KR20150143789A - 보체 반응을 완화시키기 위한 중성적으로 하전된 합성 혈소판 - Google Patents

보체 반응을 완화시키기 위한 중성적으로 하전된 합성 혈소판 Download PDF

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KR20150143789A
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Abstract

본 발명은 코어, 물-가용성 폴리머 및 RGD 펩티드 그리고 폴옥사머가 포함된 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

보체 반응을 완화시키기 위한 중성적으로 하전된 합성 혈소판{Neutrally-charged synthetic platelets to mitigate complement response}
본 출원은 2013년 4월 16일자로 제출된 미국 가특허 출원 번호 61/812,642 그리고 2013년 8월 12 일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/864,969에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원은 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
정부의 이해관계에 대한 진술
본 발명은 National Institutes of Health에 의해 부여된 보조 번호 1DP2OD007338-07, United States Department of Defense에 의해 제공된 보조 번호 W81XWH-11-1-0014 그리고 United States navy에 의해 제공된 보조 번호 NG2645-12-C4055에 따른 정부 지원에 의해 이루어진 것이다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 보유한다.
발명의 분야
본 발명은 코어(core), 물-가용성 폴리머, RGD 펩티드 그리고 폴옥사머(poloxamer)가 포함된 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
배경
출혈은 예를 들면, 중추신경계 (CNS)에서 손상 연쇄반응의 첫 번째 단계이기도 하다. 척수 및 외상에 의한 모든 뇌 손상에서 손상의 기전과는 무관하게 첫 번째로 관찰가능한 현상이 출혈이다. 출혈을 멈추게 할 수 있다면, 아마도 조직을 보존할 수 있고, 결과를 개선시킬 수 있다. 일차적 물리적 손상은 이러한 손상의 대개 작은 일부분이다. 손상 후 몇 시간, 수일 및 수주에 걸쳐 발생되는 이차 손상 과정으로의 진행 및 저조한 기능적 통제로 이어진다. 이러한 이차적 손상 과정의 중단은 더 많은 양의 조직의 보존을 의미할 것이다. 조직의 보존으로 기능적 통제는 더 잘 된다는 것을 의미한다.
손상 이후, 일련의 응고성 사건들을 통하여 지혈이 이루어진다. 혈소판 관련하여 주요 단계들은 성장 인자들과 피브리노겐이 포함된 다른 분자들의 무리의 활성화, 결합 및 방출과 관련된다. 맥관 손상 동안, 혈소판의 활성화를 촉발시키는 콜라겐이 노출된다. 혈소판 형태는 원반모양에서 별모양으로 변천되며, 이들은 노출된 콜라겐에 부착된다. 혈소판 응집이 일단 시작되면, 몇몇 염증성 물질들은 아데노신 디포스페이트 (ADP)가 포함된 이들의 저장 과립으로부터 방출되며, 이로 인하여 부근 순환 혈소판 표면은 접착성을 가지게 된다. 세로토닌, 에피네프린, 및 트롬복산 A 2는 말단 혈관수축을 더 유도한다. 최종 단계, 응혈 형성은 간에 의해 만들어지고, 보통 혈장에 존재하는 큰 가용성 혈장 단백질인 피브리노겐을 불용성의 실과 같은 분자인 피브린으로 전환되는 것이다.
심각한 손상에서, 이러한 내인적 과정은 단축되고, 통제불가능한 출혈로 결과된다. 이러한 과정을 증가시키고, 외부적 방법을 넘어선 지혈을 유도하기 위한 몇 가지 방법들이 있다. 기존 혈소판을 대체 또는 보강하는 혈소판 대체물이 수년간 추진되어 왔었다 (Blajchman, J. Thromb . Haemost . 1: 1637-41(2003)). 동종이형(allogeneic) 혈소판의 투여는 출혈의 중단에 도움이 될 수 있지만; 그러나, 혈소판은 보관기간이 짧고, 동종이형 혈소판의 투여는 이식편대숙주병, 동종면역(alloimmunization), 그리고 수혈-연합된 폐 손상 (Blajchman, J. Thromb . Haemost. 1: 1637-41(2003))을 야기할 수 있다. Arg-Gly-Asp (RGD) 서열로 변형된 적혈구 세포가 포함된 비-혈소판 대안, 알부민 기반의 피브리노겐-피복된 마이크로캡슐, 그리고 리포좀 시스템이 혈액응고제로 연구되어 왔었지만(Siller-Matula et al., Thromb . Haemost . 100: 397-404 (2008)), 그러나, 독성, 혈전증, 및 제한된 효과는 이들 산물의 임상적 적용의 주요 문제점이다 (Frink et al., J. Biomed . Biotech. 2011: 979383 (2011)).
압박 붕대, 흡수제 재료들, 이를 테면 QuikClot®, 그리고 활성화된 재조합 인자 VII (rFVIIa)의 정맥내(IV) 주입이 포함된 지혈을 보강하는 다수의 방법들이 임상 분야에 이용되지만, 그러나, 전술한 두 가지는 오직 노출된 상처에만 적용가능하고, 그리고 rFVIIa는 혼합 결과를 가지고 있었고, 냉장을 요하고, 외상 영역 또는 부위로 투여하도록 만드는데 비용이 비싸다. 분명한 것은, 영역에 투여가능한 출혈을 중단시키는 새로운 방법이 필요하다.
복합 외상에 효과적인 지혈제의 경우, 상기 시스템은 비-독성이며, 실온에서 보관시(가령 의료진 가방 안) 안정적이어야 하고, 즉각적인 I.V. 투여가 가능하며, 그리고 비-특이적 혈전증을 피하기 위하여 손상 부위-특이적 응집 성질을 보여야 한다. 이러한 시스템이 임상적으로 전환가능하기 위하여, 이상적으로는 FDA에서 이미 승인된 재료들로 만들어져야 한다. 또한 실질적으로, 가격이 적정해야 한다.
발명의 요약
본 발명은 외상에서 출혈을 감소시키고, 결과를 개선시키는 합성 혈소판 또는 정맥으로 투여되는 지혈 나노입자를 제공한다.
본 명세서에서 설명된 나노입자는 상기에서 논의된 바와 같이, 대퇴 동맥 손상 모델에서 출혈 시간을 반으로 줄여준다. 이들 나노입자는 기본적으로 합성 혈소판으로 작용하고, 실온에서 안정적이며, 그리고 정맥으로 투여될 수 있다.
본 발명은 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하는데, 상기 나노입자는 코어, 물 가용성 폴리머 및 펩티드를 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 물 가용성 폴리머의 제 1 말단에서 상기 코어에 부착되며, 상기 펩티드는 상기 물 가용성 폴리머의 제 2 말단에 부착되며, 상기 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 펩티드가 당단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 결합을 허용하도록 충분한 길이를 가지고 있으며, 상기 조성물은 폴옥사머를 더 포함한다. 본 발명의 조성물 안의 나노입자는 중성적으로 하전되는데, 이를 테면 제타 전위 약 -3.0 mV 내지 약 3 mV를 보유한 나노입자다.
본 발명의 조성물은 상기 폴옥사머가 조성물의 약 0.1% 내지 약 60%로 존재하는 것들을 포함한다. 본 발명은 상기 폴옥사머가 조성물의 약 0.1% 내지 약 40%로 존재하는 것들을 또한 포함한다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 조성물 안에 폴옥사머가 나노입자 질량의 최대 50배 존재하는 것들을 포함한다.
본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 폴옥사머는 구조 -[친수성 폴리머-소수성 폴리머-친수성 폴리머]n-를 포함하는 비-이온(non ionic) 삼중블럭 코폴리머다.
본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 폴옥사머는 -[폴리에틸렌 글리콜-폴리(프로필렌 옥시드)-폴리에틸렌 글리콜]n-이다. 예를 들면, 상기 폴옥사머는 폴옥사머 101, 폴옥사머 105, 폴옥사머 108, 폴옥사머 122, 폴옥사머 123, 폴옥사머 124, 폴옥사머 181, 폴옥사머 182, 폴옥사머 183, 폴옥사머 184, 폴옥사머 185, 폴옥사머 188, 폴옥사머 212, 폴옥사머 215, 폴옥사머 217, 폴옥사머 231, 폴옥사머 234, 폴옥사머 235, 폴옥사머 237, 폴옥사머 238, 폴옥사머 282, 폴옥사머 284, 폴옥사머 288, 폴옥사머 331, 폴옥사머 333, 폴옥사머 334, 폴옥사머 335, 폴옥사머 338, 폴옥사머 401, 폴옥사머 402, 폴옥사머 403, 폴옥사머 407 및 Kolliphor P 188로 구성된 집단으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 폴옥사머는 Pluronic® 10R5, Pluronic® 17R2, Pluronic® 17R, Pluronic® 25R2, Pluronic® 25R4, Pluronic® 31R1, Pluronic® F 108 Cast Solid Surfacta, Pluronic® F 108 NF, Pluronic® F 108 Pastille, Pluronic® F 108NF Prill Poloxamer 338, Pluronic® F 127, Pluronic® F 127 NF, Pluronic® F 127 NF 500 BHT Prill, Pluronic® F 127 NF Prill Poloxamer 407, Pluronic® F 38, Pluronic® F 38 Pastille, Pluronic® F 68, Pluronic® F 68 Pastille, Pluronic® F 68 LF Pastille, Pluronic® F 68 NF, Pluronic® F 68 NF Prill Poloxamer 188, Pluronic® F 77, Pluronic® F 77 Micropastille, Pluronic® F 87, Pluronic® F 87 NF, Pluronic® F 87 NF Prill Poloxamer 237, Pluronic® F 88, Pluronic® F 88 Pastille, Pluronic® F 98, Pluronic® L 10, Pluronic® L 101, Pluronic® L 121, Pluronic® L 31, Pluronic® L 35, Pluronic® L 43, Pluronic® L 44 NF, Poloxamer 124, Pluronic® L 61, Pluronic® L 62, Pluronic® L 62 LF, Pluronic® L 62D, Pluronic® L 64, Pluronic® L 81, Pluronic® L 92, Pluronic® L44 NF, Pluronic® N 3, Pluronic® P 103, Pluronic® P 104, Pluronic® P 105, Pluronic® P 123 Surfactant, Pluronic® P 65, Pluronic® P 84, 및 Pluronic® P 85로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하는데, 상기 나노입자는 코어, 물 가용성 폴리머 및 펩티드를 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 물 가용성 폴리머의 제 1 말단에서 상기 코어에 부착되며, 상기 펩티드는 상기 물 가용성 폴리머의 제 2 말단에 부착되며, 상기 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 펩티드가 당단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 결합을 허용하도록 충분한 길이를 가지고 있으며, 상기 조성물은 폴리(아크릴산)을 더 포함한다. 상기 조성물의 상기 나노입자는 중성 전하를 보유하거나 또는 제타 전위 약 -3.0 mV 내지 약 3.0 mV를 보유할 수 있다.
본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 조성물은 타원체 모양을 보유하고, 1 미크론 미만의 직경을 가진 나노입자를 포함한다. 예를 들면, 상기 나노입자는 0.1 미크론 내지 1 미크론 사이의 직경을 보유한다.
대안으로, 본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 조성물은 비-타원체 모양을 가진 나노입자를 포함한다. 예를 들면, 상기 나노입자는 막대(rod), 섬유 또는 위스커(whisker)다. 상기 나노입자는 폭에 대한 길이 비율이 최소한 3인 형상 비율(aspect ratio)을 가질 수 있다.
본 발명은 실온에서 최소한 14 일 동안 안정적인 전술한 임의의 조성물을 제공한다.
본 발명은 결정 폴리머인 코어를 보유하는 나노입자가 포함된 전술한 임의의 조성물을 또한 제공한다. 또한, 전술한 임의의 조성물은 단일 폴리머, 블럭 코폴리머, 삼중블럭 코폴리머 또는 사중블럭(quadblock) 폴리머인 코어를 보유한 나노입자를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 PLGA, PLA, PGA, (폴리 (ε-카프로락톤) PCL, PLL 또는 이의 조합이 포함된 코어를 보유한 나노입자를 포함한다.
본 발명은 생물분해가능한 코어 또는 대안으로 생물분해불가능한 코어스코어(corescore)를 보유한 나노입자가 포함된 조성물을 제공한다. 본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 나노입자는 고체(solid) 코어를 보유할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 나노입자가 포함된 조성물을 제공하는데, 이때 상기 코어는 금, 은, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈, ZnS, ZnO, Ti, TiO2, Sn, SnO2, Si, SiO2, Fe, Fe+4, 강철, 코발트-크롬 합금, Cd, CdSe, CdS, 및 CdS, 티타늄 합금, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, Cd3As2, InAs, GaAs, 셀룰로오즈 또는 덴드라이머(dendrimer) 구조로 구성된 군에서 선택된 재질이다.
또한, 본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분기된 PEG, 폴리시알산 (PSA), 탄수화물, 폴리사카라이드, 풀루란, 치토산, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥시드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일몰포린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 안하이드리드, 폴리스티렌-코-말레산 안하이드리드, 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코몰리머, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아세탈, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 안하이드리드 코폴리머, 폴리 (β-아미노산) (동종폴리머 또는 렌덤 코폴리머), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종폴리머 (PPG) 및 다른 폴리알킬렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POG) (가령, 글리세롤) 및 다른 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸화된 포도당, 콜론산 또는 다른 탄수화물 폴리머, 피콜(Ficoll) 또는 덱스트란 그리고 이의 조합 또는 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 물 가용성 폴리머를 포함한다.
예를 들면, 본 발명은 상기 물 가용성 폴리머 PEG, 이를 테면 평균 분자량 100 Da 내지 10,000 Da를 가진 PEG가 포함된 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 나노입자는 RGD, RGDS (서열 번호: 1), GRGDS (서열 번호: 2), GRGDSP (서열 번호: 3), GRGDSPK (서열 번호: 4), GRGDN (서열 번호: 5), GRGDNP (서열 번호: 6), GGGGRGDS (서열 번호: 7), GRGDK (서열 번호: 8), GRGDTP (서열 번호: 9), cRGD, YRGDS (서열 번호: 10) 또는 이의 변이체들로 구성된 군에서 선택된 서열이 포함된 펩티드를 포함한다. 본 발명의 조성물은 일렬 반복(tandem repeat) 안에 있는 RGD 펩티드가 포함된 나노입자를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 RGD 펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 복사체가 포함된 나노입자 또는 RGD 펩티드의 다중 복사체가 포함된 나노입자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 RGD 펩티드의 다중 복사체가 포함된 나노입자를 포함하며, 이때 RGD 펩티드의 모든 복사체는 동일하거나, 또는 상기 조성물은 RGD 펩티드의 다중 복사체가 포함된 나노입자를 포함하며, 이때 RGD 펩티드의 2개 복사체는 상이한 서열을 보유한다.
본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 조성물은 몰비율 0.1:1 내지 1:10 또는 그 이상에서 상기 코어에 부착된 물 가용성 폴리머가 포함된 나노입자를 포함한다.
본 발명의 임의의 조성물에서, 상기 조성물은 치료요법적 화합물이 더 포함된 나노입자를 포함한다. 예를 들면, 상기 치료요법적 화합물은 소수성이다. 대안으로, 상기 치료요법적 화합물은 친수성이다. 상기 치료요법적 화합물은 상기 나노입자에 공유적으로 부착될 수 있으며, 상기 나노입자와 비-공유적으로 연합되거나, 정전기적 상호작용을 통하여 상기 나노입자와 연합되거나, 또는 소수성 상호작용을 통하여 상기 나노입자와 연합될 수 있다. 상기 치료요법적 화합물은 성장 인자, 사이토킨, 스테로이드, 또는 작은 분자 또는 항암 화합물일 수 있다.
본 발명은 약학 조성물인 조성물을 제공하며, 이때 상기 조성물은 약학적으로 수용가능한 운반체, 희석제 또는 제형(formulation)을 더 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 정맥내 투여 제형 안에 있을 수 있다. 본 발명의 조성물은 동결건조되거나 또는 분말일 수 있다.
본 발명은 개체에서 상태를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 임의의 조성물을 필요로 하는 환자에게 상기 상태를 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 개체는 출혈 장애를 가지고 있는 개체에게 출혈을 줄이는데 효과적인 양의 상기 조성물을 투여하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 출혈 장애를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 투여가 없거나, 염수를 투여한 경우와 비교하였을 때 출혈 시간이 15% 이상 감소되는데 효과적인 양으로 전술한 임의의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이러한 방법들에 있어서, 상기 출혈 장애는 응고 장애, 혈소판감소증, 상처 치유 장애, 외상, 폭발(blast) 외상, 척수 손상 또는 출혈의 증상일 수 있다.
본 발명은 질환의 치료용 약물 제조를 위한 본 발명의 임의의 조성물의 용도를 또한 제공하는데, 이때 상기 약물은 질환 치료에 효과적인 양의 상기 조성물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 출혈 장애 치료용 약물 제조를 위한 본 발명의 임의의 조성물의 용도를 또한 제공하는데, 이때 상기 약물은 출혈을 감소시키는데 효과적인 양의 상기 조성물을 포함한다. 본 발명은 출혈 장애 치료용 약물 제조를 위한 본 발명의 임의의 조성물의 용도를 또한 제공하는데, 이때 상기 약물은 투여가 없거나, 염수를 투여한 경우와 비교하였을 때 출혈 시간이 15% 이상 감소시키는데 효과적인 양의 상기 조성물을 포함한다. 본 발명의 임의의 용도에 있어서, 상기 약물은 응고 장애, 혈소판감소증, 상처 치유 장애, 외상, 폭발 외상, 척수 손상 또는 출혈의 증상인 출혈 장애를 치료하기 위하여 투여될 수 있다.
본 발명은 질환, 이를 테면 출혈 장애 치료용으로 본 발명의 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 응고 장애, 혈소판감소증, 상처 치유 장애, 외상, 폭발 외상, 척수 손상 또는 출혈의 증상인 출혈 장애 치료용으로 본 발명의 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 출혈 장애 치료용 조성물을 제공하는데, 이때 상기 조성물은 투여가 없거나, 염수를 투여한 경우와 비교하였을 때 출혈 시간이 15% 이상 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.
도 1은 본 발명의 PLGA-PLL 나노입자의 도식을 제공한다.
도 2a-도 2b는 시험관에서 출혈 시간에 있어서 나노입자의 효과를 나타낸다.
도 3은 락테이트화된 링거 대조와 비교하여 누적 혈액 손실을 나타낸다. 간 손상은 시간 0에서 있으며, 자유롭게 출혈되도록 둔다. 혈액은 흡인을 통하여 수집된다. 이 곡선은 4개 실험을 평균으로 낸 누적 혈액 손실을 나타낸다. 혈액 손실의 대부분은 첫 5분 이내에 일어난다. 점선은 SEM을 나타낸다.
도 4는 4가지 시간 범위, 투여전 (0-5 분, 380+/-59 ml), 투여후 (5-15 분, 174+/-106 ml), 주입후 1 (15-30 분, 150+/-111 ml), 그리고 주입후 2 (30-60 분, 70+/-95 ml)로 분류된 혈액 손실을 나타낸다. +/-는 S.D.를 나타낸다.
