KR20150131378A - 조직 재생 및 손상 치료용 이식 조제물, 그 제조 방법, 및 그 이식 조제물을 이용한 환자의 치료 방법 - Google Patents

조직 재생 및 손상 치료용 이식 조제물, 그 제조 방법, 및 그 이식 조제물을 이용한 환자의 치료 방법 Download PDF

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쟝-루이 태요트
쟝 베흐나스코니
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코리오닉스
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Abstract

환자에게 투여가능하며, 혈청과 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈을 포함하며, 혈청과 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈을 첨가함으로써 수득되는, 새로운 조직 재생 또는 손상 치료용 조제물을 개시한다.

Description

조직 재생 및 손상 치료용 이식 조제물, 그 제조 방법, 및 그 이식 조제물을 이용한 환자의 치료 방법 {IMPLANTABLE PREPARATIONS FOR REGENERATION OF TISSUES AND TREATMENT OF WOUNDS, THEIR METHOD OF PREPARATION, AND METHOD OF TREATMENT OF PATIENTS WITH SAID IMPLANTABLE PREPARATIONS}
조직 재생 및 손상 치료용 이식 조제물, 그 제조 방법, 및 그 이식 조제물을 이용한 환자의 치료 방법
본 발명은 조직의 재생 및 손상의 치료 목적으로 동물 및 인간에게 투여될 수 있는 새로운 조제물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간의 자가 혈액 등의 혈액으로부터 이들 조제물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 이들 조제물을 투여함으로써 동물 및 인간을 치료하는 방법에 관한 것이다.
치료 목적의 재생 의학 분야 또는 피부 주름 치료 등의 성형 외과의 재생 의학 분야에서는, 세포 성장 인자, 주로 혈소판 또는 혈소판 유래 성장 인자의 인 시추 (in situ) 투여 원칙이 현재 적용되고 있다.
상기 인자들을, 히알루론산 조제물, 콜라겐 조제물, 글로빈 및 기타 유기 물질 조제물, 세라믹 및 폴리락티드 및 폴리락티드 글리콜라이드 폴리머 등의 합성 폴리머와 같은, 조직 필링 (tissue filling), 조직 확대 (tissue augmentation), 조직 재생 또는 손상 치료용 이식 조제물에 첨가하는 것도 이미 제안되어 있다.
미국 특허 6,949,625는 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈, 바람직하게는 동종 글로빈, 더 바람직하게는 자가 글로빈을 포함하는 주사용 조직 필링, 확대 및 치료용 조제물을 비롯한, 이식 조제물을 개시하고 있으며, 이 이식 조제물은 선택적으로 치료제 또는 세포 증식제, 또는 세포를 포함할 수 있다.
미국 특허 7709017은 가용성 글로빈 또는 글로빈 유도체로부터 수득가능하며, 치료제 또는 BMP 타입의 성장 인자를 선택적으로 포함할 수 있는, 조제물을 개시하고 있다.
미국 특허 출원 20090312239는 접착, 필링, 확대 또는 치유성 물질을 포함할 수 있는, 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈 조제물을 개시하고 있다.
미국 특허 출원 20120183501은 혈소판 또는 혈소판 풍부 혈장 (PRP)의 혈소판 유래 PDGF 타입의 성장 인자, 또는 재조합 생성물 또는 세포 성장 인자 (EGF, FGF, ...)를 더 포함할 수 있는, 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈 조제물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 새로운 치료 방법을 개시하고 있다.
이 조제물에서, 글로빈 성분은 생리학적 pH에서 불용성이며, 전혈로부터 적혈구의 분리, 적혈구의 용혈 유도 및 헤모글로빈에서 헴 (heme) 분리 단계 등의 방법에 의해 제조되며, 적혈구는 예를 들어 수혈 파우치로부터 수득되거나, 또는 공여 혈액 샘플, 바람직하게는 환자로부터 분리된다.
미국 특허 출원 20090074736은, 헴은 추출 또는 용해하지만, 그외 단백질 성분인 글로빈과, 알부민, 알파-글로불린, 베타-글로불린, 감마-글로불린, 및 혈액 응고 인자 뿐만 아니라 처음에 혈액으로부터 혈소판을 분리하지 않은 경우에는 글로빈 조제물에 추가로 첨가하기 위한 혈소판 인자 등은, 실질적으로 용해되지 않은 상태로 그대로 두는, 아세톤 함유 매질 등의 매질 중에서, 적혈구 및 혈장을 포함하는 전혈에 대해 탈색소 단계를 수행함으로써 수득되는, 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈 조제물을 개시하고 있다. 출원 20090074736에 따르면, 모든 혈액 단백질, 혈소판 및 기타 세포들에 대해 아세톤 처리 공정이 수행되므로, 특정 단백질은 일부 변성될 수 있어, 최종 조제물내에 이들의 원래 구조 유지를 보장할 수 없다.
조직 재생에 혈액 성분을 이용하는 최첨단 기술은 Jun Araki et al: 2012 (1)으로 발간된 최신 논문에 잘 요약되어 있다. 이 논문의 전체 서론부의 내용을 과학논문에 대한 인용을 포함하여 아래에 그대로 인용한다:
""혈소판 풍부 혈장 (PRP)의 제조법은 처음에는 수혈 혈액학에 전혈 (WB)로부터 적색 혈액 세포 (RBS)와 혈장을 분리하는 방법으로서 개발되었다 (2). PRP는 처음에는 외과적 시술시 지혈 및 일부 혈소판 감소 장애에 대한 혈소판 수혈을 위해 사용되었다 (3). 다수의 연구들을 통해, 혈소판이 파괴 및 활성화되었을 때, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 형질변형 성장 인자-베타 (TGF-b) 및 상피 성장 인자 (EGF) 등의 다양한 생리활성 물질들이, 혈소판의 알파 그래뉼 (alpha granule)에서 혈장으로 방출된다는 것이 밝혀졌다(4-5). 이들 성장 인자는 손상된 피하 조직으로부터 나오는 상처 삼출액에 함유되어 있으며, 손상 치료 과정의 초기 단계에 중요하다(6). 특히, 이들 성장 인자는 기질 줄기 세포의 증식과 혈관신생을 촉진하며, 조직 회복/재생에 중요한 신호로서 간주된다 (7-9).
자가 PRP는 세포-기반의 재생 요법 보다는 안전성 우려가 낮다. 이와 같이, PRP는 광범위한 조직 조작 및 재생 의학 연구의 대상이다(10-11). PRP는 1998년 이래로 치과 의학에서 손상 치료와 조직 회복을 가속화하기 위해 치료학적으로 사용되어 왔으며 (12), PRP의 임상적인 사용은 최근들어 심장 외과(13), 안과 (14), 구강악안면외과(15), 정형외과 (16), 성형외과(17-18), 스포츠 의학 (19) 및 미용의학 (20-21) 등의 다른 분야로도 확장되었다. 치료학적 목적에서, 한번의 원심분리를 통해 WB로부터 추출된 PRP를 종종 2차 원심분리에 의해 농축한다. 1차 원심분리는 혈소판이 스핀-다운되지 않도록 느리게 진행되는 반면, 2차 스핀은 혈소판이 스핀-다운될 만큼 빠르게 진행된다. 본 연구에서는, 2차 스핀에 의해 농축된 PRP를 PRP와 구분하기 위해 혈소판-농축 혈장 (PCP)으로 언급한다.
