KR20150126594A - 돼지 파르보바이러스 5ａ, 이용 방법 및 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 특히, 사육 돼지를 감염시키는 신규한 돼지 파르보바이러스 5A(PPV5A)를 생성하고 사용하는 것과 관련된, 신규한 뉴클레오타이드 서열, 단백질 서열, 면역원성 조성물, 백신, 및 방법을 제공한다. 상기 신규한 바이러스에 의한 감염을 검출하고, 야생 및 사육 동물 및 무리에서 바이러스 서열의 유전적 변화를 모니터링하고, 바이러스에 의한 감염으로부터 동물을 보호하기 위한 신규한 백신을 제조 및 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

돼지 파르보바이러스 5Ａ, 이용 방법 및 백신{PORCINE PARVOVIRUS 5A, METHODS OF USE AND VACCINE}

서열 목록

본 출원은, 37 C.F.R. 1.821 - 1.825에 따른 서열 목록을 포함한다. 본 출원에 첨부된 서열 목록은 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 2013년 3월 21일에 생성된 상기 ASCII 카피는 10-0150-WO-1-SEQ.txt로 명명되고, 34,542 바이트 크기이다.

본 발명의 배경

A. 본 발명의 분야

본 발명은, 동물 건강 분야 내이고, 백신접종을 위한 약독화된 스트레인을 포함하는, 신규한 돼지 파르보바이러스 스트레인, 상기 신규한 파르보바이러스 스트레인으로부터 수득되는 백신의 제조 방법 및 상기 백신을 사용한 치료 방법에 관한 것이다.

B. 관련 분야의 설명

파르보바이러스는 다양한 동물 종을 감염시키며, 이들 중 일부는 중증의 임상 질환에 대해 책임이 있지만, 이들 바이러스 중 대다수는 단지 경미하거나 무증상(subclinical) 감염을 야기한다. 이들은 파르보비리대(Parvoviridae) 과(family)에 속하고, 2개의 아과(subfamily)를 형성한다: 덴소비리내(Densovirinae)(이의 구성원은 곤충을 감염시킨다) 및 파르보비리대(이의 구성원은 척추동물을 감염시킨다). 현재, 후자의 아과는 5개의 속(genera)을 포함한다: 데펜도바이러스(Dependovirus), 에리트로바이러스(Erythrovirus), 암도바이러스(Amdovirus), 보카바이러스(Bocavirus) 및 파르보바이러스(Parvovirus)(1).

파르보바이러스 비리온은 외피가 없고, 약 5 내지 6 킬로베이스(kb)의 단일-가닥의 선형 DNA 게놈을 함유한다. 게놈은, 비-구조적 및 캡시드 단백질을 암호화하는 2개의 주요 개방 판독 프레임(ORF: open reading frame)으로 이루어진다. 새로이 기술된 보카바이러스는 2개의 주요 ORF들 사이에 제3의 ORF를 갖는다(1).

파르보바이러스 속의 전형적인 돼지 파르보바이러스(PPV1) 스트레인은 세계적으로 널리 분포되어 있고, 돼지, 특히, 백신접종 프로토콜이 정확히 수행되지 못하거나 백신 효능이 면역억제 인자로 인하여 감소되는 무리에서 생식 장애에 책임이 있다. 지난 10년 동안, 많은 새로운 파르보바이러스가 돼지에서 검출되어 왔다. 이들은 돼지 파르보바이러스 2(PPV2)(2) 및 관련 바이러스(3)를 포함한다. 새로운 그룹의 돼지 및 소 파르보바이러스, 즉, 호코바이러스(PHoV, BHoV)가 홍콩에서 동정되었으며(4), 이들 바이러스는, 사람 PARV4 및 5와 유전적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 비록 이들은 처음에는 홍콩 이후에 호코바이러스라고 불리었으나, PPV3과 같은 PHoV에 대한 새로운 분류가 제안되었다(5). PPV4는 소 파르보바이러스 2에 대해 최고의 유사성을 보이지만, 암호화 능력 및 게놈 조직화는 보카바이러스의 것과 유사하고, 이는, PPV4가 보카바이러스와 같이 ORF1과 ORF2 사이에 위치되는 추가의 ORF3을 암호화하기 때문이다. 그러나, PPV4-암호화된 추정의 ORF3 단백질은 보카바이러스의 것과 상당히 다르다(5).

