KR20160007542A

KR20160007542A - 모체 혈액으로부터의 태아 세포 포획을 사용한 태아 진단

Info

Publication number: KR20160007542A
Application number: KR1020157033713A
Authority: KR
Inventors: 한 우; 판칭 첸
Original assignee: 바세트라 메디컬 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2014-05-15
Publication date: 2016-01-20
Also published as: CN105324666B; AU2014265353A1; EP2997370A1; JP2016521134A; CN105324666A; WO2014186607A1; MX2015015687A; US20160053317A1; CA2912700A1; EP2997370A4; HK1219308A1

Abstract

비-침습성 태아 진단 방법이 제공된다. 특히, 모체 샘플로부터 태아 세포-보강 샘플을 수득하는 방법 및 모체 샘플을 태아 뉴클레오티드 서열 또는 태아 유전자의 발현에 관하여 평가하는 방법이 제공된다.

Description

모체 혈액으로부터의 태아 세포 포획을 사용한 태아 진단 {FETAL DIAGNOSTICS USING FETAL CELL CAPTURE FROM MATERNAL BLOOD}

참조로 포함된 우선권 출원

본원은 2013년 5월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 61/824,128을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

출생전 진단은 태아의 상태에 관하여 도움이 되는 정보를 제공할 수 있다. 전형적으로, 출생전 진단은 태아에 대해 위험을 제기하는 침습성 기술을 이용하여 수행된다.

보다 최근에는, 태아의 유전 물질이 모체의 순환성 혈액 내에서 발견되었다. 이러한 태아의 유전 물질은 태아에서 유래된 것이고, 태반을 통과하여 모체의 순환계 내로 유입된다.

태아 DNA의 2가지 주요 비침습성 자원은 모체의 혈장과 순환성 태아 세포이다. 태아의 유전 물질은 임신 초기 모체 혈액에서 검출될 수 있다. 몇 가지 비-침습성 진단 전략은 세포-무함유 태아 DNA를 활용하여 개발되었다. 그러나, 정량적 검정에 따르면, 태아의 DNA는 임신 초기 및 말기에 각각 총 혈장 DNA의 약 3.4% 및 약 6.2% 만을 차지한다. 이는 정확한 검정을 위한 기술적 도전과제인데, 이는 태아의 유전 정보의 절반이 부계로부터 유래되고, 이러한 정보는 모체의 DNA에 의해 압도될 것이기 때문이다. 추가로, 태아 세포-무함유 DNA는 세포막에 의해 보호되지 않기 때문에, 그 DNA 단편은 무손상 게놈과 비교해서 짧고 불완전하다. 모체 혈액으로부터의 태아 세포에 관해서는, 그들 존재의 희소성으로 인해 단리시키기가 또한 어려우며, 이는 10⁶ 내지 10⁷개 모체 세포 중 대략 1개의 태아 세포 정도로 적을 수 있다. 분석에 충분한 태아 세포를 수득하기 위해서는, 보강(enrichment) 기술을 이용한다. 그들의 적은 수로 인해, 모체 혈액 샘플로부터 태아 세포를 보강시키고 정제하는 것이 기술적 도전과제이다. 이러한 도전과제들은 궁극적으로 태아 진단 방법을 복잡하게 한다.

본 발명자들은 개선된 비-침습성 태아 진단 방법을 개발하였다. 특히, 모체 샘플로부터 태아 세포-보강 샘플을 수득하는 방법 및 모체 샘플을 태아 뉴클레오티드 서열 또는 태아 유전자의 발현에 관하여 평가하는 방법이 제공된다.

일부 실시양태에서, 모체 샘플을 제공하는 단계; 모체 샘플을, 하나 이상의 사카라이드에 대한 친화성을 갖는 제1 고정상과 접촉시키는 단계; 제1 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계; 모체 샘플을, 매트릭스 메탈로프로테이나제 14에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 단계; 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유함으로써, 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계를 포함하는, 모체 샘플로부터 태아 세포-보강 샘플을 수득하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 일부 실시양태는 모체 샘플을 상기 제1 고정상 및 상기 제1 고정상과 접촉시키기 이전에, 모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계; 및 유핵(nucleated) 태아 적혈구의 크기 및/또는 밀도를 갖는 분리된 모체 샘플의 성분을 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계는 구배 원심분리를 이용하여 수행한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 사카라이드는 갈락토스이다. 일부 실시양태에서, 제1 고정상은 렉틴-결합된 고정상이다. 일부 실시양태에서, 제1 고정상은 자기 비드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리가능하게 표지된 친화성 분자는 자기 비드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계에 이어서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 보유된 성분을, 매트릭스 메탈로프로테이나제 14에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시킨다. 일부 실시양태는 모체 샘플을, 매트릭스 메탈로프로테이나제 14 이외의 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 제2 고정상과 접촉시키는 단계; 제2 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및 제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 태아 세포 표면 마커는 트랜스페린 수용체 (CD71), 글리코포린 A (GPA), HLA-G, EGFR, 트롬보스폰딘 수용체 (CD36), CD 34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, 2,3-비오포스포글리세레이트 (BPG), 탄산 안히드라제(Carbonic anhydrase) (CA) 및 티미딘 키나제 (TK)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 태아 세포 표면 마커는 트랜스페린 수용체 (CD71)이다. 일부 실시양태에서, 모체 샘플은 모체 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 태아 세포-보강 샘플 내 세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 태아 세포이다. 일부 실시양태는 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계; 및 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계는 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포의 게놈 DNA의 서열분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA의 서열분석은 단세포의 DNA의 서열분석을 포함하며, 여기서 단세포의 DNA의 서열분석은 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포에 대해 수행한다. 일부 실시양태에서, 단세포의 DNA의 서열분석은 태아 세포-보강 샘플로부터의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 세포에 대해 수행한다. 일부 실시양태에서, 유전자의 발현은 검출가능한 항체를 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포의 표면에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계는 검출가능한 프로브를 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포의 게놈 DNA에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석한다.

또한, 모체 샘플을 제공하는 단계; 모체 샘플을, 하나 이상의 사카라이드에 대한 친화성을 갖는 제1 고정상과 접촉시키는 단계; 제1 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계; 모체 샘플을, 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 단계; 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하여, 분석용 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계; 태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 결정하는 단계; 및 태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하여, 태아 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현을 확인하는 단계를 포함하는, 모체 샘플을 태아 뉴클레오티드 서열 또는 태아 유전자 발현에 관하여 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하는 단계는, 상기 결정된 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현에 근거하여, 각각의 세포를 제1 세포 집단 또는 제2 세포 집단에 속하는 것으로서 분류하는 단계; 및 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률은, 제1 집단 및 제2 집단 각각에 대한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을, 공지된 모체 세포에 대한 공지된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현과 비교함으로써 확인되며, 여기서 공지된 모체 세포에 대해 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현의 보다 높은 유사성을 보유하고 있는 세포 집단이 모체 기원인 것으로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률은, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단의 크기를 평가함으로써 확인되며, 여기서 보다 큰 세포 집단이 태아 기원인 것으로서 확인된다.

또한, 태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 제공하며, 여기서 태아 세포-보강 샘플은 모체 샘플을 제공하는 단계; 모체 샘플을, 하나 이상의 사카라이드에 대한 친화성을 갖는 제1 고정상과 접촉시키는 단계; 제1 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계; 모체 샘플을, 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 단계; 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하여, 분석용 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 단계; 및 태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하여, 태아 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현을 확인하는 단계를 포함하는, 모체 샘플을 태아 뉴클레오티드 서열 또는 태아 유전자 발현에 관하여 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률은, 제1 집단 및 제2 집단 각각에 대한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을, 공지된 모체 세포에 대한 공지된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현과 비교함으로써 확인되며, 여기서 공지된 모체 세포에 대해 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현의 보다 높은 유사성을 보유하고 있는 세포 집단이 모체 기원인 것으로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률은, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단의 크기를 평가함으로써 확인되며, 여기서 보다 큰 세포 집단이 태아 기원인 것으로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 태아 세포-보강 샘플 제조 방법은 모체 샘플을 상기 제1 고정상 및 상기 제1 고정상과 접촉시키기 이전에, 모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계; 및 유핵 태아 적혈구의 크기 및/또는 밀도를 갖는 분리된 모체 샘플의 성분을 수거하는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계는 구배 원심분리를 이용하여 수행한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 사카라이드는 갈락토스이다. 일부 실시양태에서, 제1 고정상은 렉틴-결합된 고정상이다. 일부 실시양태에서, 제1 고정상은 자기 비드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리가능하게 표지된 친화성 분자는 자기 비드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계에 이어서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 보유된 성분을, 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 태아 세포-보강 샘플 제조 방법은 모체 샘플을, 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 제2 고정상과 접촉시키는 단계; 제2 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및 제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 태아 세포 표면 마커는 MMP14 (매트릭스 메탈로프로테이나제 14), 트랜스페린 수용체 (CD71), 글리코포린 A (GPA), HLA-G, EGFR, 트롬보스폰딘 수용체 (CD36), CD 34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, 2,3-비오포스포글리세레이트 (BPG), 탄산 안히드라제 (CA) 및 티미딘 키나제 (TK)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 태아 세포 표면 마커는 MMP14 (매트릭스 메탈로프로테이나제 14) 또는 트랜스페린 수용체 (CD71)이다. 일부 실시양태에서, 모체 샘플은 모체 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 태아 세포-보강 샘플 내 세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 태아 세포이다. 일부 실시양태에서, 태아 세포-보강 샘플 제조 방법은 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계; 및 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계는 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포의 게놈 DNA의 서열분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA의 서열분석은 단세포의 DNA의 서열분석을 포함하며, 여기서 단세포의 DNA의 서열분석은 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에 대해 수행한다. 일부 실시양태에서, 단세포의 DNA의 서열분석은 태아 세포-보강 샘플로부터의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 세포에 대해 수행한다. 일부 실시양태에서, 유전자의 발현은 검출가능한 항체를 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포의 표면에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계는 검출가능한 프로브를 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포의 게놈 DNA에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석한다.

도 1은 모체 혈액 샘플로부터 보강된 유핵 태아 적혈구를 수득하기 위한 프로토콜의 예를 도시한 것이다.
도 2는 유핵 태아 적혈구-보강된 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하기 위한 프로토콜의 예를 도시한 것이다.

