KR20150142492A

KR20150142492A - 산화아연 나노입자를 포함하는 알레르기 염증 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150142492A
Application number: KR1020140071500A
Authority: KR
Inventors: 정현자; 김형민
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2014-06-12
Publication date: 2015-12-22

Abstract

본 발명은 산화아연 나노입자를 유효성분으로 포함하는 알레르기 염증 질환 치료용 조성물에 대한 것으로서, 구체적으로, 고주파 열플라즈마 시스템을 이용하여 제조된 테트라포드 형(tetrapod-like) 아연 산화물 나노입자를 포함하는 비만세포-매개성 알레르기성 염증 반응에 미치는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 산화아연 나노입자는 사람 비만 세포주에서 염증성 사이토카인의 생성 및 mRNA 발현을 감소시키고, 카스페이즈-1, 수용체 결합 단백질2(RIP2), IkB 키나아제β(IKKβ), 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), NF-kB의 활성을 감소시키고, 신호-조절 단백질 키나아제의 인산화, 수동 피부 아나필락시를 억제시키는 것을 특징으로 알레르기 염증 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

산화아연 나노입자를 포함하는 알레르기 염증 질환 치료용 조성물{A composition for treating allergic inflammatory diseases including zinc oxide nanoparticles}

본 발명은 알레르기 염증 질환 치료용 조성물에 대한 것으로, 특히 산화아연 나노입자를 포함하는 것이며, 더욱 상세하게는 고주파 열플라즈마 시스템에 의해 제조된 산화아연 나노입자의 알레르기 염증 반응 억제 효과를 이용한 알레르기 염증 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

비만세포는 모든 포유 동물 조직에 있으며, 염증 및 자가 면역 질환의 발병 기전에 중요한 역할을 한다(Heger et al., 2014). 사실상, 비만세포는 생명을 위협하는(life-threatening) 아나필락시스, 알레르기성 비염(건초열), 아토피성 피부염(습진), 알레르기성 천식과 같은 알레르기성 반응의 초기 단계 중에 및 후기 단계 염증 반응 중에 작용 세포(effector cells)로서의 역할을 한다(El-Agamy, 2012 ; Galli 와 Tsai, 2012).

비만세포의 활성화는 탈과립(degranulation)을 유도하고 사이토카인(cytokines)과 케모카인(chemokines)을 생성한다(Galli and Tsai, 2012). 비만세포에 의해 방출되는 사이토카인은 상주 세포(resident cells)에 의한 염증유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 생성을 증가시킨다. 특히, 히스타민의 방출은 혈관(vessel) 투과성(permeabilization)을 증가시켜 염증 조직으로 호산구(eosinophils), 호중구(neutrophils), 및 대식세포의 이동을 촉진시킨다. 따라서, 비만세포의 활성화 및 탈과립은 상기 염증 반응을 증가시키고 오랫동안 지속되도록 한다(Galli and Tsai, 2012).

수용체 상호작용 단백질2(RIP2)는 면역 및 염증 반응의 조절에 중요한 역할을 하며, 이의 신호(signaling)는 IκB 키나아제β(IKKβ), 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPKs), 핵인자-κB, 및 카스페이즈-1 신호와 매우 관련이 있다(Perkins, 2007; Song et al., 2012). 또한, RIP2에 의해 활성화된 IKKβ는 IκBα단백질의 인산화를 유도하여 NF-κB로부터 분리되면, 프로테아좀(proteosomes)이 IκBα 단백질의 유비퀴틴화를 (ubiquitination) 촉진함으로써 IκBα의 분해를 유도한다(Perkins, 2007). 그리고 나서, 상기 이렇게 유리된(liberated) NF-κB는 상기 핵으로 이동하고 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-8과 같은 염증유발 매개물질 및 종양 괴사 인자(TNF-α의 합성을 유도하기 위해 특정 DNA 서열에 결합된다(Song et al., 2012). NF-κB는 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), P38, 및 c-Jun N-말단 키나아제(JNK)와 같은 MAPK 패밀리 멤버(family members)에 의해 활성화된다(Han et al., 2013). 또한, 카스페이즈-1은 세포 표면 수용체에 대한 IL-1β의 자가분비작용(autocrine action)을 통해 NF-kB 활성화에 기여한다(Wu et al., 2009). 또한, 카스페이즈-1은 염증성 사이토카인의 비활성 전구체를 활성화시키는 성숙에 (maturation) 관여한다.(Yoo et al., 2002).

한편, 아연(Zn)은 진핵세포내 미량으로 존재하는 금속으로 세포내 수 많은 생리적 기능을 조절한다(Jansen et al., 2009; Maremanda et al., 2014). 나노 기술은 나노입자의 고유한 성질, 예를 들어, 이들의 초상자성(superparamagnetic) 거동, 작은 크기, 큰 표면적 때문에 생물학, 의학, 재료 과학, 공학, 전자 공학, 환경 분야에 적용되고 있다. ZnO는 아연의 제공자로 염증성 유전자의 발현을 감소시켰다는 보고가 있다(Hu et al., 2013; Ou et al., 2007). ZnO 나노입자(ZO-NP)는 화장품, 식품 포장, 및 영상 산업(imaging industries), 항균 및 항진균제로서 넓은 범위에서 사용된다(Roy et al., 2013; Roy et al., 2014; Sharma et al., 2012).

이와 같이, 산화아연은 화장품용 자외선(UV) 흡수제, 광촉매, 고무와 플라스틱의 활성 필러, 탈취제, 가스 센서, 코팅작업에서의 항바이러스제 등으로 그 응용범위가 넓기 때문에 최근 들어 매우 주목받는 물질로서 이의 제조 방법 또는 응용 범주에 있어서 다양하나, 현재까지는 산화아연의 알레르기 염증 반응 억제 효과에 관한 연구는 미비한 실정이다.