도 5는 NP1 (손상 후 5분 시점에서 0.1 mg/kg 투여분량)의 투여후 혈액 손실 속도를 나타낸다. +/-는 S.D.를 나타낸다.
도 6은 NP100 (손상 후 5분 시점에서 0.1 mg/kg 투여분량)의 투여 후 혈액 손실 속도를 나타낸다. +/-는 S.D.를 나타낸다.
도 7: 돼지 1: 2 mg/kg PLA-PEG-NP's -PAA (제타=-30mV)의 첫 투여. CARPA는 t=0 분에서 최초 손상 후 t=1-2 분, 8-12 분, 및 61-65 분 시점에서 주사 직후 존재한다.
도 8: 돼지 1: 최초 입자 주사 후 85분 시점에서 PLA-PEG nP +PAA (제타=-30 mV)의 두 번째 투여.
도 9는 순수 입자 투여 동안 응고 시간을 나타낸다. 응고병증은 선천적으로 존재하는 것으로 보이지 않는다.
도 10 60mg PLGA-PLL-PEG -pAA (제타=-1.29 mV)의 첫 투여. ROTEM (NATEM) 및 헤모크론(Hemochron) (APTT)에 의해 측정하였을 때 응고 프로파일이 포함된, 부작용은 볼 수 없었다.
도 11은 2 mg/kg PLGA-PLL-PEG-NP =pAA (제타 = +22.97 mV)의 두 번째 투여를 나타낸다.
도 12는 간 손상 유도된 CARPA 에피소드 후 혈액 손상에서 표적화 모이어티 없이 나노입자의 효과를 나타낸다. 이것은 대조 시스템이다.
도 13은 비-CARPA 응답자에서 상향조절된 사이토킨과 비교하여 CARPA에서 상향조절된 사이토킨의 비율을 나타내는데, 이는 보체 활성화를 위한 전통적 염증성 표지들이 상향조절되었음을 설명한다.
도 14는 새로운 대상에서 기진한 동물 시간 비율을 나타낸다. 통계학적 차이는 탐지되지 않았다. 활동 (5 마리 동물), 대조 (5마리 동물) 그리고 LR (6마리 동물).
FDA-승인된 재료들에 기반을 둔 기능화된 나노입자가 포함된 조성물이 제공된다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 나노입자는 중추신경계 (CNS)에 외상을 입은 후 지혈시 손상 부위에서 출혈 시간을 감소시키고, 국소화된 약물 운반 수단을 제공한다.
활성화된 혈소판을 표적으로 하는 지혈 나노입자의 정맥 투여는 약간의 가능성과 함께, 일정범위의 검사에 의해 다수의 집단에서 조사되었다. 혈소판 적혈구(thromboerythrocytes)라고 불리는 RGD 접합된 적혈구 세포 (RBCs)는 시험관내에서 가능성을 보여주었지만, 혈소판감소성 영장류에서 연장된 출혈 시간을 상당히 감소시키지는 않았다. 피브리노겐-피복된 알부민 미립자, "신소사이트(Synthocytes)" 및 피브리노겐 γ 쇄 도데카펩티드 (HHLGGAKQAGDV (서열 번호: 13))를 운반하는 다른 것에 의해 이용된 리포좀은 혈소판감소성 토끼의 출혈 모델에서 성공적이었다. 그러나, 신소사이트(Synthocytes)는 정상적인 토끼의 출혈 치료에서는 효과가 없었으며, 상기 리포좀은 본 목적을 위하여 연구되어왔던 것으로 보이지 않는다.
이러한 작업으로부터 몇 가지 것들이 분명해진다. 첫째, 입자가 너무 크고 또는 면역원성 재료를 운반하는 경우, 이들 입자는 비-특이적 혈전증을 촉발시킬 수 있다. 응고 시스템은 상당히 복잡하기 때문에, 시험관 연구와 일치되게, 기능적으로-지향된 결과들을 가진 다중 출혈 모델 (및 종)을 이용하여, 혈소판 대체제에 관한 일련의 공개된 지침에서 FDA에서 인지된 바와 같이, 잠재적 치료법이 완벽하게 평가된다. 안전성 기준에는 첨가제로 인한 부혈전(Prothrombotic) 가능성, 면역원성 및 독성이 있으며, 효과 기준은 생체 및 시험관 테스트의 배터리(battery)에 근거한다.
본 명세서에서 제공된 실험들은 본 발명의 지혈 나노입자가 대퇴정맥 손상, 간 손상, 및 폭발 외상이 포함된 설치류의 다수의 외상 모델에서 출혈을 감소시켰음을 보여준다. 또한, 이들 지혈 나노입자는 돼지의 무딘(blunt) 외상 간 손상에 뒤따른다.
군인 인력에 의해 지속된 비-압축 손상을 모방하는 돼지 간 손상 모델이 개발되었고, 다른 지혈 중재 연구와 직접적인 비교가 허용된다. 간략하게 설명하자면, 간의 좌측 엽이 단리되었고, 이등분되어, 공동이 봉합되고, 치료 섭생의 함수로써 시간의 경과에 따른 혈액 손실양은 지속적인 모니터 및 혈액 분석과 결합된다.
우선, 나노입자의 매우 낮은 투여분량 (0.2 mg/kg)은 과도한 출혈로 이어졌다. 손상안된 돼지에서 입자 테스트는 강력한 보체-연합된 반응을 설명하는데, 이는 상기 나노입자 상에 있는 전하와 관련되었다. 본 발명의 나노입자는 중성 전하를 갖도록 공작되었고, 보체 반응에서 이들 입자에 의해 유도된 완화를 초래하였다.
본 발명은 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하는데, 상기 나노입자는 코어, 물 가용성 폴리머 및 펩티드를 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 물 가용성 폴리머의 제 1 말단에서 상기 코어에 부착되며, 상기 펩티드는 상기 물 가용성 폴리머의 제 2 말단에 부착되며, 상기 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 펩티드가 당단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 결합을 허용하도록 충분한 길이를 가지고 있으며, 상기 조성물은 폴옥사머를 더 포함한다.
본 발명의 예시적인 나노입자는 도 1에서 제시되는데, 상기 나노입자는 PLGA-PLL 나노구(nanosphere) 코어 (~200 nm), 제 1 말단에서 상기 코어에 접합된 PEG 암(arms) 그리고 제 2 말단에서 PEG 암에 접합된 RGD 펩티드를 포함한다. 이 나노입자는 활성화된 혈소판에 결합한다. 본 발명의 상기 나노입자의 속성은 맥관 손상 부위에 특이성, 생물적합성 그리고 생물분해가능성을 포함한다. 또한, 상기 나노입자는 실온에서 건조한 상태오 보관될 수 있고, 신속하고 용이하게 투여될 수 있다.
나노입자들( Nanoparticles )
본 명세서는 코어, 물 가용성 폴리머 및 펩티드를 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 물 가용성 폴리머의 제 1 말단에서 상기 코어에 부착되며, 상기 펩티드는 상기 물 가용성 폴리머의 제 2 말단에 부착되며, 상기 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 펩티드가 당단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 결합을 허용하도록 충분한 길이를 가지고 있으며, 상기 조성물은 폴옥사머를 더 포함하는 나노입자를 제공한다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 펩티드는 선형 또는 환형이다. 본 명세서의 다수의 나노입자가 포함된 조성물에서, 상기 조성물은 나노입자를 포함하는 것으로 고려되며, 이때 모든 펩티드는 선형이며, 모든 펩티드는 환형이거나, 또는 선형과 환형 펩티드 혼합물이 존재하는 것으로 인지될 것이다.
본 명세서의 나노입자는 온도 안정적이어서, 이들은 동일 구조를 기본적으로 유지하거나, 및/또는 광범위한 온도 범위에 걸쳐 기본적으로 동일한 기능을 유지한다. "기본적으로 동일한 구조" 및 "기본적으로 동일한 기능"이란," 본 명세서에서 "기본적으로 동일한"이란 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 10%, 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 10%, 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 10%, 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 9%, 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 8%, 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 7%, 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 6%, 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 5%, 또는 고유 투여량의 플러스 또는 마이너스 5%-10%의 투여량에서 이의 사용을 실행하기 위하여 상기 나노입자의 능력에 영향을 주는 변화가 없음을 의미하는 것으로 고려된다. 다양한 구체예들에서, 상기 나노입자는 상기 나노입자가 생산되었던 온도와 무관하게 생리학적 온도에서 기본적으로 동일한 구조 및/또는 기본적으로 동일한 기능을 유지한다. 생리학적 온도 이상으로 상승된 온도에서 기본적으로 동일한 구조 및/또는 기본적으로 동일한 기능을 유지하는 나노입자 또한 고려된다. 상승된 온도에서 기본적으로 동일한 구조 및/또는 기본적으로 동일한 기능을 유지하는 능력은 다수의 많은 이유, 예를 들면 안정화 공정이 포함되나, 이에 국한되지 않는 이유로 중요하다. 다른 한편, 낮아진 온도에서 기본적으로 동일한 구조 및/또는 기본적으로 동일한 기능을 유지하는 나노압자 또한 고려된다. 예를 들면, 동결 온도 또는 그 이하에서 기본적으로 동일한 구조 및/또는 기본적으로 동일한 기능을 유지하는 나노입자는 장기간 보관을 요하는 또는 장기간 보관으로 이익을 얻는 제형에서 고려된다. 다양한 측면들에 있어서, 본 명세서의 상기 나노입자는 35℃를 넘는, 40℃를 넘는, 45℃를 넘는, 50℃를 넘는, 55℃를 넘는, 60℃를 넘는, 65℃를 넘는, 70℃를 넘는, 71℃를 넘는, 72℃를 넘는, 73℃를 넘는, 74℃를 넘는, 75℃를 넘는, 76℃를 넘는, 77℃를 넘는, 78℃를 넘는, 79℃를 넘는 또는 80℃를 넘는 용융 온도를 갖는다.
본 명세서의 모든 측면의 상기 나노입자는 실온에서 최소한 5 일, 최소한 6 일, 최소한 7 일, 최소한 8 일, 최소한 9 일, 최소한 10 일, 최소한 11 일, 최소한 12 일, 최소한 13 일 또는 최소한 14 일 또는 그 이상 기간 동안 안정적이다.
본 명세서의 나노입자들은 다수의 임의의 상이한 모양을 보유하는 것이 고려된다. 특정 측면들에서 상기 나노입자의 모양은 이 나노입자의 생산 방법에 대한 함수다. 다른 측면들에서, 상기 나노입자는 나노입자의 생산 공정 전, 공정 후, 또는 공정 동안에 형성된 모양을 획득한다. 다양한 구체예들에서, 타원체 모양을 갖는 나오입자가 제공된다. 다양한 크기를 갖는 타원체 나노입자 (본 명세서에서 나노구로 지칭됨)가 고려되는데, 이때, 예를 들면 0.1 미크론 내지 0.5 미크론 사이, 0.2 미크론 내지 0.4 미크론 사이, 0.25 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.3 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.325 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.13 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.14 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.15 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.16 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.17 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.18 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.19 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.20 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.21 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.21 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.20 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.19 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.18 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.17 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.16 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.15 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.14 미크론 사이, 또는 0.12 미크론 내지 0.13 미크론 사이의 직경을 보유한 나노입자가 고려된다. 다양한 측면들에서, 0.01 미크론에서 1.0 미크론, 0.05 미크론에서 1.0 미크론, 0.05 미크론에서 0.95 미크론, 0.05 미크론에서 0.9 미크론, 0.05 미크론에서 0.85 미크론, 0.05 미크론에서 0.8 미크론, 0.05 미크론에서 0.75 미크론, 0.05 미크론에서 0.7 미크론, 0.05 미크론에서 0.65 미크론, 0.05 미크론에서 0.6 미크론, 0.05 미크론에서 0.55 미크론, 0.05 미크론에서 0.5 미크론, 0.1 미크론에서 1 미크론, 0.15 미크론에서 1.0 미크론, 0.2 미크론에서 1 미크론, 0.25 미크론에서 1.0 미크론, 0.3 미크론에서 1 미크론, 0.35 미크론에서 1.0 미크론, 0.4 미크론에서 1 미크론, 0.45 미크론에서 1.0 미크론, 또는 0.5 미크론에서 1 미크론 까지의 직경을 갖는 나노입자가 고려된다. 본 명세서에서 제공되는 나노입자의 조성물에서, 구형 나노입자는 모두 동일한 직경을 갖는 동질적이거나, 또는 상기 조성물 안의 최소한 2개의 나노입자는 이질적으로 상이한 직경을 갖는다.
비-타원체인 나노입자가 또한 제공된다. 막대, 섬유 또는 위스커 모양을 갖는 다른 나오입자들을 포함한다. 막대, 섬유 또는 위스커 구체예들에서, 상기 나노입자는 순환계로부터 제거율을 피하거나, 늦추거나, 또는 감소시키기 위한 충분히 높은 형상 비율(aspect ratio)을 갖는다.
형상 비율은 당분야에서 인지되는 용어로써, 높은 형상 비율이란 길고 좁은 모양을 나타내고, 낮은 형상 비율은 짧고, 두꺼운 모양을 나타낸다.
본 명세서의 나노입자는 최소한 3, 최소한 3.5, 최소한 4.0, 최소한 4.5, 최소한 5.0, 최소한 5.5, 최소한 6.0, 최소한 6.5, 최소한 7.0, 최소한 7.5, 최소한 8.0, 최소한 8.5, 최소한 9.0, 최소한 9.5, 최소한 10.0 또는 그 이상의 폭대 대한 길이의 형상 비율을 갖는 것으로 고려된다. 고려되는 나노입자의 조성물에서, 상기 나노입자는 한 구체예에서 동일한 형상 비율을 보유하며, 그리고 대체 구체예에서 상기 조성물 안의 최소한 두 개의 나노입자는 상이한 형상 비율을 갖는다. 나노입자의 조성물은 평균적으로 기본적으로 동일한 형상 비율을 갖는 것을 또한 특징으로 한다. 이 발명에서 시용된 바와 같이 "기본적으로 동일한"이란 형상 비율에서 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7% 약 6% 또는 최대 약 5% 변이가 포함된다는 것을 말한다. 여전히 다른 측면들에서, 상기 조성물에서 나노입자는 약 1% 내지 200% 사이, 약 1% 내지 150% 사이, 약 1% 내지 100% 사이, 약 1% 내지 약 50% 사이, 약 50% 내지 200% 사이, 약 100% 내지 200% 사이, 그리고 약 150% 내지 200% 사이의 형상 비율을 보유하는 나노입자 조성물이 제공된다. 대안으로, 상기 조성물에서 나노입자는 약 X% 내지 Y%의 형상 비율을 보유하며, 이때 X는 1에서 최대 100이 되며, Y는 100에서 최대 200이 된다.
본 명세서는 또한 다수의 나노입자를 또한 제공한다. 본 명세서에서 제공된 구형의 다수의 나노입자를 포함하는 조성물에서, 다수의 나노입자는 0.1 미크론 내지 0.5 미크론 사이, 0.2 미크론 내지 0.4 미크론 사이, 0.25 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.3 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.325 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 약 0.12 미크론, 약 0.13 미크론, 약 0.14 미크론, 약 0.15 미크론, 약 0.16 미크론, 약 0.17 미크론, 약 0.18 미크론, 약 0.19 미크론, 약 0.20 미크론, 약 0.21 미크론, 약 0.22 미크론, 약 0.23 미크론, 약 0.24 미크론, 약 0.25 미크론, 약 0.26 미크론, 약 0.27 미크론, 약 0.28 미크론, 약 0.29 미크론, 약 0.30 미크론, 약 0.31 미크론, 약 0.32 미크론, 약 0.33 미크론, 약 0.34 미크론, 약 0.35 미크론, 약 0.36 미크론, 약 0.37 미크론, 약 0.38 미크론, 약 0.39 미크론, 약 0.40 미크론, 약 0.41 미크론, 약 0.42 미크론, 약 0.43 미크론, 약 0.44 미크론, 약 0.45 미크론, 약 0.46 미크론, 약 0.47 미크론, 약 0.48 미크론, 약 0.49 미크론, 약 0.50 미크론, 약 0.41 미크론, 약 0.52 미크론, 약 0.53 미크론, 약 0.54 미크론, 약 0.55 미크론, 약 0.56 미크론, 약 0.57 미크론, 약 0.58 미크론, 약 0.59 미크론, 약 0.60 미크론, 약 0.61 미크론, 약 0.62 미크론, 약 0.63 미크론, 약 0.64 미크론, 약 0.65 미크론, 약 0.66 미크론, 약 0.67 미크론, 약 0.68 미크론, 약 0.69 미크론, 약 0.70 미크론, 약 0.71 미크론, 약 0.72 미크론, 약 0.73 미크론, 약 0.74 미크론, 약 0.75 미크론, 약 0.76 미크론, 약 0.77 미크론, 약 0.78 미크론, 약 0.79 미크론, 약 0.80 미크론, 약 0.81 미크론, 약 0.82 미크론, 약 0.83 미크론, 약 0.84 미크론, 약 0.85 미크론, 약 0.86 미크론, 약 0.87 미크론, 약 0.88 미크론, 약 0.89 미크론, 약 0.90 미크론, 약 0.91 미크론, 약 0.92 미크론, 약 0.93 미크론, 약 0.94 미크론, 약 0.95 미크론, 약 0.96 미크론, 약 0.97 미크론, 약 0.98 미크론, 약 0.99 미크론, 약 1.0 미크론, 또는 그 이상의 평균 직경을 보유한다.
