서의 웜 수명에 대한 연장을 도시한다.

따라서 본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간에게 면역억제를 유발하지 않으며 적어도 0.05 ng/mL의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 최저 전혈 수준을 생성하는 용량으로 유효량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

유사하게, 본 발명은 면역억제를 유발하지 않으며 적어도 0.05 ng/mL의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 최저 전혈 수준을 생성하는 용량으로 1일 1회 이하로 투여되는, 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 제공한다.

유사하게, 본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체의 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한, 1일에 1회 투여되는 경우에 면역억제를 유발하지 않으며 적어도 0.05 ng/mL의 최저 전혈 수준을 갖는 양의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 함유하는 의약의 제조에 있어서 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 용도를 제공한다.

최저 전혈 수준은 적절하게는 적어도 0.075 ng/mL, 예를 들어 적어도 0.2 ng/mL, 예컨대 적어도 0.3 ng/mL, 또는 적어도 0.1 ng/mL 또는 적어도 0.4 ng/mL일 수 있다.

면역억제를 피하기 위해 최저 혈액 수준은 타크롤리무스를 면역억제제로서 사용하는 경우 면역억제제로 간주되는 것의 4분의 1 미만일 것이다. 일반적으로, 이는 이식 거부를 예방하기 위해 사용된 4 ng/mL의 3분의 1 미만, 즉, 1.3 ng/mL 이하임을 의미한다.

타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체에 의해 제공된 치료 범위로부터 가장 유익하기 위해 최저 전혈 수준은 1.2 ng/mL 미만, 예를 들어 1.1 ng/mL 미만, 예컨대 1.0 ng/mL 미만이어야 하는 것으로 여겨진다.

적절하게는 치료되는 질환은 ALS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병 및 기타 시누클레인병증 및 타우병증, 예컨대 파킨슨병 치매 및 전두측두엽 치매 및 다른 치매, 및 신경독성 단백질 응집의 연령 관련 증가 및/또는 증가된 산화성 스트레스 또는 자가포식 (손상된 세포 구성성분을 제거하기 위한 세포 메카니즘)의 결함과 연관될 수 있는 기억 상실 병태이다. 상기 각각은 본 발명에 의한 치료에 대해 본원에 개별적으로 개시되어 있다. 현재는 상기 질환 각각은 본원에 기재된 바와 같은 매우 저 용량의 타크롤리무스를 사용하여 치료하는 것이 바람직하다.

타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체 둘 다 산화성 스트레스를 경감시키고 자가포식을 촉진한다는 점은 이러한 질환의 치료용으로 특히 유리하다.

본 발명에서 타크롤리무스를 사용하는 것이 현재 바람직하다. 그러나, 또한 타크롤리무스의 밀접한 구조적 유사체를 사용할 수 있다. 이러한 유사체는 C₁ 내지 C₁₇, C₁₉, C₂₀ 및 C₂₂ 내지 C₃₄의 타크롤리무스의 구조를 보유하나 C₁₈ 및/또는 C₂₁에서 변형될 수 있게 한다. 이러한 변형은 C₁₈ 또는 C₂₁ 중 어느 하나 상의 하나의 수소 원자가 C_1-4 알킬, C_2-4 알케닐, 히드록실 또는 메톡실 기에 의해 치환될 수 있게 하는 것을 포함하고 또한 C₂₁프로페닐 기를 수소 원자, C_1-6 알킬 기, 기타 C_2-6 알케닐 기, 히드록실 기 또는 메톡실 기로 대체하는 것을 포함한다. 특정 적절한 화합물은 C₂₁ 위치가 변형되는, 예를 들어 C₂₁ 프로페닐 기가 메틸 기, 에틸 기 또는 프로필 기로 대체되는 타크롤리무스의 유사체를 포함한다. 기타 적절한 화합물은 C₁₈ 수소 원자가 히드록실 기에 의해 대체되는 유사체를 포함한다. 특정의 이들 화합물, 예를 들어 C₂₁ 프로페닐 기가 메틸 기에 의해 대체되는 유사체 또는 C₁₈ 수소가 히드록실 기에 의해 대체되는 유사체 (예를 들어 C₂₁프로페닐 기가 변화되지 않거나 메틸, 에틸 또는 프로필 기에 의해 대체되는 유사체)는 타크롤리무스보다는 덜 면역억제성이다. 미국 특허 번호 5,376,663은 타크롤리무스의 유사체의 제조 방법을 개시한다. 타크롤리무스의 C₂₁프로페닐 기는 또한 플루오로 C_1-6 알킬 기, 예컨대 2-플루오로에틸 기에 의해 또는 상이한 프로페닐 기, 예컨대 1-메틸 에테닐 기에 의해 대체될 수 있다.

용어 "면역억제를 유발하지 않는"은 면역억제의 주된 부작용이 통상 일어나지 않음을 나타낸다. 이는 환자에서 TNFα 수준을 실질적으로 저하시키지 않는 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체의 용량을 사용함으로 인한 것이다. 70 kg 성인에서 이러한 화합물의 1일에 1.3 mg 미만의 용량 (다른 체중에 대해 비례하는)은 면역억제를 야기하지 않는 것으로 간주될 수 있다고 여겨진다. 그러나, 개개 개체의 변화 때문에 통상의 기술자는 상기에 나타낸 바와 같은 혈액 수준을 지침으로 삼을 것이다.

따라서, 70 kg 환자에 대해 사용될 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 최대 1일 용량은 1.3 mg (다른 체중에 대해 비례하는)일 것이고 보다 적절하게는 1.0 mg 이하, 유리하게는 0.9 mg 이하의 용량이 70 kg 환자에게 사용될 것이며, 예를 들어 0.75 mg 이하의 용량 (다른 체중에 대해 비례하는)이 임의의 날에 사용될 것이고 목적하는 효과 및 부작용 간의 더 넓은 분리를 제공할 것이다.

