KR20150143311A

KR20150143311A - 무세포 진피의 가교 및 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR20150143311A
Application number: KR1020150075852A
Authority: KR
Inventors: 김장일; 김형구; 정인희; 김이슬; 이환철
Original assignee: 주식회사 엘앤씨바이오
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2015-12-23
Also published as: KR101650273B1

Abstract

본 발명은 (i) 피부 조직에서 표피층을 제거하는 단계; (ii) 상기 표피층이 제거된 피부조직에서 진피층의 세포를 제거하는 단계; (iii) 상기 무세포 진피를 동결건조한 후, 시트 형태로 제작하거나 또는 상기 무세포 진피를 입자형으로 분쇄하는 단계; (iv) 상기 (iii) 단계의 무세포 진피에 가교제를 첨가하여 무세포진피-무세포진피 간 가교결합시키는 단계; 및 (v) 상기 가교결합된 무세포 진피를 동결건조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 생체 이식/삽입용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 BDDE로 가교된 1) 무세포 진피 조직, 2) 히알루론산-무세포 진피 조직, 3) 항산화제-무세포 진피조직 등의 조성물들은 이식/삽입 시에 나타날 수 있는 통증, 부종 발열과 같은 급성 염증반응이 적고 단백질 분해효소의 분해 영향을 적게 받아 생체 보존성이 길어 손상된 조직 수복용 생체재료로 활용 가능하다.

Description

무세포 진피의 가교 및 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법 {MANUFACTURING METHOD OF BIO-GRAFT OR BIO-IMPLANT COMPOSITIONS COMPRISING CROSSLINKIED ACELLULAR DERMAL MATRIX}

본 발명은 생분해성 가교제를 이용한 1) 무세포 진피의 가교, 2) 무세포 진피와 히알루론산의 가교, 3) 무세포 진피와 항산화제의 가교 및 4) 상기 가교물질들을 이용한 생체 이식(graft)/삽입(implant)용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 무세포 진피의 표면에 히알루론산 혹은 항산화 물질을 가교제를 통해 분자적으로 가교한 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

피부 대체재는 사람 유래의 동종진피, 동물 유래의 이종진피, 그리고 합성물로 분류할 수 있으며 동종 진피 유래 피부 대체재 (무세포 동종진피, acellular dermal matrix(ADM))가 상대적으로 고가인 반면, 이식 후에 면역 거부반응 또는 염증반응이 일어나지 않는 장점을 가지고 있어 최적의 피부 대체재로 평가 받고 있다. 시트(sheet) 형태의 동종진피는 화상 및 교통사고 등과 같은 사고 및 다양한 외과 수술재료로 사용되고 있으며 수술 후에 발생하는 유착 문제를 해결하기 위해 사용되기도 한다. 시트 형태의 동종진피를 분쇄시켜 일정 크기 입자로 만든 입자형 동종진피는 수술이 아닌, 비수술적 방법인 주사기를 이용한 주입이 가능하기 때문에 당뇨병과 같은 만성질환에 의한 피부 결손에 사용 될 뿐만 아니라, 성형외과 영역에서 확대 목적으로 다양하게 이용되고 있다. 그러나, 입자형 동종진피는 생체 내에서 콜라게나제를 비롯한 단백질 분해효소들에 의해 일정 속도로 분해되어 약 6~12 개월 정도의 낮은 생체보존성을 보이는 단점을 가지고 있다.

필러는 결손된 신체 부위 및 조직 복원용으로 사용될 뿐만 아니라, 성형외과 분야에서 매우 일상적으로 사용되고 있다. 이들 필러의 성분은 생체 적합도가 높은 생분해성 생체재료 및 합성재료가 주를 이루어 왔다. 필러 성분 중에 주류를 이루고 있는 히알루론산 (hyaluronic acid (HA))은 피부, 관절, 눈, 혈관, 뇌 등에 존재하는 생체 구성물질로서 안전성이 입증된 생체재료이다. 수분 함유량이 50 ~ 200 배에 달할 정도로 보습성이 뛰어나고 피부에 탄력을 제공할 뿐만 아니라, 염증억제 효과가 뛰어난 히알루론산은 소의 눈, 닭 벼슬과 같은 생체조직에서 추출하여 사용하거나 미생물 배양을 통해 생산하여 재료로 이용되고 있다. 히알루론산은 다양한 분자량으로 정제될 수 있으며 가교화 (cross-linking)를 통해 입자의 크기를 조절할 수 있어 다양한 목적의 필러로 개발되었다. 그러나, 생체 내에 히알루론산이 주입되었을 때, 쉽게 주변 조직으로 퍼져 버리거나 충진감이 떨어지는 단점이 있었다.