이러한 태아 물질은 발육중인 태아의 성별과 유전적 구성에 관한 정보의 소스이다. 태아의 유전 물질은 임신 초기 모체 혈액에서 검출될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 모체 혈액으로부터 태아 세포를 고 순도로 단리하기 위한 효율적인 프로토콜을 포함한다. 일부 실시양태는, 예를 들어 밀도 구배 원심분리를 통하여 많은 모체 비-유핵 세포의 제거를 촉진시키는 초기 보강 단계를 포함한다. 태아 세포의 후속 정제 또는 보강은 친화성-기반 분리를 포함할 수 있다. 한 예로서, 유핵 태아 적혈구계 전구체 세포는 렉틴에 의해 포획될 수 있는, 세포 표면 상의 다수의 갈락토스 분자를 발현한다. 따라서, 대두 응집소 (SBA)와 같은 렉틴을 사용하여, 문헌 [Kitagawa et al., 2002 Prenat. Diagn 22:17-21]에 제공된 바와 같은 공지된 방법을 이용하여 유핵 태아 세포를 보강할 수 있다. 또 다른 예로서, 유핵 태아 세포는 추가의 보강을 위해 사용될 수 있는 각종 세포 표면 마커를 갖는다. 이러한 한 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제 14 (MMP14 또는 MMP-X1) 전구체 및/또는 트랜스페린 수용체 (CD71)를 사용하여, 고도로 특이적이면서도 높은 회수율로 태아 세포를 보강할 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 마커는 글리코포린 A (GPA), 트롬보스폰딘 수용체 (CD36), CD 34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3 및 에리트로포이에틴 수용체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가의 임의 단계로서, 예를 들어 CD47, CD45, CD35, CD12, CD14, CD32를 이용하는 음성 선택을 포함할 수 있는데, 이는 모체 적혈구와 특이적으로 결합함으로써, 이를 제거하기 위해 사용될 수 있다.

모체 혈액 샘플로부터 보강된 유핵 태아 적혈구를 수득하기 위한 프로토콜의 예가 도 1에 제공되어 있으며, 이는 (1) 밀도 구배 원심분리를 이용하는 크기/밀도 선택, (2) 대두 응집소를 이용하는 렉틴 선택, 및 (3) 예를 들어, 항-MMP14 항체를 이용하는 세포 표면 마커-기반 자기 비드 선택을 포함한다.

유핵 태아 적혈구-보강된 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하기 위한 프로토콜의 예가 도 2에 제공되어 있으며, 이는 (1) 유핵 태아 적혈구-보강된 샘플로부터 약 10개 내지 100개 세포를 제공하는 단계, (2) 이 세포를 96 웰 플레이트 내로 분리하여 (세포를 함유하는 웰은 상기 도면에서 녹색 웰로서 표시됨) 각 웰이 1개 또는 0개의 세포를 함유하도록 하는 단계, 및 (3) 이와 같이 분리된 세포를 대상으로 하여, 각 개별 웰에 대해 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 결정해 주는 검정을 수행하는 단계를 포함한다.

모체 샘플

하나 이상의 유핵 태아 세포를 함유하는 모체 샘플은 그에 대한 진단 또는 예후를 수행해야 하는 임의의 동물로부터 수득할 수 있거나 또는 그에 대한 진단 또는 예후를 수행해야 하는 태아를 임신한 동물로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 임신한 것으로 추정되거나, 임신 중이거나 또는 임신한 적이 있었던 암컷 동물로부터 수득할 수 있다. 이러한 동물이 인간인 경우, 상기 샘플은 임신 초기 (약 임신 첫 3개월), 임신 중기 (약 임신 4 내지 6개월) 또는 임신 후기 (약 임신 7 내지 9개월) 동안에 취할 수 있다. 본 발명의 동물은 인간 또는 가축, 예컨대 암소, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 양 또는 염소일 수 있다. 전형적으로, 수득된 샘플은 혈액 샘플이다. 다른 샘플은 질 분비물, 면봉으로 채취한 자궁경부 표본 및 뇨를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 모체 샘플, 예컨대 모체 혈액 샘플은 임신한 암컷 인간 또는 비-인간 포유류로부터 수득할 수 있고, 이를 사용하여 상기 임신한 암컷 인간 또는 비-인간 포유류 내의 태아의 상태를 조사할 수 있다.

동물로부터 모체 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플)을 수득하는 경우, 이러한 샘플의 양은 동물 크기, 그의 임신 기간 및 스크리닝하고자 하는 병태에 따라서 다양할 수 있다. 한 실시양태에서, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5 mL 이하의 샘플을 수득한다. 한 실시양태에서, 5 내지 200, 10 내지 100, 또는 30 내지 50 mL의 샘플을 수득한다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 150 mL 초과의 샘플을 수득한다. 한 실시양태에서, 약 10 내지 100 또는 30 내지 50 ml의 말초 혈액 샘플을 임신한 암컷으로부터 수득한다. 일부 실시양태에서, 혈액 샘플은 임신 36, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4주 이내 임신한 인간 또는 비-인간 동물, 또는 심지어 임신이 종료된 후의 인간 또는 비-인간 동물로부터 수득한다.

샘플 보강/정제

상기 샘플을 대상으로 하여, 샘플의 총 성분을 기준으로 하여 유핵 태아 세포를 보강시키고/시키거나 샘플 내 총 세포를 기준으로 하여 유핵 태아 세포를 보강시키는 하나 이상의 단계를 수행한다.

모체 혈액 샘플로부터 보강된 유핵 태아 적혈구를 수득하기 위한 프로토콜의 예가 도 1에 제공되어 있으며, 이는 (1) 밀도 구배 원심분리를 이용하는 크기/밀도 선택, (2) 대두 응집소를 이용하는 렉틴 선택, 및 (3) 예를 들어, 항-MMP14 항체를 이용하는 세포 표면 마커-기반 자기 비드 선택을 포함한다. 이러한 예의 방법의 변동을 본원에 제공된 교시에 따라서 수행할 수 있다.

밀도 구배 원심분리

밀도 구배 원심분리는 혼합물 중의 세포 유형의 상이한 밀도에 근거하여 세포를 분리하는 방법이다. 이러한 방법을 이용하여 세포를, 사용된 구배 물질(들)의 특이적 밀도 보다 가볍거나 무거운 세포를 함유하는 구획 내로 분리할 수 있다. 밀도 구배 원심분리는 일련의 상이한 밀도 구배에 근거한 반복 단계를 통하여 수행하거나 또는 다른 분리 방법, 예컨대 친화성 분리, 세포 패닝, 세포 분류법 등과 조합하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 밀도 구배 원심분리는 상이한 구배 밀도의 다수 층을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 방법으로, 상이한 밀도의 세포는 원심분리 후 그들의 상응하는 밀도에서 구역 또는 밴드를 형성할 수 있게 된다. 하나 이상의 상이한 구역 내의 세포는 적당한 위치에 피펫을 놓아둠으로써 수집할 수 있다. 밀도 구배 원심분리에 의해 특이적 세포-유형을 보강시키는 방법은 미국 특허 번호 5,840,502에 기재되어 있으며, 이 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

밀도 구배 원심분리를 이용하여 표본 중에서의 태아 세포를 확인하는 방법은 밀도 구배 매질을 활용한다. 이러한 밀도 구배 매질은 콜로이드성 폴리비닐피롤리돈-코팅된 실리카 [예를 들어, 페르콜D(PercolD), 니코덴즈(Nycodenz)], 단독 또는 소듐 디아트리조에이트와 조합되는 비이온성 폴리수크로스 [피콜(Ficoll)] [예를 들어, 피콜-파크(Ficoll-Paque) 또는 히스토파크(Histopaque)], 또는 그의 혼합물일 수 있다. 이용된 시약의 밀도는 기타 혈액 성분, 예컨대 비-세포성 성분 및 비-유핵 적혈구로부터 관심 유핵 태아 세포를 분리하기 위해 선택된다.

크기-기반 보강

일부 실시양태에서, 희귀 세포의 보강은 하나 이상의 크기-기반 분리 방법을 이용하여 이루어진다. 크기-기반 분리 모듈의 예는 여과 막, 분자 체 및 매트릭스를 포함한다. 본 발명에 의해 고려된 크기-기반 분리 모듈의 예는 국제 공개 번호 WO 2004/113877에 개시된 것을 포함하고, 이 공개 공보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 기타 크기 기반 분리 방법은 국제 공개 번호 WO 2004/0144651 및 미국 특허 출원 공개 번호 US20080138809A1 및 US20080220422A1에 개시되어 있으며, 이들 공개 공보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

친화성-기반 보강

일부 실시양태에서, 유핵 태아 세포는 결합 모이어티 또는 친화성 분자에 대한 그들의 친화성을 근거로 하여 보강시킬 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 결합 모이어티는 모체 샘플의 바람직하지 못한 성분으로부터의 유핵 태아 세포의 분리를 촉진시켜 주기 위해 단리가능하게 표지된다. 예를 들어, 유핵 태아 세포에 대한 친화성을 지닌 결합 모이어티는 유핵 태아 세포에 결합할 수 있고, 이를 사용하여, 고체 지지체, 예컨대 자기 비드 또는 크로마토그래피 물질의 고체 상에 결합됨으로써 유핵 태아 세포를 분리할 수 있거나, 또는 유핵 태아 세포의 검출-지원형 보강에 의해 유핵 태아 세포가 다른 샘플 성분과 구별될 수 있도록, 결합 모이어티를 검출가능하게 표지시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 친화성 방법은 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 결합 모이어티 또는 친화성 분자를 이용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티 또는 친화성 분자를 고정상, 형광단, 방사성핵종, 또는 기타 검출가능한 모이어티에 부착시킬 수 있고, 태아 유핵 세포가 상기 결합 모이어티 또는 친화성 분자와 특이적으로 결합할 수 있게 해주지만, 샘플의 다른 성분은 이러한 결합 모이어티 또는 친화성 분자와 특이적으로 결합하지 않는 조건 하에, 상기 샘플을 단리가능하게 표지된 결합 모이어티 또는 친화성 분자와 접촉시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 접촉된, 단리가능하게 표지된 결합 모이어티 또는 친화성 분자는, 예를 들어 광학 핀셋, 자기 스탠드, 밀도 원심분리기, 유동 세포측정법 및 크기 기반의 액체 크로마토그래피를 이용하여 처리하여, 단리가능하게 표지된 결합 모이어티 또는 친화성 분자에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 단리가능하게 표지된 결합 모이어티 또는 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리할 수 있다. 이와 같이 결합된 모체 샘플의 성분을 임의로 세척하여, 비-특이적으로 결합된 성분을 제거할 수 있다. 이어서, 태아 유핵 세포를 포함하는, 단리가능하게 표지된 결합 모이어티 또는 친화성 분자에 결합된 샘플의 성분을 추가의 보강 또는 분석을 위해 보유 또는 수거할 수 있다.