다양한 측면들에 있어서, 다수의 구형 나노입자는 모든 나노입자의 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상은 0.1 미크론 내지 0.5 미크론 사이, 0.2 미크론 내지 0.4 미크론 사이, 0.25 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.3 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.325 미크론 내지 0.375 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.13 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.14 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.15 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.16 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.17 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.18 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.19 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.20 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.21 미크론 내지 0.22 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.21 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.20 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.19 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.18 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.17 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.16 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.15 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.14 미크론 사이, 0.12 미크론 내지 0.13 미크론 사이, 0.01 미크론에서 1.0 미크론 까지, 0.05 미크론에서 1.0 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.95 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.9 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.85 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.8 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.75 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.7 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.65 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.6 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.55 미크론 까지, 0.05 미크론에서 0.5 미크론 까지, 0.1 미크론에서 1 미크론 까지, 0.15 미크론에서 1.0 미크론 까지, 0.2 미크론에서 1 미크론 까지, 0.25 미크론에서 1.0 미크론 까지, 0.3 미크론에서 1 미크론 까지, 0.35 미크론에서 1.0 미크론 까지, 0.4 미크론에서 1 미크론 까지, 0.45 미크론에서 1.0 미크론 까지, 또는 0.5 미크론에서 1 미크론 까지의 직경을 보유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물 안의 나노입자는 중성적으로 하전되어, 이러한 나노입자는 약 -3.0 mV 내지 약 3.0 mV의 제타 전위를 보유한다. 예를 들면, 상기 나노입자는 -3.0 mV 내지 약 2.9 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 2.7 mV, -3.0 mV 내지 약 2.5 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 2.3 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 2.0 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 1.7 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 1.5 mV, -3.0 mV 내지 약 1.3 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 1.0 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 0.75 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 0.5 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 0.25 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 0.1 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 0.05 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 0.125 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 0 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 -0.125, 약 -3.0 mV 내지 약 -0.25 mV, 약 -3.0 내지 약 -0.50 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 -0.75, 약 -3.0 mV 내지 약 -1.0 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 -1.3 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 -1.5 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 -1.7 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 -2.0 mV, 약 -3.0 mV 내지 약 -2.3 mV, -3.0 mV 내지 약 -2.7 mV, -3.0 mV 내지 약 3 mV, -2.5 내지 약 3.0 mV, -2.5 mV 내지 약 2.9 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 2.7 mV, -2.5 mV 내지 약 2.5 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -2.5 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 2.0 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 1.7 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 1.5 mV, -2.5 mV 내지 약 1.3 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 1.0 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0.75 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0.5 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0.25 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0.1 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0.05 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0.125 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -0.125, 약 -2.5 mV 내지 약 -0.25 mV, 약 -2.5 내지 약 -0.50 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -0.75, 약 -2.5 mV 내지 약 -1.0 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -1.3 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -1.5 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -1.7 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -2.0 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 -2.3 mV, -2.0 내지 약 3.0 mV, -2.0 mV 내지 약 2.9 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 2.7 mV, -2.0 mV 내지 약 2.0 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 2.5 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 2.0 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 1.7 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 1.5 mV, -2.0 mV 내지 약 1.3 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 1.0 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 0.75 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 0.5 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 0.25 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 0.1 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 0.05 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 0.125 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 0 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 -0.125, 약 -2.0 mV 내지 약 -0.25 mV, 약 -2.0 내지 약 -0.50 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 -0.75, 약 -2.0 mV 내지 약 -1.0 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 -1.3 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 -1.5 mV, 약 -2.0 mV 내지 약 -1.7 mV, 약 -1.5 내지 약 3.0 mV, -1.5 mV 내지 약 2.9 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 2.7 mV, -1.5 mV 내지 약 2.5mV, 약 -1.5 mV 내지 약 2.5 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 2.0 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 1.7 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 1.5 mV, -1.5 mV 내지 약 1.3 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 1.0 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 0.75 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 0.5 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 0.25 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 0.1 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 0.05 mV, 약 -2.5 mV 내지 약 0.125 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 0 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 -0.125, 약 -1.5 mV 내지 약 -0.25 mV, 약 -1.5 내지 약 -0.50 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 -0.75, 약 -.5 mV 내지 약 -1.0 mV, 약 -1.5 mV 내지 약 -1.3 mV, -1.0 내지 약 3.0 mV, -1.0 mV 내지 약 2.9 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 2.7 mV, -1.0 mV 내지 약 2.5mV, 약 -1.0 mV 내지 약 2.5 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 2.0 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 1.7 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 1.5 mV, -1.0 mV 내지 약 1.3 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 1.0 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 0.75 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 0.5 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 0.25 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 0.1 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 0.05 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 0.125 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 0 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 -0.125, 약 -1.0 mV 내지 약 -0.25 mV, 약 -1.0 내지 약 -0.50 mV, 약 -1.0 mV 내지 약 -0.75, 약 -1.0 mV 내지 약 -1.0 mV, -0.5 mV 내지 약 3.0 mV, -0.5 mV 내지 약 2.9 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 2.7 mV, -0.5 mV 내지 약 2.5mV, 약 -0.5 mV 내지 약 2.5 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 2.0 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 1.7 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 1.5 mV, -0.5 mV 내지 약 1.3 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 1.0 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 0.75 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 0.5 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 0.25 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 0.1 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 0.05 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 0.125 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 0 mV, 약 -0.5 mV 내지 약 -0.125, 약 -0.5 mV 내지 약 -0.25 mV, 0 mV 내지 약 3.0 mV, 0 mV 내지 약 2.9 mV, 약 0 mV 내지 약 2.7 mV, 0 mV 내지 약 2.5mV, 약 0 mV 내지 약 2.5 mV, 약 0 mV 내지 약 2.0 mV, 약 0 mV 내지 약 1.7 mV, 약 0 mV 내지 약 1.5 mV, 0 mV 내지 약 1.3 mV, 약 0 mV 내지 약 1.0 mV, 약 0 mV 내지 약 0.75 mV, 약 0 mV 내지 약 0.5 mV, 약 0 mV 내지 약 0.25 mV, 약 0 mV 내지 약 0.1 mV, 약 0 mV 내지 약 0.05 mV, 약 0 mV 내지 약 0.125 mV, 0.25 mV 내지 약 3.0 mV, 0.25 mV 내지 약 2.9 mV, 약 0.25 mV 내지 약 2.7 mV, 0.25 mV 내지 약 2.5mV, 약 0.25 mV 내지 약 2.5 mV, 약 0.25 mV 내지 약 2.0 mV, 약 0.25 mV 내지 약 1.7 mV, 약 0.25 mV 내지 약 1.5 mV, 0.25 mV 내지 약 1.3 mV, 약 0.25 mV 내지 약 1.0 mV, 약 0.25 mV 내지 약 0.75 mV, 약 0.25 mV 내지 약 0.5 mV, 0.5 mV 내지 약 3.0 mV, 0.5 mV 내지 약 2.9 mV, 약 0.5 mV 내지 약 2.7 mV, 0.5 mV 내지 약 2.5mV, 약 0.5 mV 내지 약 2.5 mV, 약 0.5 mV 내지 약 2.0 mV, 약 0.5 mV 내지 약 1.7 mV, 약 0.5 mV 내지 약 1.5 mV, 0.5 mV 내지 약 1.3 mV, 약 0.5 mV 내지 약 1.0 mV, 약 0.5 mV 내지 약 0.75 mV, 0.75 mV 내지 약 3.0 mV, 0.75 mV 내지 약 2.9 mV, 약 0.75 mV 내지 약 2.7 mV, 0.75 mV 내지 약 2.5mV, 약 0.75 mV 내지 약 2.5 mV, 약 0.75 mV 내지 약 2.0 mV, 약 0.75 mV 내지 약 1.7 mV, 약 0.75 mV 내지 약 1.5 mV, 0.75 mV 내지 약 1.3 mV, 약 0.75 mV 내지 약 1.0 mV, 1.0 mV 내지 약 3.0 mV, 1.0 mV 내지 약 2.9 mV, 약 1.0 mV 내지 약 2.7 mV, 1.0 mV 내지 약 2.5mV, 약 1.0 mV 내지 약 2.5 mV, 약 1.0 mV 내지 약 2.0 mV, 약 1.0 mV 내지 약 1.7 mV, 약 1.0 mV 내지 약 1.5 mV, 1.0 mV 내지 약 1.3 mV, 1.5 mV 내지 약 3.0 mV, 1.5 mV 내지 약 2.9 mV, 약 1.5 mV 내지 약 2.7 mV, 1.5 mV 내지 약 2.5 mV, 약 1.5 mV 내지 약 2.5 mV, 약 1.5 mV 내지 약 2.0 mV, 약 1.5 mV 내지 약 1.7 mV, 1.7 mV 내지 약 3.0 mV, 1.7 mV 내지 약 2.9 mV, 약 1.7 mV 내지 약 2.7 mV, 1.7 mV 내지 약 2.5 mV, 약 1.7 mV 내지 약 2.5 mV, 약 1.7 mV 내지 약 2.0 mV, 2.0 mV 내지 약 3.0 mV, 2.0 mV 내지 약 2.9 mV, 약 2.0 mV 내지 약 2.7 mV, 2.0 mV 내지 약 2.5mV, 약 2.0 mV 내지 약 2.5 mV, 2.5 mV 내지 약 3.0 mV, 2.5 mV 내지 약 2.9 mV, 약 2.5 mV 내지 약 2.7 mV, 2.7 mV 내지 약 3.0 mV 또는 2.7 mV 내지 약 2.9 mV의 제타 전위를 갖는다.
본 명세서는 당분야에 잘 공지된 그리고 통상적으로 실행되는 미세구조물제작(microfabrication) 공정을 이용하여 형성된 임의의 모양을 가진 나노입자를 더 제공한다. 미세구조물제작 방법에 있어서, 상기 나노입자의 크기 및 모양은 디자인에 의해 사전결정된다.
코어(Core)
상기에서 설명된 나노입자가 제공되는데, 이때 상기 코어는 폴리머다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 코어는 결정 폴리머다. 본 명세서에서 이용되며, 당분야에서 이해되는 "결정(crystalline)"은 규칙적인 3차원 배열로 된 분자 배열을 의미하는 것으로 정의된다. 다른 측면들에서, 상기 폴리머는 모든 분자가 규칙적인 3차원 배열로 배열된 것 대신 결정과 무정형(amorphous) 영역을 모두 포함하는 반(semi)-결정이다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 코어는 단일 폴리머, 블럭 코폴리머, 또는 삼중블럭 코폴리머다. 특이적 측면들에서, 상기 코어는 PLGA, PLA, PGA, (폴리 (ε-카프로락톤) PCL, PLL, 셀룰로오즈, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 덴드라이머-기반의 폴리머 또는 이의 조합을 포함한다.
다양한 측면들에 있어서, 상기 코어는 생물분해가능한 또는 생물분해불가능한, 또는 다수의 나노입자에서, 생물분해가능한 코어와 생물분해불가능한 코어의 조합으로 제형화되는 것이 고려된다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 코어는 고체, 다공성(porous) 또는 중공성(hollow)이다. 다수의 나노입자에서, 고체, 다공성 및/또는 중공성 코어의 혼합물이 포함되는 것으로 예상된다.
본 명세서의 임의의 측면의 나노입자는 상기 코어가 대안으로 금, 은, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈, ZnS, ZnO, Ti, TiO2, Sn, SnO2, Si, SiO2, Fe, Fe+4, 강철, 코발트-크롬 합금, Cd, CdSe, CdS, and CdS, 티타늄 합금, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, Cd3As2, InAs, GaAs, 셀룰로오즈 또는 덴드라이머 구조로 구성된 군에서 선택된 물질인 것들을 포함한다.
히드로겔 코어 또한 제공된다. 한 측면에서, 상기 히드로겔 코어는 더 높은 수준의 온도 안정성을 제공하여, 혈관을 전단할 가능성이 적으며, 비-특이적 혈전증을 유도하여, 더 큰 나노입자 형성이 허용된다.
물 가용성 폴리머(Water Soluble Polymers)
본 명세서의 나노입자가 제공되는데, 이때 상기 물 가용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분기된 PEG, 폴리시알산 (PSA), 탄수화물, 폴리사카라이드, 풀루란, 치토산, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥시드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일몰포린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 안하이드리드, 폴리스티렌-코-말레산 안하이드리드, 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아세탈, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 안하이드리드 코폴리머, 폴리 (β-아미노산) (동종폴리머 또는 렌덤 코폴리머), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종폴리머 (PPG) 그리고 다른 폴리알킬렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POG) (가령, 글리세롤) 및 다른 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸화된 포도당, 콜론산 또는 다른 탄수화물 폴리머, 피콜(Ficoll) 또는 덱스트란 그리고 이의 조합 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서에서 고려되는 다수의 나노입자에서, 다양한 측면에서 나노입자 각각은 동일한 물 가용성 폴리머를 보유하는 것이 고려되거나, 또는 대안으로, 다수의 나노입자중 최소한 두 개의 나노입자는 이에 부착된 상이한 물 가용성 폴리머를 갖는 것이 고려된다.
특이적 측면에서, 본 명세서의 상기 나노입자에서 상기 물 가용성 폴리머는 PEG인 것이다. 이 측면에서 나노입자의 경우, PEG는 100 Da 내지 10,000 Da, 500 Da 내지 10,000 Da, 1000 Da 내지 10,000 Da, 1500 Da 내지 10,000 Da, 2000 Da 내지 10,000 Da, 2500 Da 내지 10,000 Da, 3000 Da 내지 10,000 Da, 3500 Da 내지 10,000 Da, 4000 Da 내지 10,000 Da, 4500 Da 내지 10,000 Da, 5000 Da 내지 10,000 Da, 5500 Da 내지 10,000 Da, 1000 Da 내지 9500 Da, 1000 Da 내지 9000 Da, 1000 Da 내지 8500 Da, 1000 Da 내지 8000 Da, 1000 Da 내지 7500 Da, 1000 Da 내지 7000 Da, 1000 Da 내지 6500 Da, 또는 1000 Da 내지 6000 Da 사이의 평균 분자량을 보유한다. 대안으로, PEG의 평균 분자량은 약 100, Da, 200 Da, 300 Da, 400 Da, 1000 Da, 1500 Da, 3000 Da, 3350 Da, 4000 Da, 4600 Da, 5,000 Da, 8,000 Da, 또는 10,000 Da인 나노입자다. 다수의 나노입자에서, 각 나노입자는 동일한 분자량의 PEG 물 가용성 폴리머에 부착되며, 대안으로 다수의 나노입자중 최소한 두 개의 나노입자는 동일한 분자량을 보유하지 않은 PEG 물 가용성 폴리머에 각각 부착되는 것이 고려된다.
명세서의 상기 나노입자는 물 가용성 폴리머가 0.1:1, 0.2:1, 0.3:1, 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 또는 그 이상의 몰비율에서 상기 코어에 부착된 것들을 포함한다. 다양한 측면들에서, 다수의 나노입자에서 각각의 나노입자에 대하여 코어에 대한 상기 물 가용성 폴리머의 비율이 동일한 다수의 나노입자가 제공되며, 그리고 대안적 측면에서 다수의 나노입자중 최소한 두 개의 나노입자는 코어에 대한 물 가용성 폴리머 비율이 상이하다.
나노입자와 물 가용성 폴리머의 연합 정도는 다양한 측면에서 선택되는 투여 경로에 의해 결정된다.
펩티드
본 명세서의 상기 나노입자는 이들과 연합된 펩티드를 보유하는 것을 특징으로 한다. 본 명세서의 다양한 측면들에 있어서. 상기 펩티드는 선형 또는 환형이다. 특이적 구체예들에서, 상기 펩티드는 RGD, RGDS (서열 번호: 1), GRGDS (서열 번호: 2), GRGDSP (서열 번호: 3), GRGDSPK (서열 번호: 4), GRGDN (서열 번호: 5), GRGDNP (서열 번호: 6), GGGGRGDS (서열 번호: 7), GRGDK (서열 번호: 8), GRGDTP (서열 번호: 9), cRGD, YRGDS (서열 번호: 10) 또는 이의 변이체들로 구성된 군에서 선택된 코어 서열을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 변이체는 본 명세서에서 정의된 바의 코어 서열과 상기 코어 서열의 한 단부 또는 양 단부에 부착된 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 잔기를 보유한 펩티드, 본 명세서에서 정의된 코어 서열을 보유하지만, 상기 코어 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 대체 아미노산 잔기로 치환된 펩티드; 상기 대체 아미노산 잔기는 자연적으로-발생되는 아미노산 잔기 또는 자연적으로-발생되지 않는 아미노산 잔기이며, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 코어 서열을 보유하지만, 상기 코어 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결손된 펩티드, 또는 이의 조합의 펩티드를 포함하며, 이때 추가 아미노산 잔기, 아미노산 치환, 아미노산 결손 또는 변화의 조합은 상기 나노입자의 활성을 기본적으로 변경시키지 않는다. 이 측면에서 이용된 "기본적으로"는 명세서의 도처에서 설명된 의미와 동일하다.
다양한 측면들에 있어서, RGD 펩티드는 일렬 반복 배열이며, 이 측면의 구체예에서, RGD의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 복사체가 고려된다. 또다른 측면에서, 다중 복사체의 RGD 펩티드는 동일한 나노입자에 부착되며, 비록 그렇지 않더라도 렌덤 반복 배열에 있지 않다.
상기 나노입자가 다중 RGD 펩티드와 연합된 다양한 측면들에 있어서, 본 명세서는 RGD 펩티드의 모든 복사체가 동일한 나노입자 뿐만 아니라, 2개의 RGD 펩티드는 상이한 서열을 갖는 나노입자를 제공한다.
고려되는 다중 나노입자에서, 상기 RGD 펩티드 (또는 다중 복사체의 RGD 펩티드)는 다중 나노입자 각각에서 동일한 구체예들이 제공된다. 대체 측면들에서, 다수의 나노입자중 최소한 두 개의 나노입자 각각은 하나 또는 그 이상의 별개의 RGD 펩티드와 연합된다.
다양한 측면들에서, 나노입자 상의 펩티드 수, 가령, 상기 펩티드 밀도는 혈소판 응집에 영향을 준다.
폴옥사머(Poloxamers )
본 발명의 상기 나노입자 조성물은 안정화제인 폴옥사머를 포함한다. 상기 폴옥사머는 중성적으로-하전된 나노입자의 응집을 감소 또는 제거한다. 폴옥사머는 중앙에 소수성 블럭과 양단에 2개의 PEG기를 가진 비-이온성 삼중블럭 코폴리머다. 폴옥사머는 이 분야에서 Pluronics으로 공지되어 있다. 임의의 폴옥사머 또는 플루로닉(pluroinic)이 본 발명의 조성물에 이용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명은 상기 폴옥사머가 폴옥사머 101, 폴옥사머 105, 폴옥사머 108, 폴옥사머 122, 폴옥사머 123, 폴옥사머 124, 폴옥사머 181, 폴옥사머 182, 폴옥사머 183, 폴옥사머 184, 폴옥사머 185, 폴옥사머 188, 폴옥사머 212, 폴옥사머 215, 폴옥사머 217, 폴옥사머 231, 폴옥사머 234, 폴옥사머 235, 폴옥사머 237, 폴옥사머 238, 폴옥사머 282, 폴옥사머 284, 폴옥사머 288, 폴옥사머 331, 폴옥사머 333, 폴옥사머 334, 폴옥사머 335, 폴옥사머 338, 폴옥사머 401, 폴옥사머 402, 폴옥사머 403, 폴옥사머 407 및 Kolliphor P 188, Pluronic® 10R5, Pluronic® 17R2, Pluronic® 17R, Pluronic® 25R2, Pluronic® 25R4, Pluronic® 31R1, Pluronic® F 108 Cast Solid Surfacta, Pluronic® F 108 NF, Pluronic® F 108 Pastille, Pluronic® F 108NF Prill Poloxamer 338, Pluronic® F 127, Pluronic® F 127 NF, Pluronic® F 127 NF 500 BHT Prill, Pluronic® F 127 NF Prill Poloxamer 407, Pluronic® F 38, Pluronic® F 38 Pastille, Pluronic® F 68, Pluronic® F 68 Pastille, Pluronic® F 68 LF Pastille, Pluronic® F 68 NF, Pluronic® F 68 NF Prill Poloxamer 188, Pluronic® F 77, Pluronic® F 77 Micropastille, Pluronic® F 87, Pluronic® F 87 NF, Pluronic® F 87 NF Prill Poloxamer 237, Pluronic® F 88, Pluronic® F 88 Pastille, Pluronic® F 98, Pluronic® L 10, Pluronic® L 101, Pluronic® L 121, Pluronic® L 31, Pluronic® L 35, Pluronic® L 43, Pluronic® L 44 NF, Poloxamer 124, Pluronic® L 61, Pluronic® L 62, Pluronic® L 62 LF, Pluronic® L 62D, Pluronic® L 64, Pluronic® L 81, Pluronic® L 92, Pluronic® L44 NF, Pluronic® N 3, Pluronic® P 103, Pluronic® P 104, Pluronic® P 105, Pluronic® P 123 Surfactant, Pluronic® P 65, Pluronic® P 84, 및 Pluronic® P 85로 구성된 군에서 선택된, 조성물을 제공한다.