PRP 또는 PCP의 치료학적 이용의 증가에도 불구하고, 보고된 이의 임상 효과는 매우 다양하다(22). 실제, 심지어 이것이 효과가 없다고 결론내린 보고도 있다 (23). PRP/PCP의 임상 조제물에 대해 다수의 상업화된 기구들이 현재 이용가능하지만, PRP/PCP에 대한 표준 프로토콜은 없는 실정이다. 아울러, 놀랍게도 인간 PRP/PCP의 조제물을 최적화하는 방법에 대한 과학적 연구도 거의 없다. 예를 들어, 일반 실험 제품에 담긴 WB에 가해지는 원심력이 PRP/PCP 수율에 미치는 영향에 대한 포괄적인 연구가 이루어지지 않았다. 이러한 실험이 거의 없는데에는 신선한 인간 WB 샘플을 충분한 양으로 수득하기 어려운 명백한 문제 뿐 아니라, 많은 이유들이 있다. 이러한 많은 이유들 중 한가지는 혈액 응고 (피브린 중합) 및 혈소판 응집의 복잡성이다. 피브리노겐과 혈소판을 정확하고 일관되게 조절하기가 매우 어렵기 때문에, 잘-설계된 연구들을 계획하고 이행하기가 어렵다. 다른 이유는, PRP/PCP 생성물에 대한 평가 방법(24-25)이 이전의 연구들에서 일관적이지 않기 때문이다. 마지막으로, 혈액 성분 및 물리적 특성이 환자 샘플에 따라 다르기 때문에, 표준화하기 어렵다.""
상기한 서론은, PRP 및 PCP를 제조하기 위한 보다 나은 표준화된 원심분리 공정을 발표하고자 하는 저자들의 목적에 대한 설명으로 종결되어 있다. 이러한 기법은 복잡하고, 시간이 소모되며, 의사 또는 의료 보조인에 의해 수행되어야 한다. 처리 과정을 완료하였을 때, 의사 또는 의료 보조인이 거의 이용하기 어려운 특수 환경에서 작업하지 않은 한, PRP가 무균 상태로 유지될 것이라고 보장하지 못한다. PRP를 마지막으로 여과 막을 통해 무균 처리하는 과정은, 혈소판이 존재하기 때문에, 불가능하다.
A.P. Sclafani, S.A Mc Cormick: 2011(26)은 논문에 아래 내용을 소개하고 있다:
""파레의 시대 이래로, 현대 외과적 치료는 상처 치료에 방해되지 않을 수 있는 국소 조직 환경의 최적화에 의존하여 왔다. 국소 성장 인자의 효능에 대한 이해가 깊어짐에 따라, 외과의들은 상처 환경을 보다 빠르고 효과적인 치유를 촉진하도록 조작하기 시작하였다. 분리된 성장 인자들을 이용하여, 일부 국소적인 성공을 거두었으며 (당뇨병성 족부 궤양에 대해서는 베카플러민 (becaplermin), 방사선 유발성 점막염에 대해서는 팔리퍼민 (palifermin)), 혈소판 풍부 혈장 (PRP)은 손상 치료를 조작하는 보다 천연적이고 보다 강력한 방법으로 과거 10년간 추진되어 왔다. 그러나, 이러한 조작 과정은 시간-소모적이며, 결과가 모호할 수 있다 (27-28).""
저자들은, 다음으로, PRFM (혈소판 풍부 피브린 매트릭스)를 이용한 경험들을 기술하고 있다. PRFM은, 외과의 또는 의료 보조자에 의해 상품명 "셀필 (Selphyl)"이라는 키트를 사용해 PRP로부터 제조되어야 한다. 채혈하여 최종 주입하기까지 무균 조작은 키트에 의해 수월해지지만, 엄격한 주의를 기울여야 한다. 30분이 소요된다. PRP를 임상 사용하는 경우, PRP내 피브리노겐이 종종 통제불가한 응집과 혈소판 활성화를 유발한다. 피브린 젤은 성장 인자의 조절-방출 담체로서(29) 또는 주사용 충진제로서(30) 유용할 수 있지만, 형성된 피브린 젤은 피브린 네트워크를 효소적으로 절단하는 역할을 하는 플라스민의 방출 지점에서 조직 플라스미노겐 활성인자에 의해 유발되는 생리학적 피브린 용해에 의해 신속하게 분해된다. 글로빈 이식물은 피브린 용해 반응에 둔감하며, 아마도 이의 불용성 특징과 매우 높은 국소 농도로 인해, 놀랍게도 어떠한 다른 혈액 단백질 보다도 국소 생분해 저항성이 높다. 아울러, 형성된 피브린 젤은 최종 제품 체적을 축소시키고, PRP의 용이한 주입을 방해하며, 다수 임상 상황들에는 바람직하지 않다. 어떠한 경우라도, 활성화된 PRP 또는 PRFM은 칼슘 함유 혈장의 완전한 응고를 방지하기 위해 수분 이내에 시린지를 통해 주입되어야 하는데, 이는 주입시간을 제한하게 되어 큰 바늘을 사용하더라도 주입하기 어렵다. 여러가지 키트들이 상업적으로 시판되고 있으며, 동일한 제약이 따른다.
전술한 Jun Araki et al: (2012) 및 A.P. Sclafani, S.A Mc Cormick: (2011)문헌들은 조직 재생의 최신 기술로 생각된다. 이들 모두 조직 재생용 PRP 또는 이의 유래 생성물을, 실무적 용도로 사용되는 유일한 혈액 성분으로 기술하고 있다. PRP는 액상이며, 상처에 붙이거나 및/또는 가용성 성장 인자 및 기타 가용성 활성 성분의 국소 확산을 지연시키기 위한 고형 겔로 만들기 위해, 주입하기 전에 트롬빈 및/또는 칼슘 이온 (Ca++)을 첨가하여 "활성화"되어야 한다. 이러한 PRP의 고형화는 트롬빈 및/또는 Ca++ 첨가에 의한 혈장 또는 PRP에 존재하는 피브리노겐 및 기타 응고 인자들의 활성화에 의해 가능해진다.
Araki J., Jona M., Eto H., Aoi N., Kato H., Suga H., Doi K., Yatomi Y., Yoshimura K. (2012) Optimized preparation method of platelet-concentrated plasma and noncoagulating platelet-derived factor concentrates: Maximization of platelet concentration and removal of fibrinogen. Tissue Eng Part C Methods, March 18 (3) 176-185 Flatow F.A. Jr. and Freireich E.J. (1966) The increased effectiveness of platelet concentrates prepared in acidified plasma. Blood 27, 449. Boldt J., von Bormann B., Kling D., Jacobi M., Moosdorf R. and Hempelmann G. (1990) Preoperative plasmapheresis in patients undergoing cardiac surgery procedures. Anesthesiology, 72, 282. Weibrich G., Kleis W.K., Hafner G. and Hitzler W.E. (2002) Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Cranio Maxillofac Surg 30, 97. Eppley B.L., Woodell J.E., and Higgins J. 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본 발명은, 조직 재생과 손상 치료를 개선하기 위해, 이러한 문제들을 해결하고 보다 신뢰성있는 방식으로 혈소판 유래 인자를 전달할 수 있는, 새로운 조제물을 제공하고자 한다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 조제물이 완전히 자가 조직으로부터 유래될 수 있게 하는 것이다. 다른 목적은 중요한 조직 필링 또는 확대 효과를 처음부터 가지는 상기한 조제물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 무균 조제물을 용이하게 제조하는 것이다. 다른 목적은 제조, 보관 및 전달이 보다 용이한 상기한 조제물을 제공하는 것이다. 마지막으로, 다른 목적은 의사나 의료 보조자에 의한 어떠한 전문적인 제조가 필요없게 하는 것이다.