동일한 기본 메카니즘을 포함하는 것으로 생각되는 병태에 관한 연구는, 용량을 증가시키는 것이 일부 치료에서 유효성의 감소를 유발할 수 있음에 따라 1일에 0.6 mg 이하, 예를 들어 1일에 0.5 mg 이하, 예컨대 1일에 0.3 ㎍의 용량이 특히 적절할 수 있음을 나타낸다.

연구는 1일에 0.05 mg 이상의 용량의 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체가 적절할 것이고 1일에 0.1 mg 이상의 용량이 일부 경우에, 예를 들어 1일에 0.15 mg 이상의 용량이 유리할 수 있음을 시사한다.

따라서, 70 kg 환자에 적절한 1일 용량 (다른 체중에 비례하는 용량으로)은 0.05 mg, 0.075 mg, 0.1 mg, 0.125 mg, 0.15 mg, 0.175 mg, 0.2 mg, 0.225 mg, 0.25 mg, 0.275 mg, 0.3 mg, 0.325 mg, 0.35 mg, 0.375 mg, 0.4 mg, 0.425 mg, 0.45 mg, 0.475 mg, 0.5 mg, 0.525 mg, 0.55 mg, 0.575 mg, 0.6 mg 및 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775,0.8, 0.825, 0.85, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1.0, 1.025, 1.075 및 1.2의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체 (예를 들어 타크롤리무스)를 포함한다. 활성제의 용량은 예를 들어 별개의 단위 용량, 예컨대 정제 또는 캡슐로서 적절하게는 경구 투여된다.

투여 제공의 편의를 위해 의사는 유리하게는 환자 군에 걸쳐 고정 용량의 타크롤리무스를 사용하기를 바랄 수 있다. 따라서, 본원에는 0.05 mg 내지 0.65 mg의 타크롤리무스, 예컨대 0.1 mg 내지 0.5 mg의 타크롤리무스, 예를 들어 0.15 mg 내지 0.4 mg의 타크롤리무스, 예컨대 0.2 mg 내지 0.35 mg의 타크롤리무스, 특히 0.3 mg의 타크롤리무스를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 병태 (및 특히 ALS, 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 호지킨병)를 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물이 제공된다. 이러한 용량은 적절하게는 1일 1회 이하로 바람직하게는 경구 투여된다.

뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 있어서 그의 유익한 효과를 제공하는 타크롤리무스 및 그의 밀접한 구조적 유사체의 후성적 작용 메카니즘 때문에, 1일에 1회 미만, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일 또는 그 초과에 1회의 투여 주기로 유리한 결과가 수득될 수 있다. 매일과 별도로 환자 각각에 특히 적합한 간격은 격일로, 1주에 1회, 10일마다 1회, 1개월에 3회, 2주에 1회 또는 1개월에 1회를 포함할 수 있다.

용량에 대한 이전 논의로부터, 통상의 기술자는 본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간에게 유효량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함하며, 여기서 용량은 0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg인, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다는 것을 이해할 것이다.

유사하게, 본 발명은 0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg의 용량으로 1일 1회 투여되는, 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 제공한다.

유사하게 본 발명은 0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 함유하는 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환 치료용 의약의 제조에 있어서 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체의 용도를 제공한다.

일반적으로 0.013 mg/kg 이하, 예를 들어 0.01 mg/kg 이하를 사용할 것이다. 적절하게는 0.0085 mg/kg 이하, 예컨대 0.007 mg/kg 이하를 사용할 것이다.

일반적으로 0.0014 mg/kg 초과, 예를 들어 0.002 mg/kg 초과를 사용할 것이다.

0.0014 mg/kg 내지 0.0085 mg/kg, 예를 들어 0.002 mg/kg 내지 0.007 mg/kg의 타크롤리무스를 사용하는 것이 특히 적합한 것으로 현재 간주된다.

이러한 용량은 상기 환자에서 사용되는 용량과 매우 상이함을 인식할 것이다.

본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간에게 자가포식의 증진 및/또는 산화성 스트레스의 감소를 야기하는 후성적 변형을 가져오는 유효량의 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

유사하게, 본 발명은 자가포식의 증가 및/또는 산화성 스트레스의 감소를 야기하는 후성적 변형을 가져오는 양의 1일 1회 이하의 투여에 의해 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 제공한다.

유사하게, 본 발명은 1일에 1회 이하의 투여에 의해 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한, 자가포식의 증가 및/또는 산화성 스트레스의 감소를 야기하는 후성적 변형을 가져오는 양의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 함유하는 의약의 제조에 있어서 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 용도를 제공한다.

사용되는 용량 및 용량 일정은 상기에 명시된 바와 같을 수 있다.

추가 측면에서 본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 0.05 mg 내지 1.3 mg의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체 및 그의 제약상 허용되는 담체를 함유하는 단위 용량 제약 조성물을 제공한다.

질환은 상기에 명시된 바와 같이, 예를 들어 ALS일 수 있다.

단위 용량은 1.2 mg 이하, 유리하게는 0.75 mg 이하, 예를 들어 0.6 mg 이하, 예컨대 0.4 mg 이하 용량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체, 바람직하게는 타크롤리무스를 함유할 수 있다.

단위 용량은 0.06 mg 이상, 유리하게는 0.1 mg 이상, 예를 들어 0.15 mg 이상의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체, 바람직하게는 타크롤리무스를 함유할 수 있다.

타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체는 용매화물, 예컨대 수화물 또는 알코올레이트일 수 있다. 적절하게는 타크롤리무스는 수화물, 예컨대 1수화물로서 사용될 수 있다 (중량이 본원에서 언급되는 경우, 이들은 용매화 분자의 중량을 포함하지는 않는다).

단위 용량은 상기에 제시된 특정의 양 중 어느 하나를 함유할 수 있다.

현재는 단위 용량이 타크롤리무스를, 예를 들어 타크롤리무스 1수화물로서 함유하는 것이 바람직하다.