또한, 양단에 PEG를 보유하고, 중앙에 소수성이 더 큰 기를 갖는 다른 삼중블럭 코폴리머는 이 폴리머가 물에 가용성이라면, 상기 조성물에서 안정화제로 이용될 수 있다. 예시적인 삼중블럭 코폴리머는 ABA 구조를 갖는 폴리머, 이때 A는 PEG 또는 PVA 또는 또다른 물 가용성 폴리머이며, B는 PLA, PGA, PLGA, 폴리프로필렌, 폴리(프로필렌 옥시드), 폴리아미드, 폴리스티렌, 폴리부타디엔이 되는 예들이다. 대안으로, 상기 삼중블럭 코폴리머는 ABA 구조를 가지며, 이때 B는 PEG 또는 임의의 상기 물 가용성 폴리머이며, A는 임의의 소수성 또는 물 불용성 폴리머다.
본 발명의 조성물은 약 0.1% 폴옥사머, 약 0.2% 폴옥사머, 약 0.3% 폴옥사머, 약 0.4% 폴옥사머, 약 0.5% 폴옥사머, 약 0.6% 폴옥사머, 약 0.7% 폴옥사머, 약 0.8% 폴옥사머, 약 0.9% 폴옥사머, 약 1% 폴옥사머, 약 2% 폴옥사머, 약 3% 폴옥사머, 약 4% 폴옥사머, 약 5% 폴옥사머, 약 6% 폴옥사머, 약 7% 폴옥사머, 약 8% 폴옥사머, 약 9% 폴옥사머, 약 10% 폴옥사머, 약 11% 폴옥사머, 약 12% 폴옥사머, 약 13% 폴옥사머, 약 14% 폴옥사머, 약 15% 폴옥사머, 약 16% 폴옥사머, 약 17% 폴옥사머, 약 18% 폴옥사머, 약 19% 폴옥사머, 약 20% 폴옥사머, 약 21% 폴옥사머, 약 22% 폴옥사머, 약 23% 폴옥사머, 약 24% 폴옥사머, 약 25% 폴옥사머, 약 26% 폴옥사머, 약 27% 폴옥사머, 약 28% 폴옥사머, 약 29% 폴옥사머, 약 30% 폴옥사머, 약 31% 폴옥사머, 약 32% 폴옥사머, 약 33% 폴옥사머, 약 34% 폴옥사머, 약 35% 폴옥사머, 약 36% 폴옥사머, 약 37% 폴옥사머, 약 38% 폴옥사머, 약 39% 폴옥사머, 약 40% 폴옥사머, 약 41% 폴옥사머, 약 42% 폴옥사머, 약 43% 폴옥사머, 약 44% 폴옥사머, 약 45% 폴옥사머, 약 46% 폴옥사머, 약 47% 폴옥사머, 약 48% 폴옥사머, 약 49% 폴옥사머, 약 40% 폴옥사머, 약 51% 폴옥사머, 약 52% 폴옥사머, 약 53% 폴옥사머, 약 54% 폴옥사머, 약 55% 폴옥사머, 약 56% 폴옥사머, 약 57% 폴옥사머, 약 58% 폴옥사머, 약 59% 폴옥사머 또는 약 60% 폴옥사머를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 폴옥사머가 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 55%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 40%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 35%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 30%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 25%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 12%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 1%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 0.5%, 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 55%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 40%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 35%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 30%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 25%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 20%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 15%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 12%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 10%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 5%, 또는 상기 조성물의 약 0.5% 내지 약 1%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 55%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 40%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 35%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 30%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 25%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 20%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 15%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 12%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 10%, 또는 상기 조성물의 약 1% 내지 약 5%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 55%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 40%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 35%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 30%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 25%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 20%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 15%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 12%, 또는 상기 조성물의 약 5% 내지 약 10%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 60%, 또는 약 10% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 40%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 35%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 30%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 25%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 20%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 15%, 또는 상기 조성물의 약 10% 내지 약 12%, 또는 상기 조성물의 약 20% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약 20% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 20% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 20% 내지 약 35%, 또는 상기 조성물의 약 20% 내지 약 30%, 또는 상기 조성물의 약 20% 내지 약 25%, 또는 상기 조성물의 약 30% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약 30% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 30% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 30% 내지 약 40%, 또는 상기 조성물의 약 30% 내지 약 35%, 또는 상기 조성물의 약 40% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약40% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 40% 내지 약 45%, 또는 상기 조성물의 약 45% 내지 약 60%, 또는 상기 조성물의 약 45% 내지 약 50%, 또는 상기 조성물의 약 50% 내지 약 60%로 존재하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 폴옥사머가 최대 50 배의 나노입자 질량, 또는 최대 40 배의 나노입자 질량, 또는 최대 35 배의 나노입자 질량, 또는 최대 30 배의 나노입자 질량, 또는 최대 25 배의 나노입자 질량, 또는 최대 20 배의 나노입자 질량, 또는 최대 15 배의 나노입자 질량, 또는 최대 10 배의 나노입자 질량, 또는 최대 9 배의 나노입자 질량, 또는 최대 8 배의 나노입자 질량, 또는 최대 7 배의 나노입자 질량, 또는 최대 6 배의 나노입자 질량, 또는 최대 5 배의 나노입자 질량으로 존재하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 음전하를 부여하지 않은 다른 안정화제가 본 발명의 조성물에 이용될 수 있는데, 이를 테면 폴리(아크릴산), 폴옥사머 이를 테면 폴옥사머 188 또는 PEG이다.
나노입자와 함께 다른 화합물(Other Compounds with the Nanoparticle )
본 명세서의 나노입자는 치료요법적 화합물을 더 포함하는 것이 또한 고려된다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 치료요법적 화합물은 소수성이며, 여전히 다른 측면에서, 상기 치료요법적 화합물은 친수성이다. 본 명세서는 상기 치료요법적 화합물이 상기 나노입자에 공유적으로 부착되거나, 상기 나노입자와 비-공유적으로 연합되거나, 정전기적 상호작용을 통하여 상기 나노입자와 연합되거나, 또는 소수성 상호작용을 통하여 상기 나노입자와 연합된, 나노입자가 제공된다. 다양한 구체예들에서, 상기 치료요법적 화합물은 성장 인자, 사이토킨, 스테로이드, 또는 작은 분자이다. 하나 이상의 치료요법적 화합물이 나노입자와 연합된 구체예들이 고려된다. 이 측면에서, 상기 나노입자와 연합된 각 치료요법적 화합물은 동일하거나, 또는 상기 나노입자와 연합된 각 치료요법적 화합물은 상이하다. 본 명세서에서 제공된 다수의 나노입자에서, 다수의 나노입자에 있는 각 나노입자는 동일한 치료요법적 화합물 또는 화합물들과 연합되거나, 또는 대안으로, 다수의 나노입자중 최소한 두 개의 나노입자는 하나 또는 그 이상의 상이한 치료요법적 화합물과 각각 연합된다.
다양한 측면들에 있어서, 상기 치료요법적 화합물은 항암 화합물이며, 특이적 구체예들에서, 상기 치료요법적 화합물은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: 질소 무스타드, 이를 테면 메클로로-에타민, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜파란 및 클로람부칠이 포함되나 이에 한정되지 않은 알킬화 물질들; 니트로소우레아, 이를 테면 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 및 세무스틴 (메틸-CCNU)이 포함되나 이에 국한되지 않으며; 에틸렌이민/메틸멜라민 이를 테면 트리에틸렌멜라민 (TEM), 트리에틸렌, 티오포스파라미드 (티오테파), 헥사메틸멜라민 (HMM, 알트레타민); 알킬 술포네이트, 이를 테면 부술판을 포함하나 이에 국한되지 않으며; 트리아진 이를 테면 다카르바진 (DTIC); 엽산 유사체, 이를 테면 메토트렉세이트 및 트리메트렉세이트를 포함하는 항대사물질; 피리미딘 유사체 이를 테면 5-플로오르우라실, 플로오로데옥시우리딘, 겜시타빈, 시토신 아라비노시드 (AraC, 시타라빈), 5-아자시티딘, 2,2´-디플로오르데옥시시티딘이나 이에 국한되지 않으며; 퓨린 유사체 이를 테면 6-멀캅토퓨린, 6-티오구아닌, 아자티오프린, 2'-데옥시코포르미신 (펜토스타틴), 에리트로히드록시노닐아데닌 (EHNA), 플루다라빈 포스페이트, 그리고 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈, 2-CdA)을 포함하나 이에 국한되지 않으며; 세포분열저지성 약물, 이를 테면 파클리탁셀이 포함되나 이에 국한되지 않은 천연 산물; 빈블라스틴 (VLB), 빈크리스틴, 그리고 비노렐빈, 탁소테레, 에스트라무스틴, 및 에스트라무스틴 포스페이트이 포함되나 이에 국한되지 않는 빈카 알카로이드; 에피포도필로톡신, 이를 테면 에토포시드 및 테니포시드가 포함되나 이에 국한되지 않으며; 항생제, 이를 테면 악티노마이신 D, 다우노마이신 (루비도마이신), 독소루비친, 미토산트론, 이다루비친, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라미아신), 미토마이신C, 그리고 악티노마이신이 포함되나 이에 국한되지 않으며; 효소, 이를 테면 L-아스파라기나제가 포함되나 이에 국한되지 않으며; 생물학적 반응 변형제, 이를 테면 인터페론-알파, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF가 포함되나 이에 국한되지 않으며; 백금 배위 복합체, 이를 테면 시스플라틴 및 카르보플라틴이 포함되나 이에 국한되지 않은 기타 물질들; 안트라세네디온, 이를 테면 미토산트론이 포함되나 이에 국한되지 않으며; 치환된 요소, 이를 테면 히드록시우레아가 포함되나 이에 국한되지 않으며; N-메틸하이드라진 (MIH) 및 프로카르바진이 포함되나 이에 국한되지 않은 메틸하이드라진 유도체; 부신피질 억제제, 이를 테면 미토탄(o,p´-DDD) 및 아미노글루테티미드가 포함되나 이에 국한되지 않으며; 부신피질스테로이드 길항제, 이를 테면 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드가 포함되나 이에 국한되지 않는 호르몬 및 길항제; 프로게스틴, 이를 테면 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시 프로게스테론 아세테이트 및 메게스트를 아세테이트; 에스트로겐, 이를 테면 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물이 포함되나 이에 국한되지 않으며; 항에스트로겐, 이를 테면 탐옥시펜이 포함되나 이에 국한되지 않으며; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스트론/등가물이 포함된 안드로겐; 항안드로겐, 이를 테면 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체 및 류프로리드가 포함되나 이에 국한되지 않으며; 비-스테로이드 항안드로겐, 이를 테면 플루타미드가 포함되나 이에 국한되지 않으며; 염산 저해제; 티오신 키나제 저해제, 이를 테면 AG1478이 포함되나 이에 국한되지 않으며, 그리고 방사능감작화 화합물.
다양한 측면들에 있어서, 상기 치료요법적 화합물은 AG1478, 아치비친(acivicin), 아클라루비친(aclarubicin), 아코다졸(acodazole), 아크로닌(acronine), 아도제레신(adozelesin), 알데스루킨(aldesleukin), 아리트레티노인(alitretinoin), 알푸퓨리놀(allopurinol), 알트레타민(altretamine), 암보마이신(ambomycin), 아메탄트론(ametantrone), 아미포스틴(amifostine), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 암사크린(amsacrine), 아나스트로졸(anastrozole), 안트라마이신(anthramycin), arsenic trioxide(아르센 트리옥시드), 아스파라기나제(asparaginase), 아스페르린(asperlin), 아자씨티딘(azacitidine), 아제테파(azetepa), 아조토마이신(azotomycin), 바티마스타트(batimastat), 벤조데파(benzodepa), 비칼루타미드(bicalutamide), 비산트렌(bisantrene), 비스나피드 디메실레이트(snafide dimesylate) 비제레신(bizelesin), 블레오마이신(bleomycin), 브레퀴나르(brequinar), 브로피리민(bropirimine), 부술판(busulfan), 칵티노마이신(cactinomycin), 카루스테론(calusterone), 카페시타빈(capecitabine), 카라세미드(caracemide), 카르베티머(carbetimer), 카르보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(carmustine), 카루비친(carubicin), 카르제레신(carzelesin), 세데핀골(cedefingol), 세페콕시브(celecoxib), 클로람부칠(chlorambucil), 씨로레마이신(cirolemycin), 시스플라틴(cisplatin), 클라드리빈(cladribine), 크리스나톨 메실레이트(crisnatol mesylate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비친(daunorubicin), 데씨타빈(decitabine), 덱소르마플라틴(dexormaplatin), 데자구아닌(dezaguanine), 데자구아닌 메실레이트(dezaguanine mesylate), 디아지퀴온(diaziquone), 도쎄탁셀(docetaxel), 독소루비친(doxorubicin), 드롤옥시펜(droloxifene), 드롤옥시펜(droloxifene), 드로모스타놀론(dromostanolone), 두아조마이신(duazomycin), 에다트렉세이트(edatrexate), 에플로미틴(eflomithine), 엘사미트루친(elsamitrucin), 엔로플라틴(enloplatin), 엔프로메이트(enpromate), 에피프로피딘(epipropidine), 에피루비친(epirubicin), 에르부로졸(erbulozole), 에소루비친(esorubicin), 에스트라무스틴(estramustine), 에스트라무스틴(estramustine), 에타니다졸(etanidazole), 에토포시드(etoposide), 에토포시드(etoposide), 에토프린(etoprine), 파드로졸(fadrozole), 파자라빈(fazarabine), 펜레티니드(fenretinide), 플록스우리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 플로오르우라실(fluorouracil), 플루로시타빈(flurocitabine), 포스퀴돈(fosquidone), 포스트레친(fostriecin), 풀베스트란트(fulvestrant), 겜시타빈(gemcitabine), 겜시타빈(gemcitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비친(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 일모포신(ilmofosine), 인터루틴 II (재조합 인터루킨 II 또는 rIL2 포함한 IL-2), 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-n1, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1a, 인터페론 감마-I b, 이프로플라틴(iproplatin), 이리노테칸(irinotecan), 란레티드(lanreotide), 레트로졸(letrozole), 루프로리드(leuprolide), 리아로졸(liarozole), 로메트렉솔(lometrexol), 로무스틴(lomustine), 로스옥산트론(losoxantrone), 마소프로콜(masoprocol), 메이탄신(maytansine), 메클로로에타민 히드로클로라이드(mechlorethamine hydrochlride), 메게스트롤(megestrol), 멜렌게스트롤 아세테이트(melengestrol acetate), 멜파란(melphalan), 메노가릴(menogaril), 멀캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토프린(metoprine), 메투레데파(meturedepa), 미틴도미드(mitindomide), 미토카르신(mitocarcin), 미토크로민(mitocromin), 미토길린(mitogillin), 미토말친(mitomalcin), 미토마이신(mitomycin), 니토스퍼(nitosper), 미토탄(mitotane), 미토산트론(mitoxantrone), 미코페놀산(mycophenolic acid), 넬아라빈(nelarabine), 노코다졸(nocodazole), 노갈라마이신(nogalamycin), 오름나플라틴(ormnaplatin), 옥시수란(oxisuran), 파클리탁셀(paclitaxel), 페가스프라가스(pegaspargase), 플레오마이신(peliomycin), 펜타무스틴(pentamustine), 페플로마이신(peplomycin), 페르포스파미드(perfosfamide), 피포브로만(pipobroman), 피포술판(piposulfan), 피록산트론 히드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride), 플라카마이신(plicamycin), 플로메스탄(plomestane), 포르피머(porfimer), 포르피로마이신(porfiromycin), 프레드니무스틴(prednimustine), 프로카르바진(procarbazine), 퓨로마이신(puromycin), 퓨로마이신(puromycin), 피라조퓨린(pyrazofurin), 리보프린(riboprine), 로글레디티드(rogletimide), 사핀골(safingol), 사핀골(safingol), 세무스틴(semustine), 심프라젠(simtrazene), 스파르포사트(sparfosate), 스파르소마이신(sparsomycin), 스피로게르마니움(spirogermanium), 스피로무스틴(spiromustine), 스피로플라틴(spiroplatin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 술오페누르(sulofenur), 타리소마이신(talisomycin), 탐옥시펜(tamoxifen), 테코갈란(tecogalan), 테가푸르(tegafur), 텔옥산트론(teloxantrone), 테모포르핀(temoporfin), 테니포시드(teniposide), 테록시론(teroxirone), 테스토락톤(testolactone), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 티아조퓨린(tiazofurin), 티라파자민(tirapazamine), 토포테칸(topotecan), 토레니펜(torernifene), 트레스토론(trestolone), 트리치리빈(triciribine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 트리프로레린(triptorelin), 투불로졸(tubulozole), 우라실 무스타드(uracil mustard), 우레데파(uredepa), 바프레오티드(vapreotide), 베르테포르린(verteporlin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴 술페이트(vincristine sulfate), 빈데신(vindesine), 비네피딘(vinepidine), 빈글리시네이트(vinglycinate), 빈루로신(vinleurosine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈로시딘(vinrosidine), 빈조리딘(vinzolidine), 보로졸(vorozole), 제니플라틴(zeniplatin), 지노스타틴(zinostatin), 조레드로네이트(zoledronate), 그리고 조루비친(zorubicin)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 물질 및 다른 항신형성 치료요법적 물질들은 예를 들면, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 10th ed., 2001에서 설명된다.
다양한 측면들에 있어서, 상기 치료요법적 화합물은 글루코코르티코이드; 칼리크레인(kallikrein) 억제제들; 코르티코스테로이드 (가령 , 프레드니손, 메틸프레디니솔론, 덱사메타손, 또는 트리암시날론 아세티니드, 이에 국한되지 않음); 항-염증성 물질들 (이를 테면 제한없이, 논코르티코스테로이드 항-염증성 화합물 (가령, 제한없이, 이부프로펜 또는 플루비프로벤)); 비타민 및 미네랄 (가령, 제한없이, 아연); 항-산화제 (가령, 제한없이, 카로테노이드 (이를 테면 제한없이, 산토필 카로테노이드 유사 제아산틴 또는 루테인)) 그리고 종양 괴사 인자 (TNF) 활성을 저해시키는 물질들, 이를 테면 제한없이, 아다리무마브 (HUMIRA®), 인플릭시마브 REMICADE®), 쎄르토리주마브 (CIMZIA®), 고리무마브(SIMPONI®), 그리고 에타네르셉트 (ENBREL®)로 구성된 군에서 선택된 항-염증제다.