결합 모이어티는, 예를 들어 유핵 태아 세포와 특이적으로 결합하는 단백질, 핵산 및 탄수화물을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 모이어티는 하나 이상의 탄수화물, 예컨대 갈락토스에 대한 친화성을 갖는다. 예를 들어, 결합 모이어티는 렉틴일 수 있다. 다른 실시양태에서, 결합 모이어티는 항체이다. 이러한 결합 모이어티 항체의 예는 항-매트릭스 메탈로프로테이나제 14 (항-MMP14), 항-트랜스페린 수용체 (항-CD71), 항-글리코포린 A (항-GPA), 항-트롬보스폰딘 수용체 (항-CD36), 항-CD34, 항-HbF, 항-HAE9, 항-FB3-2, 항-H3-3, 항-에리트로포이에틴 수용체, 항-CD235a, 항-탄수화물, 항-셀렉틴, 항-CD45, 항-GPA, 항-항원-i, 항-EpCAM, 항-E-카드헤린, 항-Muc-1, 항-hPL, 항-CHS2, 항-KISS1, 항-GDF15, 항-CRH, 항-TFP12, 항-CGB, 항-LOC90625, 항-FN1, 항-COL1A2, 항-PSG9, 항-PSG1, 항-HBE, 항-AFP, 항-APOC3, 항-SERPINC1, 항-AMBP, 항-CPB2, 항-ITIH1, 항-APOH, 항-HPX, 항-베타-hCG, 항-AHSG, 항-APOB, 항-J42-4-d, 항-2,3-비오포스포글리세레이트 (항-BPG), 항-탄산 안히드라제 (항-CA), 또는 항-티미딘 키나제 (항-TK)를 포함한다.

한 실시양태에서, 유핵 태아 세포는 항-MMP14, 항-CD71 및/또는 항-GPA 선택을 이용하여 보강한다. 또 다른 실시양태에서, 영양막은 항-HLA-G 또는 항-EGFR 선택을 이용하여 보강한다. 또 다른 실시양태에서, 유핵 태아 세포는 유전자 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK로부터 발현된 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 보강한다.

고정상-기반 보강

일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 결합 모이어티 또는 친화성 분자를 고정상, 예컨대 비드, 칼럼 또는 입자에 부착시킬 수 있고; 태아 유핵 세포는 상기 결합 모이어티 또는 친화성 분자와 특이적으로 결합할 수 있게 해주지만, 샘플의 다른 성분은 결합 모이어티 또는 친화성 분자와 특이적으로 결합하지 않는 조건 하에, 상기 샘플을 친화성 분자-부착된 고정상과 접촉시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 접촉된 고정상은, 예를 들어 이동상을 이용하여 처리하여, 친화성 분자-부착된 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 친화성 분자-부착된 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리할 수 있다. 이어서, 태아 유핵 세포를 포함하는, 친화성 분자-부착된 고정상에 결합된 샘플의 성분을 추가의 보강 또는 분석을 위해 보유 또는 수거할 수 있다.

한 실시양태에서, 자기 입자를 사용하여 유핵 태아 세포를 보강한다. 한 실시양태에서, 결합 모이어티, 예컨대 항체를 자기 입자 (예를 들어, 자기 비드)와 커플링시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 비드는 항-MMP14, 항-CD71, 항-GPA, 항-CD36, 항-CD34, 항-HbF, 항-HAE9, 항-FB3-2, 항-H3-3, 항-에리트로포이에틴 수용체, 항-CD235a, 항-탄수화물, 항-셀렉틴, 항-CD45, 항-GPA, 항-항원-i, 항-EpCAM, 항-E-카드헤린, 항-Muc-1, 항-hPL, 항-CHS2, 항-KISS1, 항-GDF15, 항-CRH, 항-TFP12, 항-CGB, 항-LOC90625, 항-FN1, 항-COL1A2, 항-PSG9, 항-PSG1, 항-HBE, 항-AFP, 항-APOC3, 항-SERPINC1, 항-AMBP, 항-CPB2, 항-ITIH1, 항-APOH, 항-HPX, 항-베타-hCG, 항-AHSG, 항-APOB, 항-J42-4-d, 항-BPG, 항-CA, 또는 항-TK 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항체 단편과 커플링시킨다.

보강의 효율

일부 실시양태에서, 심지어 보강된 생성물도 관심 대상이 아닌 세포 (예를 들어, 유핵 모체 적혈구)가 우세할 수 있다 (>50%). 일부 경우에, 보강된 샘플의 유핵 태아 세포는 보강된 샘플 내 모든 세포의 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 이상을 구성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 시스템을 이용하여, 임신한 인간으로부터의 20 mL의 모체 혈액 샘플을 하나 이상의 유핵 태아 세포, 예컨대 유핵 적혈구로 보강시켜, 이와 같이 보강된 샘플이 총 약 500개의 세포 (이중 2%는 유핵 태아 세포이고, 나머지 세포는 모체 것이다)를 갖도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이와 같이 수행된 보강 단계는 샘플로부터 불필요한 모든 분석물 (예를 들어, 모체 세포, 모체 적혈구, 유핵 모체 적혈구, 무핵 세포)의 50, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9% 이상을 제거하였다.

태아 바이오마커

일부 실시양태에서, 태아 바이오마커를 사용하여, 하나 이상의 태아 세포를 검출하고/하거나 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 이는 태아 발육 동안 차별적으로 발현되는 유전자 (예를 들어, DYS1, DYZ, CD-71, MMP14)의 상대적 발현에 근거하여 태아 유핵 세포와 모체 유핵 세포 간을 구별함으로써 수행할 수 있다. 제공된 발명의 한 실시양태에서, MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, 2,3-비오포스포글리세레이트 (BPG), 탄산 안히드라제 (CA), 또는 티미딘 키나제 (TK)를 포함한, 하나 이상의 유전자의 전사체 또는 단백질 발현의 검출을 이용하여, 태아 세포를 보강, 정제, 열거, 확인, 검출 또는 구별한다. 상기 발현은 이들 유전자로부터 발현된 전사체, 또는 단백질을 포함할 수 있다. 제공된 발명의 한 실시양태에서, MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, AHSG, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK를 포함한 하나 이상의 유전자의 발현을 이용하여, 유핵 태아 세포, 예컨대 유핵 태아 적혈구를 확인, 정제, 보강 또는 열거한다.

베타-hCG (b-hCG, HCG, CGB, CGB3 및 hCGB로서 공지되기도 함)는 당단백질 호르몬 베타 쇄 계열의 구성원이고 융모성 고나도트로핀 (CG)의 베타 3 서브유닛을 코딩한다. 당단백질 호르몬은 통상의 알파 서브유닛과, 생물학적 특이성을 부여해 주는 독특한 베타 서브유닛으로 이루어진 이종-이량체이다. CG는 태반의 영양막 세포에 의해 생성되고, 임신을 유지하는 데 필수적인 스테로이드를 합성하도록 난소를 자극한다. CG의 베타 서브유닛은 직렬식으로 배열되는 6개의 유전자 및 염색체 19q13.3 상의 역위 쌍에 의해 코딩되고 황체 형성 호르몬 베타 서브유닛 유전자와 연속적이다.

APOB (아포지단백질 B (Ag(x) 항원 포함)) 및 FLDB로서 공지되기도 함]는 킬로마이크론 및 저밀도 지단백질의 주요 아포지단백질이다. 이는 혈장 내에 2가지 주요 이소형, 즉 apoB-48 및 apoB-100으로서 존재하는데, 전자는 위장관 내에서만 합성되고, 후자는 간에서 합성된다. 장과 간 형태의 apoB는 매우 긴 단일 mRNA로부터의 단일 유전자에 의해 코딩된다. 상기 2개의 이소형은 공통의 N-말단 서열을 공유한다. apoB-48이 더 짧을 수록, 잔기 2180에서 apoB-100 전사체의 RNA 편집 후에 단백질이 생성되어 (CAA→UAA), 정지 코돈이 창출되고 조기 번역 종결이 초래된다. 이러한 유전자 또는 그의 조절 영역 내에서 돌연변이가 생기면, 혈장 콜레스테롤 및 apoB 수준에 악영향을 미치는 질환인, 저베타지단백혈증, 정상 양의 혈중 트리글리세리드를 갖는 저베타지단백혈증, 및 리간드-결손 apoB에 기인한 고콜레스테롤혈증이 유발된다.

AHSG (알파-2-HS-당단백질; AHS; A2HS; HSGA; 및 FETUA로서 공지되기도 함)는 혈청에 존재하는 당단백질이고, 간세포에 의해 합성될 수 있다. AHSG 분자는 2개의 폴리펩티드 쇄로 이루어지는데, 이러한 쇄는 둘 다 단일 mRNA로부터 코딩된 전구 단백질로부터 절단된다. 이는 몇 가지 기능, 예컨대 세포내 이입, 뇌 발생 및 뼈 조직의 형성에 관여한다. 상기 단백질은 미성숙 대뇌 피질과 골수 조혈 매트릭스의 대뇌 피질 판에 흔히 존재하므로, 이것이 상기 조직의 발생에 참여한다고 주장되어 왔다.

HPX (헤모펙신으로서 공지되기도 함)는 헴에 결합할 수 있다. 이는 헤모글로빈과 같은 헴 단백질의 전환에 의해 상실되거나 또는 방출된 헴을 스캐빈징함으로써 자유 헴에 의해 유발될 수 있는 산화적 손상으로부터 신체를 보호해줄 수 있다. 신체의 철분을 보존하기 위하여, 간 세포의 표면 상에 위치한 특이적 수용체와의 상호 작용시, 헤모펙신은 내재화를 위하여 그의 결합된 리간드를 방출할 수 있다.