항산화 물질은 활성 산소 종류의 발생을 억제함으로써 임상적으로 다양한 이점(benefits)을 갖는다. 대표적인 항산화(antioxidant) 물질 중 하나인 비타민 C는 항염증제로도 작용하고, 효소 작용에 의한 콜라겐과 신생혈관생성에 대한 조력인자(cofactor)로서 작용한다. 이러한 항산화 물질은 무세포 진피 조직 또는 히알루론산에 인체내 안정성이 입증된 생분해성 가교제인 1,4-부탄디올 다이글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 사용해 가교가 가능하다.

대한민국 등록특허 10-1304949는 히알루론산-젤라틴이 로딩된 지지체의 제조방법을 개시하고 있다. 또한, 미국 공개특허(출원) US 2013/0210760 A1은 히알루론산과 비타민 C가 BDDE로 가교된 필러용 조성물 및 그 제조방법을 개시하고 있다. 그러나 현재까지 BDDE를 이용한 1) 무세포 진피 조직끼리의 가교, 2) 무세포 진피 조직과 히알루론산의 가교, 3) 무세포 진피 조직과 항산화제의 가교 및 가교된 생체 이식/삽입용 조성물의 제조방법에 관한 기술은 전무한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1304949호 미국 공개특허 US 2013-0210760 A1

본 발명의 목적은 가교제를 이용하여 1) 무세포 진피 조직, 2) 무세포 진피 조직과 히알루론산, 3) 무세포 진피 조직과 항산화제를 가교하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는삽입용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 생체 이식 또는 삽입용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 생분해성 가교제인 1,4-부탄디올 다이글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 이용하여 1) 무세포 진피 조직끼리 가교된 조성물, 2) 무세포 진피 조직과 히알루론산이 가교된 조성물, 3) 무세포 진피 조직과 항산화제가 가교된 생체 이식 또는 삽입용 조성물을 제공한다. 본 발명의 생체 이식/삽입용 조성물의 제조방법은, 시트형 무세포 진피조직을 생산 혹은 입자형으로 파쇄하고, 상기 무세포 진피조직을 BDDE를 통해 진피 조직끼리 혹은 히알루론산 또는 항산화제와 가교하는 단계를 포함한다.

보다 구체적으로, 상기 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법은,

(i) 피부 조직에서 표피층을 제거하는 단계;

(ii) 상기 표피층이 제거된 피부조직에서 진피층의 세포를 제거하는 단계;

(iii) 상기 무세포 진피를 동결건조한 후, 시트 형태로 제작하거나 또는 상기 무세포 진피를 입자형으로 분쇄하는 단계;

(iv) 상기 (iii) 단계의 무세포 진피에 가교제를 첨가하여 무세포진피-무세포진피 간 가교결합시키는 단계; 및

(v) 상기 가교결합된 무세포 진피를 동결건조하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 상기 (iv) 단계는, 상기 가교제에 히알루론산 또는 항산화제를 추가로 포함하여 히알루론산 또는 항산화제가 가교된 무세포 진피를 제조하는 단계;로 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "시트형 무세포 진피 조직"은 분리된 진피를 화학적 처리과정을 통해 면역거부반응 일으킬 수 있는 세포들을 제거한 진피층을 말하며, 콜라겐과 엘라스틴이 주성분을 이루고 있다. 시트형 무세포 진피 조직은 적용하고자 하는 질환 부위에 따라 다양한 면적으로 제작되어 이식(graft) 또는 삽입(implant) 방식으로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "입자형 무세포 진피 조직'은 시트형 무세포 진피를 입자화하여 미세구조로 만든 것이다. 종래에, 동결건조된 입자형무세포 진피는 그 자체를 식염수 또는 증류수로 수화하여 피부 대체재로 사용하였으며 유동성 상태를 유지할 수 있기 때문에 수술을 통하지 않고 주사기를 사용하여 주입할 수 있는 장점을 가지고 있었다. 이 때문에 입자형 무세포 진피 조직은 사고로 인한 피부조직 결손 치료뿐만 아니라, 당뇨성 궤양 만성질환 치료 등의 조직 수복용으로 사용하였다. 성형시장에서 안전하고 효과적인 생체재료로써 입자형 무세포 진피 조직을 필러로 사용하기도 하였다.

본 발명의 구체예에서, 상기 입자형 무세포 진피는 약 300-800 μm의 입자크기를 가질 수 있으며, 바람직하게는 약 500 μm 정도일 수 있다. 상기 입자형 무세포 진피의 입자크기가 300 μm 미만인 경우, 단백질 분해요소인 collagenase(Matrix Metalloproteinase, MMP-1)의 영향으로 진피조직의 생분해 속도가 한층 빨라져, 인체 주입 후 체내 보존시간이 짧아질 수 있고, 상기 입자형 무세포 진피의 입자크기가 800 μm 초과인 경우, 주사기를 이용한 체내 주입이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다. 따라서 상기 입자크기 범위 안에서 수술하지 않고 주사기로 생체 내로 주입 가능한 바, 사용이 용이하다.