다양한 측면들에 있어서, 상기 치료요법적 화합물은 M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN,
Figure pct00001
TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, 트롬보포에틴, 줄기 세포 인자, 그리고 에리트로포에틴이다. 본 명세서에서 이용되는 추가 성장 인자들은 앙지오게닌, 골 형성 단백질-1, 골 형성 단백질-2, 골 형성 단백질-3, 골 형성 단백질-4, 골 형성 단백질-5, 골 형성 단백질-6, 골 형성 단백질-7, 골 형성 단백질-8, 골 형성 단백질-9, 골 형성 단백질-10, 골 형성 단백질-11, 골 형성 단백질-12, 골 형성 단백질-13, 골 형성 단백질-14, 골 형성 단백질-15, 골 형성 단백질 수용체 IA, 골 형성 단백질 수용체 IB, 뇌 유도된 신경영양성 인자, 섬모 향신경성 인자, 섬모 향신경성 인자 수용체
Figure pct00002
, 사이토킨-유도된 유트로필(eutrophils) 화학주성 인자 1, 사이토킨-유도된 유트로필, 화학주성 인자 2, 사이토킨-유도된 호중구 화학주성 인자 2, 내피 세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 상피-유도된 유트로필 유인물질(attractant), 신경아교 세포 계통-유도된 호중구 인자 수용체 1, 신경아교 세포 계통-유도된 호중구 인자 수용체 2, 성장 관련된 단백질, 성장 관련된 단백질, 성장 관련된 단백질
Figure pct00003
, 성장 관련된 단백질, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 각질세포 성장 인자, 백혈병 저해 인자, 백혈병 저해 인자 수용체, 신경 성장 인자 신경 성장 인자 수용체, 뉴로프로핀-3, 뉴로프로핀-4, 프레-B 세포 성장 자극 인자, 줄기 세포 인자, 줄기 세포 인자 수용체, 형질변환 성장 인자, 형질변환 성장 인자, 형질변환 성장 인자, 형질변환 성장 인자 2, 형질변환 성장 인자
Figure pct00004
, 형질변환 성장 인자, 형질변환 성장 인자 β, 잠복 형질변환 성장 인자 β, 형질변환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질변환 성장 인자 β 결합 단백질 II, 형질변환 성장 인자 β 결합 단백질 III, 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성인자 수용체, 세포내 시그나 펩티드 (ISP), 그리고 이들의 키메라 단백질 및 이들의 생물학적으로 또는 면역학적으로 활성 단편들을 포함한다.
항응고 약물을 제공하는 방법 또한 제공된다 . 예를 들면, 그리고 제한없이, 플라빅스(plavix), 아스피린, 와파린(warfarin), 헤파린, 티클로피딘(ticlopidine), 에녹사파린(enoxaparin), 코우마딘(Coumadin), 디쿠마롤(dicumarol), 아세노코우마롤(acenocoumarol), 구연산, 레피루딘(lepirudin) 및 이의 조합을 포함한다.
이 측면에서 방법들은 항응고 약물의 효과를 극복하며, 수술시 상당히 유용하다.
약학 조성물
본 명세서는 본 명세서의 나노입자가 포함된 약학 조성물을 제공한다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 약학 조성물은 단위 투여분량 제형이다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 약학 조성물은 정맥내 투여 제형이다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 약학 조성물은 동결건조되거나 또는 분말이다. 다양한 측면들에 있어서 상기 약학 조성물은 폴리아크릴산, 폴옥사머 188 또는 PEG를 더 포함한다.
본 발명의 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 주입 또는 주사를 통하여, 카테테르, 중추 라인(central line), 터널화된 라인(tunneled line) 또는 이식가능한 포트를 통하여 정맥으로 운반될 수 있다.
다양한 측면들에 있어서, 국소 제형이 제공된다. 내부 및 외부 용도가 제공된다. 국소 투여용 상기 약학 조성물은 임의선택적으로 운반체를 포함하며, 그리고 용액, 에멀션, 연고 또는 겔 베이스로 제형화된다. 상기 베이스는 예를 들면, 임의선택적으로 다음중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 바세린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 미네랄 오일, 희석제, 이를 테면 물과 알코올, 그리고 유화제 및 안정화제. 농후 물질들이 국소 투여용 약학 조성물 안에 임의선택적으로 존재한다. 특정 측면들에 있어서, 제형 안에 용매가 존재하는데, 상기 용매는 예를 들면 그리고 제한없이, 디메틸술폭시드 (DMSO), NMP (N-메틸-2-피롤리돈), 또는 유사한 화합물이 포함된다.
본 발명의 조성물은 스프레이-온 시스템(spray-on system)을 이용한 투여용으로 제형화될 수 있다. 한 가지 예시적인 스프레이 시스템에서, 상기 조성물 안에 있는 상기 나노입자는 운반체, 이를 테면 물에 현탁 또는 용해될 수 있거나, 또는 현탁 또는 용해되지 않을 수 있다. 또다른 스프레이 시스템에서, 상기 조성물 안에 있는 상기 나노입자는 물 혼합가능한, 이를 테면 DMSO, NMP, 디메틸포름아미드 (DMF) 또는 테트라히드로퓨란 (THF)에서 다양한 비율로 현탁 또는 용해된다. 그 다음 상기 조성물은 스프레이 시스템, 브러쉬 시스펨 또는 주사기-유형 시스템을 이용하여 손상의 내부 또는 외부 부위에 직접 투여된다. 상기 스프레이 시스템은 습식 또는 건식 에어로졸 스프레이, 또는 습식 또는 건식 정전기 스프레이일 수 있다. 대안으로, 이들 조성물은 내시경 또는 다른 복강경 장치를 이용하여 손상 부위로 도입될 수 있다.
다른 측면들에서, 상기 조성물은 경구, 피하, 근육내, 경피, 볼 경유, 장관외 또는 설하 경로용으로 제형화될 수 있다.
본 명세서는 1 mg/kg 내지 1 g/kg, 10 mg/kg 내지 1 g/kg, 20 mg/kg 내지 1 g/kg, 30 mg/kg 내지 1 g/kg, 40 mg/kg 내지 1 g/kg, 50 mg/kg 내지 1 g/kg, 60 mg/kg 내지 1 g/kg, 70 mg/kg 내지 1 g/kg, 80 mg/kg 내지 1 g/kg, 90 mg/kg 내지 1 g/kg, 10 mg/kg 내지 900 mg/kg, 10 mg/kg 내지 800 m/kg, 10 mg/kg 내지 700 mg/kg, 10 mg/kg 내지 600 mg/kg, 10 mg/kg 내지 500 mg/kg, 10 mg/kg 내지 400 mg/kg, 10 mg/kg 내지 300 mg/kg, 10 mg/kg 내지 200 mg/kg, 10 mg/kg 내지 100 mg/kg, 10 mg/kg 내지 75 mg/kg, 10 mg/kg 내지 50 mg/kg, 50 mg/kg 내지 900 mg/kg, 100 mg/kg 내지 800 mg/kg, 200 mg/kg 내지 700 mg/kg, 300 mg/kg 내지 600 mg/kg, 400 mg/kg 내지 500 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900mg/kg, 1000 mg/kg, 또는 그 이상의 나노입자 전달용으로 제형화된 약학 조성물을 제공한다.
단일 투여분량 투여 뿐만 아니라 다중 투여분량 투여도 제공된다. 다중 투여분량 투여는 최초 투여 후 두 번째 투여분량이 몇 분, 몇 시간, 몇 일, 몇 주 또는 몇 개월 이내에 투여되는 것들을 포함한다.
상기 조성물의 용도
개체에서 상태를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 명세서의 나노입자를 필요로 하는 환자에게 상기 상태를 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 측면들에 있어서, 상기 개체는 출혈 장애를 가진다. 투여가 없거나, 염수를 투여한 경우와 비교하였을 때, 출혈 시간이 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상 감소시키는데 효과적인 양의 상기 나노입자가 투여되는 방법들이 제공된다. 다양한 측면들에 있어서, 이때 상기 출혈 장애는 응고 장애, 후천적 혈소판 기능 결함, 선천적 혈소판 기능 결함, 선천적 단백질 C 또는 S 결핍, 파종성 혈관내 응고 (DIC), 인자 II(Factor II) 결핍, 인자 V(Factor V) 결핍, 인자 VII(Factor VII) 결핍, 인자 X(Factor X) 결핍, 인자 XII(Factor) XII 결핍, 혈우병 A, 혈우병 B, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 폰 빌레브란트(von Willebrand) 질환 (유형 I, II, 및 III), 거핵구/혈소판 결핍의 증상인 경우에 상기 방법이 이용된다. 다양한 측면들에 있어서, 이때 상기 상태가 화학요법 및 다양한 약물을 이용한 요법, 방사능 요법, 외과술, 사고에 의한 혈액 손실, 및 다른 특이적 질환 상태로부터 발생된 혈소판감소증인 경우, 방법이 제공된다. 다양한 측면들에 있어서, 이때 상기 상태가 재생불량빈혈, 유방암 전기 종양과 연합된 특발성 혈소판감소성 자반병으로, 혈소판감소증이 초래된 것이 포함된 특발성 또는 면역 혈소판감소증 (ITP), 신생아 루프스 증후군이 포함된 전신홍반루푸스, 혈소판감소증을 초래하는 전이성 종양, 비장비대, 판코니(Fanconi)의 증후군, 비타민 B12 결핍, 엽산 결핍, 메이-헤글린(May-Hegglin) 기형, 비스코트-올드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, 발작성야간혈색뇨, HIV 연합된 ITP 및 HIV-관련된 혈전성 혈소판감소성 자반병; 만성 간 질환; 혈소판감소증이 연합된 골수형성이상 증후군; 발작성 야간 혈색소뇨증, C7E3 Fab (아비치시마브(Abciximab)) 요법 이후 급성 격심한 혈소판감소증; 모계 동종면역 혈소판감소증이 포함된 동종면역 혈소판감소증; 항포스포리피드 항체 연합된 혈소판감소증 및 혈전증; 자가면역 혈소판감소증; 카르보플라틴-유도된 혈소판감소증과 헤파린-유도된 혈소판감소증이 포함된 약물-유도된 면역 혈소판감소증; 태아 혈소판감소증; 임신성 혈소판감소증; 휴스(Hughes)의 증후군; 루포이드(lupoid) 혈소판감소증; 사고에 의한 및/또는 대량 혈액 손실; 골증식성 장애; 악성종양 환자에서 혈소판감소증; 암환자에서 혈전성 혈소판감소성 자반병/용혈성 요독 증후군으로 현시되는 혈전성 미소혈관장애가 포함된 혈전성 혈소판감소증 자반병; 자가면역 용혈성 빈혈; 잠혈성 빈창자 곁주머니 천공(occult jejunal diverticulum perforation); 순수 적혈구 무형성증; 자가면역 혈소판감소증; 유행성 신증(nephropathia epidemica); 리팜피신-연합된 급성 신부전; 파리-트루소(Paris-Trousseau) 혈소판감소증; 신생아 동종면역 혈소판감소증; 발작성 야간 혈색소뇨증; 위암에서 혈액학적 변화; 어린이의 용혈성 요독 증후군; 그리고 A 형 간염 바이러스 및 및 CMV-연합된 혈소판감소증이 포함된 바이러스 감염과 관련된 혈액학적 현시인 경우 방법이 제공된다. 다양한 측면들에 있어서, 이때 상기 상태는 AIDS 치료로 인한 혈소판감소증이 초래된 경우, 방법이 제공된다. 다양한 측면들에 있어서, AIDS를 위한 치료는 AZT의 투여다.
다양한 측면들에서, 치료되는 상기 개체는 상처 치유 장애, 외상, 폭발 외상, 척수 손상, 출혈성 발작, TPA 투여 후 출혈, 또는 많은 경우에 볼 수 있지만, 특히 미숙아의 경우 급성 심실내 출혈을 앓고 있다.
돼지 간 외상 모델(Porcine Liver Trauma Model)
임의의 정맥내 지혈제의 임상 이동(clinical translation)은 물질 합성의 규모확대(scaling) 및 더 큰 종에서 안전성 및 효과의 조사를 필요로 한다. 분자 수준에서, 지혈은 잘 지켜온 것으로 보이나, 혈류역학 및 혈액 응고 매개변수에서 유의적인 차이가 있어 설치류로부터 인간에게 까지 완벽하게 유지되지 않을 수 있다(Siller-Matula et al., Thromb . Haemost . 100: 397-404 (2008). 맥관 외상 (대퇴 혈관) (Johnson et al., US Army Med . Depart. J. 36-39 (2012), Gegel et al., US Army Med. Depart. J. 31-35 (2012)), 고형 장기 손상 (간, 비장) (Velmahos et al., Am. Surg . 74: 297-301 (2008), Gurney et al., J. Trauma, 57: 726-38 (2004)), 흉부 손상 (폐) (Baker et al., Crit . Care Med . 40: 2376-84 (2012), 그리고 다발외상 (고형 장기/넓적다리뼈)에 대하여 돼지 출혈 손상 모델이 개발되었다. 18-20 마리의 돼지가 통제불능 출혈의 전임상 모델로 흔히 이용되는데, 이들의 혈류역학 및 크기가 상대적으로 인간에 대한 것으로 규모 확대가 잘 되기 때문이다(Siller-Matula et al., Thromb . Haemost . 100: 397-404 (2008).
잠재적 요법의 생리학적 영향을 조사할 때, 통제불능 출혈 외상에 대한 표준 모델이 돼지다. 심혈관은 인간 매개변수와 잘 관련되며, 임상 및 연구 환경 모두에서 이용되는 장치의 경우 변형없이 필적가능한 크기를 허용한다. 더욱이, 상처-치유 과정은 인간의 것과 유사한 것으로 나타는데, 이는 돼지와 인간 피부 사이의 유사성으로 부터 기인된다.
정맥내 지혈 물질들의 사용으로 시험관 및 생체(렛) 모두에서 출혈 시간을 감소시키는 것으로 나타났으며, 뿐만 아니라 렛에서 치명적 간 외상 후 생존이 유의적으로 증가되었다 (Bertram et al., Sci . Translational Med . 1: 11ra22 (2009)). 작은 동물과 큰 동물 사이에 혈류역학에서 차이를 해결하기 위하여, 큰 동물, 출혈에 대한 돼지 모델에서 지혈 나노입자의 효과가 연구되었다. 실시예 1에서, 혈액 손실을 감소시키고, 고형 장기 손상 후 생존을 증가시키기 위한 정맥내 지혈 나노입자 이용이 검사되었다.
상기 나노입자의 투여로 최근에 특징화되기 시작된 허위알레르기인 CARPA를 유도할 수 있고, 이는 돼지에서 용이하게 유도되는 것으로 보인다.
나이브 돼지 모델의 실험에서 부형제 폴리(아크릴산) 단독으로는 CARPA 반응의 개시할 수 없는 것으로 나타났는데, 중성적으로 하전된 입자 (+PAA)의 주사는 그 자체로 반응을 유도하지 못하기 때문이다. 그러나, 이 실험에서 돼지는 PAA와 함께 상기 입자에 대하여 좀더 심각한 반응을 보였다. 상기 PAA가 상기 심각성을 증가시키는데 직접적인 책임이 있을 수도 있지만, 상기 반응은 이미 강화된 그리고 활성 보체 시스템으로 인하여 증가되었을 가능성 또한 있다. PAA에 대한 부임상적 반응이 여전히 존재할 수 있다.
Szebeni et al.는 제타 전위가 정맥내 나노입자 시스템에 의해 유도된 CARPA의 잠재적 중개물질이라고 상정하였다(Szebeni et al., Nanomedicine , 8: 176-84 (2012)). 상기 기전을 현재 완전하게 이해하지 못하지만, Szebeni et al. 및 나노입자를 이용한 연구 모두의 결과에서 중성적으로 하전된 나노입자가 돼지에서 CARPA의 개시를 완화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. CARPA를 최소화시키기 위한 매개변수를 확인하기 위하여 이 기전을 밝힐 추가 연구가 필요하다.
CARPA의 기전 및 응고 연쇄 반응에 대한 이의 관련성이 아직 완벽하게 밝혀지지는 않았다. 그러나, 혈액과 접촉되는 생물재료들은 FXII 활성화, 및 이의 단편들 (인자 XI1)에 의해 중재되는 보체 활성화를 유도하는 능력을 보유하는 사전 징조가 있다. 전하를 띈, 또는 친수성 재료들은 단백질에 흡착되는 경향이 있고, FXII 단편들 뿐만 아니라 칼리크레인(이는 브래디키닌-강력한 혈관확장제-형성의 원인이다)을 만든다.
하전된 나노입자 표현에 흡착됨으로써 인자 XII 활성화에 의해 CARPA가 중재된다면, 이의 단편들은 플라스미노겐을 활성화시킴으로써 응고증을 잘 유도할 수 있고, 그리고 브래디키닌 (또는 히스타민) 혈관확장으로 인하여 추가 출혈이 더 야기된다. 응고 시간에 장기적 응고증이 관찰되지는 않지만, 이 응고증은 일과적이며, 손상과 동시에 발생된 경우만 파국적이다.
CARPA 반응의 완화
CARPA에 의해 유도된 아나필락시스를 역전시키기 위하여 디페닐히드라민, 페닐에피린, 에피네프린 및 스테로이드는 또한 병용될 수 있다 (Johnson et al., J. Pharma. Sci . 100: 2685-92 (2011)). 불행하게도, 외상 동안 투여되는 정맥내 지혈 물질들의 적용시 추가 약물과의 공동-투여는 가능한 피해야 한다.
CARPA 개시를 줄이는 한 가지 가능한 방법은 상기 나노입자를 서서히 (또는 다중 작은 투여분량으로 다수) (빠른내성) 주입시키는 것이다(Szebeni et al., Nanomedicine, 8: 176-84 (2012)). 이는 CARPA 개시를 방지하고, 임의의 증상의 심각성을 감소시키는 것으로 나타났다. 이것은 탈민감화(desensitization) 기전에 의한 것이다. 그러나, 현재 요법은 출혈 손상 후 신속한 투여에 의존하기 때문에, 빠른 내성은 성공적인 선택으로 보이지 않는다.
CARPA 방지를 위한 최상의 성공적인 선택은 표적화된 나노입자의 제타 전위를 중성에 가깝게 전환시키는 것으로 보인다. GRGDS (서열 번호: 2) 표적화 리간드는 Arg (+), Asp (-) 및 카르복실산 말단 (-)의 존재로 인하여 원래부터 음으로 하전된다. 본 연구의 한 가지 가능한 완화는 중성 전하를 가진 것을 GRGDS (서열 번호: 2) 표적화 펩티드, 이를 테면 환형 RGD로 대체하는 것인데, 이는 활성화된 혈소판 GPIIb/IIIa 에 대해 더 높은 특이성을 가지고, 네트(net) 중성 전하를 모두 보유한다.