원하는 경우 기존 시판품, 예컨대 프로그라프®를 구매할 수 있고 그의 함량을 목적하는 용량을 생성하도록 분할한 다음에 이를 경구 투여용 경질 젤라틴 캡슐에 위치시킬 수 있다.

단위 용량은 주사에 의한 투여에 적합할 수 있지만 바람직하게는 단위 용량은 경구 투여에 적합하다. 단위 용량은 액체, 예를 들어 용기 중의 용액 또는 현탁액일 수 있지만, 비-액체 중 단위 용량인 것이 바람직한 것으로 간주된다. 적합한 고체 단위 투여 형태는 정제 및 캡슐을 포함하며 이중에 캡슐이 더 적절하다. 숙련된 제약 화학자는 단위 용량의 기본 제제에 대해 타크롤리무스를 함유하는 제약 조성물을 수십년간 연구하였다.

일부 경우에, 제약 조성물은 경구 투여용으로 제제화된다. 일부 경우에, 조성물은 적합한 비히클 중 화합물의 현탁액을 포함한다. 경구 투여용 비히클의 비제한적 예는 포스페이트-완충 염수 (PBS), 5% 수중 덱스트로스 (D5W) 및 시럽을 포함한다. 조성물을 제제화하여 저장 및 투여의 기간의 걸쳐 용량의 컨시스턴시를 안정화할 수 있다. 일부 경우에 조성물은 희석제, 예컨대 물, 염수, 및 완충제 (허용되는 가용화제를 임의로 함유)에 용해된 활성 화합물의 용액일 수 있다. 바람직한 형태로, 조성물은 고체 투여 형태를 포함한다. 일부 경우에, 고체 투여 형태는 캡슐, 캐플릿, 로젠지, 사쉐, 또는 정제를 포함한다. 일부 경우에, 고체 투여 형태는 액체-충전 투여 형태이다. 일부 경우에, 고체 투여 형태는 고체-충전 투여 형태이다. 일부 경우에, 고체 투여 형태는 고체-충전 정제, 캡슐, 또는 캐플릿이다. 일부 경우에, 고체-충전 투여 형태는 분말-충전 투여 형태이다. 일부 경우에, 고체 투여 형태는 화합물을 미분화 입자, 과립 또는 미세캡슐화제의 형태로 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 계면활성제를 함유할 수 있는 에멀젼을 포함한다. 일부 경우에, 고체 투여 형태는 락토스, 소르비톨, 말티톨, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 미세결정질 셀룰로스, 히드록시 프로필 셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카르멜로스 소듐, 탈크, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 제약상 허용되는 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제, 향미제, 담체, 및 결합제 중 하나 이상을 포함한다.일부 경우에, 고체 투여 형태 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 고체 투여 형태는 고체 투여 형태 또는 향미제의 제조, 가공 또는 안정성을 촉진하는 하나 이상의 물질을 포함한다.

이러한 제제를 고려하는 경우 통상의 기술자는 일반적으로 저 용량 제약의 제제화의 기술 및 타크롤리무스의 제제화의 기술에서의 수년간의 경험을 요구할 수 있다.

상기에 명시된 바와 같이 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 초과로 투여하지 않는 것이 통상적이며 매우 바람직하다. 그러나, 훨씬 덜 바람직한 측면에서, 본 발명은 또한 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체를 1일 2회 투여 (2회 분할 용량으로서)하도록 변형된 상기에 정의된 바와 같은 방법 및 용도를 제공한다.

약동학 분석은 출원인에 의해 수행되었다. 마우스에서의 2 mg/kg/일의 용량은 70 kg 사람에 대한 인간 경구 용량 0.44-0.33 mg/일에 상응하는 것으로 밝혀졌다. 타크롤리무스에 의해 생성된 효과의 마우스 연구로부터의 바람직한 용량 효과는 특히 효과적인 것으로서 1-0.4 mg/mL의 혈액 수준으로 70 kg 사람에 대해 0.22-0.16 mg/일의 경구 용량을 나타냈다.

추가 측면에서 본 발명은 뉴런 세포에서의 단백질 응집체의 침착을 특징으로 하는 질환의 치료에서 사용하기 위한, 0.05 mg 내지 1.2 mg의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체 및 그의 제약상 허용되는 담체를 함유하는 단위 용량 제약 조성물을 제공한다.

적합하게는 질환은 ALS일 수 있다. 적합하게는 질환은 파킨슨병일 수 있다. 적합하게는 질환은 알츠하이머병일 수 있다. 적합하게는 질환은 헌팅톤병일 수 있다.

단위 용량은 0.9 mg 또는 0.75 mg 이하, 예를 들어 0.65 mg 이하, 예컨대 0.5 mg 이하 또는 0.45 mg 이하 용량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체, 바람직하게는 타크롤리무스를 함유할 수 있다.

이러한 단위 용량은 본원에 기재된 바와 같은 투여용, 특히 경구 투여용일 수 있다.

단위 용량은 0.05 mg 이상, 유리하게는 0.1 mg 이상, 예를 들어 0.15 mg 이상의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체, 바람직하게는 타크롤리무스를 함유할 수 있다.

따라서, 적절하게는 단위 용량은 0.05 mg 내지 0.9 mg, 예를 들어 0.1 mg 내지 0.75 mg, 예를 들어 0.15 mg 내지 0.6 mg 또는 0.15 mg 내지 0.5 또는 0.45 mg의 타크롤리무스를 함유할 수 있다. 이러한 단위 용량은 경구 투여용으로, 예를 들어 정제 또는 바람직하게는 캡슐로서 적합하게 할 수 있다.

골다공증의 치료용으로 타크롤리무스의 바람직한 1일 용량은 0.05 내지 0.65 mg, 예를 들어 0.1 mg 내지 0.5 mg, 예컨대 0.15 mg 내지 0.45 mg, 예를 들어 0.3 mg인 것으로 현재 예상된다. 이러한 용량은 적절하게는 경구 투여되고, 바람직하게는 1일에 1회 이하 예를 들어, 본원에 기재된 단위 용량을 사용하여 1일 1회 투여된다.