CPB2 (카르복시펩티다제 B2 (혈장); CPU; PCPB; 및 TAFI로서 공지되기도 함)는 C-말단 펩티드 결합을 가수분해시킬 수 있는 효소이다. 카르복시펩티다제 계열은 메탈로-, 세린 및 시스테인 카르복시펩티다제를 포함한다. 그들의 기질 특이성에 따라서, 이들 효소는 카르복시펩티다제 A (절단성 지방족 잔기) 또는 카르복시펩티다제 B (절단성 염기성 아미노 잔기)로서 지칭된다. 이러한 유전자에 의해 코딩된 단백질은 트립신에 의해 활성화되고 카르복시펩티다제 B 기질 상에서 작용한다. 트롬빈 활성화 후, 성숙한 단백질은 섬유소용해를 하향조절한다. 이러한 유전자 및 그의 프로모터 영역에 대한 다형성이 보고되었다. 이용가능한 서열 데이터 분석은 상이한 이소형을 코딩하는 스플라이스 변이체를 표시한다.

ITIH1 (인터-알파 (글로불린) 억제제 H1; H1P; ITIH; LATIH; 및 MGC126415로서 공지되기도 함)은 세린 프로테아제 억제제 계열 구성원이다. 이는 다음 2개의 전구체 단백질로부터 조립된다: 경쇄, 및 1개 또는 2개의 중쇄. ITIH1은 시험관내에서 세포 부착을 증가시킬 수 있다.

APOH (아포지단백질 H (베타-2-당단백질 I); BG; 및 B2G1로서 공지되기도 함)는 지단백질 대사, 응집, 및 항-인지질 자가항체의 생성을 포함한 각종 생리학적 경로에 밀접한 영향을 미쳤다. APOH는 많은 루푸스 환자와 원발성 항-인지질 증후군 환자의 혈청에서 발견된 항-인지질 자가항체에 의한 음이온성 인지질 결합에 필요한 보조인자일 수 있다.

AMBP (알파-1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체; HCP; ITI; UTI; EDC1; HI30; ITIL; IATIL; 및 ITILC로서 공지되기도 함)는 혈장에서 분비된 복잡한 당단백질을 코딩한다. 그 전구체는 다음과 같은 별개의 기능성 단백질로 단백질분해적으로 프로세싱된다: 리포칼린 수송 단백질의 슈퍼패밀리에 속하고 염증 과정의 조절에 있어서 역할을 할 수 있는 알파-1-마이크로글로불린; 및 쿠니츠(Kunitz)-유형 프로테아제 억제제의 슈퍼패밀리에 속하고 많은 생리학적 및 병리학적 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 뇨 트립신 억제제인 비쿠닌. 이러한 유전자는 리포칼린 유전자의 클러스터 내의 염색체 9에 위치한다.

J42-4-d는 t-복합체 11 (마우스)-유사 2; MGC40368 및 TCP11L2로서 공지되기도 한다.

보강된 세포를 평가함

이어서, 태아 세포-보강 샘플로부터의 세포에 대해, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현에 관하여 평가할 수 있다.

유핵 태아 적혈구-보강된 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하기 위한 프로토콜의 예가 도 2에 제공되어 있으며, 이는 (1) 유핵 태아 적혈구-보강된 샘플로부터 약 10개 내지 100개 세포를 제공하는 단계, (2) 이 세포를 96 웰 플레이트 내로 분리하여 (세포를 함유하는 웰은 상기 도면에서 녹색 웰로서 표시됨) 각 웰이 1개 또는 0개의 세포를 함유하도록 하는 단계, 및 (3) 이와 같이 분리된 세포를 대상으로 하여, 각 개별 웰에 대해 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 결정해 주는 검정을 수행하는 단계를 포함한다. 이러한 예의 방법의 변동을 본원에 제공된 교시에 따라서 수행할 수 있다.

세포 검정

보강된 유핵 태아 세포는 유핵 태아 세포의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 유핵 태아 세포의 하나 이상의 유전자의 발현을 확인시켜 주는 하나 이상의 세포 검정에 의해 분석할 수 있다.

일부 실시양태에서, 유핵 태아 세포의 하나 이상의 유전자의 발현은 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에 대해 평가한다. 일부 실시양태에서, 유핵 태아 세포의 하나 이상의 유전자의 발현은 단세포에 대한 유전자 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단세포의 하나 이상의 유전자의 발현은 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에 대해 평가한다. 일부 실시양태에서, 단세포의 하나 이상의 유전자의 발현은 태아 세포-보강 샘플로부터의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 세포에 대해 평가한다.

일부 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 평가하는 단계는 태아 세포-보강 샘플로부터의 세포 중의 게놈 DNA의 서열분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계는 관심 서열과 혼성화하는 검출가능한 프로브를 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유핵 태아 세포의 뉴클레오티드 서열(들)은 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에 대해 평가한다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA의 서열분석은 단세포의 DNA의 서열분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단세포의 DNA의 서열분석은 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에 대해 수행한다. 일부 실시양태에서, 단세포의 DNA의 서열분석은 태아 세포-보강 샘플로부터의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 세포에 대해 수행한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계는 검출가능한 프로브를 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포의 게놈 DNA에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석한다.

일부 실시양태에서, 유전자 발현은 태아 세포-보강 샘플로부터의 세포에서의 유전자의 RNA 발현을 검출함으로써 평가한다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 태아 세포-보강 샘플로부터의 세포에서의 유전자의 단백질 발현을 검출함으로써 평가한다. 일부 실시양태에서, 유전자의 발현은 검출가능한 항체를 태아 세포-보강 샘플로부터의 세포의 표면에 혼성화하는 것을 포함한다.

뉴클레오티드 서열분석 방법은 표적화 뉴클레오티드 서열분석 방법 및 게놈 뉴클레오티드 서열분석 방법을 포함한다. 표적화 서열분석 방법은, 예를 들어 표적화 핵산 영역을 증폭시키는 프라이머-기반 PCR을 이용한 다음, 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 통상적인 뉴클레오티드 서열분석을 이용하여, 하나 이상의 특정한 유전자 또는 다른 표적을 서열분석하는 것을 포함한다. 게놈 뉴클레오티드 서열분석 방법은 게놈 DNA의 증폭 및 뉴클레오티드 서열분석 방법을 포함한다. 게놈 뉴클레오티드 서열분석 방법은 문헌 [Zhang et al. (2006) "Sequencing genomes from single cells by polymerase cloning" Nature Biotechnology 24(6):680-6]; 및 [Spits et al. (2006) "Whole-genome multiple displacement amplification from single cells" Nature protocols 1(4):1965-70]에 의해 교시된 바와 같이, 단세포에서의 다수의 변위 증폭을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가의 게놈 뉴클레오티드 서열분석 방법은 문헌 [Zong et al. (2012) "Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell" Science 338:1622-6]에 의해 교시된 바와 같이, 다수의 어닐링 및 루핑-기반 증폭 주기 (MALBAC)로 교시된 바와 같이, 단세포에서의 다수의 변위 증폭을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 전체 게놈 증폭 후, 관심 부분 게놈 서열은 사용자가 설계한 올리고를 이용한 혼성화-기반 선택 후에 서열분석할 수 있다 (예컨대, 전체 엑솜 서열분석).

유전자의 발현은, 예를 들어 유전자로부터 발현된 전사체 또는 단백질을 검출함으로써 결정할 수 있다. 유전자로부터의 전사체의 발현은, 예를 들어 RNA 발색 계내 혼성화 (CISH), RNA FISH, 분자 비콘 프로브를 이용한 RNA-FISH, Q-PCR, RT-PCR, 택맨(Taqman) RT-PCR, 노던 블롯팅, 리보뉴클레아제 보호 검정, 마이크로어레이를 이용한 RNA 발현 프로파일링, 또는 전체 전사체 서열분석에 의해 검출할 수 있다.

단백질 발현은, 예를 들어 면역조직화학, 면역세포화학, 웨스턴 블롯팅, 질량 분광측정법, ELISA, 겔 전기영동에 이은 쿠마시(Coomassie) 염색 또는 은 염색, 유동 세포측정법, FACS 또는 미세유체 형광 세포 분류법에 의해 검출할 수 있다. 이와 같이 발현된 단백질은 세포 표면 또는 내부 발현된 단백질일 수 있다. 세포 표면 단백질은 결합 모이어티, 예를 들어 항체 기반 모이어티에 의해 인식될 수 있다. 검출에 사용된 결합 모이어티는 항체, Fab 단편, Fc 단편, scFv 단편, 펩티드 모방제, 또는 펩토이드일 수 있다.

한 실시양태에서, 발현 수준은 신생 또는 프로세싱되지 않은 전사체를 포함한 핵 RNA 전사체를 측정함으로써 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 발현 수준은 리보솜 RNA를 포함한 mRNA를 측정함으로써 결정된다. 핵산 또는 RNA를 영상화 (예를 들어, 측정)하기 위한 수많은 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있는데, 이 방법은 아피메트릭스, 인크.(Affymetrix, Inc.)로부터의 발현 어레이를 이용하거나 또는 일루미나, 인크.(Illumina, Inc.) 및 라이프 테크놀로지스, 인크.(Life Technologies, Inc.)로부터의 서열분석을 이용하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

유전자-특이적 영역을 표적화하고, 앰플리콘 크기를 선택하며, 등가의 PCR 증폭 효율을 달성하기 위하여 프라이머 어닐링 온도를 조정함으로써 RT-PCR 프라이머를 설계할 수 있다. 따라서, 잘-분리된 형광 염료, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-355, 알렉사 플루오르-488, 및 알렉사 플루오르-555를 이용하여 앰플리콘 각각에 대한 택맨 프로브를 설계할 수 있다. 이와 같이 선택된 프라이머는 먼저, 이중체 포맷으로 검증하여, 표적 cDNA 주형을 이용하여 그들의 특이성, 검출 한계 및 증폭 효율을 입증할 수 있다. 그의 증폭 효율, 검출 동적 범위 및 검출 한계를 알아보기 위하여, 프라이머의 가장 우수한 조합을 삼중체 포맷으로 추가로 시험할 수 있다.