대한민국 등록특허 제1036484호(명칭 : 플라즈마 제트를 이용한 산화아연 나노막대의 제조방법 및 이에 의해 제조된 산화아연 나노막대의 광촉매 활성)에는 플라즈마 제트를 이용한 산화아연 나노막대의 제조방법 및 이에 의해 제조된 산화아연 나노막대 분말의 광촉매로서의 용도에 관한 것이 기재되어 있으나, 여기에는 산화아연의 광촉매로서 용도에 관한 것 일뿐, 알레르기 염증 반응 억제 의 효과는 기재되어 있지 않아서, 본 발명과 상이하다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 고주파 열플라즈마 시스템을 이용하여 산화아연 나노입자(ZO-NP)를 합성하였고, 상기 산화아연 나노입자를 포함함으로써 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate) 플러스 A23187(PMACI)로 자극된 사람 비만 세포주, HMC-1 세포에서 알레르기 항-염증 효과를 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 알레르기 염증 질환 치료용 조성물은, 산화아연 나노입자를 유효성분으로 포함하는 것이다.

또한, 상기한 본 발명에 따른 산화아연 나노입자는 테트라포드 형인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 산화아연 나노입자는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 크기인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 알레르기 염증 질환 치료용 조성물은 알레르기 염증 반응 억제 효과에 의해 억제되는 것을 특징으로 하는 것이다.

여기서, 알레르기 염증 반응 억제 효과는 염증성 사이토카인의 생성, 및 mRNA 발현을 감소시키고, 카스페이즈-1, 수용체 결합 단백질2(RIP2), IkB 키나아제β(IKKβ, 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), NF-kB의 활성을 감소시키고, 신호-조절 단백질 키나아제의 인산화, 수동 피부 아나필락시를 억제시키는 것 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 알레르기 염증 질환은 비염, 천식, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 또는 아토피성 피부염일 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 일 실시예는, 고주파 열 플라즈마 시스템을 이용하여 제조된 산화아연 나노입자를 포함하고, 알레르기 염증 반응 억제 효과는 염증성 사이토카인의 생성 및 mRNA 발현을 감소시키고, 카스페이즈-1, 수용체 결합 단백질 2(RIP2), IkB 키나아제β(IKKβ), 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), NF-kB의 활성을 감소시키고, 신호-조절 단백질 키나아제의 인산화, 수동 피부 아나필락시를 억제시키는 것 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 알레르기 염증 질환 치료용 조성물이다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

이러한 본 발명은 산화아연 나노입자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 염증 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 산화아연 나노입자들은 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate) 플러스 A23187 (PMACI)로 자극된 사람 비만 세포주, HMC-1 세포에서 알레르기 항-염증 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화아연 나노입자(ZO-NP)의 (A) FE-SEM 및 (B) FE-TEM, (c) XRD 패턴, 및 (D) 10% FBS를 함유하는 IMDM에 용해된 ZO-NP 및 ZnO (10 ㎍/ml)의 TEM 이미지를 나타내는 이미지이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 HMC-1 세포의 염증성 사이토카인과 세포 생존율에 대한 ZO-NP의 효과를 나타내는 그래프로서, ELISA에 의한 사이토카인 수준(도 2의 A 내지 도 2의 D), RT-PCR에 의한 상대강도(도 2의 E), 및 MTT에 의한 세포생존율을 나타내는 그래프(도 2의 F)이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 비색 분석법에 의해 측정된 카스페이즈-1의 활성을 나타내는 그래프(도 3의 A)이고, 웨스턴 블롯 분석에 의한 카스페이즈-1 의 분석 결과(도 3의 B)를 나타내는 것이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 산화아연 나노입자(ZO-NP)의 HMC-1 세포에서 NF-κB, IKKβ 및 RIP2의 활성화에 대한 효과를 나타내는 사진 및 그래프로써, 웨스턴 블롯 분석에 의한 NF-κB 및 IκBα의 웨스턴 블롯 분석 결과(도 4의 A), 농도계에 의한 NF-κB 및 IκBα의정량 그래프(도 4의 B), IKKβ및 RIP2의 웨스턴 블롯 분석 결과(도 4의 C), 및 IKKβ와 RIP2의 정량 그래프(도 4의 D)이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 HMC-1 세포에서 ERK의 인산화에 대한 산화아연 나노입자(ZO-NP)의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화아연 나노입자(ZO-NP)의 PCA 반응에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 발명은 산화아연 나노입자를 유효성분으로 포함하는 알레르기 염증 질환 치료용 조성물이다.

본 발명에 따른 산화아연 나노입자는 테트라포드 형인 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 산화아연 나노입자는 구형, 막대형, 트리포드형, 입방체형, 박스형, 스타형, 또는 테트라포드형 등의 형태가 가능할 수 있으나, 테트라포드 형이 더 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 산화아연 나노입자는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 크기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 본 발명의 일 실시예에 따른 산화아연 나노입자는 약 200 nm의 크기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

여기서, 상기 알레르기 염증 반응 억제 효과는 염증성 사이토카인의 생성, 및 mRNA 발현을 감소시키고, 카스페이즈-1, 수용체 결합 단백질2(RIP2), IkB 키나아제β(IKKβ), 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), NF-κB의 활성을 감소시키고, 신호-조절 단백질 키나아제의 인산화, 수동 피부 아나필락시를 억제시키는 것 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 ZO-NP는 카스페이즈-1 활성의 조절에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였다. 특히, 상기 ZO-NP는 NF-κB의 활성화를 억제함으로써 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 ZO-NP는 PMACI로 자극된 HMC-1 세포에서 IKKβ, RIP2, 및 ERK의 활성화를 억제하였다.

본 발명에 따른 일 실시예에 따르면, PMACI로 자극된 세포에서 알레르기 염증 반응 억제 효과를 갖는 것이나, 상기 PMACI를 대신하여 IgE 항체, 항원, 집먼지 진드기, 또는 미세먼저 등의 세포를 자극할 수 있는 자극제가 될 수 있는 것이라면, 어느 것이라도 제한되지 않을 수 있다.