본 명세서에서 설명된 실험에서 큰 출혈 손상 동안 투여되었을 때 나노입자 투여에 의해 유도된 CARPA는 대량 출혈을 일으킨다. CARPA (심폐의 기능이상을 특징으로 함)가 지나간 후에도 응고병증이 여전히 존재할 수 있다. 그러나, 이 반응은 일시적으며, 정맥내 지혈 나노입자의 매개변수를 조율함으로써, 구체적으로 이들의 전하 (제타 전위)를 중성화시킴으로써 조절될 수 있다.
실시예들
실시예 1
나노입자의 합성(Nanoparticle Synthesis)
나노입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 암(arms)에 접합된 폴리 (젖산-코-클리콜산)-폴리-L-리신 (PLGA-PLL) 블록 코폴리머로부터 합성되었다. 구형 나노입자는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 나노 침천 방법을 이용하여 제작되었다. 멕사메타손은 용매에 용해되었고, 적절한 양의 폴리머 또한 용해되고, 약물과 혼합되었다. 상기 약물/폴리머 용액은 회전되는 1x PBS 안으로 한방울씩 피펫팅되었다. 생성 용액은 실온에서 대략적으로 20분간 덮개없이 교반되도록 두었다. 나노구 혼합(stir)이 경화된 후, pH는 3.0 - 2.7까지 하향조절됨으로써 응집이 유도되었다. 이 pH 범위는 응집이 일어나는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 상기 나노구는 원심분리 (500g, 3 분, 3x)에 의해 정제되었고, 탈이온수에 재현탁되고, 냉동되고, 동결건조기 상에서 동결-건조되었다. 10 mg의 나노구를 1 mL 1x PBS에 용해시켜 방출 연구가 실행되었는데, 3회 반복되었다.
상기 나노구의 크기는 동적 빛 산란(DLS)에 의해 측정되었다. 크기 및 형태 확인은 스캐닝전자현미경(SEM)에 의해 측정되었다. DMSO에 나노구들을 용해시키고, UV-Vis 상에서 이동시킴으로써 약물의 양이 측정되었다. 다양한 시점에서 방출 연구 데이터를 수집하고, 시간이 경과함에 따라 상기 나노입자로부터 얼마나 덱사메타손이 용리되는지를 측정하기 위하여 UV-Vis 상에서 이동되었다.
실시예 2
나노입자에 펩티드 부착(Attachment of Peptides to Nanoparticles )
생성물을 만드는 수율 및 시간은 중간생성물 처리 단계를 위한 필수적인 최단 시간을 측정함으로써 상당히 감소되었다. 침전 후 PLGA-PLL-PEG 수집하기 위하여 원심분리를 이용하면 수율이 상당히 증가된다. 나노침전 나노입자 형성 방법으로 수율은 또한 상당히 증가되며, 나노입자 수집을 위한 폴리(아크릴산) 코아세르베이트(coacervate) 침전 기술을 이용할 경우 훨씬 더 증가된다.
일단 PLGA-PLL-PEG가 합성되면, 활성 펩티드, 이를 테면 GRGDS (서열 번호: 2)는 상기 폴리머에 연결되어야 한다.
사중 블록 폴리머 (PLGA-PLL-PEG-펩티드)가 이용되었고, 구들의 수율은 상당히 낮았다. 상기 펩티드는 상기 폴리머에서 가장 고가의 부분이기 때문에, 상기 삼중블럭 (PLGA-PLL-PEG)으로부터 구를 만들고, 구 자체에 상기 펩티드를 부착시키는 방법이 이용되었다.
상기 펩티드를 삼중블럭 나노입자에 접합시키면 대략 50% 접합 효율을 얻었다(리신에 대한 아르기닌 비율로 산출됨).
그러나, 아미노산 분석에 앞서 나노구의 여분의 헹굼 단계는 상기 펩티드의 상당한 손실로 이어지고, 접합 효율도 11%인 것으로 밝혀졌다. 반응을 1g 나노구 베취(batch)로 규모를 상향시켰을 때, 접합 효율은 기본적으로 0%까지 하락되었다. 따라서, 최소한 필적가능한 수율로 완전한 사중 블록 폴리머를 만들 수 있고 그리고 엄격한 크기 분포를 가진 나노입자를 만드는 방법이 추구되었다.
이 방법으로 상기 나노입자가 형성되기에 앞서 사중 블록 폴리머의 제작이 이루어졌다. 네가 블록 접합 효율은 대략적으로 80%이었지만, 폴리(아크릴산)과 함께 그리고 폴리(아크릴산) 없이 나노침전 기술을 이용하면 나노구 형성후 13%까지 하락되었다. 최종적으로, 상기 펩티드의 추가 직전 DMSO 안에서 CDI와 상기 폴리머를 반응시킴으로써, 사중 블록이 만들어졌다. 이 단계는 펩티드의 접합을 50% (n=3) 이상으로 증가시킨다.
에멀션 방법 ( Emulsion Method)
상기 에멀션 방법은 326-361 nm의 직경을 가진 구를 만드는데 성공적이다.
상기 에멀션 방법은 탈이온화된 물 안에 50ml의 5% PVA에서 나노구를 교반-경화시킨다. 이 방법을 이용한 나노구 생산의 규모 확대는 교반 경화(stir hardening)를 위하여 더 큰 용적의 용액을 필요로 한다. 기존 방법이 과립 형성 후 접합 단계를 위하여 상기 펩티드를 추가한 사실과 함께 이러한 관찰은 상당한 결합 효율을 획득하기 위하여 큰 용적의 용액에서는 매우 많은 양의 펩티드가 요구된다는 사실을 의미한다.
규모를 축소한 형태인 상기 나노침전 방법의 경우, 10 ml PBS에서 교반 경화는 상기 펩티드의 동시 접합과 함께 실시되었다. 이 단계는 충분한 양의 펩티드를 추가한다. 상기 나노침전 방법은 자체로 사중 블록 폴리머를 가진 나노입자 형성을 제공하여, 제작-후 결합 반응의 필요성이 제거된다.
나노입자로 확인되는 근본적인 다수의 문제들이 있는데, 입자의 균일성, 입자의 응집, 나노입자 현탁에 대한 난제 그리고 동결건조후 재현탁의 난제 등이 포함된다.
몇몇 집단들은 이들 난제을 다루기 위한 다수의 접근 방법을 생각해내었다. 예를 들면, 동결건조후 작은 나노입자를 재현탁시키기 위하여 동결건조보호제(lyoprotectant)를 가질 수 있다 (Sauaia et al., J. Trauma 38: 185 (1995), Champion et al., J. Trauma 54: S13 (2003)). 입자들을 응집시키기 위하여 폴리(아크릴산)을 이용하는 것과 함께 나노침전 기술을 통하여 용액에 동결건조보호제를 추가해야 하는 필요성이 없어졌다는 것을 발견하였다.
나노침전( Nanoprecipitation )
상기 나노침전 방법은 일관된 크기의 구를 만들기 위하여 물 혼합가능한 용매, 이를 테면 아세토니트릴에 용해된 폴리머의 점적 추가를 이용한다 (Regel et al., Acta. Anaesthesiol . Scand . Suppl 110: 71 (1997); Lee et al., Exp . Opin . Investig . Drugs 9: 457 (2000); Blajchman, Nat. Med . 5: 17 (1999); Lee et al., Br. J. Haematol . 114: 496 (2001)).
폴리 (아크릴산) 코아세르베이트 침전( Poly (acrylic acid) Coacervate Precipitation)
(Regel et al. (1997); Kim et al., Artif . Cells Blood Substit . Immobil . Biotechnol. 34: 537 (2006))로부터 변형된 이 방법을 이용하여 나노입자의 수율을 증가시키고, 이미 관찰된 바와 같이 원심분리 및 동결건조 단계 동안 구의 응집을 감소시켰다. 상기 침전은 <500g의 약한 원심분리를 허용한다.
따라서, 크기 재현성(size reproducibility)은 에멀션 및 나노침전 단독 방법 보다 장점이 있는 것으로 보이며, 균질한 크기 분포를 만들기 위하여 초음파파쇄 조건에 매우 의존적이다. SEM 영상은 나노입자의 형태 및 크기 균일성을 보여준다. 나노입자 직경의 100회 측정으로 부터 히스토그램 인레이(Histogram inlay)가 만들어졌고, 크기 분포는 236.1 nm +/- 56.6 nm 주변에 집중됨을 보여준다.
PAA -피복된 나노침전된 합성 혈소판을 만드는 방법
PLGA (Resomer 503H)는 Evonik Industries에서 구입하였다. 폴리-l-리신 및 PEG (~4600 Da MW)는 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 모든 시약은 ACS 등급이며, Fisher Scientific로부터 구입하였다. PLGA-PLL-PEG 코블록 폴리머는 이미 언급된 바와 같이(Lavik et al), 표준 생물접합 기술을 이용하여 만들었다.
사중블록 접합( Quadblock Conjugation)
PLGA-PLL-PEG는 무수 DMSO에 100 mg/ml의 농도로 용해되었다. PEG 기를 재가동시키기 위하여 2몰 당량의 CDI가 추가되었으며, 1 시간 동안 교반되었다. 25 mg의 올리고펩티드 (GRGDS (서열 번호: 2) 또는 GRADSP (서열 번호: 3))가 1 ml DMSO에 용해되었고, 교반 폴리머 용액에 추가되었다. 이 혼합물은 3 시간 동안 반응되었고, 그 다음 투석 튜브(SpectraPor 2 kDa MWCO)로 이동되었다. 투석 물은 유형 I D.I. 물로 4시간 동안 매 30분마다 교체되었다. 이 산물은 액화 질소에서 순간-냉동되었고, 2일 동안 동결건조되었다.
나노침전( Nanoprecipitation )
생성된 사중블록 코폴리머 PLGA-PLL-PEG-GRGDS (서열 번호: 11)은 아세토니트릴에서 20 mg/ml의 농도로 용해되었다. 이 용액은 교반되는 PBS에 한방울씩 추가되었다. 일반적인 규칙은 PBS의 용적은 아세토니트릴의 2배를 이용하는 것이다. 물-혼합가능한 용매가 소멸될 때 침전된 나노입자가 형성되었다. 그러나, 출발 사중블록의 양을 최대 300 mg 이상으로 확대시키기 위하여, 상기 침전 용적을 아세토니트릴로 프라이밍시키면(priming) 자발적 응집 형성이 감소됨을 알았다. 용매:물 비율은 침전 공정동안 조정되어, 침전 용적에서 최종 농도는 2:1 PBS:아세토니트릴이 된다. 그 다음 입자는 3시간 동안 교반-경화되었다. 15000 g에서 원심분리를 이용하여 입자들이 수거되었고, PBS로 3회 세척되었다. 대안으로, 입자들은 코아세르베이트(coacervate) 침전 방법을 이용하여 수집되었다.
코아세르베이트 침전(Coacervate Precipitation)
1 질량 당량의 건조 폴리(아크릴산)은 교반 입자 현탁액에 추가되었다. 그 다음 응집이 발생될 때까지 1% w/v pAA는 교반 현탁액에 추가되었다. 응집을 관찰하기 위하여 각 pAA를 추가한 후 교반은 잠깐씩 중단되었다. 5 분 후, 응집된 입자들은 500g에서 원심분리에 의해 수집되었고, 1% pAA로 3회 세척되었다 (500 g에서 원심분리, 2m, 세척간 4C). 최종 세척시, 입자들은 D.I. 물로 재현탁되었으며, 순간-냉동되었고, 그리고 최종 물의 용적에 따라 2-5일 동안 동결건조되었다.
재현탁
입자들의 무게를 측정하였고, 1xPBS에서 20 mg/ml의 농도로 재현탁되었다. 입자들은 재현탁되도록 볼텍스되거나, 또는 대안으로 볼텍스한 후 탐침 소니케이터(VCX-130, Sonics & Materials, Inc.)를 이용하하여 간단히 4W에서 50 J의 총 에너지로 초음파분쇄하였다.
실시예 3
대퇴정맥 손상 모델에서 생체내 테스트
예비 작업에서, 대퇴 동맥 손상 모델이 이용되었다. 출혈시 요법의 영향을 간단히 평가할 수 있는 매우 분명한 모델이다. Sprague-Dawley 수컷 렛은 이소플루란으로 마취되었다. 동물의 체온은 히팅 패드를 이용하여 유지되었고, 체온 탐침을 이용하여 실험 동안 체온은 관찰되었다. 혈압 및 체혈을 측정하기 위하여 동맥 카테테르가 이용되었고, 정맥 카테테르는 테스트되는 물질의 투여를 위하여 이용되었다. 복부강이 개방되었고, 간의 중앙 엽은 상대정맥(superior vana cava)을 따라 이로부터 1.3cm에 예리하게 절단된다. 공동은 바로 봉하고, 실험 물질이 전달되었다.
손상 직전, 손상 후 5분, 그리고 손상 후 30분에 혈액 시료를 빼내었다. 동물은 60분간 유지되거나 또는 사망까지 유지되었다. 60분이 종료될 때, 사전-무게를 잰 스폰지를 이용하여 혈액 손실을 결정하기 위하여 복강 안에 있는 혈액을 수집하였다. 모든 주요 장기는 조직학 및 상기 나노입자의 생체분포를 위하여 수집되었다.
본 발명의 나노입자는 손상 직후 5분의 평형(equilibration)과 함께 3분 주사에 의해 캐뉼라가 끼워진(canulated) 대퇴정맥 안으로 0.5 ml 주사 용적(20 mg.ml)으로 정맥 투여되었다. 투여된 상기 나노입자는 PLGA-PLL 나노구 코어 (~200 nm), 다중 4600 kD PEG 암(arms) 그리고 상기 PEG 암에 접합된 다음중 하나의 RGD 펩티드 하나를 갖는다: RGD, RGDS (서열 번호: 1), 및 GRGDS (서열 번호: 2).
이들 나노입자가 출혈 시간에 끼지는 영향은 염수 대조, 재조합 인자 VIIa(Factor VIIa) 및 PEG 만으로 구성된 나노입자와 비교되었다. RGD 펩티드를 포함하는 상기 나노입자 모두는 출혈 시간을 상당히 감소시켰다. 상기 나노입자는 손상 직전 투여되거나 (도 2a 참고) 또는 손상 후 투여되었다 (도 2b 참고). 손상 후 투여될 때, 4600-GRGDS (서열 번호: 12) 펩티드를 포함하는 나노입자는 PEG (PEG 4600) 만을 포함하는 나노입자와 비교하였을 때 출혈 시간 %를 상당히 감소시켰다. (도 2b 참고)
실시예 2
돼지 간 외상 모델(Porcine Liver Trauma Model)
간 절제 모델 ( Liver Resection Model)
동물 프로토콜은 Gurney et al.16에 근거하여 개발되었고, Massachusetts General Hospital의 Trauma Research Laboratory과 함께 조정되었고, Case Western Reserve University IACUC으로부터 승인되었다. 간 손상 연구의 목적은 상기 나노입자 치료의 안전하고, 효과적인 투여분량 수준을 결정하는 것이었다. 최초 투여분량은 대략 20 mg/kg에서 출발하여, 안전한 투여분량에 도달될 때까지 10 계수(factor)씩 투여분량을 낮추었고, 그 다음 효과가 관찰되지 않을 때까지 2 계수씩 낮추었다 (-0.03 mg/kg).
Yorkshire 돼지(30-35 kg)는 테라졸 (6-8 mg/kg i.m.)로 마취시키고, 삽관하였으며, 환기기에 배치시켰고, 이소플루란(2-2.5%)에서 유지시켰다. 동맥 시료채취 및 침습성 혈압 모니터링을 위하여 카테테르를 위치시켰으며, 뿐만 아니라 약물 투여 및 염수 주입을 위하여 내경정맥 경동맥에 카테테르를 위치시켰다. 개복을 실행하였으며, 가단성 견인기(malleable retractor)로 기본적 해부학에 의해 간의 좌엽이 단리되었다 (도 29). 이로써 손상 후 혈액 흡인을 위한 수집 표면이 제공된다. 좌엽(left lobe)은 #15 작은 날을 이용하여 꼭지로부터 2"에서 절제되었다(상기 엽의 가장 먼 말단으로부터 측정하였을 때). 손상 후 5분에 활성 정맥내 지혈제 (GRGDS-NP (서열 번호: 6)), 스크램블된 과립 (Scrambled-NP) 및 염수 (락테이트화된 링거)로 구성된 치료물이 i.v.로 투여되었다.
복강으로부터 혈액 흡인에 의해 혈액 손실이 직접적으로 측정되었지만, 손상 표면의 응혈이 제거되는 것을 방지하기 위하여 대략적으로 1cm의 스위프 반경(sweep radius)은 유지되었다. 동맥혈액 시료는 기선, 손상 후 15, 30, 60, 120, 180, 및 240 분에 수집되었으며, 곧이어 락테이트화된 링거가 주입되었다: 첫 시점(15분)에는 분당 40ml에서 400ml(400 ml @ 40 ml/min) 그리고 MAP가 기선 아래인 모든 후속 시점의 경우 분당 20ml에서 200ml(200 ml @ 20 ml/min).
고려되는 결과는 생리학적 매개변수를 포함한다: 심박수 (HR), 평균 동맥혈압(MAP), Sp02, 및 ETCO2. 혈소판 카운트, 혈액 가스, 및 진단학적 응고 시간 (ROTEM 및 헤모크론(Hemochron))에 대하여 혈액 시료가 분석되었다. 동물은 손상 후 사망 후 4시간 동안 관찰되었고 또는 펜토바르비탈 나트륨의 과다분량으로 안락사되었을 때 관찰되었다.
나이브 투여/반응 모델(
Figure pct00005
)
이 돼지 모델의 최초 결과에서 0.15 mg/kg 이상으로 투여되었을 때, 실험 나노입자 치료제의 불리한 효과가 나타났었다. 이 불리한 반응은 유도된 간 손상으로부터 급속한 출혈을 특징으로 하였다. 손상 없이 상기 나노입자의 영향을 결정하기 위하여 나이브 투여 모델이 개발되었다. 여기에서, 상기 나노입자의 제형은 2개 인자의 영향을 살펴보기 위하여 변화되었다: 부형제 (+/- 폴리아크릴산), 및 제타 전위 (-30mV, 중성, 및 +20mV).
침습성 혈압 관찰, 동맥 혈액 시료채취 및 정맥 주입을 위하여 카테테르를 도입시키기 위하여 상기에서 설명한 바와같이 외과술이 실행되었다. 시점 0에서 2 mg/kg의 나노입자 투여분량이 주사되었다. 그 다음 생리학적 매개변수: 심박수 (HR), 평균 동맥혈압 (MAP), Sp02, 및 ETCO2에 대하여 1시간 동안 상기 돼지는 관찰되었다. 혈소판 카운트, 혈액 가스, 및 진단학적 응고 시간 (ROTEM 및 헤모크론(Hemochron))에 대하여 혈액 시료가 분석되었다.