새로운 바이러스의 출현에 대해 돼지를 모니터링하고, 새로운 바이러스에 대한 백신, 치료제 및 검출 방법을 개발하는 것에 대한 지속적 요구가 존재한다.

본 발명의 요약

본 발명은, 특히, 사육 돼지를 감염시키는 신규한 파르보바이러스 스트레인을 제조하고 사용하는 것과 관련된, 신규한 뉴클레오타이드 서열, 단백질 서열, 면역원성 조성물, 백신, 및 방법을 제공한다. 이들 스트레인은 임상적으로 이환 상태인 사육 돼지로부터의 조직 샘플에서 확인된 신규한 돼지 파르보바이러스와 관련되며; 공지의 돼지 파르보바이러스 종 및 스트레인과의 서열 상동성에 기초하여, 신규한 바이러스는 돼지 파르보바이러스 5A 또는 PPV5A로 명명되었다.

상기 신규한 바이러스에 의한 감염을 검출하고, 야생 및 사육 동물 및 무리에서 바이러스 서열의 유전적 변화를 모니터링하고, 바이러스에 의한 감염으로부터 동물을 보호하기 위한 신규한 백신을 제조하고 사용하기 위한 본 발명의 조성물 및 방법이 제공된다.

본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은, 임의로 더욱 강력한 면역원성 반응을 유도하기 위한 항원 보강제(adjuvant)를 포함하는, 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다.

본 발명의 예시적 조성물은, PPV5A에 대해 특이적인 항체와 면역반응성인 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드 서열 또는 이의 단편 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 4, 특히, 서열번호 4의 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이들 폴리펩타이드 또는 이들의 단편은 PPV5A에 대해 특이적인 항체에 대해 면역반응성이다.

다른 양상에서, 본 발명은, 하나 이상의 폴리펩타이드, 항체 작제물, 또는 항체 접합체를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열은, 서열번호 1의 서열, 특히, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 2845-5547(캡시드 단백질), 또는 PPV5A에 대해 특이적인 항체에 대해 면역반응성인 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 1의 단편과 적어도 95%, 90%, 85% 또는 심지어 80% 상동성이고/이거나 동일한 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 핵산 서열은, PPV5A에 대해 특이적인 항체에 대해 면역반응성인 폴리펩타이드를 암호화하는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1975-2844, 및 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2845-5547, 및 이들의 단편의 서열 중 어느 하나를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열 또는 유전자는, PPV5A에 대해 특이적인 항체에 대해 면역반응성인 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 것이다.

또한, 본원에서 사용되는 본 발명의 폴리펩타이드는, 하기를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다:

i) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

ii) i)의 폴리펩타이드와 적어도 80% 상동성이고/이거나 동일한 폴리펩타이드;

iii) i) 및/또는 ii)의 폴리펩타이드의 단편;

iv) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열에 포함되는 적어도 5개, 바람직하게는 8개, 더욱 바람직하게는 10개, 더욱 더 바람직하게는 15개의 연속 아미노산을 포함하는 iii) 또는 iv)의 단편;

v) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1975-2844 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2845-5547의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드;

vi) vi)의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80% 상동성이거나 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드;

vii) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1975-2844 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2845-5547의 서열에 포함되는 적어도 15개, 바람직하게는 24개, 더욱 바람직하게는 30개, 더욱 더 바람직하게는 45개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질 단편.

본원에서 정의되는 적어도 하나 이상의 PPV5A 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은, 생리학적으로 허용가능한 비히클, 예를 들면, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 항원 보강제, 또는 이들의 배합물을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 임의의 PPV5A 폴리펩타이드 또는 본원에서 제공되는 이들 PPV5A 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 임의의 면역원성 조성물은, 가장 바람직하게는, PPV5A 감염에 대해 피험체를 예방하거나 치료하기 위한 의약으로서, 바람직하게는 백신 또는 면역원성 조성물로서 사용된다.