상업적으로 입수가능한 각종 시약, 예컨대 퀴아젠(Qiagen) 1-단계 RT-PCR 키트 및 어플라이드 바이오시스템즈 택맨(Applied Biosystems TaqMan) 1-단계 RT-PCR 마스터 믹스(Master Mix) 시약 키트를 포함한 1-단계 RT-PCR 시약이 RT-PCR에 이용가능하다. 정방향 프라이머를 각각의 표적에 대해 표지시킬 수 있다. 보강된 세포는 유리 슬라이드 상으로 시토스피닝함으로써 침전시킬 수 있다. 추가로, 보강된 세포를 시토스피닝하는 것은 계내 RT-PCR 후에 수행할 수 있다. 그 후, 형광-표지된 앰플리콘의 존재는 형광 현미경 검사에 의해 가시화할 수 있다. 모체의 시그너처를 통한 태아의 최대 분리를 나타내는 앰플리콘 신호:배경 비를 최대화하도록 역전사 시간과 PCR 주기를 최적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호:배경 비는 5, 10, 50, 또는 100 초과이고, 이러한 과정 동안 전반적인 세포 손실은 50, 10 또는 5% 미만이다.

핵산, 항체 또는 항체-기반 단편 프로브와 함께 사용될 수 있는 각종 형광 분자 또는 염료 중 임의의 것이 본원에 제공되며, 이는 알렉사 플루오르 350, AMCA, 알렉사 플루오르 488, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), GFP, RFP, YFP, BFP, CFSE, CFDA-SE, 디라이트(DyLight) 288, 스펙트럼그린(SpectrumGreen), 알렉사 플루오르 532, 로다민(Rhodamine), 로다민 6G, 알렉사 플루오르 546, Cy3 염료, 테트라메틸로다민 (TRITC), 스펙트럼오렌지, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 리사민(Lissamine) 로다민 B 염료, 알렉사 플루오르 594, 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 스펙트럼레드, 알렉사 플루오르 647, Cy5 염료, 알렉사 플루오르 660, Cy5.5 염료, 알렉사 플루오르 680, 피코에리트린 (PE), 프로피듐 아이오다가드 (PI), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-알렉사 플루오르 700, PE-Cy5 (TRI-COLOR), PE-알렉사 플루오르 750, PE-Cy7, APC, APC-Cy7, Draq-5, 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange), 아민 아쿠아(Amine Aqua), 퍼시픽 블루, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 500, 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르-555, 알렉사 플루오르-568, 알렉사 플루오르-610, 알렉사 플루오르-633, 디라이트 405, 디라이트 488, 디라이트 549, 디라이트 594, 디라이트 633, 디라이트 649, 디라이트 680, 디라이트 750, 또는 디라이트 800을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 태아 세포에서의 하나 이상의 유전자의 전사체 발현 또는 그의 존재는 하나 이상의 프라이머/프로브 세트를 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 프라이머/프로브 세트를 사용하여 태아 세포 (예를 들어, 유핵 태아 적혈구)에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 검출할 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머/프로브 세트는 2개의 프라이머와 1개의 프로브, 및 임의로 켄처를 포함한다. 한 실시양태에서 다수의 프라이머/프로브 조합은 하나 이상의 프라이머/프로브 세트를 포함한다. 한 실시양태에서 프라이머/프로브 세트 또는 다수의 프라이머/프로브 조합은 q-PCR을 위해 샘플과 조합된다. 한 실시양태에서 프라이머/프로브 세트 또는 다수의 프라이머/프로브 조합은 실시간-PCR을 위해 샘플과 조합된다. 한 실시양태에서 다수의 프라이머/프로브 조합은, 표적 서열이 샘플에 존재하는 경우에, 각각의 프라이머/프로브 세트에 대한 검출가능한 신호가 생성되도록 각 세트에 대한 프라이머 및 프로브의 양의 균형이 맞도록 설계할 수 있다. 한 실시양태에서 다수의 프라이머/프로브 조합이 동일한 반응 챔버 내에서 기능하여 샘플 내 표적 서열의 존재를 검출할 수 있도록 최적의 어닐링 온도와 열순환처리 프로파일을 설계할 수 있다. 한 실시양태에서 프로브를 상이한 형광 염료로 표지시킨다. 이와 같이 염료 표지된 프로브는, 각 세트 프로브로부터의 형광을 확인할 수 있도록 다른 염료로 표지된 프로브와 충분히 상이한 피크 파장에서 형광을 내는 상이한 염료를 이용하여, 다수의 반응에서 특정한 프라이머/프로브 세트로부터의 각 프로브를 표지시키도록 최적화할 수 있다. 한 실시양태에서, 다수의 프라이머/프로브 조합은 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자의 게놈 DNA에 어닐링되는 하나 이상의 프라이머/프로브 세트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 다수의 프라이머/프로브 조합은 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자에 의해 발현된 RNA, 또는 이러한 RNA의 cDNA에 어닐링되는 하나 이상의 프라이머/프로브 세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 유핵 태아 세포는 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자의 게놈 DNA, 이들 유전자에 의해 발현된 RNA, 또는 이러한 RNA의 cDNA에 어닐링되는 하나 이상의 프라이머/프로브 세트를 포함하는 다수의 프라이머/프로브 조합을 이용하여 보강, 열거, 정제, 검출 또는 확인한다. 또 다른 실시양태에서 다수의 프라이머/프로브 조합은 FN1, 베타-hCG, 또는 AHSG 유전자의 게놈 DNA, 이들 유전자에 의해 발현된 RNA, 또는 이러한 RNA의 cDNA에 어닐링되는 3개 이상의 프라이머/프로브 세트를 포함한다.

또 다른 실시양태에서 프라이머의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 세트를 사용하여, 유핵 태아 세포에서의 하나 이상의 유전자의 전사체 발현 또는 그의 존재를 검출할 수 있다. 한 실시양태에서 프라이머 세트는 2개의 프라이머를 포함한다. 한 실시양태에서 2개 이상의 프라이머 세트는 표적 서열을 포함하는 샘플과의 다수의 반응에 포함된다. 한 실시양태에서 다수의 프라이머 조합은, 표적 서열이 샘플에 존재하는 경우에, 각각의 프라이머 세트에 대한 검출가능한 증폭된 생성물이 생성되도록 각 세트에 대한 프라이머의 양의 균형이 맞도록 설계할 수 있다. 한 실시양태에서 다수의 프라이머 세트가 동일한 반응 챔버 내에서 기능하도록 조합하여 샘플 내 표적 서열의 존재를 증폭시킬 수 있도록 최적의 어닐링 온도와 열순환처리 프로파일을 설계할 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머 세트는 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자의 게놈 DNA에 어닐링된다. 또 다른 실시양태에서, 프라이머 세트는 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자에 의해 발현된 RNA, 또는 이러한 RNA의 cDNA에 어닐링된다. 한 실시양태에서, 유핵 태아 세포는 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자의 게놈 DNA, 이들 유전자에 의해 발현된 RNA, 또는 이러한 RNA의 cDNA에 어닐링되는 프라이머 세트를 이용하여 보강, 열거, 정제, 검출 또는 확인한다.

또 다른 실시양태에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 프로브를 사용하여, 유핵 태아 세포에 의한 하나 이상의 유전자의 전사체 발현을 검출할 수 있다. 한 실시양태에서 2개 이상의 프로브가 검출가능하게 표지되고, 이는 RNA 서열에 결합될 수 있다. 한 실시양태에서 2개 이상의 프로브를 사용하여, 태아 세포에 의해 발현된 2개 이상의 RNA 서열을 검출한다. 한 실시양태에서 2개 이상의 프로브가 형광 계내 혼성화 방법에 사용된다. 한 실시양태에서 이러한 형광 계내 혼성화 방법은 RNA-FISH이다. 한 실시양태에서 프로브는 핵산 프로브이다. 또 다른 실시양태에서 프로브는 펩티드 핵산 (PNA)이다. 또 다른 실시양태에서 프로브는 하나 이상의 변형된 핵산, 예컨대 아미드 변형된 핵산, 포스포르아미데이트 변형된 핵산, 보라노포스페이트 변형된 핵산, 메틸포스포네이트 변형된 핵산, 데옥시리보핵산 구아니딘 (DNG) 변형된 핵산 또는 모르폴리노 변형된 핵산을 포함한다.

한 실시양태에서 2개 이상의 프로브를, 표지된 접합체에 결합할 수 있는 검출가능한 태그, 예컨대 비오틴 또는 스트렙타비딘으로 표지시킨다. 또 다른 실시양태에서 프로브를, 기질 [예컨대, 패스트 레드(Fast Red)]을 검출가능한 표지로 전환시킬 수 있는 효소 (예컨대, 알칼리성 포스파타제)로 표지시킨다. 한 실시양태에서 효소는 알칼리성 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 또는 글루코스 옥시다제이다.

한 실시양태에서 접합체는 형광 염료로 표지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 프로브를 형광 표지에 의해 검출가능하게 표지시킨다. 한 실시양태에서 2개 이상의 프로브를 동일한 형광 표지로 표지시킨다. 한 실시양태에서 2개 이상의 프로브를 상이한 형광 표지로 표지시킨다. 이와 같이 형광 표지된 프로브는, 각 프로브로부터의 형광을 확인할 수 있도록 다른 형광 표지된 프로브와 충분히 상이한 피크 파장에서 형광을 내는 상이한 표지를 이용하여 각 프로브를 표지시키도록 최적화할 수 있다.

한 실시양태에서, 하나 이상의 검출가능하게 표지된 프로브는 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자에 의해 발현된 폴리펩티드와 특이적으로 결합하거나 또는 RNA 서열과 어닐링된다. 한 실시양태에서, 유핵 태아 세포는 MMP14, CD71, GPA, HLA-G, EGFR, CD36, CD34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, BPG, CA, 또는 TK 유전자 중 하나 이상에 의해 발현된 폴리펩티드와 특이적으로 결합하거나 또는 RNA 서열과 어닐링되는 하나 이상의 검출가능하게 표지된 프로브를 이용하여 보강, 열거, 정제, 검출 또는 확인한다.

또 다른 실시양태에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 항체 또는 항체-기반 단편을 사용하여, 태아 세포 (예를 들어, fnRBC 또는 영양막)에서의 하나 이상의 단백질의 발현을 검출할 수 있다.

한 실시양태에서 항체 또는 항체-기반 단편을, 표지된 접합체에 결합할 수 있는 검출가능한 태그, 예컨대 비오틴 또는 스트렙타비딘으로 표지시킨다. 또 다른 실시양태에서 항체 또는 항체-기반 단편을, 기질 (예컨대, 패스트 레드)을 검출가능한 표지로 전환시킬 수 있는 효소 (예컨대, 알칼리성 포스파타제)로 표지시킨다. 한 실시양태에서 효소는 알칼리성 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 또는 글루코스 옥시다제이다.