본 발명의 내용은 환자에게 투여가능하며, 혈청, 바람직하게는 자가 혈청과 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈을 포함하는, 새로운 조제물이다. 이러한 조제물은, 상기 혈청을 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈에 첨가함으로써, 수득된다. 글로빈은 혈장 또는 혈청으로부터 적혈구를 분리한 다음 적혈구로부터 수득할 수 있다.
바람직하게는, 이러한 새로운 조제물은 주름 또는 기타 피부 균열의 필링 등의 피부 재생, 및/또는 단독으로 또는 다른 확대 물질과 조합 또는 혼합 사용하여, 결함성 괄약근, 성대, 치주 조직을 비롯한 조직의 증대, 입술, 볼 또는 다른 신체 부위를 확대하기 위한 성형 수술 또는 미용 수술, 및/또는 당뇨병 환자 또는 사지의 국소 혈관생성에 결함을 야기하는 동맥 또는 정맥 장애를 앓고 있는 환자, 또는 흉터를 가진 환자 등에서, 체내 외상, 장기의 일부, 피부 조직의 만성적인 손상의 치료, 및/또는 심부 화상 상처에서 괴사 조직을 적출한 후 육아 조직의 재생 보조를 위한, 치료학적 방법에 사용되는 조제물이다.
상기 조제물내 혈청은 수계 비히클에 희석되거나 또는 천연 혈청에 비해 보다 농축될 수 있지만, 조제물내 혈청은 환자의 천연 혈청의 10% 내지 120% 농도인 것이 바람직하며, 실질적으로는 동일한 농도인 것이 더 바람직하다.
상기 조제물은 바람직하게는 이식가능하며, 즉, 이를 필요로 하는 환자의 조직 상에 또는 그 내부로 비경구 주입, 이식 또는 개방 조직 (open tissue), 예컨대 상처 위 적층 (deposition)에 의해 투여할 수 있다는 것을 의미하며, 상당 시간 동안 잔류할 수 있다.
본 발명에서, 혈청은 혈액 샘플을 응고시켰을 때 액체 부분을 의미한다.
바람직하게는, 글로빈은 동종 글로빈, 즉 동일 종으로부터 유래되는 동종 글로빈이며, 인간의 경우에는 글로빈이 자가 글로빈, 즉 동일 환자의 혈액 샘플로부터 준비된 자가 글로빈인 것이 더 바람직하다.
가장 바람직한 구현예에서, 2가지 성분 모두, 즉 혈청과 글로빈 모두 환자의 동일 혈액 샘플로부터 수득된다.
이식가능한 가용성 또는 불용성 글로빈 조제물은 바람직하게는 페이스트 (paste) 또는 젤 형태, 또는 분말, 과립, 드레싱 (dressing) 또는 필름 (film)과 같은 고형 물질 형태, 또는 형상화된 이식체 형태이다.
글로빈 : 혈청의 각 부피 비율은 크게 달라질 수 있지만, 바람직하게는, 적어도 페이스트 또는 젤 형태의 경우, 글로빈/혈청의 비율 (글로빈 중량/페이스트 중량)은 바람직하게는 14% 이상, 더 바람직하게는 15% 이상, 더 바람직하게는 18% 이상, 심지어 20% 이상이며, 단, 페이스트 조제물은 가장 가는 주사 바늘을 통해 여전히 전달가능하다.
본 발명에 따른 조제물은, 하기를 비롯한 다른 성분들을 선택적으로 포함할 수 있다:
- 조직 필링 (filling) 또는 확대 (augmentation) 물질, 예컨대 콜라겐, 젤라틴, 가교된 히알루론산, 합성 충진 폴리머, 세라믹 입자, 수산화 인회석, 뼈 입자 (bone particle), 만일 이들 물질이 존재한다면, 이의 비율은 글로빈 비율 보다 낮은 것이 바람직함;
- 치유성 폴리머 물질, 예를 들어 산화된 셀룰로스와 같은, 상처용 제제 (wound agent);
- 합성 또는 천연 폴리머 접착제들 중에서 선택되는 접착제;
- 헤모글로빈, 바람직하게는 자가 헤모글로빈;
- 기타 세포 성장 인자; 및/또는
- 줄기 세포, 모세포 (blast), 예컨대 섬유모세포, 골모세포, 연골모세포, 또는 섬유세포, 골세포, 연골 세포, 지방 세포와 같은 분화된 세포를 비롯한, 세포.
세포는 배양된 세포 또는 분리된 세포일 수 있지만, 또한, 본 발명에 따른 조제물에, 자가 조직, 예컨대 환자로부터 수득되며 자가이식편으로서 통상적으로 가공 처리된, 예컨대 균질화 또는 분쇄된, 골 조직 또는 지방 조직이 첨가될 수도 있다.
본 발명의 다른 내용은, 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 조제물의 제조 방법이다:
- 전혈 (whole blood)을 항응고제 사용없이 수득하는 단계;
- 상기 전혈을 응고시키는 단계;
- 형성된 혈청을 응고물로부터 분리하는 단계;
- 선택적으로, 상기 혈청을 일정량 사용하여, 감염성 질환 마커에 대한 테스테를 수행하는 단계;
- 상기 혈청을, 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈이 포함된 조제물에 첨가하는 단계.
바람직하게는, 혈청은, 동종 혈청, 즉 치료할 동물과 동일 종의 혈액으로부터 수득되는 혈청이며, 더 바람직하게는, 특히 인간의 경우, 혈청은 자가 혈청, 즉 환자의 혈액으로부터 수득되는 혈청이다.
또한, 글로빈 성분의 경우, 동종 글로빈이 바람직하며, 특히 인간의 경우, 글로빈이 자가 글로빈인 것이 더 바람직하다.
바람직하게는, 혈청과 글로빈 둘다 동종 유래이며, 더 바람직하게는 혈청은 자가 혈청이며, 가장 바람직하게는 혈청과 글로빈 둘다 자가의 것이다.
글로빈 성분은, 예를 들어, 미국 특허 6949625; 7709017; 20090312239; 20120183501에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있으며, 상기 특허들은 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, 당해 기술 분야의 당업자는 이를 참조할 수 있다.
그러나, 글로빈 성분은 혈액 응고물로부터, 바람직하게는 자가 혈액 응고물로부터 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 글로빈은 혈액의 혈장으로부터 적혈구를 분리한 다음, 적혈구로부터 수득할 수 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 무균성 전혈을 먼저 항응고제 없이 응고시키는 단계;
- 혈청을 제거하는 단계;
- 선택적으로, 응고물을 생리 식염수로 세척하는 단계;
- 멸균수를 첨가하여 교반 또는 균질화하여, 응고물을 해리시키고 헤모글로빈을 분리시키는 단계;
- 예를 들어 한번의 원심분리 단계에 의해 헤모글로빈을 청징 (clarifying)하는 단계;
- 바람직하게는, 상기 헤모글로빈을, 바람직하게는 아질산 나트륨을 첨가하여 메트헤모글로빈 (methemoglobin)으로 산화시키는 단계;
- 상기 헤모글로빈으로부터, 바람직하게는 산성 pH에서, 아세톤 함유 물질에 의해 헴 (heme) 부분을 추출하는 단계;
- 석출된 글로빈을 액체로부터, 바람직하게는 여과 단계에 의해 분리하는 단계;
- 상기 석출된 글로빈을 멸균수에 산성 pH 하에 용해시키는 단계;
- pH를 중성으로 조정하여, 글로빈을 석출시키는 단계;
- 선택적으로, 석출물을 세척하는 단계,
- 글로빈 페이스트를 회수하는 단계,
- 선택적으로 글로빈을 건조하는 단계.