특히 바람직한 PPV5A 폴리펩타이드는, PPV5A에 대해 특이적인 면역학적 반응을 유도하는 면역원성 에피토프를 갖는 것들을 포함한다. 바람직한 PPV5A 폴리펩타이드는, 관련된 PPV1에서 표면 항원인 것으로 예측되는 아미노산 서열을 갖는 것들을 포함하고(Simpson et al. JMB 315, 2002), 서열번호 4의 잔기 141-156, 272-278, 및 329-339를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

당업자는, 본원에서 사용되는 조성물이 공지된 주사가능한 생리학적으로 허용가능한 멸균 용액을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉시 사용가능한(ready-to-use) 용액을 제조하기 위해, 수성의 등장성 용액, 예를 들면, 염수 또는 혈장 단백질 용액이 쉽게 입수가능하다. 또한, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은, 수의학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 등장화제(isotonic agent), 안정화제, 또는 항원 보강제를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은, 피험체에게 본원에서 정의되는 하나 이상의 PPV5A 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 PPV5A 감염에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 면역 반응은 PPV5A의 하나 초과의 혈청형 또는 스트레인에 대해 유발된다. 본 발명의 조성물은, PPV5A 감염을 치료하거나 대안으로 예방하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 면역 반응은, 하나 이상의 PPV5A 혈청형과 관련되거나 하나 이상의 PPV5A 혈청형으로의 감염에 의해 야기되는 하나 이상의 임상학적 징후의 발생정도(incidence) 또는 중증도를 감소시킨다.

본원에서, 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 적합한 피험체 및 조성물의 투여를 필요로 하는 피험체로는, 바이러스, 미생물, 기생충, 원생동물, 세균 또는 진균 연관 감염, 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물이 포함된다. 본 발명의 조성물 또는 방법의 사용에 의해 면역 반응이 자극되는 동물로는 가축, 예를 들면, 돼지, 소, 가금(예: 닭, 오리, 거위 또는 칠면조), 염소 및 양, 및 사육 동물, 예를 들면, 마우스, 토끼, 개, 고양이 및 말이 포함된다. 바람직한 동물로는 돼지, 쥐, 말, 토끼 및 소가 포함된다. 가장 바람직하게는, 면역 반응은 돼지에서 자극된다.

또한, 본 발명은, PPV5A 감염의 임상 징후의 발생정도 및 증증도가 본원에서 제공되는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 피험체에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 적어도 100% 감소되도록, 본원에서 제공되는 하나 이상의 PPV5A 펩타이드 및 바람직하게는 담체 분자를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, PPV5A 감염과 연관되거나 이에 의해 야기되는 하나 이상의 임상 징후의 발생정도 또는 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 임상 징후는 PPV5A 단독으로의 감염으로부터의 결과로서 바이러스혈증 및 면역억제를 포함한다. 이러한 임상 징후는 신경학적 징후 (우울, 운동실조, 무기력), 설사, 호흡곤란, 건강 상태의 상실, 관절 부종(파행(lameness) 및 횡와(recumbency) 초래), 감소된 평균 1일 체중 증가, 사망률, 및 다른 유기체, 예를 들면, 마이코플라스마 하이오리니스(Mycoplasma hyorhinis)와의 공동-감염의 결과로서의 다발장막염을 포함할 수 있다.

추가의 양상에서 따르면, 본 발명은, 또한, 본원에서 제공되는 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 서열번호 1, 2, 3 및/또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 100% 서열 동일성을 갖거나, 서열번호 1, 2, 3 및/또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나, 서열번호 1, 2, 3 및/또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나, 또는 서열번호 1, 2, 3 및/또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 PPV5A에 의해 야기될 수 있는 PPV5A 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 또한, 바람직하게는, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드 및 담체 분자가 서로 공유결합적으로 커플링되거나 접합되도록, 본원에서 제공되는 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 담체 분자와 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 본원에서 제공되는 임의의 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 이러한 접합체는 다가 또는 일가일 수 있다. 다가 조성물 또는 백신은 다중 PPV5A 펩타이드와 담체 분자의 면역-접합을 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은, 숙주 세포, 바람직하게는 원핵새물 세포, 예를 들면, 이. 콜라이를, 본원에서 제공되는 임의의 PPV5A 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자로 형질전환하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 대안으로, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들면, 동물 세포, 곤충 세포, 원생생물 세포, 식물 세포, 또는 진균 세포일 수 있다. 바람직하게는, 진핵생물 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, CHO, BHK 또는 COS, 또는 진균 세포, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애, 또는 곤충 세포, 예를 들면, Sf9이다. 본 발명의 핵산의 배큘로바이러스 발현도 바람직하다.