한 실시양태에서 항체 또는 항체 단편은 태아 세포 마커 단백질에 결합한다. 한 실시양태에서 항체 또는 항체 단편은 형광 염료로 표지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 형광 염료로 표지시킨 항체 또는 항체 단편에 결합한다. 한 실시양태에서 2개 이상의 항체 또는 항체 단편을 동일한 형광 염료로 표지시킨다. 한 실시양태에서 각각의 항체 또는 항체 단편을 상이한 형광 염료로 표지시킨다. 이와 같이 염료 표지된 항체 또는 항체-기반 단편은, 각 항체 또는 항체-기반 단편으로부터의 형광을 확인할 수 있도록 또 다른 염료 표지된 항체 또는 항체-기반 단편과 충분히 상이한 피크 파장에서 형광을 내는 상이한 염료를 이용하여 각 항체 또는 항체-기반 단편을 표지시키도록 최적화할 수 있다.

한 실시양태에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 항-MMP14, 항-CD71, 항-GPA, 항-CD36, 항-CD34, 항-HbF, 항-HAE9, 항-FB3-2, 항-H3-3, 항-에리트로포이에틴 수용체, 항-CD235a, 항-탄수화물, 항-셀렉틴, 항-CD45, 항-GPA, 항-항원-i, 항-EpCAM, 항-E-카드헤린, 항-Muc-1, 항-hPL, 항-CHS2, 항-KISS1, 항-GDF15, 항-CRH, 항-TFP12, 항-CGB, 항-LOC90625, 항-FN1, 항-COL1A2, 항-PSG9, 항-PSG1, 항-HBE, 항-AFP, 항-APOC3, 항-SERPINC1, 항-AMBP, 항-CPB2, 항-ITIH1, 항-APOH, 항-HPX, 항-베타-hCG, 항-AHSG, 항-APOB, 항-J42-4-d, 항-BPG, 항-CA, 또는 항-TK 항체 또는 항체-기반 단편을 사용하여, 태아 세포에 의한 하나 이상의 단백질의 발현을 검출한다. 한 실시양태에서 항체 또는 항체-기반 단편은 태아 세포 내의 단백질에 결합한다. 또 다른 실시양태에서 항체 또는 항체-기반 단편은 태아 세포의 표면 상에 발현된 단백질에 결합한다.

특이적 유전자에 의한 단백질 또는 전사체 발현의 검출을 이용하여, 태아 세포를 참조 세포, 예를 들어 모체 세포와 구별할 수 있거나, 태아 세포 유형들 간을 구별할 수 있거나, 태아 세포를 확인할 수 있거나, 하나 이상의 태아 세포를 정제 또는 보강할 수 있거나, 또는 하나 이상의 태아 세포를 열거할 수 있다.

한 실시양태에서, 세포 유형 특이적 태아 세포 마커를 사용하여, RT-PCR 접근법에 의해 태아 세포 유형을 확인할 수 있다.

한 실시양태에서, 태아 세포는 RNA FISH에 의해 표지시킬 수 있다. 한 실시양태에서 태아 세포는 분자 비콘으로 표지시킬 수 있다. 한 실시양태에서 분자 비콘으로 표지시킨 태아 세포는 FACS 또는 미세유체 형광 세포 분류법에 의해 확인, 정제, 보강 또는 열거할 수 있다.

한 실시양태에서, RT-PCR과 디지털 PCR을 조합함으로써, 태아 세포 유형을 확인할 수 있고 태아 세포수를 계수하였다.

한 실시양태에서, 태아 세포는 태아 세포 마커 유전자에 의해 발현된 단백질에 결합하는 항체 또는 항체-기반 단편에 의해 표지시킬 수 있다. 한 실시양태에서 항체 또는 항체-기반 단편으로 표지시킨 태아 세포는 FACS 또는 미세유체 형광 세포 분류법에 의해 확인, 정제, 보강 또는 열거할 수 있다.

G-밴드 염색체의 통상적인 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 달리 제공된 한 가지 이상의 세포유전 방법, 기타 세포유전 밴딩 기술 뿐만 아니라 분자 세포유전학, 예컨대 형광 계내 혼성화 (FISH) 및 비교 게놈 혼성화 (CGH)를 이용하여 염색체 분석을 수행할 수도 있다.

한 실시양태에서, 샘플 분석은 태아 세포-보강 샘플로부터의 핵산에 대한 하나 이상의 유전 분석 또는 검출 단계를 수행하는 것을 포함한다. 본원의 방법에 의해 분석될 수 있는 보강된 세포 또는 보강된 핵으로부터의 핵산은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA 헤어핀, DNA/RNA 혼성체, RNA (예를 들어, mRNA) 및 RNA 헤어핀을 포함한다. 보강된 세포 또는 핵산 상에서 수행될 수 있는 유전 분석의 예는, 예를 들어 SNP 검출, STR 검출, 및 RNA 발현 분석을 포함한다.

한 실시양태에서, 분석은 태아 세포-보강 샘플의 하나 이상의 세포로부터의 DNA 또는 RNA 전사체 내에서의 하나 이상의 돌연변이 또는 SNP를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 검출은, 예를 들어 DNA 마이크로어레이 또는 RNA 전사체 발현 어레이를 이용하여 수행할 수 있다. DNA 마이크로어레이의 예는 문헌 [Kennedy, G. C., et al., Nature Biotechnology 21, 1233-1237, 2003]; [Liu, W. M., Bioinformatics 19, 2397-2403, 2003]; [Matsuzaki, H., Genome Research 3, 414-25, 2004]; 및 [Matsuzaki, H., Nature Methods, 1, 109-111, 2004] 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,445,934; 5,744,305; 6,261,776; 6,291,183; 5,799,637; 5,945,334; 6,346,413; 6,399,365; 및 6,610,482, 및 EP 619 321; 373 203 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 입증된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라서 아피메트릭스, 인크. (미국 캘리포니아주 산타클라라)로부터 상업적으로 입수가능한 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 마이크로어레이는 샘플 내 적어도 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000 10,000, 20,000, 50,000, 100,000, 200,000, 또는 500,000개의 상이한 핵산 표적(들)을 검출하기 위해 사용된다.

컴퓨터 실행가능 로직을 구비하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램은 유전자형별 클러스터와 호출을 자동화하는데 사용될 수 있다.

본원에서의 실시양태 중 어느 것에서, 보강된 희귀 세포 또는 보강된 희귀 세포 핵으로부터의 유전적 내용의 유전자형별 (예를 들어, SNP 검출) 및/또는 발현 분석 (예를 들어, RNA 전사체 정량화)은 서열분석에 의해 달성될 수 있다. 서열분석은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 전통적인 생어(Sanger) 서열분석 방법을 통하여 달성할 수 있다. 서열분석은 또한, 고 처리량 시스템 (이중 일부는 성장 가닥 내로의 혼입 직후 또는 그의 혼입시 서열분석된 뉴클레오티드의 검출을 허용해주는데, 즉 서열을 실시간으로 또는 실질적으로 실시간으로 검출할 수 있음)을 이용하여 달성할 수 있다. 한 실시양태에서, 고 처리량 서열분석하면, 시간당 10,000개 이상, 50,000개 이상, 100,000개 이상, 200,000개 이상, 300,000개 이상, 400,000개 이상, 500,000개 이상, 1,000,000개 이상 또는 5,000,000개 이상의 서열 판독치가 생성되는데; 각 판독치는 판독당 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 120개 이상 또는 150개 이상의 염기이다. 서열분석은 주형으로서 RNA 전사체로부터 유래된 cDNA 또는 게놈 DNA를 이용하여 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 태아 세포-보강 샘플로부터의 단세포의 고 처리량 서열분석을 포함한 고 처리량 서열분석을 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 태아 또는 모체 세포로부터 수득된 mRNA로부터 역전사되는 cDNA를 분석한다. 이러한 cDNA의 유형과 존재량을 이용하여, 세포가 태아 세포인지의 여부 (예컨대, Y 염색체 특이적 전사체의 존재로서) 또는 태아 세포가 유전적 기형 (예컨대, DNA 메틸화 또는 각인에 따른 문제점 또는 대체 전사체의 이수성, 존재량 또는 유형)을 갖고 있는지의 여부를 결정할 수 있다.

병태 또는 질환의 존재를 결정하기 위해 하나 이상의 세포를 분석하는 것은 또한, 보강된 희귀 세포 샘플 중에서 미토콘드리아 DNA, 텔로머라제, 또는 핵 매트릭스 단백질을 검출하거나; 보강된 샘플의 세포 중의 핵주위 구획의 존재 또는 부재를 검출하거나; 또는 유전자 발현 분석을 수행하여, 상기 보강된 샘플의 핵산 카피 수, 세포 내에서의 PCR, 또는 형광 계내 혼성화를 결정하는 것을 포함할 수 있다.

본원에서의 실시양태 중 어느 것에서, 표적 핵산을 단세포로부터 수득할 수 있다.

태아 세포-보강 샘플은 하나 이상의 보강된 세포를 분석하기에 앞서 "비닝될" 수 있다. 비닝은 보강된 세포 산출량의 총 세포 수 및/또는 복잡성을 감소시켜 주는 임의의 공정이다. 비닝은 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 기재된 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 보강된 세포를 비닝하는 한 가지 방법은 일련의 희석에 의해서이다. 이러한 희석은 임의의 적절한 플랫폼 (예를 들어, PCR 웰, 마이크로타이터 플레이트)을 이용해서도 수행될 수 있다. 기타 방법은 샘플을 액적 내로 분리하여 주는 나노유체 시스템 [예를 들어, 바이오트로브(BioTrove), 레인댄스(Raindance), 플루이딤(Fluidigm)]을 포함한다. 이러한 비닝은 웰 또는 나노액적 내에 존재하는 단세포의 존재를 초래할 수 있다. 태아 세포를 위해 보강된 샘플을 비닝하는 경우, 바람직하게 각 부위는 0개 또는 1개의 세포를 포함한다.