본원에서의 실시예는 타크롤리무스의 효과가 효모, 웜 및 포유동물에서 발생하는 것을 나타내며 이는 산화성 스트레스 및 자가포식을 가져오는 그의 능력이 진화적으로 보존됨을 나타내는 것이다. 따라서, 인간 질환이 마우스를 포함한 다른 종에서와 동일한 방식으로 타크롤리무스 (및 밀접한 구조적 유사체)로 치료가능하게 될 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 본원에서 RDC5의 언급은 타크롤리무스에 대한 것이다.

실시예 1 타크롤리무스에 의한 응집체의 클리어런스의 입증

알파-시누클레인 (A30P) 발현 효모를 사용하여 응집체 증진 및 생존율에 대한 그의 효과를 모델링하였다. 효모 배양물을 정지상으로 성장시키고 숙성시켰다 (제0일). 생존율 측정을 후일에 여러가지 시누클레인 카세트를 발현시키는 균주 중에서 및 도 1에 도시된 바와 같은 다양한 처리 하에 행하였다. 그의 출발 생존율의 50%에 이르는 다양한 배양에 걸리는 시간 (일)을 계산하였고 (도 2에서의 평균 수명) 생존율에 대해 개입의 효과의 일반 척도로서 사용하였다. a-시누클레인-A30P의 독성 효과는 평균 수명을 50% 초과로 감소시켰다 (도 2 또는 p대조군 (도 1에서)을 p-GFP-asyn-A30P (도 1에서 DMSO 처리)와 비교함으로써). DMSO를 타크롤리무스 처리 배양물 발현 p-GFP-asyn-A30P 카세트와 비교하는 것에 의하면 RDC5 처리가 p-GFP-asyn-A30P 발현이 배양물에 미치는 네거티브 효과를 개선할 수 있는 것으로 나타났다.

이들 세포의 현미경 검사에 의하면 타크롤리무스 처리가 또한 도 3에 도시된 바와 같이 가시적인 p-GFP-asyn-A30P 응집체를 갖는 세포의 수를 감소시킬 수 있었던 것으로 나타났다.

실시예 2 타크롤리무스는 폴리q (HD) 독성을 개선시킨다

그 다음에 타크롤리무스를 다양한 신경변성 질환과 연관된 응집하기 쉬운 단백질을 발현시키는 다수의 웜 모델에서 시험하였다.

웜 (씨. 엘레간스) 생존율을 배양물을 동시화하고 이를 숙성시킴으로써 검정하였다. 소정의 집단 중의 각각의 웜을 이를 수동으로 머리를 두드리고 움직임에 대해 지켜봄으로써 생존율에 대해 시험하였다. 매일 기준으로 반복하여 하기에 나타낸 바와 같은 생존율 (생활 수명) 곡선을 결정하였다.

응집하기 쉬운 폴리 Q-YFP 단백질은 헌팅톤병에서의 병원성 단백질과 관련된다. 웜에서 발현되는 경우 이는 웜 수명을 상당히 단축시켰다 (흑색 곡선을 청색 곡선과 비교하여). 타크롤리무스는 또한 독성 폴리Q 단백질 발현 웜의 평균 수명을 WT의 것에 매칭시키는 수명 프로파일로 복원하는 것이 가능하였다 (도 4 참조).

타크롤리무스 처리 웜을 그의 연령 매칭 대조군에 현미경적으로 비교하여 각각의 웜에 대한 평균 응집 피크 강도를 두 집단에서 응집이 어느 정도로 일어나는지의 척도로서 측정하였다. 타크롤리무스 및 대조군 처리 웜에서의 폴리Q 응집체의 수 및 강도를 또한 조사하였다 (도 5 참조).

비록 타크롤리무스 처리 웜에서 어떤 더 적은 수의 피크도 없긴 하지만, 피크 강도가 상당히 더 낮았는데, 이는 그들의 형성 속도가 감소하거나 용해 속도가 촉진됨을 나타내는 것이다 (도 5 참조).

실시예 3 타크롤리무스는 알파-시누클레인 (PD) 독성을 개선시킨다

알파-시누클레인은 파킨슨병의 병리학에 관련된 응집하기 쉬운 단백질이다. A-syn 발현 웜은 이들 응집체의 독성으로 인해 수명이 단축되었다. 타크롤리무스는 독성 알파-시누클레인을 발현시키는 웜의 평균 수명을 19%까지 상당히 개선시키는 것이 가능하였다. 이를 도 6에 도시하였다.

실시예 4 타크롤리무스는 SOD1 (ALS) 독성을 개선시킨다

돌연변이체 SOD1은 특정 유형의 ALS의 병리학에 관련된 응집하기 쉬운 단백질이다. 웜을 발현시키는 돌연변이체 SOD1 (127X)은 이들 응집체의 독성 및 산화성 스트레스의 후속 증가로 인해 수명이 단축되었다 (흑색 프로파일을 청색 프로파일과 비교하여). 타크롤리무스는 SOD1의 독성 응집체를 발현시키는 웜의 평균 수명을 37%까지 상당히 개선시키는 것이 가능하였다. (흑색 프로파일을 적색 프로파일과 비교하여). 이를 도 7에 도시하였다.

실시예 5 자가포식의 입증

타크롤리무스는 씨. 엘레간스를 발현시키는 SOD1의 생존율 (수명)을 개선시키는 것으로 나타났지만 (실시예 4에 나타낸) 기능적 자가포식을 필요로 한다. bec-1는 자가포식의 필수적인 구성성분이다. bec-1의 RNAi 녹다운을 사용함으로써 자가포식은 그의 수명 연장을 위해서는 타크롤리무스가 필요하고 따라서 자가포식은 응집체의 독성을 감소시키는데 있어서 타크롤리무스에 대한 MOA의 일부이다.

bec-1은 포유동물 자가포식 단백질 Atg6/Vps30/Beclin1의 씨. 엘레간스 오르토로그를 코딩하며; 상동성에 의해, BEC-1은 전자가포식소체 구조에 자가포식 단백질을 국재화시키는데 역할을 하는 부류 III 포스파티딜이노시톨 3-키나제 복합체의 일부일 수 있다.