본 발명의 다른 양상은, PPV5A의 하나 이상의 유전적 변이체 및 더욱 바람직하게는 PPV5A의 2개 이상의 유전적 변이체에 대해 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 생성하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 본원에 개시되는 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 암호화하고 발현하는 형질전환된 발현 벡터를 배양하는 단계를 포함한다. 발현된 단백질은 발현 유기체에 의해 보유되거나 배양 배지로 분비된다. 발현은, PPV5A에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 PPV5A 펩타이드를 생성하기에 충분한 조건 하에 수행된다. PPV5A 펩타이드가 면역 반응을 유도하는 PPV5A 혈청형은, 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 또는 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물을 제조하는 방법은, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드 및 담체 분자의 접합체를 생리학적으로 허용가능한 비히클, 예를 들면, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 항원 보강제 또는 이들의 배합물과 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 당업자는, 비히클, 항원 보강제 또는 이의 배합물의 선택이 특히 전달 경로, 개인적 선호도, 및 동물 종에 의해 결정될 것임을 인지할 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은, 피험체에서 PPV5A 감염을 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 제공하는 단계; 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 피험체로부터 수득된 샘플과 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 PPV5A 펩타이드와 결합할 수 있는 항체가 샘플에서 검출되는 경우 피험체가 PPV5A 감염을 갖는 것으로 동정되는 단계를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은, 피험체가 PPV5A 감염에 이전에 노출되었고, PPV5A에 대한 면역 반응을 발현할 수 있음을 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 제공하는 단계; 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 피험체로부터 수득된 샘플과 접촉시키는 단계; 하나 이상의 PPV5A 펩타이드에 결합할 수 있는 항체가 샘플 중에서 검출되는 경우 피험체가 PPV5A 감염을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 바람직하게는 담체 분자와 함께 포함하는 면역원성 조성물; 면역원성 조성물을 포장하기 위한 컨테이너; 인쇄된 지침서 세트; 및 동물에게 면역원성 조성물을 투여할 수 있는 디스펜서를 포함하는 키트를 제공한다. 임의로, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드 및 담체 분자는 접합체로서 또는 개별 화합물로서 포장될 수 있다. 별도로 공급되는 경우, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드 및 담체 분자를 접합시키는 수단 및 적합한 인쇄된 지침서도 공급된다.

또한, 본 발명은 인쇄된 지침서 세트; 동물에게 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를 포함하는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물을 투여할 수 있는 디스펜서를 포함하는, 동물을 백신접종하기 위한 키트를 제공하고, 여기서, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드는 PPV5A 감염과 연관된 하나 이상의 질환에 대해 동물을 효과적으로 면역화시킨다. 바람직하게는, 하나 이상의 PPV5A 펩타이드는 본원에서 제공되는 것들로부터 선택된다. 본 발명의 키트는, 수의학적으로 허용가능한 담체, 항원 보강제, 또는 이의 배합물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트 내의 디스펜서는 이의 내용물을 소적(droplet)으로 분배할 수 있고; 키트에 포함되는 본원에서 제공되는 PPV5A 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물은, 동물에게 비내, 경구, 진피내 또는 근육내 투여되는 경우, PPV5A 감염에 대한 하나 이상의 임상 징후의 중등도를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 임상 징후의 중증도는, 비처리된 감염된 동물과 비교하여 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 적어도 100% 감소된다.