한편, 알레르기 염증은 알레르겐(allergen)에 노출한 후 초기 즉시형 과민반응(early-phase immediate hypersensitivity) 및 후기 염증(late-phase inflammation)의 조합에 의해 유도된다(Galli and Tsai, 2012). 초기 즉시형 과민반응은 알레르겐 노출의 몇 분 이내에 발생하고, 비만세포에서 이미 존재하고 있던(preformed) 매개물질의 방출에 의해 유도된다(Galli and Tsai, 2012; Oh et al., 2011). 반면에, 후기 반응은 염증 부위(site)에 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 생성 및 호중구(neutrophils), 호염기구(basophils), 호산구(eosinophils), 대식세포(macrophages), 및 비만세포(mast cells)와 같은 면역 세포의 동원(recruitment)의 결과이다(Ipp et al., 2014). 예를 들어, 비만세포의 수는 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 및 천식에서 증가되며(Enerbаck et al., 1986; Kneilling and Rocken, 2009; Laitinen et al., 1993), 비만세포에 의해 방출된 전염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α은 상기 염증 과정을 증가시킨다(Oh et al., 2011).

본 발명에 따르면, 상기 ZO-NP는 활성화된 HMC-1 세포에서 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 생성과 mRNA 발현을 억제하는 것을 보여준다.

염증성 사이토카인의 발현은 NF-κB 및 MAPKs의 신호 전달(transductions)에 의존한다(Han et al., 2013; Song et al., 2012). 비만세포가 PMACI로 자극되면, MAPKs/NF-κB 신호가 활성화되며, 이것은 많은 사이토카인 및 케모카인(chemokines), 부착분자(adhesion molecules), 염증 매개물질(inflammatory mediators), 여러 매트릭스 분해 효소(matrix degrading enzymes)의 과량 발현(over-expressions) 및 방출을 초래한다(Oh et al., 2011; Oh et al., 2013; Marcu et al., 2010). 또한, MAPKs는 카스페이즈-1 활성화에 의해 매개되긴 하지만(Lamkanfi et al., 2006), MAPKs는 중요한 NF-κB 활성화 인자이다(Han et al., 2013). PMACI에 의한 카스페이즈-1 활성화는 HMC-1 세포에서 염증성 사이토카인의 생성을 유도했다(Song et al., 2012). 프로카스페이즈-1(procaspase-1)의 카스페이즈 동원 도메인(Caspase recruitment domain, CARD)은 CARD-CARD 상호 작용을 통해 NF-κB의 활성화를 매개하는 것으로 보고되었으며(Kersse et al., 2011), 또한 RIP2는 MAPKs 및 IKKβ 경로의 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Jiang and Chen, 2011). 한편, RIP2의 활성이 결핍된 돌연변이(RIP2 mutants lacking functional kinase activity)은 TNF-α에 의한 ERK의 활성화를 감소시켰다(Navas et al., 1999). 따라서, NF-κB 조절 유전자로서 IKKβ/RIP2 타겟팅(targeting)은 유전자 발현을 조절하는 신규 수단으로 제공됨을 보여준다. 본 발명에 따른 산화아연 나노입자(ZO-NP)는 IκBα 분해를 감소시키고 NF-κB P65의 핵 이동(nuclear translocation)을 방지하고, PMACI로 자극된 HMC-1 세포에서 ERK, IKKβ 및 RIP2의 활성화를 억제하는 것으로 나타났다. 또한, ZO-NP는 PMACI로 자극된 카스페이즈-1 활성화를 억제하였다. 따라서, 전염증성 사이토카인의 발현 및 생성에 대한 ZO-NP의 억제 효과가 NF-κB, 카스페이즈-1, ERK, IKKβ 및 RIP2의 신호전달 경로(signaling pathways)의 억제와 관련되었음을 알수 있다.

염증성 사이토카인의 발현은 NF-κB, 활성화 단백질-1(AP-1), NF-IL6, 및 저산소유도인자-1(hypoxia inducible factor-1)과 같은 다양한 전사 인자에 의해 조절된다(Fiorini et al., 2000; Jeong et al., 2002; Jeong et al., 2003). 다양한 전사 인자는 각각 유전자의 프로모터 영역에 다양한 보존 서열에 결합한다. 이러한 보존 서열의 위치는 유전자마다 다르다. AP-1이 ZnO에 의해 활성화되는 반면, ZnO는 NF-κB 활성화를 감소시켰다(Sargeant et al., 2011). 상기 NF-κB 음성적 피드백 조절자(negative feedback regulator) A20[징크 핑거(zinc finger) 단백질]은 염증과 자가 면역(autoimmunity)의 예방에 중요하고, A20 결핍은 NF-κB의 활성화를 통해 사이토카인의 발현을 급격하게 증가시킨다(Heger et al., 2014). ZnO는 NF-κB의 활성화를 증가시키지 않았다. ZnO는 PMACI로 자극된 IL-6 생성, NF-κB 활성화 및 IκBα 분해를 억제하였다. 따라서, 다른 사이토카인 생성이 AP-1 또는 다른 전사 인자에 의해 증가되었던 반면, ZnO는 NF-κB 활성화 억제를 통해 PMACI-유도 IL-6의 생성을 억제한다고 가정한다.

한편, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS) 및 나노입자에 의해 생성된 활성 질소 종(reactive nitrogen species)의 세포독성 효과를 가지고 PI3 키나아제 및 MAPKs 경로를 활성화시킴으로써 염증 반응을 유도한다고 보고되기도 했다(Heng et al., 2011; Roy et al., 2013b). 정(Jeong) 등은, 세포내이입(endocytosis)에 의해 내면화된 ZnO 나노입자(직경 20 nm)가 사람의 케라틴 세포(keratinocytes)에서 상기 ROS/ERK/Egr-1 신호 경로를 활성화함으로써 염증 반응을 유도했다고 보고했다(2013). Sahu 등은, ZnO(약 5 μm) 및 ZnO 나노입자(약 100 ㎚)는 THP-1 세포에서 염증성 사이토카인의 방출을 증가시켰다고 보고했다(2014). ZnO 나노입자(상기 배지에서 195 ± 17 nm)는 폐, 간, 피부, 및 뇌에서 독성을 나타낸다(Chiang et al., 2012). 그러나, 다른 나노입자들은 항-염증 효과가 있다고 보고했다(Niu et al., 2011; Rehman et al., 2012). Hu 등은, ZnO가 염증과 관련된 유전자의 발현을 감소시켰음을 발견했다(2013). Ou 등은, ZnO가 비만세포의 수와 히스타민 방출을 감소시킴을 제시했고(2007), Klosterhalfen 등은, Zn²⁺가 LPS에 대응하여 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α 수준을 감소시켰음을 관찰하였다(1996). Oyarzun-Ampuero 등은, 나노입자(221-729 nm)가 비만세포 탈과립(degranulation)을 방지했음을 보고했다(2012). Pati 등은, ZnO 나노입자(500 nm)가 마우스의 알레르기성 염증 반응을 억제하였음을 보고했다(2014).