도 8에 도시된 바와 같이, SOD1 돌연변이체 (AM263)를 발현시키는 웜은 대조군 웜과 비교하여 상당한 수명 감소를 나타낸다 (이전 섹션 참조). 타크롤리무스는 돌연변이체의 독성 효과를 감소시키는 것이 가능하고 감소된 생존율 표현형을 개선시키는 것이 가능하였다.

SOD1 돌연변이체 배경에서의 bec-1의 RNAi 녹다운은 수명을 더욱 더 감소시켰다 (황색과 오렌지색 곡선을 비교하여). 그러나, bec-1이 녹아웃되는 경우 (오렌지색 곡선을 연한 회색 곡선과 비교하여) 타크롤리무스가 수명 프로파일을 개선시키는 것은 (이전에서와 같이) 불가능하였다.

이는 타크롤리무스가 자가포식을 사용하여 수명 표현형을 개선시킨다는 것을 입증하는 것이며, 이는 자가포식이 RDC5의 작용 방식 (MOA)의 부분임을 나타내는 것이다.

실시예 6 타크롤리무스는 포유동물 세포에서 SOD1 독성을 개선시킨다

SOD1-G93A (가족성 ALS를 유발하는 것으로 공지된 돌연변이)를 발현시키는 NSC-34 세포 및 대조군 벡터를 24시간 동안 100 ng/ml의 타크롤리무스로 처리하거나 대조군 처리하였다.

그 다음에 세포를 트립판 블루의 배제 불능을 사용하여 사망률에 대해 평가하였다. 세포가 그의 세포질로부터 트립판 블루를 배제시킬 수 없다면, 세포는 사멸 또는 사멸중인 것으로 분류된다. 따라서 트립판 블루를 축적하는 세포의 집단의 비율이 낮다는 것은 사멸 또는 사멸중인 세포가 더 적다는 것을 가리키는 것이다.

도 9에 도시된 바와 같이, 대조군 처리된 WT SOD1을 발현시키는 세포주는 그의 세포 중 대략 15%가 트립판 블루를 배제시킬 수 없었다. 이는 SOD1의 병원성 G93A 돌연변이체 형태를 발현시키는 세포주에서 40%로 증가하였는데, 이는 이들 세포의 더 큰 비율이 사멸 또는 사멸중임을 나타내는 것이다. 이는 SOD1의 병원성 대립유전자는 세포사를 유도한다고 하는 문헌에서 행해진 이전 관찰을 확인해 준다.

이 세포주를 100 ng/ml RDC5로 처리한 경우 트립판 블루를 배제시킬 수 있는 세포의 비율은 25%로 하락하였는데, 이는 더 적은 수의 타크롤리무스 처리 세포가 그의 대조군 처리 등가물과 비교하여 사멸 또는 사멸중임을 나타내는 것이다.

실시예 7 효모 및 Hela 세포에서의 산화성 스트레스 저항성에 미치는 타크롤리무스 효과의 입증

산화성 스트레스는 또한 많은 신경변성 질환에서의 중요한 원인 인자이다. 타크롤리무스가 어떻게 산화성 스트레스를 감소시키고 어떻게 그렇게 할 수 있는지를 확인하기 위해 하기 실험을 계획하였다.

효모에서의 산화성 스트레스 저항성

명시된 바와 같이 처리된 3일령 효모 배양물을 2개로 분할하여, 하나는 과산화물로 처리하였다. 배양물 둘 다를 생존율에 대해 검정하였다. 도 10에 제시된 데이터를 각각의 군에 대해 비-과산화물 처리 배양물의 생존율으로 나눈 과산화물 처리 배양물의 생존율으로서 표기하였다.

요컨대, 도 10에 도시된 결과 중에서, 타크롤리무스 처리는 3일령 효모 배양물에서 과산화물 내성 (과산화물은 산화성 스트레스에 대한 대용품으로서 사용됨)을 증가시켰다.

효모에서 산화성 스트레스 저항성에 대한 MOA

대조군 또는 타크롤리무스로 처리된 효모 세포에서의 전사체 수준을 비교하여 산화성 스트레스에 대한 저항성이 개선된 RDC5로 처리된 세포를 야기할 수 있는 유전자 발현에서의 차이를 밝혀냈다.

도 11에서의 두 차트에 도시된 데이터는 과산화물 및 RDC5 처리 하에 효모에서의 유전자 발현 수준을 비교한다. 타크롤리무스는 초산화물을 포함한 과산화물로 처리한 바와 같은 유사한 세트의 유전자의 전사를 유도하였다.

이는 타크롤리무스가 산화성 스트레스를 취급하기 위한 세포의 자연 메카니즘을 촉진함을 입증하는 것이다.

인간 세포에서 타크롤리무스 및 Ox 스트레스

그 다음에 또한 RDC5 처리 하에 Hela 세포 유전자 발현 패턴을 분석하여 RDC5 또는 대조군 처리 하에 SOD1의 발현 및 SOD2 유전자 발현을 관찰하였다.

도 12에서의 결과는 타크롤리무스로 처리된 Hela 세포가 더 높은 수준의 SOD1 및 SOD2 전사체를 가짐을 나타냈으며, 이는 타크롤리무스로 처리된 인간 배양 세포가 효모에서와 같이 산화성 스트레스 저항성이 개선되었음을 시사하는 것이다.

실시예 8 마우스 모델

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WT 노화 마우스를 사용하여 노화 마우스 뇌에서 타우 및 a-시누클레인의 내인성 응집체의 자연 축적 (이는 인간에서 질환 진행에 관련되는 것으로 생각되어 진다)을 연구하였다. 결과를 도 13에 도시하였다.