또한, PPV5A에 의해 야기되는 감염의 치료 또는 예방 방법이 기재된다. 이 방법은, 피험체에게 본 발명의 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 치료 또는 예방은, PPV5A 감염의 징후 감소, PPV5A 감염의 임상 징후의 중증도 또는 발생정도 감소, PPV5A 감염으로부터의 피험체 사망률 감소, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물은 수의학적으로 허용가능한 담체, 항원 보강제, 또는 이들의 배합물을 추가로 포함한다. 이러한 조성물은 백신으로 사용될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 약독화된 백신, 불활성화된 백신, 또는 이들의 배합물을 포함한다. 이러한 백신은 돼지 파르보바이러스 1, 2, 3, 4, 5A, 5B, 다른 돼지 파르보바이러스 종, 다른 돼지 병원성 바이러스 및 세균, 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 바이러스와 연관된 하나 이상의 질환에 대해 보호성 면역학적 반응을 유발한다. PPV5A에 대한 백신과 병용하여 공동-투여될 수 있는 다른 유형의 백신으로는, 돼지 시르코바이러스 유형 2(예를 들면, Ingelvac® CircoFLEX, Ingelvac® CircoFLEX-MycoFLEX), 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스(예를 들면, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRRSV MLV), 돼지 파르보바이러스(예를 들면, ReproCyc® PRRSV-PLE), 마이코플라스마(예를 들면, Ingelvac® MycoFLEX) 등이 포함되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

당업자는, 본원에서 사용되는 조성물은 공지되어 있는 주사가능하고 생리학적으로 허용가능한 멸균 용액을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉시 사용가능한 용액을 제조하기 위해, 수성의 등장성 용액, 예를 들면, 염수 또는 혈장 단백질 용액이 쉽게 이용가능하다. 또한, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 등장화제, 안정화제, 또는 항원 보강제를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은, 또한, 본 발명의 조성물을 수의학적으로 허용가능한 담체, 항원 보강제, 또는 이들의 배합물과 함께 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 당업자는, 담체, 항원 보강제, 또는 이들의 배합물의 선택이 특히 전달 경로, 개인 선호도, 및 동물 종에 의해 결정될 것임을 인식할 것이다.

또한, 본 발명은 동물에게 조성물을 투여함으로써 동물에서 진행중인 PPV5A 감염의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 조성물은, 약독화된 바이러스 배양물 또는 하나 이상의 PPV5A 펩타이드를, 허용가능한 수의학적 담체와 함께 포함할 수 있다.

바람직한 투여 경로로는 비내, 경구(예를 들면, 음료수 중), 진피내, 및 근육내가 포함된다. 근육내 투여가 바람직하고, 단일 용량으로의 근육내 투여가 가장 바람직하다. 당업자는, 본 발명의 조성물이 2개 이상의 용량으로, 그리고, 다른 투여 경로로 투여될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 이러한 다른 경로로는 피하, 피부내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 경막내, 기관내, 피부내, 심장내, 엽내(intralobally), 척수내, 폐내 또는 질내가 포함된다. 목적하는 치료 지속기간 및 치료 효율에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 1회 또는 수회, 또한, 간헐적으로, 예를 들면, 수일, 수주 또는 수개월 동안 1일 단위로 그리고 상이한 용량으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 인쇄된 지침서 세트; 동물에게 백신을 투여할 수 있는 디스펜서; 및 PPV5A, 다른 파르보바이러스 스트레인, 다른 병원체, 및/또는 이들의 배합물과 연관된 하나 이상의 질환에 대해 동물을 효과적으로 면역화시키는, 세균, 진균, 곤충 또는 포유동물 세포 배양물을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 세포 배양물로부터의 하나 이상의 단리물을 포함하는, 동물을 백신접종하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 수의학적으로 허용가능한 담체, 항원 보강제, 또는 이들의 배합물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트 내의 디스펜서는 이의 내용물을 소적으로 분배할 수 있으며, 키트 내에 포함되는 단리물은, 동물에게 비내, 경구, 진피내, 또는 근육내로 투여되는 경우에 PPV5A 감염의 하나 이상의 임상 징후의 중등도를 감소시킬 수 있다. 일부 키트에서, 단리물은, 또한, PPV5A 감염의 하나 이상의 임상 징후의 중증도를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 임상 징후의 중증도는, 비치료된 감염된 동물에 비해 적어도 10% 감소된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은, 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내지만, 본 발명의 취지 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형이 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 단지 설명을 위해 제공됨이 이해되어야만 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 소정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은, 본원에 제시되는 구체적 실시형태들에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더욱 잘 이해될 수 있다. 본원은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬라 도면(들)을 갖는 본 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 수수료 납부시 기관(Office)에 의해 제공될 것이다.
도 1은 PPV5A의 핵산 서열(서열번호 1)을 도시한다.
도 2는 PPV5A 레플리카제의 단백질 서열(서열번호 2)을 도시한다.
도 3은 PPV5A 개방 판독 프레임(ORF) 단백질의 단백질 서열(서열번호 3)을 도시한다.
도 4는 PPV5A 캡시드 단백질의 단백질 서열(서열번호 4)을 도시한다.
도 5는 PPV5A 캡시드 단백질의 단백질 서열과 다수의 다른 바이러스 서열의 쌍-방식(pair-wise) 아미노산 동일성 비교를 도시한다. 바이러스 서열에 대한 참조가 표 1에 열거된다:
[표 1]