본 발명에 있어서, 상기 무세포 진피 조직은 인간유래의 동종 혹은 동물 유래의 이종 진피조직일 수 있으며, 이러한 무세포 진피조직을 준비하는 과정은 다음과 같이 동종의 무세포 진피 조직을 제작하는 과정으로 묘사한다:

기증된 시신의 조직을 신체에서 분리하여 운반할 때, 저산소증에 의한 조직손상, 자가분해효소에 의한 분해, 단백질 분해효소에 의한 세포외간질의 손상 등의 위험이 있다. 또한, 운반용액의 삼투압에 따라 물리적인 손상을 입을 수도 있다. 그 뿐 아니라 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 의한 오염 위험이 항상 존재한다. 따라서 조직의 운반에 이용되는 용액에는 저산소증에 의한 분해, 자가분해효소에 의한 분해, 단백질, 분해효소에 의한 분해를 막을 수 있는 물질을 첨가하여야 하고, 미생물의 오염을 막을 수 있는 항생제와 항균제를 첨가하여야 한다. 삼투압에 의한 조직의 손상을 막기 위해 적절한 완충용액이 포함되어야 한다. 조직 운반용액의 삼투압은 혈장의 삼투압인 260 ~ 320 mOsm/kg 정도의 삼투압을 가져야 한다. 동물세포배양 등에 많이 이용되는 상업적인 배지의 경우 삼투압이 260 ~ 320 mOsm/kg 정도로 혈장의 삼투압과 비슷한 수준을 갖는다. 따라서, 상업적인 배지를 기본용액으로 이용하고 거기에 여러 가지 역할을 하는 성분을 첨가하여 이용한다.

세균이나 곰팡이의 오염을 막기 위해 페니실린, 스트렙토마이신, 가나마이신, 네오마이신, 바시트라신, 젠타마이신, 반코마이신 등과 같은 항생제를 단독 또는 조합으로 첨가하여, 암포테리신-비, 니스타틴, 폴리믹신 등과 같은 항균제를 단독 또는 조합으로 첨가한다. 또 여러가지 분해효소에 의한 조직의 손상을 막기 위해 효소억제제를 첨가하여야 한다.

효소억제제로는 엔-에틸말레이미드(NEM), 불화페닐메틸술포닐(PMSF), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 등과같은킬레이트화물질, 루펩틴, 아포프로티닌 등과 같은 단백질분해효소 억제제 등을 이용한다. 또한, 물리적인 손상을 최소화 할 수 있는 방법에 따라 조직을 운반하여야 한다.

대부분의 효소반응은 온도에 따라 많은 영향을 받으며 인간의 체온인 37℃ 주변에서 가장 활성이 강하게 된다, 따라서 조직을 4℃ 정도의 저온 상태로 운반한다. 일반적으로 아이스박스에 얼음을 채워 운반하는 방법을 이용한다. 운반용액이 얼 정도로 낮은 온도로 조직을 운반하면 얼음결정이 조직을 손상시킬 수 있으므로 피해야 한다.

무세포 진피 조직을 얻는 과정은 크게 2단계로 나눌 수 있으며, 제 1 단계는 상기와 같이 준비된 조직으로부터 표피층을 제거하는 단계로서, 표피층과 진피층을 분리한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 표피층은 단백질 분해 효소를 이용하여 진피층과 분리시켜 제거할 수 있다. 일반적으로 진피층과 표피층을 분리하는데 여러 가지 단백질 분해효소를 사용하게 된다. 효소를 사용하는 경우 사용 농도가 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 분리가 잘 이루어지지 않고, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 세포나 조직에 손상을 일으키게 된다. 따라서 적절한 농도와 시간에 따라 처리하여야 한다. 진피층과 표피층을 분리하는데 이용되는 효소로는 중성 단백질 분해효소인 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등이 있다. 1.0 units/㎖ 농도의 디스파아제로 37℃에서 60∼120 분 간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 또는 200 ㎍/㎖ 농도의 터몰리신을 37℃에서 30분 간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 터몰리신을 이용하면 디스파아제를 이용하는 경우보다 기저막의 손상 위험이 낮아진다. 또 다른 방법으로는 용액의 이온강도를 변화시켜 조직의 두 층을 분리하기도 하는데 이 방법도 역시 이온강도와 처리시간, 처리온도 등의 조건에 따라 효율이 달라진다. 1몰 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 1몰 이상의 염화나트룸 용액에서는 세균이나 곰팡이 등이 증식할 수 없기 때문에 미생물의 오염위험을 낮출 수 있다. 또는 20 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하여도 역시 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. EDTA를 이용하면 EDTA가 단백질 분해효소 억제제의 역할을 하기 때문에 단백질분해효소에 의한 조직의 손상을 줄일 수 있다. 따라서, 1몰의 염화나트륨용액에 1∼5 mM의 EDTA를 첨가하여 처리하면 미생물의 오염이나 효소에 의한 조직손상을 최소화하며 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.