IHC에 의해 측정된 바와 같은 포스포-타우 및 α-시누클레인 국재화의 영상을 컴퓨터적으로 분석하였다. 선조체에서 α-시누클레인 및 포스포-타우 병소 둘 다의 강도의 연령으로 인한 증가는 0.5 mg/kg/일 타크롤리무스를 이용한 처리에 의해 감소될 수 있었다. 비록 연령 의존적이진 않긴 하지만, 0.5 mg/kg/일로 처리함으로써 흑색질에서 포스포-타우 병소의 강도가 감소될 수 있었다. 흑색질에서의 α-시누클레인의 연령으로 인한 증가 및 시상에서의 포스포-타우 병소 강도는 여기서 시험된 타크롤리무스의 어떤 양으로 처리하여도 감소될 수 없었다. 시상에서의 α-시누클레인 병소 강도는 연령에 의해서도 또는 타크롤리무스 처리에 의해서도 영향을 받지 않았다. 이 데이터는 타크롤리무스 처리가 신경활성일뿐만 아니라 포스포-타우 및 α-시누클레인 국재화에도 영향을 미침을 시사하는 것이다.

이는 0.5 mg/kg/일 타크롤리무스가 단백질 응집체의 응집을 예방하는데 더 많은 용량, 예컨대 8 mg/kg/일 또는 2 mg/kg/일보다 우세한 효과를 나타냈음을 입증하는 것이다.

평균 및 S.E.M. 오차 막대를 이용한 image_read.m 프로그램에 의해 분석한 데이터는 도 14에 명시된 바와 같은 군에 대해 플롯팅하였다. 12개월 대조군으로부터의 유의한 편차 (p<0.05 t-검정 결과에 의해 평가된 바와 같이)는 도시된 바와 같이 표시되었다 (명시되지 않는 한 유의하지 않음).

이는 다시 0.5 mg/kg/일 타크롤리무스 용량의 효과가 2 mg/kg/일 또는 8 mg/kg/일에서의 효과보다 크다는 것을 입증하는 것이다.

실시예 9 타크롤리무스의 밀접한 구조적 유사체의 효과

도 15에 도시된 수명 플롯은 아스코마이신 (21-에틸 유사체)이 타크롤리무스 만큼 효과적으로 웜의 수명을 연장시키는 것이 가능함을 나타낸다. 도 15에서의 이 플롯은 또한 타크롤리무스의 상이한 공급원이 아마도 공급원의 품질로 인해 웜에서의 수명을 연장시키는데 있어서 다양한 효능을 갖는다 (시그마(Sigma) 대 에비타(Evita))는 것을 나타낸다.

도 16에 도시된 수명 플롯은 디히드로타크롤리무스 (21-프로필 유사체)가 거의 타크롤리무스 만큼 효과적으로 웜의 수명을 연장시키는 것이 가능함을 나타낸다. 이러한 플롯은 또한 RDC5의 상이한 공급원이 웜에서의 수명을 연장시키는데 있어서 다양한 효능을 갖는다 (시그마 대 에비타)는 것을 나타낸다.

도 15 및 16에 제시된 이 데이터는 매우 저 용량의 타크롤리무스가 그의 효과를 나타내는 메카니즘이 또한 밀접한 구조적 유사체, 예컨대 디히드로타크롤리무스 및 타크롤리무스의 21-에틸 유사체에서 나타남을 입증하는 것이다.

실시예 10 뉴런 재생

시험의 개요

1 mg/kg/일 RDC5 또는 비히클을 18개월 암컷 피셔(Fisher) 래트에게 6-OHDA 주입 후 3주에 시작하여 1주 6일 피하 (s.c.) 투여하고 종점 (대략 6개월)까지 계속하였다. 래트의 거동 장애를 암페타민 유도 회전 비대칭 검정에 의해 평가하였으며 이 검정은 6-OHDA 병변화 후 2주부터 시작하여 2개월 마다 추적 기간의 종료까지 (대략 6개월) 계속하였다. HPLC를 사용하여 신경 샘플에 대해 도파민 및 그의 사후 대사산물의 수준을 측정하였다. 뇌의 비-병변화된 측으로부터 뇌 절편의 조직학을 사용하여 p-타우 및 알파-시누클레인의 연령-관련 축적뿐만 아니라 도파민작동성 뉴런 세포 계수를 조사하였다. 3개월 도태 n=5, 6개월 도태 n=20.

회전 비대칭 검정

한 연구에서, 노화 래트를 6-OHDA로 비대칭적으로 병변화하고, 병변화 후 2주 및 2, 4 및 6개월에 암페타민 유도된 회전 비대칭 검정에 의해 거동으로 평가하였다. 병변화된 동물에서는 병변의 측을 향해 자발적으로 회전하는 경향이 있다 (즉 뇌의 좌측에 병변화된 경우 시침 방향 회전 마이너스 반시침 방향 회전 (CW-CCW)이 양의 값이다). 이는 동측 움직임으로 공지되어 있다. 병변화의 효과가 신경-재생 화합물로의 처리를 통해 감소되는 경우, CW-CCW는 대조군 처리 연령-매칭 대조군보다 0에 더 인접하여야 하며, 즉 동측 움직임의 정도가 감소한다.

본 연구에서, 도 17에 도시된 바와 같이, 래트의 두 군 모두 (대조군 및 RDC5 처리)를 처리 전 (15일)에 평가하였고 자발 회전에서 어떤 유의한 차이도 나타나지 않았으며 CW-CCW는 대략 2500이었다. 이는 처리 전에 두 군 간의 어떤 차이도 없었음을 나타내는 것이다. 검정을 2, 4 및 6개월 시점에서 반복한 경우, 대조군과 RDC5 처리군 간의 차이는 점차 커졌으며, RDC5 처리 래트는 점차 동측 회전을 덜 나타냈다. 그에 반해서, 대조군 처리 래트는 동측 움직임에서 어떤 유의한 감소도 나타내지 않았다. 이 경향의 결과는 6개월 시점까지 대조군에 비해, RDC5 처리 래트에서 동측 움직임에서의 상당한 감소이다. 이는 RDC5가 신경-재생을 촉진하는 것이 가능함을 시사하는 것이다.

p-타우 및 α-시누클레인의 IHC 분석

IHC를 사용하여 래트로부터의 뇌 절편에서 α-시누클레인 및 포스포-타우 응집체를 함유하는 세포의 분획뿐만 아니라 응집의 패턴을 평가하였다. 결과를 도 18에 도시하였다.