도 6은, 표 1에 열거된 다른 바이러스 VP1 및 캡시드 단백질과 비교한 PPV5A의 VP1/CAP 영역의 계통발생 분석을 도시한다.
도 7은, 40%(310/774)의 서열 동일성을 나타내는, PPV4[GenBank 수탁 # AFM73871(서열번호 5)]의 가장 밀접하게 관련된 단백질에 대한 PPV5A 캡시드 단백질(서열번호 4의 잔기 55-792)의 동일성을 도시한다.
도 8은, 58%(292/504)의 서열 동일성을 나타내는, PPV4[GenBank 수탁 # ADB20210(서열번호 11)]의 가장 밀접하게 관련된 단백질에 대한 PPV5A 레플리카제 단백질(서열번호 2의 잔기 15-516)의 동일성을 도시한다.

본 발명은, 본원에 개시된 신규한 돼지 파르보바이러스 5A 및 이의 변이체와 관련된, 핵산 및 이의 단편, 폴리펩타이드 및 이의 면역학적으로 유효한 단편, 백신, 면역학적으로 유효한 제제, 항체, 진단 검정 및 키트, 및 상기 조성물 및 제제를 제조 및 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당해 기술 내인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 단백질 화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전하게 설명된다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); 및 Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications]을 참조한다.

본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 특정 DNA, 폴리펩타이드 서열 또는 공정 파라미터에 제한되지 않으며 이러한 것들은 당연히 변화될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 이용되는 용어는 단지 본 발명의 특정 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이지 이를 제한하도록 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태 "한", "하나" 및 "상기"는, 내용이 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것에 주의해야만 한다. 따라서, 예를 들면, "항원"에 대한 참조는 2개 이상의 항원의 혼합물을 포함하고, "부형제"에 대한 참조는 2개 이상의 부형제의 혼합물을 포함한다.

A. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는, 출원시 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어의 의미 및 범위는 분명해야만 하지만; 임의의 잠재적 모호성을 갖는 경우, 본원에서 제공되는 정의는, 임의의 사전적 또는 외적 정의에 우선한다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본원에서 "또는"의 사용은, 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 용어의 사용은 제한적이지 않다. 본원에 인용되는 모든 특허 및 공개는 본원에 인용에 의해 포함된다.

"질환에 대한 보호", "방어 면역", "기능적 면역" 및 유사한 어구는, 질환 또는 감염에 노출된 비-면역화된 피험체에서 예상되는 유해 영향보다 적은 유해 영향을 초래하는, 본 발명의 하나 이상의 치료학적 조성물, 또는 이의 배합물의 투여로 생성되는 질환 또는 병태에 대한 반응을 의미한다. 즉, 감염의 유해 영향의 중증도가, 백신접종된 피험체에서 경감된다. 감염은 백신접종된 피험체에서 감소되거나, 느려지거나, 가능하게는 완전히 예방될 수 있다. 본원에서, 완전한 감염 예방이 의미되는 경우, 이는 구체적으로 언급된다. 완전한 예방이 언급되지 않는 경우, 이 용어는 부분적 예방을 포함한다.