본 발명에 따른 ZO-NP(배지에서 약 200 nm)는 HMC-1 세포에서 비만세포 매개성 염증 반응을 억제하였다. 한편, 염증성 사이토카인의 생성 및 카스페이즈-1 활성은 ZnO 단독에 의해 상향 조절되었다. Chiang 등은, ZnO의 해리가 세포 아연 항상성(cellular zinc homeostasis)의 파괴를 야기함을 보고했다(2012). 또한, 상기 나노입자의 물리적 및 화학적 특성은 이들의 비-나노 크기의 대응과는 상당히 상이하다(Seabra et al., 2013; Seo and Hong, 2012). Tripathy 등은, 나노입자의 응집(aggregation)은 대식세포의 세포 독성에 영향을 끼치고 나노입자의 농도는 나노입자 응집의 조절에 중요한 역할을 함을 발견했다(2014). 본 발명에 따른 ZO-NP의 높은 농도(100 ㎍/㎖)는 세포 독성을 발휘하나(데이터는 도시되지 않음), ZO-NP의 저농도는 HMC-1 세포에서 세포 독성이 없었다. Xia 등은, ZnO 해리가 세포 독성 및 단백질의 형태, 풀림(unfolding)에 중요한 역할을 하고, 표면 특성은 세포 단백질 효소 및 생리 활성에 영향을 받는 나노입자에 의해 변경됨을 발견했다(2008). 종래 연구는 나노입자의 크기 및 모양, 나노입자의 예방용으로 사용된 계면활성제, 배지, 및 실험 조건이 세포 신호전달 경로에 또한 영향을 줄 수 있음을 보고했다(Lu et al., 2010; Xia et al., 2009).

본 발명에서, 상기 ZO-NP 및 ZnO 의 정확한 메커니즘이 이 시점에 알려져 있지 않지만, ZO-NP가 상기 PMACI로 자극된 염증 반응 및 상기 IgE-매개 PCA 반응을 감소시켰음을 발견했다. 따라서, 상기 ZO-NP가 비만세포-매개 알레르기 반응을 억제하는 것으로 생각된다.

이에 따라, 본 발명에 따른 조성물은, 산화아연 나노입자를 포함하고, 염증성 사이토카인의 생성 및 mRNA 발현을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 카스페이즈-1, 수용체 결합 단백질2(RIP2), IkB 키나아제β(IKKβ), 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), NF-kB의 활성을 감소시키는 것이 가능하다. 신호-조절 단백질 키나아제의 인산화, 수동 피부 아나필락시를 억제시킬 수 있다.

또한, ZnO는 단지 PMACI로 자극된 IL-6 생성 및 NF-κB 활성화를 억제하는 반면, ZO-NP는 염증성 사이토카인, NF-κB의 활성화, 카스페이즈-1, IKKβ, RIP2 및 PMACI에 의한 ERK, 및 IgE 매개 PCA 반응 등 거의 모든 알레르기염증 인자들의 활성을 억제하였으며, 이것은 ZO-NP가 ZnO 보다 염증 반응을 보다 효과적으로 억제함을 나타낸다.

본 발명의 알레르기 염증 질환용 조성물은 알레르기 염증 질환의 치료 및/또는 예방에 탁월한 효과를 가지고 있고, 정제, 과립, 캡슐, 분말, 시럽, 연고, 좌제 및 피하, 근육, 정맥 또는 점적 주사제 등의 일반적인 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있으며, 1일 10~1000 mg을 1회 내지 수회에 나누어 복용할 수 있다.

본 발명에 따른 산화아연 나노입자를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 계면 활성제 및 공용매를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 약효에 악영향을 미치지 아니하는 범위 내에서 약제학적으로 통상 사용되는 물질, 예를 들면, 산화아연 나노입자의 용해도 및 위장관내 흡수를 증가시키고 경구 투여시에 물과 함께 분산 및 유화됨으로써 용출을 증가시키고 생체 이용율 향상에 널리 활용될 수 있는 지방산 또는 지방산 알코올과 같은 첨가제, 백당, 맥아이온 엿, 정백당, 젤라틴, 설탕 및 물엿과 같은 당류, 스테아린산 마그네슘, 탈크와 같은 활택제, 미세결정셀롤로우스, 인산일수소칼슘, 전분, 만니톨과 같은 부형제, 제제가 산화되는 것을 방지하는 항산화제, 착향제, 방부제, 방향제, 감미료, 색소, pH 조절제 및 점도 조절제를 추가로 포함할 수 있으며, 이들은 산화아연 나노입자에 대하여 통상적으로 사용되는 사용량으로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 산화아연 나노입자를 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 경구용 제제를 제공한다.

상기 경구용 제제는 정제, 환제, 산제, 경질 캅셀제, 젤라틴 밴딩한 경질캅셀제 및 연질 캅셀제, 카라멜 또는 젤리 타입의 츄정 및 수용액을 함유하는 경구용 액제이다. 바람직하게는 상기 조성물을 포함하는 연질 캅셀제를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 산화아연 나노입자, 계면 활성제 및 공용매를 혼합하고, 80℃에서 가열 용해시킨 후 통상적인 방법을 이용하여 경구용 제제로 제형화 할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

<실시예>

<재료>

PMA, A23187, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸리윰 브로마이드(MTT) [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)], 항-디니트로페닐(DNP) IgE[anti-dinitrophenyl (DNP) IgE], DNP-사람 혈청 알부민(human serum albumin, HSA), 및 다른 시약은 시그마로부터 구매되었다(세인트 루이스, MO, 미국). 이스코브 변형 둘벡코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 및 소태아혈청(FBS)은 지브코 비알엘[Gibco BRL(그랜드 아일랜드, NY, 미국)]로부터 구매되었다. 항-사람 IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α 비오틴이 부착된(biotinylated) 항-사람 IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α 재조합 사람(recombinant human, rh) IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α 파밍젠[Pharmingen(샌디 에이고, CA, 미국)]으로부터 구매되었다. IKKβ, RIP2, 카스페이즈-1, ERK, 인산화(phosphorylated) (p) ERK, p38, pp38, JNK, pJNK, NF-κB, IκBα 히스톤(histone), 및 액틴(actin)에 대한 항체들(Abs)은 산타크루즈 바이오테크놀러지[Santa Cruz Biotechnology(산타크루즈, CA, 미국)]로부터 얻어졌다. 상기 카스페이즈 분석 키트는 알엔디 시스템즈 주식회사[R&D Systems Inc.(미네아폴리스, MN, 미국)]에 의하여 공급되었다.