데이터를 평균 + SEM으로서 제시하였다. 비히클 3개월, n = 3; 비히클 6개월, n = 6; RDC5 1 mg/kg 3개월, n = 5; RDC5 1 mg/kg 6개월, n = 5. 스튜던트 t-검정을 사용하여 비히클 대 RDC5 데이터를 분석하였다.

도 18에 도시된 바와 같이, RDC5 1 mg/kg 3개월 군은 대조군 처리보다 p-타우 및 α-시누클레인 양성 세포 둘 다의 상당히 더 낮은 계수를 나타냈다.

이 데이터는 RDC5가 신경변성 장애, 예컨대 파킨슨병 및 알츠하이머병을 기반으로 한 응집체의 처리에 유익하다는 것과 일치되는 것이다.

연구 (티로신 히드로일라제로 염색)는 효과가 증가하는 도파민 수준에 의해 생성된 것이 아님을 나타냈다.

실시예 11

단위 용량

경질 젤라틴 캡슐을 하기 조성물로 채웠다:

0.3 mg의 타크롤리무스를 함유하는 상기에서와 같은 하나의 캡슐을 건강한 인간 지원자 (수)에게 3일 연속으로 매일 투여하였다. 투여의 결과로서 혈액 TNF-α 수준에서의 어떤 유의한 변화도 일어나지 않았다. 유사하게, 건강한 지원자에게 타크롤리무스를 매일 0.6 mg 투여한 결과로서 TNF-α 수준에서의 어떤 변화도 일어나지 않았다. 관찰된 타크롤리무스의 평균 최저 수준 (각각의 용량의 투여의 24시간 후의 수준)은 대략 220 pg/mL이었다. 관찰된 타크롤리무스의 평균 피크 수준은 대략 3700 pg/mL이었고 평균 곡선하 면적은 대략 AUC O_t = 23500 (h*pg/mL)이었다.

상기 캡슐을 사용하여 상기에 기재된 처리를 제공할 수 있다.

0.6의 단일 용량을 동시에 제공하는 2개의 이러한 캡슐의 사용은 약 440 pg/mL의 최저 수준을 유발할 것으로 예상될 것이다.

실시예 12

타크롤리무스에 대한 용량 최적화

이하에 개략적으로 설명된 사실은 RDC5가 웜 수명 연장에서의 종 형상의 용량 반응으로서 조골 세포의 산화성 스트레스에 대한 반응을 생성함을 나타낸다.

이들 용량은 RDC5에 대한 효과적인 용량 범위를 정의한다.

보다 저 용량의 1 ug/ml 및 10 ug/ml가 Bus5 웜에서 CLS를 연장시키는데 가장 효과적이었다. (오염된 20 ug/ml)

저 용량의 10 ug/ml가 Bus8 웜에서 건강수명을 연장시키는데 가장 효과적이었다. 더 고 용량의 20 ug/ml 및 40 ug/ml은 평균 및 최대 수명 연장에서 10 ug/ml의 효능에는 일치하나 건강수명에서는 아니었다.

(콜라이(Coli) 음식물 공급원 및 FUDR은 수명에 영향을 미칠 수 있기 때문에 배제되었음.)

도 19에 도시된 바와 같이 웜에서의 용량 반응 -> 시험된 용량의 하한치에서의 CLS에서의 효능의 좁은 범위, 10 ug/ml이 일관되게 건강수명을 개선시키기 위한 가장 효과적인 용량이며, 심지어 보다 저 용량이 때때로 또한 효과적이고 고 용량의 40 ug/ml은 항상 최소로 효과적이었다.

Bus8 웜에서 건강수명을 위한 적은 효과적인 용량 범위, 평균 수명을 고려하는 경우 용량 반응에 대한 더 큰 범위가 있지만, 건강수명 및 평균 수명 연장 둘 다를 위해 효능은 10 ug/ml에서 피크이었다. 이를 도 20에 도시하였다.

Bus8 웜에서 다시 건강수명을 위한 적은 효과적인 용량 범위 및 평균 수명을 위한 용량 반응에 대한 더 큰 범위가 있다. 효능은 건강수명 연장을 위해서는 1 ug/ml에서 및 평균 수명 연장을 위해서는 10 ug/ml에서 피크이었다.

추가 실험에서 일수의 3분의 2에서 투여하는 것은 또한 대조군과 비교하여 수명의 상당한 증가를 생성한 것으로 측정되었고 일수의 3분의 1에서 투여하는 것은 수명의 상당한 증가를 생성한 것 (투여하는 것이 수명에서 조기에 개시되지 않은 경우는 제외)으로 측정되었다. 이는 본원에 기재된 목적하는 치료 효과가 매일 투여 미만으로 달성되는 것과 일치되는 것이다.

실시예 13 타크롤리무스는 효모 및 웜에서 노화를 지연시킨다

효모 바이오스크린은 노화 효모 배양물의 생활 수명 프로파일을 측정한다. 평균 수명은 소정의 집단의 50%가 사멸한 시간으로서 정의된다. 상대 생존율 (하기 차트에 표기됨)은 대조군 비히클 처리 배양물의 분율로서 배양물 생존율에 대한 처리 효과를 비교한다. RDC5는 성장 속도에 효과를 나타내지 않으면서 에스. 세레비지아에의 생활 수명 프로파일을 연장시키는 것을 가능하게 하는 것으로서 확인되었다.