제 2 단계는 상기와 같이 표피층을 제거한 다음, 진피층의 세포를 제거하는 것이다. 면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막단백질에 의해 야기된다. 따라서 세포를 제거하면 면역반응을 최소화할 수 있다. 세포와 세포외간질과의 물리, 화학적 성질의 차이를 이용하여 조직의 손상 없이 세포만 선별적으로 제거하는 방법을 이용한다. 세포막의 주성분은 인지질로 여러 가지 계면활성제를 이용하면 조직의 손상 없이 세포를 제거할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 진피층의 세포는 계면활성제 또는 초음파 처리하여 제거할 수 있다. 이를 위하여 소듐도데실설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제, 또는 트리톤엑스-100, 트윈20, 트윈40, 트윈60, 트윈80, 노니데트피-10(NP-10), 노니데트피-40(NP-40) 등과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용된다.

진피층을 실온에서 0.2∼1% 농도의 SDS 용액으로 실온에서 30∼120분 간 처리하면 조직의 손상 없이 세포를 제거할 수 있다. 또는 0.1∼2.0% 농도의 트윈 20 용액으로 실온에서 30∼180분 간 처리하거나, 0.2∼2% 농도의 트리톤엑스-100 또는 노니데트피-40 용액으로 22-37℃에서 30∼180분 간 처리하면 역시 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다.

상기 화학적인 방법 외에 물리적인 방법으로도 세포를 제거할 수 있는데, 진피층에 5∼60분간 10∼100 ㎑의 초음파를 처리하면 세포를 제거할 수 있다. 또는 계면활성제와 초음파를 조합하여 사용하여도 역시 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 또한, 용매(TNBP)와 계면활성제를 사용하여 세포제거와 바이러스 제거를 동시에 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "히알루론산"은 동물 등의 피부, 관절액, 연골 등에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질로서 수산화기가 많기 때문에 친수성을 띤 뮤코다당류이다. 물과 결합하여 겔 상태가 되어 관절의 윤활작용이나 피부의 유연성 등에 관여하며 점성이 크므로 세균의 침입이나 독물의 피부 침투를 막는 데에도 중요한 역할을 한다. 피부에 히알루론산이 부족하면 피부가 건조하고 탄력이 없고 주름이 지게 된다. 이 때문에 히알루론산을 주름을 방지하거나 꺼진 부위를 채워주기 위해 필러로 사용하기도 한다. 미생물에서 발현한 히알루론산은 110 만 달톤 (1,100 kDa) 또는 300 만 달톤 (3,000 kDa)의 크기를 가지고 있으며 자외선, 방사선, 전자빔과 같은 물리적인 방법 또는 BDDE 등을 이용한 화학적 방법을 통한 가교화 (cross-linking)에 따라 물리적 물성과 생리적 물성의 차이가 나타난다.

본 발명에 있어서, 상기 무세포 진피 조직끼리의 가교 혹은 무세포 진피 조직과 히알루론산 또는 항산화제와의 가교는 가교물질을 통해 분자적으로 결합된 형태일 수 있다. 미생물에서 정제된 고분자 히알루론산은 농도에 따라 점성이 달라진다. 또한, 가교화 되지 않은 히알루론산은 가교된 히알루론산 보다 점도가 떨어지고 생체 내에서 분해가 빨리 이루어지므로 생체 보존성을 높이기 위해 히알루론산을 적절한 방법을 이용하여 가교화 시킨다.

본 발명에서는 BDDE를 이용하여 1) 무세포 진피 조직 또는 2) 히알루론산 또는 3) 항산화제를 무세포 진피 조직에 분자적으로 가교시킬 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 가교화를 위한 가교제로는 에폭시(epoxide) 관능기를 갖는 단일기능성 가교제를 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단일기능성 가교제"는 에폭시 관능기를 갖는 가교제를 모두 포함하며 그 대표적인 예로는, 1,4-부탄디올 다이글리시딜 에테르(1,4-butanediol dyglycidyl ether, BDDE) 또는 star-PEG 에폭사이드(pentaerythritol glycidal ether) 등이 될 수 있다. 본 명세서에서 상기 단일기능성 가교제는 에폭시 관능기에 무세포 진피 조직의 아민기(-NH2) 또는 히드록시기(-OH) 또는 치올기(-SH)가 pH에 따라 결합 가능한 가교제를 의미한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 가교제의 첨가량은 전체 조성물 1 mL 당 10 μL 내지 100 μL로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체예에서, 상기 히알루론산의 함유량은 전체 조성물 1mL 당 10 μg 내지 100 mg 으로 포함될 수 있다. 바람직하게는 일반적으로 체내에 존재하는 히알루론산의 농도인 0.03 중량%로 포함될 수 있다. 히알루론산의 함유량이 전체 조성물의 100 mg 를 초과하게 되면, 고농도의 히알루론산이 결합된 무세포 진피조직 조성물은 주된 물성이 진피조직의 물성 보다는 히알루론산의 물성으로 역전될 수 있고, 입자형의 경우는 이로 인하여 주사기를 통한 체내 주입이 어려울 수도 있다. 반면, 10 μg 미만의 저농도 히알루론산이 결합된 무세포 진피조직 조성물은 체내 보존성 증가를 기대하기 어렵다.