조제물의 글로빈 성분은, 단지 무균 환경에서 이를 제조함으로써, 무균 형태로 쉽게 수득할 수 있으며, 혈청 성분은 살균 여과 단계를 쉽게 수행할 수 있기 때문에, 이는 사용 준비된 (ready for use) 무균 조제물로 직접 수득할 수 있다.
글로빈 페이스트 또는 글로빈 건조 분말은, 그런 후, 혈청과 혼합하여 본 발명에 따른 조제물을 만들거나, 또는 이들을 분리 보관하여, 나중에 혼합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 이러한 글로빈 수득 방법은 혈청을 분리한 동일한 혈액 응고물을 이용함으로써, 환자 자신으로부터 유래된 동일한 전혈, 예컨대 혈액 샘플 20 mL로부터 혈청 성분과 글로빈 성분 둘다를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 내용은, 필요한 환자에게 본 발명에 따른 조제물을 유효량으로 재생시킬 조직 상에 또는 그 내부로 투여하는 단계를 포함하는, 조직의 재생 방법이다.
바람직하게는, 상기 조제물은 조직 상에 또는 그 내부로 이식된다.
일 구현예에서, 본 방법은 주름 또는 기타 피부 균열 (cutaneous flaw)의 필링 방법이다. 이 방법은 가장 가는 주사 바늘을 통해 주사할 수 있는 페이스트 형태로 조제물을 사용하며, 이때 조제물내 글로빈의 농도는 바람직하게는 적어도 12%이며, 더 바람직하게는 그 보다 더 높다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 단독으로 또는 다른 확대 물질, 예컨대 자가 지방 조직과 조합 또는 혼합 사용하여, 조직, 예를 들어, 결함성 괄약근, 치주 조직의 증대 방법, 또는 입술, 볼 또는 기타 신체 부위의 확대를 위한 성형 수술 또는 미용 수술 방법을 제공한다. 이런 용도에서, 조제물은 페이스트 형태로, 바람직하게는 주사에 의해 사용하는 것이 바람직하다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어, 당뇨병 환자, 사지의 국소 혈관생성에 결함을 야기하는 동맥 또는 정맥 장애를 앓고 있는 환자, 또는 흉터가 생긴 환자에서, 체내 외상, 장기의 일부, 피부 조직의 만성적인 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 조제물은 또한 심부 화상 상처에서 괴사 조직을 적출한 후 육아 조직의 재생을 보조하기 위해 사용할 수 있다. 이 단계는 시험관내 배양된 상피 시트를 이식하기 전까지 중요하다.
따라서, 본 발명은 자가 혈청을 이용할 수 있으며, 자가 혈장 유래 생성물을 이용할 필요가 없다. 본 발명에 따른 조제물은 혈장 유래 생성물에 비해 성장 인자를 고 함량으로 보장하므로(31), 재생 특성에 관한 한 결정적일 수 있다. 이는, 단순한 방식으로 최종 조제물의 무균성을 보장할 수 있게 한다. 혈청의 마지막 살균 처리는, 혈소판이 없기 때문에, 막 여과에 의해 행해질 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 조제물은, 혈소판 함유 액체 또는 피브린 기재의 젤과는 대조적으로, 혈청 성분과 글로빈 성분의 탁월한 안정성으로 인해, 장기 보관이 가능하다. 혈청은 수일간 +4℃에서 안정적이며, 이의 최종 사용을 위해 해동할 때까지 수년간 냉동된 상태로 보관할 수 있다.
혈장과는 대조적으로, 혈청은 응고 시스템의 임의의 활성 성분이 존재하지 않기 때문에, 단독으로는 더 이상 굳지 않을 수 있다. 혈청은 명백히 주사 부위에서 벗어나 즉각적으로 확산될 수 있는 액체이다. 혈청과 콜라겐 입자를 혼합하고자 하는 모든 시도들은 성공하지 못하였다. 무균 콜라겐 입자 또는 겔은 생리학적 pH에서 혈청과 혼합하였을 때 적절한 시간내에 팽창하지 않는다. 제조되는 혼합물은, 심지어 수 시간 인큐베이션하더라도 균질하지 않으며, 적절한 바늘 크기로는 주사할 수 없다. 히알루론산 기재의 입자 또는 겔과 같은 다른 친수성 폴리머는 혈청과 접촉하면 팽창할 수 있다. 하지만, 이 물질의 음전하성 특징은 세포를 밀어내 세포가 부착, 증식 및 분화하여 새로운 조직으로 생장할 수 없기 때문에, 조직 재생에 사용하는 것은 바람직하지 않다(32). 놀랍게도, 자가 혈청을 불용성의 글로빈 분말과 혼합하게 되면, 15 - 20% (페이스트 중량 당 글로빈 중량)의 고농도의 페이스트의 제조가 가능해진다. 이러한 15% 이상의 고농도의 글로빈은 Tayot의 미국 특허 6,949,625에 따르면 제조할 수 없으며, 어떤 경우에는 얇은 피하 (30g) 바늘을 통한 주사를 확신할 수 없다. 이러한 혈청과 15 - 20%의 글로빈 ("혈청글로빈")으로 된 새로운 혼합물은, 층류 흐름 (laminar air flow) 하에 무균 상태로 제조할 수 있다. 또한, 시린지에 배분하여, 냉동고에 보관할 수 있으며, 나중에, 심지어 수년 후 사용 전에 해동시킬 수도 있다. 의사 또는 외과의는 어떠한 중간 단계 없이도 이를 즉각적으로 사용할 수 있다. 놀랍게도, 혈청글로빈 페이스트는, 심지어 냉동 및 해동된 후에도, 고농도임에도 불구하고 가장 가는 피하 바늘을 통해 쉽게 주사되며, 피부 필링제 또는 재생 의학 어플리케이션으로서 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 혈청과 이의 첨가제로 된 최종 혼합물의 "자가" 상태를 유지시킨다. 자가는, 주입물의 모든 성분들이 환자 자신에게서 나온 것이며, 어떠한 외래 첨가물이 첨가되지 않은 것을 의미한다. 이는, 안전성 고려, 환자 수용성 및 아울러 이러한 새로운 생체재료 (biomaterial)에 대한 규제기관의 승인을 용이하게 해주므로, 매우 중요하다. 혈청은, 예를 들어, 어떠한 첨가제의 첨가 없이 응고된 혈액으로부터 쉽게 분리되는 천연 액체 생성물이다. 이와는 대조적으로, PRP 역시 자가이지만, 사용하기 전에, 환자에게 외래의 것인 칼슘 염 및/또는 트롬빈을 혼합하여야 한다. 그래서, 주사되는 PRP 유래 생성물은 이런 측면에서는 완전한 자가는 아니며, 규제기관으로부터 승인받는데 보다 복잡한 문제를 야기할 수 있다. 글로빈은 제조되는 혈청과의 혼합물에 높은 점성 특징을 부여하기 위한, 동일 환자의 혈액으로부터 제조될 수 있는 유일한 첨가제임이 확인되었다. 불순물이 없고, 글로빈 이외의 다른 성분은 글로빈 분말에 존재하지 않는다. 그래서, 글로빈 분말을 환자 자신의 혈액으로부터 제조하는 경우에는 글로빈 분말은 자가 생성물로서 실제 간주할 수 있다. 이는, 혈청을 제1 혈액 샘플에서 준비하고, 글로빈은 제2 혈액 샘플에서 준비하는, 실시예 2에서 예시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 또한 비-혈연 공여자로부터 제조된 글로빈을 환자의 혈청과 혼합하는 것도 놀랍게도 가능하다. 다른 혈액형의 수여체에게는 부적절한 항체를 포함하는 혈청과는 대조적으로, 글로빈은 항체 또는 감염성 물질을 함유하지 않아, 다른 수여체에게도 안전하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 응고된 동일 혈액 샘플로부터 혈청과 글로빈을 제조할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 지금까지, 글로빈을 제조하는 모든 과정들은 구연산나트륨, EDTA 또는 헤파린과 같은 항응고성 첨가제를 첨가하여 혈액을 채혈하는데서 시작한다. 이런 과정은 원심분리 단계에 의해 혈장으로부터 적색 세포를 분리한 다음 수중에서 적색 세포를 용혈시켜 청징된 헤모글로빈을 제조하는 가장 쉬운 방법으로 알려져 있었다. 그러나, 놀랍게도, 다른 혈액 단백질도 포함할 수 있는 혈액 세포와 피브린으로 된 응고물을 출발 재료로 하여 고순도의 글로빈을 제조할 수 있다. 이 경우, 혈청은 응고된 혈액의 상층 분액으로부터 쉽게 취할 수 있다. 글로빈은 적색 응고물을 염수 용액으로 세척한 후 이로부터 추출할 수 있다. 이 방법의 일 예는 실시예 3에 기술한다. 이러한 처리 과정을 완료하였을 때, 하나의 동일한 혈액 샘플로부터 제조되는 혈청과 글로빈 분말의 각각의 양은 15% 이상의 적절한 농도의 "혈청 글로빈" 페이트스의 제조가 가능하다. 이는, 환자로부터 채혈되는 혈액의 양을 1/2로 줄일 수 있기 때문에, 예를 들어, 실시예 2 및 3에 나타낸 바와 같이 40 ml이 아닌 20 ml로 사용하기 때문에, 환자에게 매우 유익하다.