비닝은 친화성 결합 (예를 들어, 렉틴, 항-MMP14 및/또는 항-CD71 항체를 이용함)을 포함하나 이에 제한되지 않는 태아 세포 보강 방법보다 앞서 수행될 수 있다. 예를 들어, 보강된 모체 혈액을 대상으로 하여 구배 원심분리, 렉틴-기반 친화성 분리 및 MMP-14-기반 친화성 분리를 수행할 수 있다. 이어서, 대략 100개의 세포를 함유하는 상기 샘플의 분취량을 100개 빈 (PCR 웰 또는 기타 허용되는 비닝 플랫폼) 내로 분리할 수 있으므로, 각 빈이 대략 1개 세포를 함유하는 것으로 예상될 것이다. 통상의 기술자는 빈의 수가 비닝을 위해 사용된 플랫폼 및/또는 실험적 설계에 따라서 증가될 수 있다는 사실을 인지할 것이다. 비닝된 세포 집단의 복잡성 감소는 표적 세포의 추가의 유전적 및 세포성 분석을 촉진시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 분석은 개별 빈 상에서 수행하여, 이러한 개별 빈 내에서의 유핵 태아 세포의 존재 또는 부재를 확증한다. 이러한 분석은 본원에서의 교시에 따라서 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행할 수 있는데, 이러한 방법은 FISH, PCR, STR 검출, SNP 분석, 바이오마커 검출, 및 서열분석을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서의 방법 및 시스템에 근거하여 결정될 수 있는 태아 병태는 태아의 존재 및/또는 태아의 이수성, 예를 들어 삼염색체 13, 삼염색체 18, 삼염색체 21 [다운 증후군(Down Syndrome)], 클라인펠터(Klinefelter) 증후군 (XXY), 및 하나 이상의 염색체의 일염색체 [터너 증후군(Turner's syndrome)으로서 공지되기도 한, X 염색체 일염색체], 하나 이상의 염색체의 삼염색체 (13, 18, 21, 및 X), 하나 이상의 염색체의 사염색체 및 오염색체 (이는 인간의 성염색체에 가장 흔히 발견되는 것이고, 예를 들면 XXXX, XXYY, XXXY, XYYY, XXXXX, XXXXY, XXXYY, XYYYY 및 XXYYY이다)를 포함한, 기타 불규칙한 수의 성염색체 또는 상염색체; 일배성, 삼배성 (모든 염색체, 예를 들어 인간의 69개 염색체 중 3개), 사배성 (모든 염색체, 예를 들어, 인간의 92개 염색체 중 4개), 오배성 및 다배성과 같은 태아의 병태를 포함한다. 본원에서의 방법을 이용하여 검출될 수 있는 기타 태아의 병태는 분절 이수성, 예컨대 1p36 중복, dup(17)(p11.2p11.2) 증후군, 다운 증후군, 전자간증(Pre-eclampsia), 조기 분만, 자궁내막증, 펠리제우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), dup(22)(q11.2q11.2) 증후군, 고양이 눈 증후군을 포함한다. 한 실시양태에서, 검출하고자 하는 태아 기형은 성염색체 또는 상염색체 내에서의 하나 이상의 결실에 기인하는데, 이는 고양이 울음(Cri-du-chat) 증후군, 울프-허쉬호른(Wolf-Hirschhorn) 증후군, 윌리암스-보이렌(Williams-Beuren) 증후군, 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 압박성 마비에 대해 책임이 있는 유전성 신경병증, 스미스 마제니스(Smith-Magenis) 증후군, 신경섬유종증, 알라질(Alagille) 증후군, 구개심장안면(Velocardiofacial) 증후군, 디조지(DiGeorge) 증후군, 스테로이드 술파타제 결핍증, 칼만(Kallmann) 증후군, 선형 피부 결함이 있는 소안구증(Microphthalmia), 부신 발육부전, 글리세롤 키나제 결핍증, 펠리제우스-메르츠바허병, Y 상에서의 고환 결정 인자, 무정자증 (인자 a), 무정자증 (인자 b), 무정자증 (인자 c) 및 1p36 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 태아 기형은 염색체 수에 있어서의 비정상적인 감소인데, 예컨대 XO 증후군이다. 상기 목록은 단지, 본원에 제공된 방법을 이용하여 평가될 수 있는 가능한 유전병의 예로서 제공된다. 그러나, 이들 방법은 공지된 유전적 원인을 갖는 모든 질환 (이는 OMIM과 같은 공개 데이터베이스 내의 질환을 포함하나 이에 제한되지 않음)으로 확장될 수 있다.

태아 세포 서열 또는 발현의 확인

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 개별 세포에 대해 결정된 유전자 발현 데이터 또는 핵산 분자 데이터의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계, 및 이러한 데이터가 모체 서열 또는 유전자 발현을 표시하는지 아니면 태아 서열 또는 유전자 발현을 표시하는 지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 상기 데이터가 모체 정보를 표시하는지 아니면 태아의 정보를 표시하는 지의 확률을 결정한다. 심지어 보강 방법을 수행한 후에도, 모체 세포는 태아 세포-보강 샘플에 아마도 여전히 존재하는 것으로 고려된다. 따라서, 세포가 태아 기원인지 모체 기원인지를 확인하기 위한 방법, 또는 세포가 태아 기원 또는 모체 기원일 확률을 확인하는 방법을 이행할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 세포가 태아 기원인 것으로서 확인시켜 주거나 또는 세포가 태아 기원일 가능성을 확인시켜 줄 능력을 증강시킬 수 있는데, 이는 태아 세포-보강 샘플의 세포를 분석하는 것이 단세포 개별적으로 수행되기 때문이다. 따라서, 본원에 제공된 실시양태에 따라서 서열 또는 유전자 발현을 결정하는 것은 세포의 앙상블 또는 수많은 세포로부터의 평균 신호에 근거하지 않고, 대신 복수 개의 단세포 서열 또는 유전자 발현 측정치에 근거한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 데이터 또는 유전자 발현 데이터를 분석하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 상기 결정된 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현에 근거하여, 각각의 세포를 제1 세포 집단 또는 제2 세포 집단에 속하는 것으로서 분류하는 단계; 및 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시양태에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률은, 제1 집단 및 제2 집단 각각에 대한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을, 공지된 모체 세포에 대한 공지된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현과 비교함으로써 확인되며, 여기서 공지된 모체 세포에 대해 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현의 보다 높은 유사성을 보유하고 있는 세포 집단이 모체 기원인 것으로서 확인된다.

일부 실시양태에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률은, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단의 크기를 평가함으로써 확인되며, 여기서 보다 큰 세포 집단이 태아 기원인 것으로서 확인된다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태는 모체 세포 보다 태아 세포를 더 많이 함유하는 태아 세포-보강 샘플을 산출하는 것으로 본원에 고려된다. 따라서, 이들 실시양태에서는, 모체 세포가 태아 세포-보강 샘플에 여전히 존재하는 것으로 예상되긴 하지만, 태아 세포-보강 샘플의 전체 세포 집단에 걸쳐 보다 흔한 서열 또는 유전자 발현은 모체 세포의 것이 아니라 태아 세포의 것일 가능성이 더 높다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 단세포의 측정에 적용될 수 있긴 하지만, 복수 개의 세포의 측정에 적용된 경우에 그 정확도가 증가될 확률이 크다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 개별 세포에 대해, 뉴클레오티드 서열 정보 또는 유전자 발현 정보에 관하여 분석할 수 있고, 이러한 분석 결과는 태아 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현을 확인시켜 줄 수 있고/있거나 특정한 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현이 태아 기원일 확률을 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 유전 분석으로부터의 결과를, 참조 샘플 (예를 들어, 모체 세포)로부터의 유사한 분석으로부터의 결과와 비교함으로써 진단을 수행한다. 예를 들어, 태아 세포 보강 샘플로부터의 세포에서의 서열 또는 유전자 발현을 공지된 모체 세포 (예를 들어, 모체 진피 또는 상피 세포)에서의 서열 또는 유전자 발현과 비교함으로써, 하나 이상의 태아 세포의 존재 및/또는 이러한 세포에서의 서열 또는 유전자 발현을 결정하기 위하여 태아 세포 보강 샘플을 분석할 수 있다.

한 실시양태에서, 유전자의 발현이 참조 샘플, 예를 들어 모체 세포에서 보다 태아 세포에서 더 높거나 더 낮을 경우에, 상기 태아 세포를 보강, 열거, 정제, 검출 또는 확인하기 위한 마커로서, 태아 세포에서의 상기 유전자의 전사체 또는 단백질 발현을 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자의 발현 (전사체 또는 단백질의 형태) 수준이 참조 샘플 (예를 들어, 모체 세포)에서의 유전자의 발현 (전사체 또는 단백질의 형태) 수준 보다 적어도 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 750%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% 또는 10,000% 더 높거나 더 낮은 경우에, 이러한 유전자는 태아 세포 마커일 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자는 참조 샘플 (예를 들어, 모체 세포)과 비교해서 더 높은 수준의 단백질 또는 전사체 발현을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플 (예를 들어, 모체 세포)에서의 유전자의 발현과 비교해서 태아 세포에서의 유전자의 단백질 또는 전사체의 발현 비가 적어도 약 11:10, 6:5, 13:10, 7:5, 3:2, 8:5, 17:10, 9:5, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 또는 10:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1, 650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1, 또는 1000:1인 경우에, 이러한 유전자는 태아 세포의 마커일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 태아 세포에서의 유전자의 단백질 또는 전사체의 발현이 참조 샘플 (예를 들어, 모체 세포)에서의 전사체의 발현 보다 적어도 약 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 55-, 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, 또는 100-배 더 높거나 더 낮은 경우에, 이러한 유전자는 태아 세포의 마커일 수 있다. 전사체 또는 단백질 발현의 수준은 다른 전사체 또는 단백질의 발현 수준 각각에 대하여 표준화시킬 수 있다.

실시예

임신 첫 3개월, 두 번째 3개월 및/또는 세 번째 3개월 동안 100명의 임신 여성으로부터 샘플을 수득하였다. 혈액 샘플은 수집 후 3시간 이내에 처리하였다. 각 혈액 샘플을 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 1:1로 희석시켜 적당한 부피가 되도록 하였다. 이와 같이 희석시킨 혈액 샘플을 약 1.09 g/ml의 밀도로 조정된 밀도 배지 전체에 발라두었다. 밀도 원심분리를 실온에서 30분 동안 1,500 rpm 하에 수행하였다. 냉 PBS로 3회 세척한 후, 실온에서 10분 동안 다시 원심분리함으로써 단핵 세포를 수집하였다. 침강물을 PBS로 재현탁시키고, 문헌 [Kitagawa et al., 2002 Prenat. Diagn 22:17-21]에 기재된 바와 같은 대두 응집소 (SBA)를 사용하여 렉틴 선택하였다.