실시예 : 산화아연 나노입자의 제조 및 특성

원료로서, ZnO의 미크론-크기의 분말(입자 크기 1~10 μm)은 ㈜이영세라켐 [Yee Young Cerachem. Ltd(서울, 대한민국)]으로부터 구매되었다. ZO-NP는 상업용 고주파(RF) 열플라즈마 시스템에서 원료를 처리함으로써 수득되었으며, 이것은 플라즈마를 발생시키기 위해 RF 전원 장치, 주입 토치(torch) (Tekna, PS-100), 고 열 플라즈마의 분말을 개질(reforming)시키기 위한 합성 반응기, 벌키 입자의 분리를 위한 사이클론, 제조된 나노입자를 모으기 위한 여과 유닛(filtration unit), 및 분말 공급장치(powder feeder)로 이루어진다. 상기 ZnO는 ~89.6 kPa의 작동 압력, ~140 kVA의 플레이트 전력 수준, 및 5 g/분의 공급속도에서 나노입자로서 재구성된다(reconstituted). 아르곤 및 산소는 하기 가스 흐름 속도에서 플라즈마를 생성하기 위하여 사용되었다; 중심 가스(central gas)의 60(Ar), 차단 가스(sheath gas)의 100(Ar) 및 100(O₂), 및 켄칭 가스(quenching gas)의 7200(재순환된 가스).

한편, 실험 전반의 통계 분석 결과는 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현하였고, 통계 분석은 그룹 간의 차이를 표현하는 Tukey 사후 검사(Tukey post hoc test)로 일원 분산 분석(one-way analysis)에 의해 수행되었다. P < 0.05의 값은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다.

실험예 1: 산화아연 나노입자의 특성 분석

[전계 방출형 주사 전자 현미경(FE-SEM), 전계 방사형 투과 전자 현미경(FE-TEM), 및 X-레이 회절분석법(XRD)]

ZnO 및 ZO-NP의 입자 형태(morphologies)는, FE-SEM (S4800, 히타치, 일본), FE-TEM (JEM-2200FS, JEOL, 일본), 그리고 바이오-TEM (H-7650, 히타치(주), 일본)에 의해 조사하였다. FE-SEM은 10 kV의 가속 전압에서 작동했다. FE-TEM 또는 바이오 TEM 샘플은 원하는 용매 (IMDM 중 에탄올 또는 10% FBS)에서 ZO-NP를 분산하고 구리 그리드 상에 이것을 건조하여 제조하였다. 15° 내지 90°까지의 2-쎄타(theta) 범위에서의 XRD 패턴은, 구리 Kα 방사원 (λ= 1.5406 Å)을 이용하여 두 분말에 대해 얻어졌다(D8Advance, Bruker AXS GmbH., 독일).

본 발명의 일 실시예에 따른 ZO-NP의 물리화학적 특성을 조사하기 위해, FE-SEM 및 FE-TEM 이미지를 분석하고 XRD 패턴에 의하여 ZO-NP 구조를 확인했다. ZO-NP의 FE-SEM 및 FE-TEM 이미지는 도 1A 및 도 1β에 나타난다. 상기 ZO-NP의 평균 입자 크기는 약 200 nm였고, 상기 입자는 테트라포드 형태(도 1β)를 가지고 있었다. ZnO의 XRD의 피크는 RF 열 플라즈마 처리에 의해 변하지 않았지만, ZO-NP의 피크 강도는 입자 크기의 감소 때문에 상기 ZnO의 피크 강도보다 낮았다(도 1C). 또한, 10% FBS를 함유하는 IMDM에서 10 ㎍/㎖의 농도에서 ZO-NP 또는 ZnO의 크기는 바이오-TEM에 의해 조사되었다. ZO-NP는 약 200 nm의 테트라포드-같은 형태였고, ZnO는 ZO-NP 보다 더 큰 크기를 유지했다(도 1). 즉, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화아연 나노입자(ZO-NP)의 10% FBS를 함유하는 IMDM에 용해된 ZO-NP 및 ZnO (10 ㎍/ml)의 TEM 이미지이다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 고온 플라즈마에 의해 합성된 산화아연 나노입자의 전자현미경의 결과, 사이즈가 200 nm이며, 테트라포드(tetrapod) 결정형태를 가졌다.

실험예 2 : 비만 세포로부터 생성된 염증성 사이토카인의 생성 및 mRNA 발현 억제 측정

2-1. 세포배양(Cell culture)

HMC-1 세포는 37℃, 5% CO₂ 및 95%의 습도에서 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 10% 열불활성화된(heat inactivated) FBS를 포함하여 보충된 IMDM에서 성장되었다. 분말 ZO-NP 및 ZnO는 DMSO로 용해하여 제조하였다. ZO-NP와 ZnO은 10% FBS가 포함된 IMDM으로 희석하였다. 상기 세포는 PMACI 자극에 앞서 1 시간 동안 ZO-NP (0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/ml) 또는 ZnO (0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/ml)의 다양한 농도로 전처리 되었다.

2-2. 효소-결합 면역흡착 검사[Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)]

배양 상등액에서 분비된(Secreted) IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α은 상기 제조업체의 사양에 따라 측정되었다(Pharmingen, San Diego, CA, 미국).

2-3. MTT 분석

HMC-1 세포(3 × 10⁵ 세포/ml)는 마이크로 플레이트에서 ZnO 또는 ZO-NP과 처리하여, 8 시간 동안 마이크로 플레이트 웰에서 배양하였고, 이후 추가 4 시간 동안 37℃에서 5% CO₂와 95% 공기 하에서 MTT 용액(5 ㎎/㎖) 20 ㎕와 배양하였다. 연속하여, DMSO 250 ㎕가 첨가되어 MTT 포르마잔(formazan)을 추출하였고, 540 nm에서 각 웰의 흡광도는 자동 마이크로 플레이트 리더기에 의해 판독되었다.