아래 실시예들은 비제한적인 방식으로 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예들을 예시한다:
도 1: 혈액 응고물로부터 제조된 글로빈의 SDS PAGE 전기영동 사진.
도 2: 현미경 사진 n°1. 피하 계면 (hypodermis interface)에, 식균 세포 (대식세포 및 자이언트 세포)가 침윤되어 있고, 중간 등급의 섬유 증식 활성 신호와 낮은 등급의 섬유모세포 신호를 보인다 (메이슨의 트리크롬 염색, 글로빈은 적색으로 표시됨).
도 3: 현미경 사진 n°2. 제품 물질과 천연 진피 콜라겐이 직접 접촉된 영역이 존재하며, 이는 조직 반응이 없음을 보여준다. 이러한 최종 특징은 제품의 완벽한 국소 허용성으로 해석되었다. (메이슨의 트리크롬 염색, 글로빈은 적색으로 표시됨).
도 4: 현미경 사진 n°3. 물질 내부에 콜라겐이 축적되며, III형 콜라겐 신호가 존재하며, I형 콜라겐 축적물이 지배적이다. 이 단계에서는 섬유증 증거는 나타나지 않았다 (콜라겐 매트릭스의 조직형태계측학적 정량을 위해 Picrosirius 레드 염색함).
도 5: 현미경 사진 n°4. 제품의 주변 및 내부에서 생장하는 새롭게 형성된 조직에, 중간 등급의 신생 혈관이 형성되었다 (혈관 마커인 알파 평활근 액틴의 염색).
실시예 1: 응고 혈액으로부터 자가 혈청 준비
인간 혈액 20 mL을 정맥 천공에 의해 환자로부터 채혈하여, 어떠한 항응고제도 사용하지 않고 건조된 Vacutainer® 시험관 5개에 채집한다. 시험관은 혈액이 응고될 때까지 실온에서 30분간 둔 후, +4℃에 보관한다. 1일 이상 경과 후, 혈액 시험관들 모두 내용물을 100 mL 용기에 붓는다. 혈청을 25 mL 무균 파이펫으로 취하여, 20 mL 루어 (luer) 시린지에 넣는다. 20 mL 시린지를 0.2 ㎛ 막이 장착된 무균 시린지 필터와 연결한다. 혈청액을 여과하여, 무균 혈청 약 11 mL을 다른 20 mL의 무균 시린지에 채집한다. 혈청 시린지를 뚜껑으로 닫고, 사용할 때까지 +4℃에서 잠깐 보관한다.
실시예 2: 동일 환자의 다른 혈액 샘플로부터 자가 인간 글로빈 분말의 제조
인간 혈액 20 mL을 정맥 천공에 의해 환자로부터 채혈하여, EDTA 또는 사이트레이트가 담긴 Vacutainer® 시험관 5개에 채집한다. 그 후, 시험관을 +4℃에 보관하며, 2주간 보관할 수 있다. 혈액을 50 mL 원심분리 버킷 2개에 넣고, 생리 식염수로 희석한다. 이를 2000 rpm으로 3분 원심분리한 후, 상층 혈장을 버리고, 새로운 식염수를 넣는다. 2회 세척한 후, 적색 세포 펠렛을 합치고, 물 30 mL을 넣어, 용혈을 유도한다. 5분간 용혈을 완료한다. 헤모글로빈 현탁물을 하나의 원심분리 버킷으로 옮긴다. 이를 3000 rpm에서 10분간 +20℃에서 1회 원심분리하여, 헤모글로빈 용액을 맑게 처리한다. 맑게 된 헤모글로빈 용액에 1M 글리신 0.9 mL을 넣은 후, 1M 아질산나트륨 0.45 mL을 첨가한다. 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시킨 후, 헤모글로빈의 적색이 검정색으로 바뀐다. 산화된 혈액의 용액을, 12N 진한 염산 5 mL이 첨가된 아세톤 500 mL에, 왕성하게 교반하면서, 점적으로 첨가한다. 검정 색소 헴은 아세톤에 의해 추출되며, 이때 약간 흰 글로빈은 잔류하는 모든 혈액 단백질과 함께 즉각적으로 석출된다. 그 후, 이 현탁물을, 횡 방향으로 둥글게 말고 양측을 붙여 튜브로 만든, 공극률 약 1 미크론인 직사각형 직물 여과 막을 통해 여과한다 (예, 내경이 20 mm이고, 초음파에 의해 붙인, SEFAR NITEX 03-1/1 패브릭으로 제조된 튜브). 튜브의 한쪽 끝은 여과할 현탁물을 도입하는 깔때기와 연결하고, 다른 쪽 끝은 클립으로 봉한다. 글로빈 석출물은 튜브 안에 축적되고, 색소가 추출된 아세톤 용액은 쉽게 여과되며, 이를 체류 용기로 옮긴 다음 아세톤 재사용을 위해 아세톤을 빼낼 수 있다. 여과 완료시, 산 석출물을 아세톤 200 ml에 재현탁하고, 다시 동일한 튜브를 통해 여과하여 남아있는 미량의 색소를 제거한다. 산 글로빈 석출물을 멸균 증류수 100 mL에 용해하고, 이 용액을 무균 0.45㎛ 및/또는 0.2㎛ 다공성 막을 통해 여과한다. 산성 pH (=2.5)는 NaOH 1N을 첨가하여 중성 (pH 7.0 ± 0.2)으로 조정한다. 글로빈은 묵직하게 석출되며, 임의의 기타 잔류 단백질은 상층액에 용해되어 유지된다. 정제된 글로빈의 중성 석출물을 이전과 같이 동일 여과 메쉬 상에서 세척한다. 마지막으로, 불용성 글로빈 페이스트를 아세톤으로 세척하여, 수분을 제거한 다음, 공기 흐름 또는 진공 하에 건조하여, 중성의 불용성 글로빈 분말을 수득한다. 글로빈 분말 2.05 g을 칭량하여, 5 mL 루어 시린지에 배분한다 (500 mg/시린지). 남겨진 분말을 사용해, 배양 배지에 접종함으로써 무균성을 조사한다. 이 분말은 층류 공기 흐름 하에 제조한다면 직접 살균할 수 있다. 필요하다면, 불용성 글로빈 분말은 조사량 5 - 30 kGray의 베타 또는 감마 방사선 조사에 의해 살균할 수 있다.