또한 본 발명은 상기한 생체 이식/삽입용 조성물의 제조방법에, 상기 히알루론산이 결합된 입자형 무세포 진피를 멸균수, 생리 식염수, 혈액에서 추출한 PRP (platelet rich plasma) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 가교된 무세포 진피를 멸균수, 생리 식염수, 혈액에서 추출한 PRP (platelet rich plasma)와 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 용액의 사용을 통해 염증반응 및 면역반응 등을 피할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 항산화제를 무세포 진피 조직에 분자적으로 가교시킬 수 있다. 상기 항산화제는 안정화된 비타민 C 유도체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 비타민 C 유도체는 바람직하게 아스코르브산 2-글루코사이드, L- 아스코르브산 2-글루코사이드, 2-포스포-L-아스코르브산 트리소듐염, 아스코르빌 3-아미노프로필 포스페이트, 소듐 아스코르빌 포스페이트 및 이들의 혼합물로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 항산화제는 가장 바람직하게 아스코르브산 2-글루코사이드(Ascorbic acid 2-glucoside, Matrix Scientific, AA2G) 또는 2-포스포-L-아스코르브산 트리소듐염(2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt, AA2P) 일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 비타민C 유도체의 첨가량은 전체 조성물 1mL 당 50 mg 내지 700 mg으로 포함되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 생체 이식 또한 삽입용 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 무세포 진피 조직끼리 혹은 무세포 진피 조직과 히알루론산 또는 항산화제를 가교물질을 통해 분자적으로 결합시킨 생체 이식 또는 삽입용 조성물을 제공한다. 상기 생체 이식 또는 삽입용 조성물은 피부 및 조직을 수복하기 위한 손상 치료제, 생체재료로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 가교된 무세포 진피조직은 더욱 상세하게는, 수술하지 않고 주사기로 주입 가능한 입자 크기를 갖는 입자형 무세포 진피조직이 가교제를 통해 가교된 조성물; 혹은 히알루론산 또는 항산화제가 가교제를 통해 분자적으로 입자형 무세포 진피 조직에 결합된 생체 이식 또는 삽입용 조성물이거나, 동일한 방식의 가교를 통해 만들어지는 시트형 무세포 진피 조직일 수 있다. 본 발명의 조성물들은 이식 또는 삽입 시에 나타날 수 있는 통증, 부종 발열과 같은 급성 염증반응이 감소할 수 있고 단백질 분해효소의 분해 영향을 적게 받아 생체 보존성이 길 수 있다. 따라서 손상된 조직 수복용 생체재료로 활용 가능하다. 또한, 피부과, 화상외과 및 일반외과에서 창상으로 인한 조직 수복용 생체재료로 사용할 수 있으며, 성형외과에서 안구함몰, 유방암 치료에 따른 가슴재건 등 다양한 목적의 필러로서도 활용 가능하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에 따른 생체 이식 또는 삽입용 조성물은 생체 내에서 스캐폴드(scaffold)로 작용하여 피이식/피삽입자의 세포들이 이동하여 생장할 수 있는 생리적 공간으로 작용하고 신생혈관형성(angiogenesis)으로 모세혈관이 생겨 시간이 흐름에 따라 피이식/피삽입자의 조직이 될 수 있어, 손상된 조직의 수복 및 성형의 용도로 활용 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물 내의 항산화제는 조력인자로서 신생혈관형성 및 콜라겐 생성에 도움을 줄 수 있다.