2-4. RNA 분리 및 RT-PCR

총 RNA 는 easy-BLUE RNA 추출 키트[인트론 바이오테크(iNtRON Biotech, 한국)]를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 HMC-1에서 분리되었다. 총 RNA(2.0 ㎍)를 65℃에서 가열하고, 이후 10 분간 얼음에서 식혔다. 각 샘플은 cDNA 합성 키트를 사용하여 37℃에서 90 분 동안 cDNA 로 역전사되었다. RT-PCR은 2.5 mM의 MgCl₂, 200 mM dNTPs, 25 pM 사이토카인 프라이머, 및 반응 완충액(50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9, 및 0.1% 트리톤 X-100)의 TaqDNA 중합 효소의 2.5 U를 갖는 20 ㎕의 최종 부피에서 cDNA 혼합물의 1 ㎕를 이용하여 실시되었다. PCR은 하기 프라이머를 이용하여 사람 IL-1β (5' CCG GAT CCA TGG CAC CTG TAC GAT CA 3'; 5' GGG GTA CCT TAG GAA GAC ACA AAT TG 3'); 사람 IL-6 (5' GAT GGA TGC TTC CAATCT GGAT 3'; 5' AGT TCT CCATAG AGA ACA ACA TA 3'); 사람 TNF-α(5' CAC CAG CTG GTT ATC TCT CAG CTC 3'; 5' CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG 3'); 사람 GAPDH (5' CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG 3'; 5' CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG 3')에 대해 수행되었다. 상기 사용된 어닐링(annealing) 온도는 IL-1β에 대해 50℃, IL-6에 대해 56℃, TNF-α와 GAPDH에 대해 60℃였다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고 에티디움(ethidium) 브로마이드 염색에 의해 가시화되었다.

한편, IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α의 생성에 따른 ZO-NP 및 ZnO의 효과를 조사하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 HMC-1 세포의 염증성 사이토카인과 세포 생존율에 대한 ZO-NP의 효과를 나타낸 것이다. 상기 세포는 8 시간 동안 PMACI 자극 이전에 1 시간 동안 ZO-NP(0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖) 또는 ZnO(0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖)의 다양한 농도로 전처리 하였다. (A-D) 세포의 배양 상등액에서 분비된 사이토카인 수준은 ELISA로 측정하였다. (E) 세포는 6 시간 동안 PMACI 자극 이전에 1 시간 동안 ZO-NP(0.1, 1, 10 ㎍/㎖) 또는 ZnO(10 ㎍/㎖)의 다양한 농도로 전처리 하였다. 총 RNA는 RT-PCR 분석에 의해 측정하였다. 농도계에 의해 정량화된 상대 강도는 IL-1β/GAPDH, IL-6/GAPDH 및 TNF-α/GAPDH를 의미한다. 각 자료는 3 회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차(S.D.)를 나타낸다. (F) 세포 생존율은 MTT 분석에 의해 평가하였다. 상기 데이터는 3 회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차(S.D.)를 나타낸다. (#P < 0.05 : 비자극 세포에서 유의한 차이. *P < 0.05 : PMACI 자극 세포에서 유의한 차이. PMACI, PMA 플러스 A23187 ; ZO-NP, 산화아연 나노입자).

PMACI 자극은 배지(media) 대조군과 비교하여 IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α을 유의하게 증가시켰다(도 2A 내지 도 2D, P < 0.05). 또한, PMACI 에 의해 IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α의 이러한 상향조절은 ZO-NP에 의해 유의하게 억제되었다(도 2A, 도 2B, 및 도 2D, P < 0.05). 그러나, ZO-NP는 PMACI에 의해 유도된 IL-8 단백질 수준에 영향을 미치지 않았다(도 2C). ZnO는 PMACI로 자극된 IL-6 생성만을 유의하게 억제하였다(도 2B, P < 0.05). ZnO 단독은 IL-1β, IL-8, 및 TNF-α 생성을 유의하게 증가시켰다. 또한, PMACI에 의한 조절 사이토카인 발현에 대한 ZO-NP의 효과를 더 조사하기 위해 RT-PCR에 의한 IL-1β, IL-6, 및 TNF-αmRNA 수준에 대해 분석했다. 상기 ZO-NP-처리된 세포에서 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α mRNA 발현은 상기 PMACI-투여군에 비해 현저히 낮았다(도 2E). 또한, MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율(cell viability)을 조사하였으나, 부작용은 관찰되지 않았다(도 2F).

따라서, 본 발명에 따른 산화아연 나노입자가 알레르기 원인세포인 비만세포로부터 생성된 염증성 사이토카인의 생성 및 mRNA발현을 유의하게 억제하였음을 보여준다.

실험예 3 : 비만 세포로부터 활성화된 카스페이즈-1 활성화 억제 측정

3-1. 카스페이즈-1 활성 측정법

상기 카스페이즈-1의 효소 활성은 제조업체의 프로토콜에 따라 카스페이즈-1 비색 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 상기 용해된 세포는 5 분 동안 15,000 ×g에서 원심 분리하였다. 상기 단백질 상등액은 2 시간 동안 37℃에서 50 ㎕ 반응 완충액 및 5 ㎕ 카스페이즈 기질(substrate) (WEHD-P-니트로아닐린)과 함께 배양하였다. 상기 흡광도는 405 ㎚의 파장에서 플레이트 리더기를 사용하여 측정하였다. 각 용해물(lysate)에서 총 단백질의 동일한 양은 바이신코니닉산 (bicinchoninic acid) 단백질 정량 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였다.