실시예 3: 혈청 제조에 사용된 동일한 응고 혈액으로부터 자가 인간 글로빈 분말의 제조
실시예 1을 하기 조작으로 계속 진행하며, 이는 실시예 2와는 대조적으로 다른 혈액 샘플이 필요없다는 것을 의미한다. 혈청을 취한 후 방치된 혈액 응고물을 멸균 생리식염수 (9g/L NaCl 용액)로 세척한다. 서서히 교반하면서 2분 인큐베이션하고, 파이펫으로 세척 식염수를 제거한다. 포트에 다시 식염수를 넣고, 동일한 과정을 3번 반복한다. 응고물을 30 mL 시린지 하나에 넣는다. 시린지에 멸균수 약 20 mL을 넣는다. 응고물을 용해시키고, 커플러를 통해 시린지의 내용물을 다른 30 mL 시린지로 이동시켜 시린지의 내용물을 균질화한다. 5분간 용혈을 완료하고, 실시예 2와 동일하게 진행한다.
마지막으로, 불용성 글로빈 페이스트 역시 아세톤으로 세척하여 수분을 제거한 다음, 공기 흐름 또는 진공 하에 건조하여, 중성의 불용성 글로빈 분말을 수득한다. 글로빈 분말 2.15 g을 칭량하여, 5 mL 루어 시린지에 배분한다 (500 mg/시린지). 남겨진 분말을 사용해, 배양 배지에 접종함으로써 무균성을 조사한다. 이 이 분말은 층류 공기 흐름 하에 제조한다면 직접 살균할 수 있다. 필요하다면, 불용성 글로빈 분말은 조사량 5 - 30 kGray의 베타 또는 감마 방사선 조사에 의해 살균할 수 있다. 실시예 2 및 실시예 3에 의해 제조된 글로빈 분말의 순도를 SDS PAGE 전기영동으로 비교한다. 2종의 조제물은 동일한 프로파일을 나타내어, 16kd 모노머, 일부 32kd 다이머가 확인되며, 가시적인 불순물은 없었다 (사진 1 참조). 놀랍게도, 실시예 3의 글로빈은 혈액 응고물로부터 제조되었음에도 불구하고, 이의 순도는 보다 정제된 헤모글로빈 용액으로부터 제조된 실시예 2의 글로빈의 순도와 동일하다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 4: 동일 환자로부터 유래된 자가 혈청과 자가 글로빈 분말을 혼합하여, 최종 "혈청글로빈" 페이스트 제조
분말을 액체와 혼합할 때, 분말에 포함된 공기를 배출시키는 것이 바람직하다. 만일, 페이스트에 일부 가압 공기가 들어간다면, 시린지 개봉시 페이스트의 자발적인 배출을 야기할 수 있으며, 바늘 적응 (adaptation) 문제가 생기며, 무균 조사가 불가능하거나 또는 적어도 불확실할 수 있다. 무균 트리 웨이 루어 스탑코크 (sterile three way luer stopcock) (Cole Parmer reference: #S-31200-80)를 사용해, 분말에서 공기를 빼낼 수도 있다. 표준 스탑코크는 또한 동일한 연속 조작과 함께 사용할 수 있다. 트리 웨이 스탑코크는 수동으로 투 웨이 결합하고, 3가지 가능한 컴비네이션에서 3번째를 닫을 수 있다. 글로빈 분말 500 mg이 담긴 실시예 2 또는 3의 5 mL 시린지 하나를, 무균 층류 공기 흐름 하에 원 웨이 스탑코크의 루어 어댑터에 연결한다. 혈청이 담긴 시린지를 반대쪽 채널에 연결하고, 스탑코크내 모든 공기 방울은 혈청 한 방울을 수직 채널을 통해 떨어뜨려, 제거한다. 30 mL의 살균된 빈 시린지 하나를 수직 채널과 연결한다. 분말 시린지에 존재하는 공기는 30 mL 시린지의 피스톤을 당겨 분말 입자 주면에 충분한 진공을 형성함으로써, 배출시킬 수 있다. 그런 후, 분말과 혈청 사이에 커넥션을 즉시 확립한다. 혈청을 분말로 흡입시켜, 피스톤 아래에 존재하는 보이는 공간을 모두 채운다. 시린지에 가압 공기는 유입시키지 않는다. 열었을 때, 시린지 안에 글로빈 페이스트가 모두 남게된다. 루어 커넥션은 깨끗하게 유지되며, 시린지의 물질이 배출되지 않는다. 그런 후, 잔류 혈청이 담긴 시린지와 분말이 담긴 시린지를 직접 연결한 후, 페이스트를 재구축 및 균질화할 수 있다. 제조되는 페이스트의 균질화는, 시린지 하나의 내용물을 다른 시린지로 옮기고, 다시 이전 시린지로 옮기는 과정을 10번 행하여 수행된다. 그 후, 소구경 (0.2 mm) 커넥터를 사용하여, 최종 페이스트가 매우 가는 30g 피하 주사 바늘을 통해 쉽게 주사가능한 지를 체크할 수 있다.
동일 부피의 혈청 또는 생리 식염수에 대해 분말 500 mg과의 혼합을 테스트하였다. 혈청 2.5 mL을 사용하는 경우, 페이스트내 글로빈의 최종 농도는 16.7% w/w (500mg/2500mg+500mg)이었다. 30g 바늘을 통한 주사를 약력계 (dynamometer)로 추적한다. 페이스트를 주사하는데 필요한 압력은 일정하였으며, 25 뉴턴 미만이었다. 식염수를 동일 부피 2.5 mL로 사용하는 경우, 제조되는 페이스트는 균질화하기 어려웠으며, 30g 바늘을 통한 주사가 불가능하였다. 글로빈 500 mg에 식염수 (2.5 mL 대신) 3.5 mL을 첨가하여, 글로빈 농도가 12.5% w/w (500mg/3500mg+500mg)인 페이스트를 제조하였다. 이 경우, 30g 바늘을 통한 주사시 기록된 압력은 만족스러운 수준이었으며, 25 뉴턴 미만이었다.
배치 (batch)를 구성하는 모든 5 mL 시린지의 혈청 및 글로빈 혼합물을 20 mL 시린지에 모운다. 전체 페이스트를 균질화한 다음, 1 mL BD 시린지에 배분 (0.8 mL/시린지)하여, 환자에게 주사하기 전까지 -20℃에서 냉동 보관한다. 실시예 2에서와 같이 혈액 40 mL로부터 또는 실시예 3에서와 같이 20 mL의 응고된 혈액 샘플 단 하나로부터, 동일한 "혈청글로빈" 시린지를 평균 16개 제조할 수 있다. 1 mL 시린지를 실온에서 해동시켰을 때, 혈청글로빈 페이스트는 처음 페이스트와 동일 조건에서 여전히 주사가능하였다. 시린지의 자연적인 해동 외에는 어떠한 중간 조작이 의사에게 필요하지 않았다.