RDC5 처리 효모 배양물은 대조군 처리 배양물보다 상당히 더 긴 평균 수명을 가졌다. 따라서 RDC5는 노화 및 연령-관련 질환, 예컨대 원치 않는 지방 축적의 개시를 지연시키는 것이 가능한 것으로 여겨진다. 수명에 대한 효과를 도 21에 도시하였다.

적어도 80개 웜의 웜 배양물을 수명의 지속기간 동안 수동으로 매일 평가하였다. RDC5는 또한 웜뿐만 아니라 효모의 집단의 건강수명 및 평균 수명을 연장시키는 것이 가능하였다.

타크롤리무스가 Bus8 배경에서 웜 수명에 미치는 효과를 도 22에 도시하였다.

10 ug/ml의 저 용량이 Bus8 웜에서 건강수명을 연장시키는데 가장 효과적이었다.

Claims

뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간에게 면역억제를 유발하지 않으며 적어도 0.05 ng/mL의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 최저 전혈 수준을 생성하는 용량으로 유효량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법.
면역억제를 유발하지 않으며 적어도 0.05 ng/mL의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 최저 전혈 수준을 생성하는 용량으로 1일 1회 이하로 투여되는, 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체.
뉴런 세포에서의 단백질 응집체의 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한, 1일에 1회 투여되는 경우에 면역억제를 유발하지 않으며 적어도 0.05 ng/mL의 최저 전혈 수준을 갖는 양의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 함유하는 의약의 제조에 있어서 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 최저 전혈 수준이 적어도 0.075 ng/mL, 적어도 0.2 ng/mL 또는 적어도 0.3 ng/mL인 방법, 화합물 또는 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 최저 전혈 수준이 1.2 ng/mL 미만, 1.1 ng/mL 미만 또는 1.0 ng/mL 미만인 방법, 화합물 또는 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 타크롤리무스를 사용하는 것인 방법, 화합물 또는 용도.
뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간에게 유효량의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함하며, 여기서 용량은 0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg인, 상기 질환을 치료하는 방법.
0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg의 용량으로 1일 1회 투여되는, 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체.
뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한, 0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 함유하는 의약의 제조에 있어서 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체의 용도.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 0.001 mg/kg 내지 0.02 mg/kg을 사용하는 것인 방법, 화합물 또는 용도.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 0.013 mg/kg 이하, 0.01 mg/kg 이하, 0.0085 mg/kg 이하 또는 0.007 mg/kg 이하를 사용하는 것인 방법, 화합물 또는 용도.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 0.0014 mg/kg 초과 또는 0.002 mg/kg 초과를 사용하는 것인 방법, 화합물 또는 용도.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 0.0014 mg/kg 내지 0.0085 mg/kg 또는 0.002 mg/kg 내지 0.007 mg/kg을 사용하는 것인 방법, 화합물 또는 용도.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 타크롤리무스를 사용하는 것인 방법, 화합물 또는 용도.
뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간에게 자가포식의 증진 및/또는 산화성 스트레스의 감소를 야기하는 후성적 변형을 가져오는 유효량의 타크롤리무스 또는 밀접한 구조적 유사체를 1일 1회 이하로 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법.
자가포식의 증가 및/또는 산화성 스트레스의 개선을 야기하는 후성적 변형을 가져오는 양의 1일 1회 이하의 투여에 의해 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체.
1일에 1회 이하의 투여에 의해 뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한, 자가포식의 증가 및/또는 산화성 스트레스의 개선을 야기하는 후성적 변형을 가져오는 양의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 함유하는 의약의 제조에 있어서 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체의 용도.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타크롤리무스를 사용하는 것인 방법, 화합물 또는 용도.
뉴런 세포에서의 단백질 응집체 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 0.05 mg 내지 1.3 mg의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체 및 그의 제약상 허용되는 담체를 함유하는 단위 용량 제약 조성물.
제19항에 있어서, 1.2 mg, 0.75 mg, 0.6 mg 또는 0.4 mg 이하의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 함유하는 단위 용량 제약 조성물.
제19항 또는 제20항에 있어서, 0.06, 0.1 또는 0.15 mg 이상을 포함하는 단위 용량 제약 조성물.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 구강 투여에 적합화된 단위 용량 제약 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 근위축성 측삭 경화증인 방법, 화합물, 제약 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 알츠하이머병인 방법, 화합물, 제약 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 파킨슨병인 방법, 화합물, 제약 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 헌팅톤병인 방법, 화합물, 제약 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 시누클레인병증 또는 타우병증인 방법, 화합물, 제약 조성물 또는 용도.
제27항에 있어서, 치매, 예컨대 파킨슨병 치매 및 전두측두엽 치매 또는 다른 치매, 및 신경독성 단백질 응집의 연령 관련 증가 및/또는 증가된 산화성 스트레스 또는 자가포식의 결함과 연관된 기억 상실 병태인 방법, 화합물, 제약 조성물 또는 용도.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 타크롤리무스를 사용하는 것인 방법, 화합물, 제약 조성물 또는 용도.
뉴런 세포에서의 단백질 응집체의 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 0.05 mg 내지 1.2 mg의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 단위 용량 경구 투여가능 제약 조성물.
제30항에 있어서, 질환이 ALS, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병인 단위 용량.
제30항 또는 제31항에 있어서, 타크롤리무스를 포함하는 단위 용량.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 0.9 mg, 0.75 mg, 0.65 mg 이하, 또는 0.5 mg 이하 또는 0.45 mg 이하의 타크롤리무스를 포함하는 단위 용량.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 0.05 mg 이상, 0.1 mg 이상 또는 0.15 mg 이상의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 포함하는 단위 용량.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 또는 캡슐의 형태인 단위 용량.
신경 세포에서의 단백질 응집체의 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 양의 타크롤리무스 또는 그의 밀접한 구조적 유사체를 포함하는 제약 조성물을 경구 투여에 의해 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법.
제36항에 있어서, 타크롤리무스를 1일에 1회 이하로 투여하는 것인 방법.