카스페이즈-1은 사이토카인 생성을 조절하며(Oh et al., 2011), 따라서 PMACI로 자극된 카스페이즈-1 활성화에 대한 ZO-NP 및 ZnO의 조절 효과(regulatory effects)를 평가하기 위해, 카스페이즈-1 활성을 측정했다. 세포가 PMACI로 자극되었을 때, 카스페이즈-1 활성이 유의하게 증가하였다. 그러나, 카스페이즈-1 활성의 증가는 ZO-NP에 의해 유의하게 억제되었다(도 3A, P <0.05). 도 3A 데이터와 일치하여, 상기 ZO-NP는 PMACI에 의해 카스페이즈-1 활성을 감소시켰다(도 3B). 반면에, ZnO 단독은 카스페이즈-1 활성을 증가시켰다(도 3).

3-2. 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis)

상기 카스페이즈-1의 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되었다. 단백질 수준을 측정하기 위하여, 자극 세포를 빙냉(ice-cold) 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세정한 후 빙냉 용해(lysis) 완충액에 용해하였다(0.1% SDS, 1% 트리톤, 1% 데옥시콜레이트(deoxycholate)를 함유하는 PBS). 세포 용해물(Cell lysates)이 전기 영동을 통해 분리되었고, 상기 단백질은 전기영동 이동(electrophoretic transfer)에 의하여 나일론 막에 이동되었다. 상기 막은 2 시간 동안 6% 탈지 우유에서 차단되어(blocked), 세척하고 1차 항체들(primary Abs)과 4℃에서 밤새 배양되었다. PBS 함유 0.05% 트윈-20(PBST)에서 3 회 세척 후, 상기 막은 양고추냉이 과산화효소-결합된 2차 항체들(horse radish peroxidase-conjugated secondary Abs)과 1 시간 동안 배양하였다. PBST에서 3 회 세척한 후, 상기 단백질 밴드(bands)는 제조업체의 지침에 따라 향상된 화학 발광(chemiluminescence) 분석에 의하여 시각화되었다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 HMC-1 세포에서 카스페이즈-1 활성화에 대한 ZO-NP의 효과를 나타낸 것이다. 상기 세포는 2 시간 동안 PMACI 자극 이전에 1 시간 동안 ZO-NP(0.1, 1, 또는 10 ㎍/㎖) 또는 ZnO(10 ㎍/㎖)의 다양한 농도로 전처리 하였다. (A) 카스페이즈-1의 효소 활성은 카스페이즈-1 비색 분석법으로 측정하였다. 상기 데이터는 3 회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차(S.D.)를 나타낸다. (B) 카스페이즈-1의 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 결과는 3 회의 독립적인 실험을 나타낸다. (#P < 0.05 : 비자극 세포에서 유의한 차이. *P < 0.05 : PMACI 자극 세포에서 유의한 차이. PMACI, PMA 플러스 A23187; ZO-NP, 산화아연 나노입자).

따라서, 상기 산화아연 나노입자가 알레르기 원인세포인 비만세포로부터 활성화된 카스페이즈-1 (염증성 사이토카인을 성숙시켜, 분비를 유도하는 효소) 활성을 유의하게 억제하였음을 확인하였다.

실험예 4 : 비만 세포로부터 활성화된 NF-kB 및 IKKb와 RIP2의 활성 억제 측정

염증성 사이토카인의 발현은 전사 인자, NF-κB에 의해 조절된다(Song et al., 2012). ZO-NP에 의한 사이토카인 mRNA 발현의 감소는 도 2E에 제시된다. 따라서, PMACI로 자극된 NF-κB 활성화에 대한 ZO-NP의 효과를 조사했다. 핵 분획물(fractions)에서, PMACI에 의한 NF-κB의 상향 조절(upregulation)은 ZO-NP에 의해 감소했다(도 4A 및 도 4B). 이러한 ZO-NP의 억제 효과는 IκBα 분해(degradation)에 미치는 영향 때문이었는지 여부를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 세포질에서 IκBα 단백질의 수준을 조사하였다. 세포질(cytoplasm)의 IκBα 분해가 ZO-NP에 의해 억제되었다(도 4A 및 도 4B). 또한, ZnO도 PMACI-유도된 NF-κB 활성화 및 IκBα 분해를 억제하였다(도 4A).

상기 IKKβ및 RIP2 신호 전달 경로(signaling pathways)는 NF-κB와 카스페이즈-1의 활성화에 중요한 역할을 한다. 따라서, 이러한 경로의 활성화에 대한 ZO-NP의 효과를 조사하였다. 도 4C 및 도 4D에 도시된 바와 같이, PMACI 자극은 IKKβ및 RIP2의 활성화를 증가시켰고, 이러한 활성화는 ZO-NP에 의해 감소되었다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 HMC-1 세포에서 NF-κB, IKKβ 및 RIP2의 활성화에 대한 ZO-NP의 효과를 나타낸 것이다. 상기 세포는 2 시간 동안 PMACI 자극 이전에 1 시간 동안 ZO-NP(0.1, 1, 또는 10 ㎍/㎖) 또는 ZnO(10 ㎍/㎖)의 다양한 농도로 전처리 하였다. (A) 실험 절차에 설명된 바와 같이 핵 및 세포질 단백질은 제조되어 웨스턴 블로팅에 의해 NF-κB 및 IκBα에 대해 분석하였다. (B) NF-κB 및 IκBα 수준은 농도계에 의해 정량화하였다. (C) IKKβ 및 RIP2의 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. (D) IKKβ 및 RIP2의 수준은 농도계에 의해 정량화하였다. 상기 결과는 3 회의 독립적인 실험을 나타낸다. 농도계에 의해 정량화된 상대 강도는 NF-κB/히스톤(histone), IκBα/액틴(actin), IKKβ/액틴, 및 RIP2/액틴을 의미한다. 각각의 데이터는 3 회의 독립적인 실험의 평균 ±표준편차(S.D.)를 나타낸다. (#P < 0.05 : 비자극 세포에서 유의한 차이. *P < 0.05 : PMACI 자극 세포에서 유의한 차이. PMACI, PMA 플러스 A23187; ZO-NP, 산화아연 나노입자; NE, 핵 추출물; CE, 세포질 추출물).

따라서, 산화아연 나노입자가 알레르기 원인세포인 비만세포로부터 활성화된 NF-κB의 핵내로의 이동 및 IκBα 분해를 억제하였으며, NF-κB의 상위 단계 신호기전인 IKKβ와 RIP2의 활성을 억제하였음을 확인하였다.