도 1은 본 발명의 구체예에 따른 이식(graft)을 위한 시트형 무세포 진피 조직의 (1) 동결건조 후 사진, (2) H&E염색 사진, 그리고 (3) 모식도이다.
도 2는 본 발명의 구체예에 따른 삽입(implant)을 위한 입자형 무세포 진피 조직의 (1) 동결건조 후 사진, (2) ex vivo H&E염색 사진, 그리고 (3) 모식도이다.
도 3은 본 발명의 구체예에 따라, BDDE로 가교된 (1) 시트형 무세포 진피 조직의 사진과 (2) pH 7.5~8.5; pH 8~10; pH 11~12의 조건에서 BDDE로 가교된 시트형 무세포 진피 조직의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 구체예에 따라, BDDE로 가교된 (1) 입자형 무세포 진피 조직의 사진과 (2) pH 7.5~8.5; pH 8~10; pH 11~12의 조건에서 BDDE로 가교된 입자형 무세포 진피 조직의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 구체예에 따른 히알루론산이 가교된 시트형 무세포 진피 조직의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 구체예에 따른 히알루론산이 가교된 입자형 무세포 진피 조직의 모식도이다.
도 7는 본 발명의 구체예에 따른 비타민 C가 가교된 시트형 무세포 진피 조직의 모식도이다.
도 8은 본 발명의 구체예에 따른 비타민 C가 가교된 입자형 무세포 진피 조직의 모식도이다.
도 9는 본 발명의 구체예에 따라, HA의 feed ratio가 증가할수록 무세포진피에 가교되는 HA의 양이 증가하는 것을 간략히 확인한 사프라닌 O stain/destain 결과이다(MF: 입자형 무세포 진피 대조군; MF, HA Mix: 무세포진피 및 히알루론산의 혼합물 대조군; MF-MF: MF끼리 가교된 대조군; 2% HA CL: feed ratio가 2% HA인 MF-HA 가교군; 3% HA CL: feed ratio가 3% HA인 MF-HA 가교군; 4% HA CL: feed ratio가 4% HA인 MF-HA 가교군; 5% HA CL: feed ratio가 5% HA인 MF-HA 가교군)
도 10은 본 발명의 구체예에 따라, 무세포진피에 가교된 히알루론산 비율을 열중량분석법(TGA)을 이용해 측정한 결과이다(MF: 입자형 무세포 진피 대조군; MF, HA: 히알루론산 대조군; HA+MF, 0.6% HA: 무세포진피 및 0.6% 히알루론산의 혼합물 대조군; HA-B-MF, 0.6% of HA: feed ratio가 0.6%인 MF-HA 가교군; HA-B-MF, 6.0% of HA: feed ratio가 6.0% MF-HA 가교군).
도 11은 본 발명의 구체예에 따른 무세포진피(ADM)와 비타민 C(AA2P, AA2G)의 가교 결과의 FT-IR 스펙트럼 결과이다.
도 12는 본 발명의 구체예에 따른 입자형 무세포진피(MF)와 비타민 C(AA2P, AA2G)의 가교 결과의 FT-IR 스펙트럼 결과이다.
도 13은 본 발명의 구체예에 따른 입자형 무세포진피(MF)와 히알루론산의 가교 결과의 FT-IR 스펙트럼 결과이다.
도 14는 본 발명의 구체예에 따라, 가교제 농도(BDDE 0.03125%, 0.25%, 2%)에 따른 무세포진피-무세포진피 간 가교 결과의 FT-IR 스펙트럼 결과이다.
도 15는 본 발명의 구체예에 따른 무세포진피와 무세포 진피의 가교 결과의 FT-IR 스펙트럼 중, 가교의 영향으로 인한 amide II group의 peak 위치 이동에 대한 분석 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명에 따른 생체 이식/삽입용 조성물의 제조

실시예 1-1. 이식용(graft) 시트형 무세포 진피 조직의 제조

피부조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자의 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 중성 단백질 분해효소인 디스파아제 1.0 units/㎖ 농도로 처리하고, 교반 배양기에서 37℃의 온도로 60분 내지 120분 동안 교반 후 멸균증류수로 3회 세척하여 진피층과 표피층을 분리하여 표피층을 제거하였다. 표피층을 제거한 조직을 1% 농도의 트리톤엑스-100 용액으로 30 ℃에서 100분 간 처리하여 진피층의 세포를 제거하였다.

멸균 증류수로 3회 이상 세척하여 공정상 사용한 처리물질들을 제거하고 동결건조를 위해 무세포 동종진피를 -40ºC 이하의 온도에서 2 시간 이상 동결시킨 다음, 동결건조기에 넣고 12 시간 이상 건조하여 수분을 제거하였다(도 1).

실시예 1-2. 삽입용(implant) 입자형 무세포 진피 조직의 제조

분쇄 전, 작업으로 실시예 1-1의 동종진피를 수술용 칼을 이용하여 가로X세로 약 1X1 cm² 크기로 절단한 다음, 동종진피의 3 차 구조를 깨지 않는 마이크로 분쇄기에 100 g의 동종진피를 넣고 콜라겐과 엘라스틴의 변성을 막을 수 있는 최적의 조건인 5000 rpm의 회전수로 3 분간 분쇄하면서 무세포 동종진피를 무균상태에서 생체 내에서 생착률이 가장 유리한 500 μm 구경의 체 (sieve)를 통과한 입자형무세포 진피조직을 제작하였다(도 2).

실시예 2. BDDE 로 가교된 무세포 진피 조직의 제조

실시예 2-1. BDDE 로 가교된 시트형 무세포 진피 조직의 제조

실시예 1-1의 시트형 무세포 진피 조직을 멸균증류수에서 충분히 수화하였다. 0.6 mL의BDDE(Sigma-Aldrich)를 0.1 M의 수산화나트륨 용액 30 mL에 분산시켰다. 반응 용액을 10mL 씩 셋으로 분리하여, 반응용액의 pH가 각각 11~12, 8~10, 7.5~8.5 사이가 되도록 조절하였다. 준비된 시트형 무세포 진피 조직을 각각의 반응용액에 침지한 후, 45°C에서 1 시간 정도 교반하였다. 반응 후, 시트형 무세포 진피 조직을 멸균증류수로 수 회 세척하였다. 시트형 무세포 진피 조직을 동결보존액에 침지하였다가 꺼낸 후 각각 동결건조 하였다(도 3).