10 mg의 단백질 A/G 자기 비드 혼합물 [라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation)]을 재현탁시키고, PBS + 트윈(Tween)-20으로 2회 세척하였다. 50 ㎍의 후보 항체 [CD71 및 MMP14; EMD 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)]를, PBS + 트윈-20에 희석시킨 400 ㎕ 비드 혼합물에 첨가하고, 인큐베이션하며, 실온에서 30분 동안 회전시켰다. 항체와 커플링된 비드를 자기 스탠드로 분리하고, PBS + 트윈-20에서 3회 세척하였다. 렉틴 선택 후에 단리된 조 단핵 세포를, 400 ㎕ PBS + 트윈-20에 희석시킨 항체 커플링된 단백질 A/G 비드에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 보강된 세포를 하류 분석을 위해 20 ㎕ 내로 희석시켰다.

보강 후 세포의 품질과 순도를 평가하기 위하여, 보강된 세포 샘플의 절반을 대상으로 하여, 세포유전 분석을 수행하였고, 전술된 바와 같은 태아 세포 표면 마커로 면역염색하였다. 샘플의 다른 절반에 대해서는, 세포를 96-웰 플레이트의 개별 웰 내로 분리하여, 웰당 1개 이하의 세포를 보장하였다.

3 내지 5개의 단세포의 세포유전 분석, 전사체/게놈, 및 DNA/RNA 조성의 기타 분석이 수행될 것이다. 대조군으로서, 모체 세포는 타액 샘플로부터 수거될 것이다. 단세포 데이터의 DNA 서열을 모체 세포의 DNA 서열과 비교하여, 태아 단세포를 모체 단세포와 구별할 뿐만 아니라 태아 세포-특이적 유전자 변이를 구별할 것이다. 개별 단세포들 간의 차별적 RNA 및 단백질 발현을 계산하고, 이를 활용하여 신규 특징을 확인할 것이다.

Claims

모체 샘플을 제공하는 단계;
모체 샘플을, 하나 이상의 사카라이드에 대한 친화성을 갖는 제1 고정상과 접촉시키는 단계;
제1 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계;
제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계;
모체 샘플을, 매트릭스 메탈로프로테이나제 14에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 단계;
단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및
단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유함으로써, 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계
를 포함하는, 모체 샘플로부터 태아 세포-보강 샘플을 수득하는 방법.
제1항에 있어서, 모체 샘플을 상기 제1 고정상 및 상기 제1 고정상과 접촉시키기 이전에,
모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계; 및
유핵 태아 적혈구의 크기 및/또는 밀도를 갖는 분리된 모체 샘플의 성분을 수거하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계를 구배 원심분리를 이용하여 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 사카라이드가 갈락토스인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고정상이 렉틴-결합된 고정상인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고정상이 자기 비드를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단리가능하게 표지된 친화성 분자가 자기 비드에 결합되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계에 이어서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 보유된 성분을, 매트릭스 메탈로프로테이나제 14에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
모체 샘플을, 매트릭스 메탈로프로테이나제 14 이외의 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 제2 고정상과 접촉시키는 단계;
제2 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및
제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 태아 세포 표면 마커가 트랜스페린 수용체 (CD71), 글리코포린 A (GPA), HLA-G, EGFR, 트롬보스폰딘 수용체 (CD36), CD 34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, 2,3-비오포스포글리세레이트 (BPG), 탄산 안히드라제 (CA) 및 티미딘 키나제 (TK)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 태아 세포 표면 마커가 트랜스페린 수용체 (CD71)인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 샘플이 모체 혈액 샘플인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 태아 세포-보강 샘플 내 세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 태아 세포인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계; 및
태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 분석하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계가 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포의 게놈 DNA의 서열분석을 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 게놈 DNA의 서열분석이 단세포의 DNA의 서열분석을 포함하며, 여기서 단세포의 DNA의 서열분석을 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포에 대해 수행하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 단세포의 DNA의 서열분석을 태아 세포-보강 샘플로부터의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 세포에 대해 수행하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 유전자의 발현이 검출가능한 항체를 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포의 표면에 혼성화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계가 검출가능한 프로브를 태아 세포-보강 샘플로부터의 하나 이상의 세포의 게놈 DNA에 혼성화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 하나 이상의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석하는 것인 방법.
모체 샘플을 제공하는 단계;
모체 샘플을, 하나 이상의 사카라이드에 대한 친화성을 갖는 제1 고정상과 접촉시키는 단계;
제1 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계;
제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계;
모체 샘플을, 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 단계;
단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계;
단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하여, 분석용 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계;
태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 결정하는 단계; 및
태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하여, 태아 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현을 확인하는 단계
를 포함하는, 모체 샘플을 태아 뉴클레오티드 서열 또는 태아 유전자 발현에 관하여 평가하는 방법.
제22항에 있어서, 태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하는 단계가,
상기 결정된 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현에 근거하여, 각각의 세포를 제1 세포 집단 또는 제2 세포 집단에 속하는 것으로서 분류하는 단계; 및
제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률을 확인하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제23항에 있어서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률이, 제1 집단 및 제2 집단 각각에 대한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을, 공지된 모체 세포에 대한 공지된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현과 비교함으로써 확인되며, 여기서 공지된 모체 세포에 대해 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현의 보다 높은 유사성을 보유하고 있는 세포 집단이 모체 기원인 것으로서 확인되는 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률이, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단의 크기를 평가함으로써 확인되며, 여기서 보다 큰 세포 집단이 태아 기원인 것으로서 확인되는 것인 방법.
태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 제공하며, 여기서 태아 세포-보강 샘플은
모체 샘플을 제공하는 단계;
모체 샘플을, 하나 이상의 사카라이드에 대한 친화성을 갖는 제1 고정상과 접촉시키는 단계;
제1 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계;
제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계;
모체 샘플을, 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 단계;
단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및
단리가능하게 표지된 친화성 분자에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하여, 분석용 태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 단계; 및
태아 세포-보강 샘플의 2개 이상의 세포 각각에 대해, 개별 세포에 대해 결정된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 평가하여, 태아 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현을 확인하는 단계
를 포함하는, 모체 샘플을 태아 뉴클레오티드 서열 또는 태아 유전자 발현에 관하여 평가하는 방법.
제26항에 있어서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률이, 제1 집단 및 제2 집단 각각에 대한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을, 공지된 모체 세포에 대한 공지된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현과 비교함으로써 확인되며, 여기서 공지된 모체 세포에 대해 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 발현의 보다 높은 유사성을 보유하고 있는 세포 집단이 모체 기원인 것으로서 확인되는 것인 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 태아 기원 또는 모체 기원일 확률이, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단의 크기를 평가함으로써 확인되며, 여기서 보다 큰 세포 집단이 태아 기원인 것으로서 확인되는 것인 방법.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 태아 세포-보강 샘플 제조 방법이 모체 샘플을 상기 제1 고정상 및 상기 제1 고정상과 접촉시키기 이전에,
모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계; 및
유핵 태아 적혈구의 크기 및/또는 밀도를 갖는 분리된 모체 샘플의 성분을 수거하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 모체 샘플의 성분을 크기 및/또는 밀도에 따라 분리하는 단계를 구배 원심분리를 이용하여 수행하는 것인 방법.
제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 사카라이드가 갈락토스인 방법.
제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고정상이 렉틴-결합된 고정상인 방법.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고정상이 자기 비드를 포함하는 것인 방법.
제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단리가능하게 표지된 친화성 분자가 자기 비드에 결합되는 것인 방법.
제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계에 이어서, 제1 고정상에 결합된 모체 샘플의 보유된 성분을, 단리가능하게 표지된 친화성 분자와 접촉시키는 것인 방법.
제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 태아 세포-보강 샘플 제조 방법이
모체 샘플을, 태아 세포 표면 마커에 대한 친화성을 갖는 제2 고정상과 접촉시키는 단계;
제2 고정상에 결합되지 않은 모체 샘플의 성분으로부터, 제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 분리하는 단계; 및
제2 고정상에 결합된 모체 샘플의 성분을 보유하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 태아 세포 표면 마커가 MMP14 (매트릭스 메탈로프로테이나제 14), 트랜스페린 수용체 (CD71), 글리코포린 A (GPA), HLA-G, EGFR, 트롬보스폰딘 수용체 (CD36), CD 34, HbF, HAE 9, FB3-2, H3-3, 에리트로포이에틴 수용체, HBE, AFP, APOC3, SERPINC1, AMBP, CPB2, ITIH1, APOH, HPX, 베타-hCG, AHSG, APOB, J42-4-d, 2,3-비오포스포글리세레이트 (BPG), 탄산 안히드라제 (CA) 및 티미딘 키나제 (TK)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제37항에 있어서, 태아 세포 표면 마커가 MMP14 (매트릭스 메탈로프로테이나제 14) 또는 트랜스페린 수용체 (CD71)인 방법.
제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 샘플이 모체 혈액 샘플인 방법.
제22항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 태아 세포-보강 샘플 내 세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 태아 세포인 방법.
제22항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 태아 세포-보강 샘플 제조 방법이
태아 세포-보강 샘플을 제공하는 단계; 및
태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에서의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 발현을 분석하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법.
제41항에 있어서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계가 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포의 게놈 DNA의 서열분석을 포함하는 것인 방법.
제42항에 있어서, 게놈 DNA의 서열분석이 단세포의 DNA의 서열분석을 포함하며, 여기서 단세포의 DNA의 서열분석을 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포에 대해 수행하는 것인 방법.
제43항에 있어서, 단세포의 DNA의 서열분석을 태아 세포-보강 샘플로부터의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 세포에 대해 수행하는 것인 방법.
제41항에 있어서, 유전자의 발현이 검출가능한 항체를 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포의 표면에 혼성화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제41항에 있어서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계가 검출가능한 프로브를 태아 세포-보강 샘플로부터의 2개 이상의 세포의 게놈 DNA에 혼성화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제46항에 있어서, 하나 이상의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석하는 것인 방법.
제46항에 있어서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 개별 세포에 대해, 각각의 분석 세포의 게놈 DNA에 대한 검출가능한 프로브의 혼성화에 관하여 분석하는 것인 방법.