실시예 5: 자가 "혈청글로빈" 시린지를 제조하기 위한 바람직한 조작 순서와 이의 의학적인 활용
의사는 환자에게 특수 진단 실험실에서 자가 혈액 20 mL을 공여할 것을 권고한다.
항응고제를 사용하지 않으면서 건조된 튜브로 혈액을 채혈하고, 구체적으로 라벨 표시한 다음 30분간 실온에 인큐베이션한 후 +4℃로 냉각된 패키지에 넣어 특수 제조 실험실로 보낸다. 혈액 튜브는 필요에 따라 1주 또는 2주간 +4℃에서 보관할 수 있다.
다른 혈청 샘플을 대상으로 모든 필수 바이러스 마커에 대해 테스트하여, 해당되는 혈액 샘플을 폐기하고, 환자에게 다른 대안책을 제안한다.
응고된 혈액은 바람직하게는 실시예 1 및 3에 따라 처리한다.
응고된 혈액 20 mL로부터 제조된 자가 글로빈 분말과 자가 혈청을 실시예 4에 따라 혼합하여, 시린지 1개당 페이스트가 0.8 mL인 시린지 약 16개를 제조한다. 페이스트내 글로빈 농도는 12 - 20% (w/w)에서 다양할 수 있다.
한명의 환자로부터 제조된 모든 시린지에는 개별 표시하고, 표시된 무균 파우치로 포장한 후, 이를 큰 라벨 표시된 파우치에 모두 넣는다. 이 lot 전체를 +20℃에서 최대 5년간 냉동한다. 각 lot의 시린지 하나를 무균 관리한다.
각 환자나 의사는 안전한 개인 인터넷 접근을 통해 시린지 재고 목록에 접근할 수 있다.
의사가 요청하면, 적정 수의 시린지가 +4℃로 이동되며, 수일내 (+4℃에서 1주일 미만)에 주사되어야 한다.
비-혈족 혈액 공여자로부터 제조된 글로빈 분말을 치료할 환자로부터 제조된 자가 혈청과 혼합하여, 유사 시린지를 제조할 수 있다.
혈청글로빈의 주 처방 증상은 반복 주사에 의한 피부 접힌 부분과 주름의 교정, 입술, 볼, 유방, 근육과 같은 연조직의 확대, 및 급성 및 만성 손상의 치료이다.
혈청글로빈은 이식 전 또는 후 이의 생존을 개선시키기 위해 섬유모세포, 각질형성 세포, 연골 세포, 골모세포, 지방세포, 줄기 세포와 같은 세포, 지방흡입으로부터 유래된 지방세포와 같은 조직 추출물, 또는 골 단편 (bone fragment)과 혼합될 수 있다.
실시예 6: 동일 인간 공여자에서 자가 혈청글로빈 피부 이식물의 재생 특성에 대한 생체내 입증
실시예 4에 따라 응고된 혈액 20 mL로부터 각각 제조된, 자가 글로빈 분말 2 g과 자가 혈청 10 mL을 혼합하였다. 자가 혈청글로빈 페이스트의 최종 부피는 14 mL이었다. 샘플을 무균성 및 주사성에 대한 품질 관리(quality control)에 사용하였다. 각 시린지 당 페이스트 0.8 mL이 담긴 BD 루어 1 mL 시린지 나머지 14개는 2013년 3월 26일에 -20℃에 냉동 보관하였다. 페이스트의 글로빈 농도는 16.6 % (w/w)였다. 이 lot의 시린지 하나를 실온에 30분간 두었다. 이 시린지를 사용해 각각 0.2 mL 씩 30 g 바늘을 사용해 개체의 왼팔 상위에 3번 진피 주사하였다. 즉시, 그리고 1, 2, 3, 7, 16, 23, 30, 40, 51 및 58일 후에 연속하여 사진을 촬영하였다. 30일 후 외과의는 1차 바이옵시를 취하였다. 2차 바이옵시는 58일 후에 취하였다. 바이옵시 2종은 샘플을 취한지 24시간에 10% (w/v) 완충화된 포르말린 용액내에 담긴 상태로 하청 전문 기업으로부터 제공받았다. 표본을 만들기 전에 현미경 사진을 촬영하였다. 고정한 후, 각각의 바이옵시는 길이 방향으로 이등분하여 절단하였다. 이등분된 바이옵시 단편을 알코올 농도를 증가시키면서 알코올 용액 중에 탈수하고, 자일렌으로 세척한 후, 파라핀 블록에 포매시켰다. 블록 하나는 나중 분석을 위해 보관하고, 나머지 블록은 마이크로톰으로 절편으로 절단하였다 (5　㎛ 절편 두께 +/- 0.5 ㎛). 4개의 연속 절편들을 마이크로톰을 사용해 제조하였다(MICROM®, France):
절편 하나는 전체 형태와 세포외 기질 평가를 위해 메이슨 트리크롬으로 염색하였다.
절편 하나는 염증 반응을 분석하기 위해 사프라닌-헤마톡실린-에오신으로 염색하였다.
절편 하나는 콜라겐 기질의 조직형태계측학적 정량을 위해 피크로시리우스 레드 (Picrosirius Red)로 염색하였다.
절편 하나는 알파-SMA 혈관 마커를 면역조직화학적 (IHC) 방법으로 측정하는데 사용하였다.
절편들은 디지탈 카메라 니콘에 결합된 x2, x10, x20 및 x40 대물렌즈가 장착된 Nikon Eclipse 80i 현미경을 사용하여 평가하였다. 국소 효과에 대한 준-정량 평가는, 염증 반응 (다형핵 세포 PMS, 림프구, 혈장 세포, 대식세포 및 자이언트 세포/파골세포), 피브린, 괴사, 신생 혈관, 분해 및 물질 파편의 평가를 수반하는 0 - 4 등급 척도 (grading scale)로 수행하였다.
현미경 사진은 대상 영역들에 대해 입수하였다. 또한, 전체 절편들에 대한 디지털화를 수행하였다.
절편들은 유색 이미지 분석 시스템을 이용하여 평가하였다. 대상 조직형태계측 영역에 이식 물질과 그 주변 및 각 물질 잔류물 내부에 형성된 새로운 콜라겐 매트릭스를 포함시켰다. 정량적인 조직형태계측 분석을 수행하여, 잔류하는 이식체 표면적, 콜라겐 총 함량 및 콜라겐 I/콜라겐 III의 비율을 측정하였다.
아래 단락은 독립된 회사에서 수행된 테스트에 대한 공식 보고서에서 취한 사본이다.
"이식 2달 후 취한 피부 바이옵시는 폐쇄된 영역 3곳에 테스트 제품이 파편화되어 다량 존재하며, 또한 주변 진피 조직으로 통합된 것으로 확인되었다. 물질의 일부분은 피하 계면에 위치하였다. 피하 계면에서는, 중간 등급의 섬유 증식 활성 신호가 있었으며, 식균 세포 (대식 세포 및 자이온트 세포)가 침윤하였으며, 섬유모세포는 낮은 등급의 신호로 나타내었다. 제품 물질의 나머지 표면은 약간 낮은 수준으로 유사한 조직 반응을 나타내었다. 피하 계면에서 리모델링 신호가 보다 강하였다. 제품 물질이 천연 진피 콜라겐과 직접 접촉하는 영역이 존재하지만, 조직 반응은 없었다 (현미경 사진 n°2). 이러한 최종 특징은 제품의 완벽한 국소 허용성으로 해석되었다. 콜라겐 축적물이 제품 물질 내부에서 확인되었고, 콜라겐 III형과 I형이 있었으며, 콜라겐 I형이 축적물이 지배적이었다 (현미경 사진 n°3). 섬유증의 증거는 이 단계에서 보이지 않았다. 중간 등급의 신생 혈관이 제품 주변 및 내부에서 생장 중인 새롭게 형성된 조직에서 생겨났다 (현미경 사진 n°4).