실시예 2-2. BDDE 로 가교된 입자형 무세포 진피 조직의 제조

실시예 1-2의 입자형 무세포 진피 조직을 사용하여 실시예 2-1의 조건으로 가교하였다. 반응 후, 입자형 무세포 진피 조직을 멸균 증류수로 수회 세척하였고 동결건조 전에 동결보존액으로 1회 세척하여 각각 동결건조 하였다(도 4).

실시예 3. BDDE 를 통해 히알루론산이 가교된 무세포 진피 조직의 제조

실시예 3-1. BDDE 를 통해 히알루론산이 가교된 시트형 무세포 진피 조직의 제조

실시예 1-1의 시트형 무세포 진피 조직을 10 mL의 멸균증류수에서 충분히 수화하였다. 0.2 mL의 BDDE를 시트형 무세포 진피 조직이 들어있는 반응 용액에 넣고 pH를 8~10으로 조절하였다. 상온에서 20분 정도 교반 후, pH가 11~12 사이로 조절된 1 mg/mL의 히알루론산 수용액에 시트형 무세포 진피 조직을 침지하였다. 상온에서 20분간 교반 후, 시트형 무세포 진피 조직을 꺼내어 멸균증류수로 수회 세척하였다. 동결건조 전에 시트형 무세포 진피 조직을 동결보존액에 침지하였다가 꺼내어 동결건조 하였다(도 5).

실시예 3-2. BDDE 를 통해 히알루론산이 가교된 입자형 무세포 진피 조직의 제조

실시예 1-2의 입자형 무세포 진피 조직을 이용하여 실시예 3-1의 조건으로 가교하였다. 반응 후, 입자형 무세포 진피 조직을 멸균 증류수로 수회 세척하였고 동결건조 전에 동결보존액으로 1회 세척하여 동결건조 하였다(도 6).

실시예 4. BDDE 를 통해 항산화제가 가교된 무세포 진피 조직의 제조

실시예 4-1. BDDE 를 통해 항산화제가 가교된 시트형 무세포 진피 조직의 제조

실시예 1-1의 시트형 무세포 진피 조직을 멸균증류수에서 충분히 수화하였다. 0.2 mL의 BDDE를 0.1 M의 수산화나트륨 용액 10 mL에 분산시켰다. 70 mg의 AA2G(Ascorbic acid 2-glucoside, Matrix Scientific) 또는 AA2P(2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt, Sigma-Aldrich)를 반응 용액에 녹이고, 반응용액의 pH를 11~12 사이로 조절하였다. 45°C에서 20분 정도 교반한 후, 반응용액의 pH를 8~10 사이로 조절하고 준비된 시트형 무세포 진피 조직을 반응 용액에 침지하여 45°C에서 1~2 시간 정도 교반하였다. 반응 후, 시트형 무세포 진피 조직을 멸균증류수로 수 회 세척하였다. 동결건조 전에 시트형 무세포 진피 조직을 동결보존액에 침지하였다가 꺼낸 후 동결건조 하였다(도 7).

실시예 4-2. BDDE 를 통해 항산화제가 가교된 입자형 무세포 진피 조직의 제조

실시예 1-2의 입자형 무세포 진피 조직을 이용하여 실시예 4-1의 조건으로 가교하였다. 반응 후, 입자형 무세포 진피 조직을 멸균 증류수로 수회 세척하였고 동결건조 전에 동결보존액으로 1회 세척하여 동결건조 하였다(도 8).

실험예 1. 무세포 진피와 히알루론산의 가교 확인

실험예 1-1. 사프라닌 염색을 이용한 무세포 진피와 히알루론산의 가교 유무 확인

무세포진피와 히알루론산(HA)의 가교 유무를 실험실 수준에서 간단하게 파악해 보기 위해, 사프라닌(Safranin O) 염색시약을 이용해 분석을 진행했다. 사프라닌 염색시약은 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG) 계열의 당사슬(sugar chain)과 반응하여 시료를 붉게 염색시키는 성질이 있다.

구체적으로 HA가 가교된 무세포진피 30 mg을 스트레이너(strainer)에 칭량하여 6-웰 플레이트에 위치시켰다. 1% 농도의 Safranin O 염색용액 5 mL을 웰에 넣은 후, 5분~10분 간 상온에서 염색을 진행하였다. 증류수로 시료 내에 잔류하는 사프라닌(Safranin O)을 수 차례 씻어낸다. 37도에서 증류수로 시료를 하루 정도 투석하고, 물기를 제거한 상태에서 4N HCl 10mL을 시료에 첨가하여 37도에서 3시간 이상 탈색(destaining)을 진행했다. 탈색된 용액으로부터 UV/vis 흡광도를 측정했다. 그 결과, 가교제의 농도를 고정시킨 상태에서 HA의 feed ratio가 증가할수록 무세포진피와 가교되는 HA의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 9).