실험예 5 : MAPKs 활성 억제 측정

PMACI 자극에 의한 사이토카인의 발현 및 생성은 MAPKs의 활성화를 통해 발생한다(Han et al., 2013). ZO-NP의 항-염증성 활성이 MAPKs 경로 조절을 통해 매개되는지 여부를 확인하기 위하여, 인산화된 ERK에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. ZO-NP는 이러한 세포에서 ERK의 인산화를 감소시켰다(도 5).

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 HMC-1세포에서 ERK의 인산화에 대한 ZO-NP의 효과를 나타낸 것이다. 상기 세포는 30 분 동안 PMACI 자극 이전에 1 시간 동안 ZO-NP(0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖) 또는 ZnO(10 ㎍/㎖)으로 전처리 하였다. (A) 인산화 ERK 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 상기 결과는 3 회의 독립적인 실험을 나타낸다. (PMACI, PMA 플러스 A23187; ZO-NP, 산화아연 나노입자). 따라서, 산화아연 나노입자가 알레르기 원인세포인 비만세포로부터 활성화된 pERK를 억제하였음을 확인하였다.

실험예 6 : 수동적 피부 알레르기 반응[수동 피부 아나필락시(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)] 억제 측정

생체내(in vivo)에서 ZO-NP의 항-알레르기 효과를 확인하기 위해, 마우스의 등쪽(dorsal) 피부 부위(site)의 PCA 반응을 수행하였다.

(4 주령) 수컷 ICR 마우스의 원종(original stock)은 대한 실험 동물 센터 (음성군, 한국)에서 구입하였고, 상기 동물은 경희대학교 한의과대학에서 관리되었다. 동물 보호 및 실험 절차는 경희대학교에서 동물 관리 위원회의 승인에 따라 실시하였다[승인 번호 KHUASP (SE)-10-019]. 상기 IgE-의존성 피부 반응은 항-DNP IgE의 피내 주사(intradermal injection)로 피부를 민감하게(sensitizing) 함으로써 생성되었고, 48 시간 후에 상기 마우스의 꼬리 정맥에 에반스블루 염색시약과 DNP-HSA를 주입하였다. ZO-NP는 1 시간 동안 구강(10 ㎎/㎏) 또는 국소적으로[10 mg/부위, 등쪽 피부(dorsal skin)] 투여되었다. 상기 마우스(n = 6)는 정맥 주사 후 (intravenous challenge) 후에 40 분에 안락사 시켰다. 상기 추출의 흡수 강도는 분광형광계의 620 ㎚에서 측정되었고, 상기 염료의 양은 에반스 블루 표준곡선 (Evans blue measuring-line)을 이용하여 계산하였다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCA 반응에 대한 ZO-NP의 효과를 나타낸 것이다. 상기 마우스는 항-DNP IgE의 100 ng을 포함하여 피내 주사 하였다. ZO-NP는 48 시간 후에 꼬리 정맥을 통해 4% 에반스 블루를 포함하는 항원(DNP-HSA) (1:1)의 1 ㎎/㎖를 포함하는 도전(challenge) 이전에 1 시간 동안 구강 투여(10 ㎎/㎏) 또는 국소적으로(T.A, 10 ㎍/site) 투여되었다. (N = 6, # P < 0.05 ; 블랭크(blank)에서 유의한 차이. *P < 0.05 ; 대조값에서 유의한 차이. ** P < 0.01 ; 블랭크에서 유의한 차이). 본 발명의 일 실시예에 따른 ZO-NP가 마우스에 구강(10 ㎎/㎏) 또는 국소적으로(10 mg/부위) 투여될 때, 상기 ZO-NP는 상기 PCA 반응이 유의하게 억제되었다(도 6, P <0.05). 또한, ZO-NP 단독(10 ㎎/㎏)은 상기 PCA 반응이 유의하게 감소되었다(도 6, P <0.05).

따라서, 상기 산화아연 나노입자의 구강투여 및 피부도포로 알레르기 동물모델인 수동적 피부 알레르기 반응이 유의하게 억제 되었음을 확인하였다.

본 발명에 따른 결과에 따르면, 상기 ZO-NP의 항-염증 효과가 RIP2, IKKβ및 ERK의 활성화의 억제 및 NF-κB와 카스페이즈-1의 억제에 의한 것이며, 이러한 활동은 염증성 사이토카인의 발현 및 생성을 감소시킨다. 또한, 우리는 ZO-NP가 PCA 반응을 감소시켰음을 확인하였다. 본 발명에 따른 결과는 상기 ZO-NP가 비만세포-매개 알레르기성 염증 질환의 치료를 위한 잠재적인 예방 및 치료제로 이용될 수 있음을 나타낸다.

상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims

산화아연 나노입자를 유효성분으로 포함하는 알레르기 염증 질환 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산화아연 나노입자는 테트라포드 형인 것을 특징으로 하는 것인, 알레르기 염증 질환 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산화아연 나노입자는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 크기인 것을 특징으로 하는 것인, 알레르기 염증 질환 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 알레르기 염증 질환은 알레르기 염증 반응 억제 효과에 의해 억제되는 것을 특징으로 하는, 알레르기 염증 질환 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 알레르기 염증 반응 억제 효과는 염증성 사이토카인의 생성 및 mRNA 발현을 감소시키고,
카스페이즈-1, 수용체 결합 단백질 2(RIP2), IkB 키나아제β(IKKβ), 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), NF-kB의 활성을 감소시키고,
신호-조절 단백질 키나아제의 인산화, 수동 피부 아나필락시를 억제시키는 것 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 알레르기 염증 질환 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 알레르기 염증 질환은 비염, 천식, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 또는 아토피성 피부염인 것인, 알레르기 염증 질환 치료용 조성물.
산화아연 나노입자를 유효성분으로 포함하고,
알레르기 염증 반응 억제 효과는 염증성 사이토카인의 생성 및 mRNA 발현을 감소시키고,
카스페이즈-1, 수용체 결합 단백질 2(RIP2), IkB 키나아제β(IKKβ), 세포외 신호-조절 키나아제(ERK), NF-kB의 활성을 감소시키고,
신호-조절 단백질 키나아제의 인산화, 수동 피부 아나필락시를 억제시키는 것 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 알레르기 염증 질환 치료용 조성물.