1 시간 후, 두 번째 상기 나노입자 제형이 주사되었고, 나이브 투여 모델 실험이 반복되었다. N=2 마리 돼지가 이 실험에서 이용되었다. 첫번째 돼지는 (t=0 분)에 그리고 (t=85 분)에 PAA 부형제없이 2회 투여분량의 PLA-PEG-NP's (제타=-30 mV)를 제공받았다. 두 번째 돼지는 2회 투여분량의 PLGA-PEG-NP's (PAA와 함께)을 제공받았고, -1.29 mV (t=0) 및 +20 mV (t=65 분)의 제타 전위가 비교되었다.
재현가능 모델의 구축 ( Making a Reproducible Model)
재현가능한 간 손상을 만드는 것은 일관된 손상 모델을 만드는데 결정적이었다. 우리의 최초 실험 동안 최초의 그리고 유일한 기준은 꼭지점으로부터 2"을 재어 간의 좌엽을 양분하는 것이었다. 투여전 시점 (0-5 분)에서 혈액 손실과 비교하였을 때, 돼지간의 매우 큰 변이가 있음이 관찰되었다. 간 손상이후 설명된 바와 같이 표준화된 후, 일관되게 300-400 ml로 감소되었다. 이것은 주로 일관된 손상 수준의 확립 뿐만 아니라, 좌엽 꼭지점으로부터 2"를 잰 절단 각도에 의해 주로 획득된 것이었으며, 이러한 측정이 등가임을 담보하는 것이다. 자연적 휴식 장소에서 손상된 좌엽의 대체는 긴장/비틀림에 의한 꼬임정상적인 간 혈류 변경을 방지하는데 또한 중요하였다. 기존에 확립된 손상 프로토콜과 일관성을 유지하기 위하여 손상 동안 전단에 링 클램프가 배치되었다(Gurney et al., J. Trauma 57: 726-38 (2004).
우리의 초기 작업에서, 투여전 혈액 손실 (0-5 분)은 매우 가변적이며, 이는 재현불가능한 손상 모델임을 나타내었다. 이는 손상을 엄밀히 표준화시킴으로써 나중에 개선되었다. 입자 투여 전과 후 누적 혈액 손실 (도 3), 또는 관련된 실험 시점에서 혈액 손실(도 4)의 비교는 이들 입자의 지혈 효과를 측정하고, 돼지 간의 투여전 혈액 손실에서 차이의 영향을 최소화시키는데 이용가능한 하나의 측정단위로 보인다.
실시예 3
나오입자 투여는 출혈을 가중시킨다
나노입자 조성물 NP1 및 NP100이 투여되었다. NP100은 표면에 NP1 제형보다 대략적으로 100배 더 많은 펩티드를 가진 제형을 지칭한다. 부착된 펩티드와는 상관없이, >= 2 mg/kg의 투여분량에서 상기 나노입자를 투여하면 예상치못한, 다량의 출혈이 야기되었다. 이는 NP100 및 NP1 입자(펩티드 밀도를 변화시키면서)에서 발생되었고, 그리고 부착된 펩티드 (GRGDS (서열 번호: 2), GRADSP (서열 번호: 3), 또는 아무엇도 없음)와 무관하게 발생되었다. 이는 생존 시간 및 총 혈액 손실에서 용이하게 볼 수 있는데, 락테이트화된 링거 (n=4/4)가 제공된 대조군은 240 분 실험 전체 기간 동안 생존하였고, 평균 혈액 손실은 775 ml +/- 225 S.D.이었지만, 입자 처리 집단은 상당히 악화되었다 (표 1).
표 1은 투여 분량(mg/kg)에 의해 구분된 생존 시간 및 혈액 손실을 제공한다. 모든 4/4 락테이트화된 링거 대조 돼지는 전체 240분 동안 생존하였고, 평균 혈액 손실은 775 ml +/- 225 S.D이었다. 최적의 투여분량은 0.1-0.2 mg/kg이었고, 이때 불리한 효과가 최소화된다. 흥미로운 것은, 0.03 mg/kg으로 투여 분량을 낮추면, 손상 모델이 또한 악화되는 것으로 보이지만, 그러나 >2.0 mg/kg의 투여분량에서 관찰된 것과 같이 급격하지는 않았다. 오히려, 급속한 출혈이 유도되는 대신 연장된 출혈 시간에 동물은 민감하다.
Figure pct00006
이러한 불리한 반응에 대한 최초 가설은 입자들이 유리 RGD 펩티드 투여에서 볼 수 있는 것과 같이 혈소판 수용체의 포화를 초래시켜, 혈소판 저해를 야기할 수 있다는 것이었다. 따라서, 우리는 계획된 우리의 투여 분량 연구를 진행하였고, 불리한 반응을 유도하지 않은 "최적"의 투여 분량은 0.1-0.2 mg/kg이라는 것을 알았다. 그러나, 추가 분석에서, 입자들은 돼지에서 출혈 시간을 연장시키는 것으로 여전히 나타났고, 이는 처리 후(5-60분) 출혈의 양이 증가됨을 설명한다. 이는 NP1 입자 (도 5) 및 NP100 입자 (도 6) 모두에서 사실이었다.
도 5에서 볼 수 있는 것과 같이, 투여전 (0-5 분) 창에서 혈액 손실은 집단간에 일관되었지만, 염수 대조 (395 +004 ml)와 비교하여, 투여후 (5-60 분) 혈액 손실은 GRGDS (서열 번호: 2) (560 +018 ml) 및 스크램블된 (533 +/- 146 ml) 집단 모두에서 상당히 악화되었다. 염수 대조의 경우 240분과 비교하였을 때, 평균 생존 시간은 스크램블된 경우 26분이었으며, GRGDS (서열 번호: 2)의 경우 144분 이었다.
도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 투여전 (0-5 분) 창에서 혈액 손실은 집단간에 일관되었지만, 염수 대조 (395 +004 ml)와 비교하여, 투여후 (5-60 분) 혈액 손실은 GRGDS (서열 번호: 2) (777+077 ml) 및 스크램블된 (968+083 ml) 집단 모두에서 상당히 악화되었다. 염수 대조의 경우 240분과 비교하였을 때, 평균 생존 시간은 스크램블된 경우 73분이었으며, GRGDS (서열 번호: 2)의 경우 172분 이었다.
표적화 펩티드를 포함하지 않은 몇 가지 입자 대조 (2 mg/kg)들이 테스트되었고, GRADSP (서열 번호: 3) 펩티드는 여전히 혈소판 수용체들과 상호작용할 수 있는 것으로 의심된다. 그러나, 상기 나노입자가 펩티드를 포함하지 않고 있다는 사실과 무관하에, 상기 나노입자는 출혈 반응을 유도하였다. 따라서, 불리한 효과는 상기 나노입자 재료 자체의 비특이적 상호작용으로 부터 온 것으로 보이며, 이는 이러한 현상을 더 조사하기 위하여 나이브 투여 모델 개발로 이어진다.
실시예 4
나이브 돼지에서 나노입자 투여는 CARPA 를 유도한다.
손상안된(나이브) 돼지에서 지혈 나노입자 (2 mg/kg, 펩티드 없는 대조 NP's)의 1 분 투여 안에, 심폐 문제가 존재하며, 이는 보체 활성화 관련된 허위알레르기 (CARPA)에서 이미 보고된 것과 일관되었다.26-28 CARPA의 증상이 포함된다: 심장 박동의 증가, 저혈압, 피부 홍조(홍반), 심장박출량 감소, 폐 압 감소, 그리고 혈액 가스 수준의 감소. 놀라운 것은, 이러한 문제는 수분 안에 자발적으로 해결된다. 그러나, 이러한 급성 증장의 재발성 에피소드가 관찰되며, 이는 경동맥으로부터 동맥혈액 채취와 수반된다는 것을 주목하였는데, 이는 기존에 보고된 바가 없었다. 이러한 첫 실험의 목적으로, 블랭크(펩티드 없음, 쿠마린-6 없음)의 페길화된 나노입자가 이용되었는데, 이는 코폴리머 폴리(l-젖산)-폴리(에틸렌 글리콜) (PLA-PEG-NP's)을 포함한다. 2 mg/kg의 나노입자 (-pAA)가 t=0 분에 주사되었고, 또다른 2 mg/kg의 나노입자 (+pAA)는 t=85 분에 주사되어, CARPA 반응에서 pAA 부형제의 효과가 테스트되었다. 2 mg/kg은 이 투여분량이 간 손상 모델의 실험에서 강력한 효과를 나았다고 확신하기 때문에 선택되었다.
돼지 1: 첫 번째 투여 2 mg/kg PLA -PEG- NP' s - PAA (제타 = -30.04 mV)
t=0에서 첫 주사 후 1.5 분에 증상이 제시되며, 심각한 동맥 혈압 감소 및 호흡 종기(end-tidal) CO2 및 pa02가 포함되었다 (도 7). 이사건 동안 펄스-옥시미터(pulse-oximeter)는 실패하였는데, 저혈압 동안 사지의 제한된 관류 때문인 것으로 보인다. 그러나, 동맥 혈액 가스 시료는 이 사건 동안 680-700 mmHg 기전에서 269 mmHg으로 변화됨으로써, p02 감소를 입증하였다.
이러한 심폐 시건으로부터 회복된 직후 피부의 홍조(홍반)가 나타났고, 이는 각각 대략적으로 1분 지속된다(최초 주사 후 t=1-2 분, 8-12 분, 및 61-65 분에 사건이 발생된다). 후속적인 에피소드는 이들이 수집 직후 발생되었기 때문에 혈액과 연계된 것으로 보였다.
돼지 1: 두 번째 투여 2 mg/kg PLA -PEG- NP' s + PAA (제타 = -31.64 mV)
상기 돼지는 최초 주사후 최대 88분간 안정되었고, 이 시점에 2 mg/kg PLA-PEG-NP's + pAA의 두번째 주사되었다. 이는 또다른 CARPA 반응을 개시시켰으며, 상기 돼지는 이로부터 회복되지 못하였다 (도 8). 이는 pAA는 더 강력한 반응을 유도하였거나, 또는 후속 투여의 결과임을 나타낼 수 있다.
실시예 5
나노입자 전하(제타 전위)를 변화시킴으로써 CARPA 가 완화된다
나노입자 전하 (제타 전위)를 변화시킴으로써 CARPA가 완화된다. 이 연구는 돼지에게 t=0 시점에서 중성 입자(제타 전위 = -1.29 mV)가 주사되었고, 이어서 t=65 분 시점에서 양으로 하전된 입자의 두번째 주사가 주사되는 것으로 구성되었다. 이들 두 입자 제형은 모두 폴리(아크릴산)을 포함하였다. 표 2에 나타낸 것과 같이, 부형제가 아닌 상기 제타 전위가 CARPA를 조정한다.
Figure pct00007
첫번째 투여 2 mg/kg PLGA -PLL-PEG- NP' s + PAA (제타 = -1.29 mV)
중성적으로 하전된 입자의 주사 후 불리한 효과는 없었다 (도 10). ROTEM (NATEM) 및 헤모크론(Hemochron) Jr. (APTT)에 의해 측정된 바와 같이, 생리학적 매개변수 심박율 (HR,) MAP, p02, pCO2, 그리고 응고 프로파일은 이들의 기준 값 범위내에서 유지되었다. 상기 돼지는 두번째 주사 주사 (t=65 분)가 진행되기 전 최대 1시간 동안 관찰되었다.
나노입자-유도된 CARPA 이후의 손상
HR, MAP, CO2 및 02의 기준 생리학적 판독은 기준으로 복귀된 후, 출혈성 외상 후 지혈에 있어서 CARPA의 영향을 조사하기 위하여 상기 간 손상 모델이 실행되었다 (t=88 분, 또는 +20 mV 입자에 의해 유도된 CARPA의 해결 후 10분). 기존 연구에서와 같이, 즉각적인 흡출(bleed-out)은 관찰되지 않았고, 간 손상이 만들어진 후 5분에 CARPA가 유도되었다. 그러나, 대신, 표적화 모이어티가 없는 나노입자가 투여되었을 때, 염수 만을 제공받은 기존 대조집단과 비교하였을 때, 장기간에 걸쳐 혈액 손실의 양이 증가된 것으로 보였다(도 12). CARPA 없이, 염수 단독의 투여와 유사하게 나노입자의 투여에 반응하여 출혈이 느리게 진행된다.
염수-처리된 돼지와 비교하였을 때, 명백한 응고병증이 있다. 입자들은 시간=0 분에 투여되었다. 급성 단계 (0-5 분)에서 혈액 손실은 염수 대조군에서 380m1+/-59 ml (S.D.)에서 519ml로 악화되었다. 이 응고병증은 5-60 분 시간 범위에서 지속되어, 염수 대조 군의 395 ml와 비교하였을 때, 814 ml으로 출혈이 악화되었다. 염수로 처리된 돼지(n=4/4)의 240분과 비교하였을 때, CARPA (+손상) 실험에서 생존은 82분이었다.
대조 집단의 평균 775ml와 비교하였을 때, 이 연구의 총 1-시간 혈액 손실은 1330ml이었다 (또는 대조보다 -2.5 표준 편차의 등가). 모든 (n=4) 돼지는 최소한 240 분 (실험 종료)까지 생존하였던 염수 대조집단과 비교하였을 때, 총 생존 시간은 82 분이었다.
이 연구에서, 상기 돼지는 나노입자-유도된 CARPA에 과민한 것으로 나타났음이 설명되었으며, 하위 집단은 증상을 경험할 수도 있다. 중성 나노입자는 CARPA를 완화시킨다.
실시예 6
응집을 감소시키기 위하여 안정화제의 추가
중성 나노입자는 출혈을 감소시키고, CARPA를 유도하지 않지만, 이들 입자는 전하가 부족하기 때문에 응집된다는 것이 설명되었다. 따라서, 투여시 상기 나노입자의 응집을 감소시키기 위하여, 나노입자 조성물에 안정화제의 추가에 대하여 조하하였다. 이 연구는 실시예 2에서 설명된 돼지 간 손상 모델에서 실행되었다.
이 연구 결과는 하기 표 3과 4에서 제공된다. 상기 나노입자는 폴리(비닐 알코올) (PVA) 또는 폴옥사머 안에 포함되어 있었다. 각 처리 집단에는 한 마리 돼지가 있다. 폴리아크릴산 (PAA)을 추가하면 중성 입자보다는 음으로-하전된 나노입자가 초래되었다.
Figure pct00008
동적 빛 산란(DLA)이 이용되어 상기 나노입자의 크기 및 제타 전위가 측정되었다. CARPA를 유도하는 입자와 CARPA를 유도하지 않는 입자는 크기가 유사하였으며, 따라서 제타 전위에서의 차이가 나노입자 유도된 CARPA에 결정적이었다 (표 4 참고).
Figure pct00009
ELISA 사이토킨 분석 변이가 CARPA 동물에서 실행되었고, 사이토킨 비율은 비-CARPA 응답자와 비교하여 CARPA 동물에서 상향조절되었다. 도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 보체 활성화에 관련된 다음의 전통적 염증성 사이토킨들은 CARPA 동물에서 상승되었다: GM-CSF, SDF-1, INF-γ, IL-17E, SerpinE1, C5/C5a, MIP-1α, IL-23, IL-16, MIF, CD40 리간드. 이들 동물에서 CARPA (보체 반응)의 완화 결과로써, 상기 나노입자의 투여로 흡출이 촉발되지 않았다.
실시예 5
전신과 머리에만 폭발 외상에서 합성 혈소판의 스테로이드 운반
나노입자 (PLGA-PLL-PEG-cRGD)에 덱사메타손을 적하시켜, 폭발 외상 동물 모델을 이용하여 운반 계로써 상기 나노입자를 이용하여 약물 전달이 조사되었다.
폭발 및 처리에 대한 생리학적 반응 - 체중 감소
폭발 후 2일과 7일 시점에 렛(rat)의 체중 감소 (g)가 측정되었고, 테스트 당일의 체중과 비교되었다. 예상과 같이, 모의 집단 (폭발 없음)은 폭발 집단과 비교하였을 때 체중 감소를 더 경험하였고, 처리 집단간에 유의적인 차이는 없었다. 그러나, 7일 시점에서 활성 집단은 상기 대조 집단과 LR 집단과 상당한 차이를 보이기 시작한다. 이는 폭발 후 생리학적 회복을 설명할 수 있을 것이다.
상기 모의 집단은 2일 시점에서 모든 다른 집단과 통계학적으로 유의적이었다 . 상기 모의 집단은 대조 집단과 LR 집단보다 상당히 상이하였다. 대조군보다는 활성 집단 (합성 혈소판의 스테로이드-전달을 제공받은 집단 )은 대조 집단과 비교하였을 때 통계학적으로 유의적이며(p<0.05), 락테이트화된 링거 (LR) 집단 (p = 0.08)과 비교하였을 때 경향이 있다.
신경행동 및 인지 평가 - 오픈 필드 ( Open Field)
7일 시점에서 생존된 동물들은 인지 및 거동 테스트를 받았다. 렛에서 보행 및 탐색 거동을 측정하기 위하여, '오픈 필드 테스트(Open Field Test)'가 실행되었다(Sallinen et al., Br. J. Pharmacol . 150(4): 391-402 (2007)). 간략하게 설명하자면, 이 테스트를 위하여 80 x 80 x 36 cm 크기의 불투명 검정 아크릴 상자가 이용되었다. 동물들은 폭발에 노출된 후 2일차 및 7일차에 상자에 함께 배치된 물체없이 상자 안을 탐색하도록 하였다. EthoVision XT™ 소프트웨어 트래킹을 이용하여 활동 변화가 탐지되었다. 5분의 작업 동안 이동 거리 및 평균 속도를 구하여 폭발 손상 및 치료 후 동물의 행동 변화가 탐지되었다. 활동 집단은 LR 집단과는 통계학적으로 상이하였다.
NOR 평가
공간적 학습 및 단기 기억을 평가하기 위하여, 상기 동물들은 Novel Object Recognition (NOR) 테스트를 받았다. 잘-확립된 NOR 테스트를 이용하여 설치류 기억이 측정되었다 (Bevins et al., Nat. Protoc. 1(3):1306-11 (2006), Davis et al., J. Neurosci. Methods 189(1): 84-7 (2010). 간략하게 설명하자면, 동물은 폭발 테스트전 2일간 순화(acclimation) 기간을 거친다. 이 과정은 스트레스 및 처리를 줄이고, 테스트 환경에 대한 친화도를 증가시키기 위하여 실행되었다(Besheer et al., Behav . Processes, 50(1): 19-29 (2000)). 폭발 노출 후 7일차, 상기 동물들은 단기 기억 평가를 위하여 각 시험간에 20분 지연 시차를 두고 2가지 시험을 거쳤다. 첫 번째 시험(T1)은 5분 동안 동일한 "친숙한(familiar)" 대상에 대하여 동물을 노출시키는 것이다. 두 번째 시험(T2)에서, 동물들은 5분 동안 "친숙한" 대상(첫 번째 임무에서 이용된 것과 동일한 대상)과 "새로운(novel)" 대상에 노출되었다. 시험 및 동물 거동은 EthoVision XT™ 트래킹 소프트웨어를 이용하여 추적되었다. 각 시험 사이에 쳄버를 깨끗하게 하고, 실험 동안 그 방에 실험자를 남겨두는 주의를 기울여야 한다(Bevins et al., Nat. Protoc . 1(3): 1306-11 (2006)). 분석을 위하여, 각 시험에서 식별 지표가 산출되었다(각 시험 동안 새로운 대상과 비교하여 친숙한 대상을 탐색하는데 소요된 시간을 각 실험 동안 대상들을 탐색하는데 소요된 전체 시간으로 나눈다). 비율 0.5는 시험 동안 두 대상 모두에 대하여 동등한 탐색을 나타낸다. 내비축삭(entorhinal) 피질 병소를 갖는 렛들은 새로운 대상의 식별이 저조함을 보여주며(Aggleton et al., Behav . Neurosci. 124(1): 55-68 (2010)), 따라서 이 시험은 내비축삭 피질에 대한 손상 및 해마 과정으로의 문맥(portal)으로써 기억 형성에서 이의 역할을 반영할 수 있다. 결과는 각 평가의 통계학적 분석과 함께 제공되었다.