실험예 1-2. 열중량분석기(TGA)를 이용한 무세포 진피와 히알루론산의 가교 중량 확인

열중량분석기 (Thermal Gravimetric Analysis, TGA)는 혼합물 또는 화합물의 조성성분 비율 또는 종류를 열 분석에 의한 중량 차이를 통해 판단할 수 있는 분석법이다. 무세포진피에 히알루론산이 가교된 비율을 분석하기 위해 TGA 분석법을 사용했다. TGA 측정 조건은, 온도 상승률 10°C/min로 상온에서부터 800°C까지 측정하였고, 측정 시 대기상태는 시료의 열적 산화를 방지하기 위해 N₂ 가스를 100mL/min의 비율로 주입하며 진행했다. 가교된 히알루론산 중량 분석은 순수한 히알루론산의 중량변화가 가장 큰 구간을 대상으로 진행하였고, 정량방식은 J. of Korea Society of Waste Management, Vol. 31, No. 4, pp. 382-387, June 2014의 방식을 변형하여 적용했다. 분석 결과, 무세포진피 1 mg 당 10~25 μg의 히알루론산이 가교되어 있음을 확인했다(도 10).

실험예 2. 푸리에변환 적외선 분광법(FT-IR)을 이용한 무세포진피의 가교 확인

푸리에변환 적외선 분광법(FT-IR)을 이용해 무세포진피의 가교를 확인하여 도 12 내지 도 16에 나타내었다. 구체적으로 FT-IR을 이용해, 시트형 무세포진피(ADM)와 항산화제(AA2P, AA2G)의 가교(도 11), 입자형 무세포진피와 항산화제(AA2P, AA2G)의 가교(도 12), 입자형 무세포진피와 히알루론산의 가교(도 13), 무세포진피-무세포진피 간 가교(도 4, 도 14, 도 15)를 확인하였다. 입자형 무세포진피-입자형 무세포진피 간 가교를 확인하기 위해 FT-IR을 측정한 결과, 잔류가능성이 있는 가교제의 에폭사이드(epoxide) 관능기에 대한 FT-IR peak은 관측되지 않았고(잔류 가교제 불검출, 도 14), 가교 시에 peak shift를 보이는 아마이드 II 기의 peak shift를 관측했다(도 15). 이 때, 최대 peak shift는 가교제 2%를 사용한 그룹에서 가교하지 않은 대조군 대비 약 10~12 cm-1 정도의 shift를 보이는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였다. 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예 일 뿐이며, 기술된 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

(i) 피부 조직에서 표피층을 제거하는 단계;
(ii) 상기 표피층이 제거된 피부조직에서 진피층의 세포를 제거하여 무세포 진피를 제조하는 단계;
(iii) 상기 무세포 진피를 동결건조한 후, 시트 형태로 제작하거나 또는 상기 무세포 진피를 입자형으로 분쇄하는 단계;
(iv) 상기 (iii) 단계의 무세포 진피에 가교제를 첨가하여 무세포진피-무세포진피 간 가교결합시키는 단계; 및
(v) 상기 가교결합된 무세포 진피를 동결건조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (iv) 단계는, 상기 가교제에 히알루론산 또는 항산화제를 추가로 포함하여 히알루론산 또는 항산화제가 가교된 무세포 진피를 제조하는 단계;
로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 가교제는 에폭시 관능기를 포함하는 단일기능성 가교제인 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 가교제는 1,4-부탄디올 다이글리시딜 에테르(BDDE)인 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 가교제의 첨가량은 전체 조성물 1 mL 당 10 μL 내지 100 μL로 포함되는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 무세포 진피는 인체 유래 동종 진피 또는 동물 유래 이종 진피인 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 입자형 무세포 진피는 300-800 μm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 히알루론산의 첨가량은 전체 조성물 1mL 당 10 μg 내지 100 mg 으로 포함되는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 항산화제는 안정화된 비타민C 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 비타민C 유도체는 아스코르브산 2-글루코사이드, L-아스코르브산 2-글루코사이드, 2-포스포-L-아스코르브산 트리소듐염, 아스코르빌 3-아미노프로필 포스페이트, 소듐 아스코르빌 포스페이트 및 이들의 혼합물로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 비타민C 유도체의 첨가량은 전체 조성물 1mL 당 50 mg 내지 700 mg으로 포함되는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 표피층은 단백질 분해 효소를 이용하여 진피층과 분리시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 진피층의 세포는 계면활성제 또는 초음파를 처리하여 제거하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 히알루론산이 가교된 입자형 무세포 진피를 멸균수, 생리 식염수, 혈액에서 추출한 PRP (platelet rich plasma) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 어느 하나와 혼합하는 단계;
를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 이식 또는 삽입용 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 생체 이식 또는 삽입용 조성물.