아는 한 그리고 본원에 규명된 혈청글로빈 물질과는 대조적으로, 임의의 어떠한 물질도 임의의 염증성 반응을 수반하지 않으면서 이렇듯 허용성이 우수하며, 동시에 세포 이동 및 군락화에 의해 국소 조직 재생을 유도할 수 있다고 언급된 적 없다.
실시예 7: 혈청글로빈 혼합물이 사용되는 주요 치료 증상
이러한 새로운 조제물은 바람직하게는 주사에 의해, 주름 또는 기타 피부 균열 필링 등의 피부 재생을 위한, 단독으로 또는 다른 확대 물질과 조합 또는 혼합 사용되어 볼, 입술 또는 기타 신체 부위를 확대하기 위한, 및/또는 괄약근, 성대, 치주 조직의 결핍 등의 조직의 증대를 위한, 치료학적인 방법으로 사용하기 위한 조제물이다. 또한, 이것은, 당뇨병 환자, 사지의 국소 혈관형성에 문제를 일으키는 동맥 또는 정맥 장애를 앓고 있는 환자, 또는 흉터를 가지고 있는 환자 등에서, 체내 외상, 장기의 일부, 피부 조직의 만성적인 손상을 치료하거나, 및/또는 심부 화상 상처에서 괴사 조직을 제거한 후 육아 조직의 재생을 보조하는데 사용할 수도 있다. 상처 치료를 위해, 혈청글로빈은 분말 또는 페이스트로 직접 사용되거나, 또는 시트, 직물, 유공성 또는 무공성 물질과 연계하여 사용될 수 있다. 또한, 이는 다공성 메쉬와 연계하여 사용될 수 있다. 모든 조합되는 물질들은 바람직하게는 필요에 따라 일부 또는 완전 치유 후, 상처로부터 이를 제거하지 않아도 되도록 생체흡수될 수 있어야 한다.

Claims (15)

  1. 환자에게 투여가능한 조직 재생용 또는 손상 치료용의 조제물로서,
    상기 조제물은 혈청 및 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈을 포함하며,
    상기 조제물은 상기 혈청을 생리학적 pH에서 불용성인 상기 글로빈에 첨가함으로써 수득되는 것인, 조제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈청이 자가 (autologous) 혈청인, 조제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글로빈이 자가 글로빈인, 조제물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 혈청 및 상기 글로빈이 상기 환자의 동일 혈액 샘플로부터 수득되는, 조제물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 페이스트 (paste) 또는 젤 형태, 또는 분말, 과립, 드레싱 (dressing) 또는 필름 (film)과 같은 고형 물질 형태, 또는 형상화된 이식체 형태인, 조제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 페이스트 중량에 대한 글로빈 중량이 12% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 더 바람직하게는 18% 이상, 가장 바람직하게는 20% 이상인, 조제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 선택적으로
    조직 필링 (filling) 또는 확대 (augmentation) 물질, 예컨대 콜라겐, 젤라틴, 가교된 히알루론산, 합성 충진 폴리머, 세라믹 입자, 수산화 인회석, 뼈 입자 (bone particle);
    치유성 폴리머 물질, 예를 들어 산화된 셀룰로스와 같은, 상처용 제제 (wound agent);
    합성 또는 천연 폴리머 접착제들 중에서 선택되는 접착제;
    헤모글로빈, 바람직하게는 자가 헤모글로빈;
    기타 세포 성장 인자; 및/또는
    줄기 세포, 모세포 (blast), 예컨대 섬유모세포, 골모세포, 연골모세포, 또는 섬유세포, 골세포, 연골 세포, 지방 세포와 같은 세포를 비롯한, 세포
    와 같은 기타 성분을 포함하는, 조제물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 조제물을,
    주름 또는 피부 균열의 필링 (fillling)을 포함하는 조직 재생, 및/또는
    단독으로 또는 다른 확대 물질과의 조합 또는 혼합에 의한, 결함성 괄약근, 성대, 치주 조직을 비롯한 조직의 증대, 입술, 볼 또는 다른 신체 부위를 확대하기 위한 성형 수술 또는 미용 수술, 및/또는
    당뇨병 환자, 사지의 국소 혈관생성에 결함을 야기하는 동맥 또는 정맥 장애를 앓고 있는 환자 또는 흉터를 가진 환자를 비롯하여, 체내 외상, 장기의 일부, 피부 조직의 만성적인 손상 치료, 및/또는
    심부 화상 상처에서 괴사 조직 적출 후 육아 조직의 재생 보조를 위한
    치료학적 방법에 사용하기 위한 것인, 조제물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 조제물의 제조 방법으로서,
    - 항응고제를 사용하지 않고 전혈을 수득하는 단계;
    - 상기 전혈을 응고시키는 단계;
    - 형성된 혈청을 응고물로부터 분리하는 단계;
    - 상기 혈청을, 생리학적 pH에서 불용성인 글로빈이 들어 있는 조제물에 첨가하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    - 무균성 전혈을 항응고제 없이 응고시키는 단계;
    - 혈청을 제거하는 단계;
    - 선택적으로, 응고물을 생리 식염수로 세척하는 단계;
    - 멸균수를 첨가하여 교반 또는 균질화함으로써, 상기 응고물을 분해 (dissocation)하고, 헤모글로빈을 방출시키는 단계;
    - 예를 들어 한번의 원심분리에 의해서 헤모글로빈을 청징 (clarifying)하는 단계;
    - 바람직하게는 상기 헤모글로빈을, 바람직하게는 아질산 나트륨을 첨가하여, 메트헤모글로빈 (methemoglobin)으로 산화시키는 단계;
    - 상기 헤모글로빈으로부터, 바람직하게는 산성 pH에서, 아세톤 함유 물질에 의해 헴 (heme)을 추출하는 단계;
    - 석출된 글로빈을, 바람직하게는 여과 단계에 의해 액체로부터 분리하는 단계;
    - 산성 pH 하에 상기 석출된 글로빈을 멸균수에 용해하는 단계;
    - pH를 중성으로 조정하며, 글로빈을 석출시키는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 조직 재생 또는 손상 치료 방법으로서,
    환자에게, 제1항 또는 제8항 중 어느 한항에 따른 조제물을 유효량으로 재생할 조직 또는 치료할 손상부 상에 또는 그 내부로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 접힌 부분 (fold), 주름 또는 기타 피부 균열을 필링하거나 또는 손상을 치료하기 위한 방법.
  13. 단독으로 또는 다른 확대 물질과 조합 또는 혼합에 의해, 결함성 괄약근, 성대, 치주 조직들을 비롯한 조직의 증대 방법, 또는 입술, 볼 또는 다른 신체 부위를 확대하기 위한 성형 수술 또는 미용 수술 방법으로서,
    환자에게, 제1항 또는 제8항 중 어느 한항에 따른 조제물을 유효량으로 확대할 조직 상에 또는 그 내부로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 체내 외상, 장기의 일부 또는 피부 조직의 만성적인 손상을 치료하는 방법으로서,
    환자에게 제1항 또는 제8항 중 어느 한항에 따른 조제물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 심부 화상에서 괴사성 조직을 적출한 후 육아 조직의 재생을 보조하는 방법으로서,
    환자에게 제1항 또는 제8항 중 어느 한항에 따른 조제물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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