이 결과들은 폭발 후 1주일 시험에서 처리 집단에서 단기 기억 결함의 유의적인 개선을 설명하지는 않았다(도 14). 전신 회복은 뇌의 인지 중심과 관련된 기능적 결과를 지연시켰을 가능성도 있다. 이와 같이, 조직학적 매개변수들이 평가되었다.
오픈 필드 테스트 무대를 이용하여, 불안-유사 거동에 대하여 동물들이 또한 평가되었다(Sallinen et al., Br. J. Pharmacol . 50(4): 391-402 (2007)). 오픈 필드는 빈 무대로 구성되었다. 렛의 타고난 경향은 오픈 필드를 탐색하는 것이며, 이 경향은 개방된 켜진 공간의 자연적인 공포에 의해 균형을 이룬다. 따라서, 이 쳄버를 따라 보내는 시간은 불안의 증가된 수준을 반영하는 것으로 간주되었다. 5분간 렛을 비디오테이프로 녹화하였고, 중앙 광장 활동의 회피(가령, 불안-관련된 거동)은 개방 필드의 중앙 부분으로 진입하는 시간의 양 및 빈도를 측정함으로써 결정되었다.
주촉성( Thigmotaxis ) 평가 - 설치류에서 공포( 3 주차 집단-스테로이드)
활동 집단은 폭발 후 7일차에 대조 집단 및 LR 집단 모두와 유의적으로 상이하였다(* - p<0.05). 벽에 대한 유병률은 대조 및 LR 집단에서 더 많이 볼 수 있었다. 이 작업은 스테로이드-적하된 합성 혈소판은 폭발-유도된 두부 외상과 연합된 불안 및 기능적 결함을 감소시킬 수 있음을 암시하였다.
폭발 및 처리에 대한 조직학적 반응
1주일 후 생존 시점 및 거동 테스트에 후속적으로 동물은 안락사되었고, 모든 주요 장기들은 고정 용액 안에 수집되었다. 조직학적 착색 및 분석은 폐와 뇌에서 완료되었다.
폐 손상
폐 조직은 3가지 조직학적 기술을 이용하여 손상에 대하여 분석되었다. 고정 48 시간 후, 상기 폐는 조직 단편화를 위하여 30% 슈크로즈 용액에 두었다. 분석을 위하여 단리된 각 폐 엽과 함께 폐는 카세트로 분리되었다. 기존 연구에서 가장 많이 손상된 것으로 측정된 폐의 엽 A로부터 시료는 절단되고, 착색되었다. 각 폐 조직 단편에서 3개의 관심 영역(ROI)에 대한 영상을 찍었다. 이들 3개 영상은 흑백으로 전환되었고, 광학 밀도 판독을 수집하여 Image J 소프트웨어를 이용하여 폐 조직에서 손상 수준이 측정되었다. 각 엽에서 손상된 영역의 비율이 산출되었고, 유의성이 결정되었으며, 평균 ± SEM으로 보고되었다. 조직학적 통계학적 분석은 이원(two way) ANOVA 및 이어서 p < 0.05로 획득된 유의성과 함께 post hoc LSD 테스트에 의해 산출되었다.
우선, 폐 조직은 표준 헤마토실린 및 에오신 (H&E) 착색으로 평가되었다. 하기, 활동 집단은 LR 집단 대비 경향 유의성(trending significance)을 보유한다. 다른 엽에서의 결과는 결정적이지 못한데, 그 이유는 1주 시점에서 혈액 세포 제거가 있다고 의심되기 때문이다.
뇌 조직병리학
폭발 TBI 연구에서, 자가사멸(apoptosis) 및 신경아교 활성의 조직학적 표지들이 대조와 비교하였을 때 폭발 노출 후 상당히 상승되었다는 것이 밝혀졌다 (Sajja et al., NMR Biomedicine 25(12): 1331-9 (2012), Sajja et al., J. Neurosci . Res. 91(4): 593-601 (2013) and VandeVord et al.. Ann. Biomed . Engin . 40(1): 227-36 (2012)). 따라서, 이들 표지들을 이용하여 우리의 실험적 폐 손상 모델에서 폭발 신경외상의 기전을 입증하였다 반응성 별아교세포증은 모든 형태의 중추신경계 손상 또는 질환에서 주로 발생되기 때문에 1, 우리는 뇌 조직 안에 GFAP 수준을 검사하였다1. 자가사멸성 세포 사멸은 초기 단계 자가사멸의 지표인 카스파제 3(Abcam, Cambridge, MA)과 신경 퇴행에 대한 민감 정보를 제공하는(Kim et al., BMC Neurosci, 10: 123 (2009)) FluoroJade B (Abcam, Cambridge, MA)의 정량화에 의해 확인되었다. 집합적으로, 이들 착색으로 폭발 신경 손상의 존재, 정도 및 성질에 대한 평가가 허용될 것이다. 모든 측정은 개별적으로 기록되어, 착색, 손상 및 회복간의 상관 관계를 결정하였다. ANOVAs을 이용하여 집단간에 정량적인 수치가 비교되었다.
편도핵에서 GFAP 발현
녹색 형광으로 탐지되는 GFAP 발현은 활성 별아교세포의 수를 나타내었다. 활동 집단과 대조 집단 간에 활성 별아교세포의 수에서 유의적인 차이가 관찰되었다. 허위 집단은 모든 다른 집단과 통계학적으로 상이하였다. GFAP 발현을 나타내는 녹색 형광의 양에 따라 집적된 밀도(Integrated Density)는 영상 영역으로 표준화되었다. 전반적으로, 허위 집단과 활동 집단은 뇌 외상과 연합된 반응성 별아교세포를 덜 갖는다는 것이 자명하다.
편도핵에서 카스파제 -3 발현
절단된 카스파제-3 발현은 세포 사멸의 표지이며, 편도핵에서 측정되었다. 활동 집단 및 허위 집단과 비교하였을 때 대조 집단에서 카스파제-3 활성의 유의적인 차이가 관찰되었다. 활동 집단 및 허위 집단보다는 대조 집단 및 LR 집단에서 분명히 더 많은 세포 사멸이 있었다.
FJB 발현
Florojade B는 뇌에서 세포 사멸의 표지이다. 이 표지는 편도핵에서 관찰되었다. 이 경향은 활동 집단 및 허위 집단에서의 사멸이 대조 집단 보다 사멸이 적다는 것을 암시하였다. 이 결과는 시료 크기가 작기 때문에 유의적이지 않았다.
전반적으로, 데이터에 대한 조직학적 분석에서 대조집단보다 스테로이드-전달 합성 혈소판을 제공받은 집단(활동 집단)의 뇌에 세포 사멸이 적었고, 외상의 징후가 더 적음을 암시하지만, 조사된 집단의 수는 작다.
실시예 6
스테로이드 적하된 나노입자를 이용한 연구는 본 발명의 조성물 안의 나노입자 및 폴옥사머의 바람직한 농도를 찾도록 허용하였다. 이는 하기 표 5에 요약된다. 조성물은 상기 나노입자에 대하여 20% 폴옥사머 (중량비)를 포함한다. 상기 폴옥사머의 추가로 응집이 감소되었고, 초음파파쇄 없이 재현탁이 어용되었다.
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY Lavik, Erin <120> NEUTRALLY CHARGED SYNTHETIC PLATELETS TO MITIGATE COMPLEMENT RESPONSE <130> 31973/47879A PCT <150> US-61/812,642 <151> 2013-04-16 <150> US-61/864,969 <151> 2013-08-12 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Gly Arg Gly Asp Asn 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Gly Arg Gly Asp Asn Pro 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Gly Arg Gly Asp Lys 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Tyr Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PLGA-PLL-PEG <400> 11 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEG 4600 <400> 12 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 His His Leu Gly Gly Ala Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10

Claims (47)

  1. 나노입자를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 나노입자는 코어, 물 가용성 폴리머 및 펩티드를 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 물 가용성 폴리머의 제 1 말단에서 상기 코어에 부착되며, 상기 펩티드는 상기 물 가용성 폴리머의 제 2 말단에 부착되며, 상기 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 펩티드가 당단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 결합을 허용하도록 충분한 길이를 가지고 있으며, 상기 조성물은 폴옥사머를 더 포함하는 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 폴옥사머는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 60%로 존재하는, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 폴옥사머는 상기 조성물의 약 0.1% 내지 약 40%로 존재하는, 조성물.
  4. 청구항 1-3중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 조성물 안에 폴옥사머는 나노입자 질량의 최대 50배 존재하는 것들을 포함하는, 조성물.
  5. 청구항 1-4중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 폴옥사머는구조 -[친수성 폴리머-소수성 폴리머-친수성 폴리머]n-를 포함하는 비-이온(non ionic) 삼중블럭 코폴리머인, 조성물.
  6. 청구항 1-5중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 폴옥사머는 -[폴리에틸렌 글리콜 - 폴리(프로필렌 옥시드)- 폴리에틸렌 글리콜]n- 인, 조성물.
  7. 청구항 1-5중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 폴옥사머는 폴옥사머 101, 폴옥사머 105, 폴옥사머 108, 폴옥사머 122, 폴옥사머 123, 폴옥사머 124, 폴옥사머 181, 폴옥사머 182, 폴옥사머 183, 폴옥사머 184, 폴옥사머 185, 폴옥사머 188, 폴옥사머 212, 폴옥사머 215, 폴옥사머 217, 폴옥사머 231, 폴옥사머 234, 폴옥사머 235, 폴옥사머 237, 폴옥사머 238, 폴옥사머 282, 폴옥사머 284, 폴옥사머 288, 폴옥사머 331, 폴옥사머 333, 폴옥사머 334, 폴옥사머 335, 폴옥사머 338, 폴옥사머 401, 폴옥사머 402, 폴옥사머 403, 폴옥사머 407 및 Kolliphor P 188로 구성된 집단에서 선택된, 조성물.
  8. 청구항 1-5중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 폴옥사머는 Pluronic® 10R5, Pluronic® 17R2, Pluronic® 17R, Pluronic® 25R2, Pluronic® 25R4, Pluronic® 31R1, Pluronic® F 108 Cast Solid Surfacta, Pluronic® F 108 NF, Pluronic® F 108 Pastille, Pluronic® F 108NF Prill Poloxamer 338, Pluronic® F 127, Pluronic® F 127 NF, Pluronic® F 127 NF 500 BHT Prill, Pluronic® F 127 NF Prill Poloxamer 407, Pluronic® F 38, Pluronic® F 38 Pastille, Pluronic® F 68, Pluronic® F 68 Pastille, Pluronic® F 68 LF Pastille, Pluronic® F 68 NF, Pluronic® F 68 NF Prill Poloxamer 188, Pluronic® F 77, Pluronic® F 77 Micropastille, Pluronic® F 87, Pluronic® F 87 NF, Pluronic® F 87 NF Prill Poloxamer 237, Pluronic® F 88, Pluronic® F 88 Pastille, Pluronic® F 98, Pluronic® L 10, Pluronic® L 101, Pluronic® L 121, Pluronic® L 31, Pluronic® L 35, Pluronic® L 43, Pluronic® L 44 NF, Poloxamer 124, Pluronic® L 61, Pluronic® L 62, Pluronic® L 62 LF, Pluronic® L 62D, Pluronic® L 64, Pluronic® L 81, Pluronic® L 92, Pluronic® L44 NF, Pluronic® N 3, Pluronic® P 103, Pluronic® P 104, Pluronic® P 105, Pluronic® P 123 Surfactant, Pluronic® P 65, Pluronic® P 84, 및 Pluronic® P 85로 구성된 집단에서 선택된, 조성물.
  9. 나노입자를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 나노입자는 코어, 물 가용성 폴리머 및 펩티드를 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 물 가용성 폴리머의 제 1 말단에서 상기 코어에 부착되며, 상기 펩티드는 상기 물 가용성 폴리머의 제 2 말단에 부착되며, 상기 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하며, 상기 물 가용성 폴리머는 상기 펩티드가 당단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 결합을 허용하도록 충분한 길이를 가지고 있으며, 상기 조성물은 폴옥사머를 더 포함하는 조성물.
  10. 청구항 1-9중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자는 약 -3.0 mV 내지 약 3 mV의 제타 전위를 보유하는, 조성물.
  11. 청구항 1-10중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자는 타원체 모양을 보유하고, 1 미크론 미만의 직경을 가진, 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 이때 상기 나노입자는 0.1 미크론 내지 1 미크론 사이의 직경을 보유하는, 조성물.
  13. 청구항 1-10중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자는 비-타원체 모양을 갖는, 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 이때 상기 나노입자는 막대, 섬유 또는 위스커(whisker)인 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 이때 상기 나노입자는 폭에 대한 길이 형상 비율(aspect ratio)이 최소한 3인, 조성물.
  16. 청구항 1-15중 임의의 하나에 있어서, 최소한 14 일 동안 실온에서 안정적인 조성물.
  17. 청구항 1-16중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자 코어는 결정 폴리머인 조성물.
  18. 청구항 17중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 코어는 단일 폴리머, 블럭 코폴리머, 삼중블럭 코폴리머 또는 사중블록 폴리머인 조성물.
  19. 청구항 1-18중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자 코어는 PLGA, PLA, PGA, (폴리 (ε-카프로락톤) PCL, PLL 또는 이의 조합을 포함하는, 조성물.
  20. 청구항 1-19중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자 코어는 생물분해가능한, 조성물.
  21. 청구항 1-20중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자 코어는 고체인 조성물.
  22. 청구항 1-19중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자 코어는 생물분해불가능한, 조성물.
  23. 청구항 1-23중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자 코어는 금, 은, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈, ZnS, ZnO, Ti, TiO2, Sn, SnO2, Si, SiO2, Fe, Fe+4, 강철, 코발트-크롬 합금, Cd, CdSe, CdS, and CdS, 티타늄 합금, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, Cd3As2, InAs, GaAs, 셀룰로오즈 또는 덴드라이머 구조로 구성된 집단에서 선택된 물질인, 조성물.
  24. 청구항 1-22중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 물 가용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분기된 PEG, 폴리시알산 (PSA), 탄수화물, 폴리사카라이드, 풀루란, 치토산, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥시드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일몰포린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 안하이드리드, 폴리스티렌-코-말레산 안하이드리드, 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아세탈, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 안하이드리드 코폴리머, 폴리 (β-아미노산) (동종폴리머 또는 렌덤 코폴리머), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종폴리머 (PPG) 그리고 다른 폴리알킬렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POG) (가령, 글리세롤) 및 다른 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸화된 포도당, 콜론산 또는 다른 탄수화물 폴리머, 피콜(Ficoll) 또는 덱스트란 그리고 이의 조합 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된, 조성물.
  25. 청구항 1-23중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 물 가용성 폴리머는 PEG인, 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 PEG는 100 Da 내지 10,000 Da의 평균 분자량을 보유하는, 조성물.
  27. 청구항 25 또는 26에 있어서, 이때 PEG는 최소한 약 100의 평균 분자량을 보유하는, 조성물.
  28. 청구항 1-27중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 펩티드는 RGD, RGDS (서열 번호: 1), GRGDS (서열 번호: 2), GRGDSP (서열 번호: 3), GRGDSPK (서열 번호: 4), GRGDN (서열 번호: 5), GRGDNP (서열 번호: 6), GGGGRGDS (서열 번호: 7), GRGDK (서열 번호: 8), GRGDTP (서열 번호: 9), cRGD, YRGDS (서열 번호: 10) 또는 이의 변이체들로 구성된 집단에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물.
  29. 청구항 1-28중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 RGD 펩티드는 일렬 반복으로 된 조성물.
  30. 청구항 1-29중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 RGD 펩티드 복사체를 포함하는, 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서, 이때 RGD 펩티드의 다중 복사체를 포함하는, 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 RGD 펩티드의 모든 복사체는 동일한, 조성물.
  33. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 RGD 펩티드의 2개 복사체는 상이한 서열을 보유한, 조성물.
  34. 청구항 1-33중 임의의 하나에 있어서, 이때 청구항 1-8 및 11-27중 임의의 하나에 따른 상기 나노입자에서, 상기 물 가용성 폴리머는 0.1:1 내지 1:10 또는 그 이상의 몰비율에서 상기 코어에 부착된, 조성물.
  35. 청구항 1-34중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 나노입자는 치료요법적 화합물을 더 포함하는, 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서,이때 상기 치료요법적 화합물은 소수성인, 조성물.
  37. 청구항 35에 있어서, 이때 상기 치료요법적 화합물은 친수성인, 조성물.
  38. 청구항 35-37중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 치료요법적 화합물이 상기 나노입자에 공유적으로 부착되거나, 상기 나노입자와 비-공유적으로 연합되거나, 정전기적 상호작용을 통하여 상기 나노입자와 연합되거나, 또는 소수성 상호작용을 통하여 상기 나노입자와 연합된, 조성물.
  39. 청구항 35-38중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 치료요법적 화합물은 성장 인자, 사이토킨, 스테로이드, 또는 작은 분자인, 조성물.
  40. 청구항 35-39중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 치료요법적 화합물은 항암 화합물인, 조성물.
  41. 청구항 1-40중 임의의 하나에 있어서, 약학 조성물인 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, 정맥내 투여 제형안에 있는 조성물.
  43. 청구항 41에 있어서, 동결건조되거나 또는 분말인 조성물.
  44. 개체의 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 상태를 치료하는데 효과적인 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 청구항 1-43중 임의의 하나에 따른 조성물을 투여하는 단계가 포함된, 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 이때 상기 개체는 출혈 장애를 가진, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 이때 상기 조성물은 투여가 없거나 또는 염수 투여와 비교하였을 때 투여되는 출혈 시간을 15% 이상 감소시키는데 효과적인 양으로 투여되는, 방법.
  47. 청구항 45 또는 46에 있어서, 이때 상기 출혈 장애는 응고 장애, 혈소판감소증, 상처 치유 장애, 외상, 폭발 외상, 척수 손상 또는 출혈의 증상인, 방법.
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