본원에서 "임상 징후의 발생정도 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상 증상의 감소"는, 그룹 중 감염된 피험체 수의 감소, 감염의 임상 징후를 나타내는 피험체 수의 감소 또는 제거, 또는 야생형 감염과 비교하여 하나 이상의 피험체에 존재하는 임의의 임상 징후의 중증도의 감소를 의미하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 병원체 부하, 병원체 쉐딩 (shedding)의 감소, 병원체 전파의 감소, 또는 PPV5A로의 감염의 증상을 나타내는 임의의 임상 징후의 감소를 말한다. 바람직하게는, 이들 임상 징후는, 조성물을 투여받지 않고 감염된 피험체와 비교하여, 본 발명의 치료학적 조성물을 투여받은 하나 이상의 피험체에서 적어도 10% 감소된다. 더욱 바람직하게는, 임상 징후는 본 발명의 조성물을 투여받은 피험체에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 50% 감소된다.

본원에서 용어 "증가된 보호"는, 비-백신접종된 대조군 그룹의 피험체에 비해 백신접종된 그룹의 피험체에서 감염성 작용제(agent), 바람직하게는 PPV5A에 의한 감염과 연관된 하나 이상의 임상 증상의 유의한 감소를 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "임상 증상의 유의한 감소"는, 백신접종된 그룹의 피험체에서 하나 이상의 임상 증상의 발생정도의 빈도가 감염성 작용제를 챌린지한 후 비-백신접종된 대조군에서보다 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 더욱 바람직하게는 30%, 더욱 더 바람직하게는 50%, 및 더욱 더 바람직하게는 70% 낮다는 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

"장기-지속적 보호"는, 적어도 3주, 더욱 바람직하게는 적어도 3개월, 더욱 더 바람직하게는 적어도 6개월 동안 지속되는 "개선된 효능"을 말한다. 가축의 경우, 장기 지속적 보호는, 동물이 고기를 위해 시판되는 평균 연령까지 지속적인 것이 가장 바람직하다.

"면역원성 또는 면역학적 조성물"은, 조성물에 대해 세포 또는 항체-매개된 면역 반응을 갖는 숙주에서 면역학적 반응을 유발하는 하나 이상의 PPV5A 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 물질의 구성물(composition of matter)을 말한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하고, 더욱 바람직하게는 PPV5A 감염의 임상 징후 중 하나 이상에 대해 보호 면역을 부여한다.

본원에서 사용되는 "면역원성" PPV5A 폴리펩타이드 또는 "항원"은, 본원에서 기술되는 면역학적 반응을 유발하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 말한다. "면역원성" PPV5A 단백질 또는 폴리펩타이드는, 본원에서 동정되는 임의의 암호화 서열의 전장 서열 또는 이의 유사체 또는 면역원성 단편을 포함한다. 용어 "면역원성 단편" 또는 "면역원성 부분"은, 하나 이상의 에피토프를 포함하고, 따라서, 본원에서 기술되는 면역학적 반응을 유발하는 PPV5A 단백질의 아미노산 서열의 단편 또는 절두되고/되거나 치환된 형태를 말한다. 일반적으로, 이러한 절두되고/되거나 치환된 형태, 또는 단편은, 전장 단백질, 예를 들면, 캡시드 단백질로부터 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하거나 암호화할 것이다. 더욱 바람직하게는, 절두되거나 치환된 형태, 또는 단편은 전장 단백질, 예를 들면, 캡시드 단백질로부터 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 적어도 15개, 더욱 더 바람직하게는 적어도 19개, 더욱 더 바람직하게는 30개의 연속 아미노산을 가질 것이다.

용어 "에피토프"는, 면역계, 특히, 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 물질의 구성물, 예를 들면, 단백질 또는 폴리펩타이드의 절편 또는 단편을 의미한다. 본 발명에서, 에피토프는 바이러스 단백질의 폴리펩타이드 서열의 단편 또는 단편들이다.

이러한 단편은, 당해 분야에 익히 알려져 있는 많은 에피토프 맵핑 기술을 이용하여 동정될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들면, 선형 에피토프는, 고체 지지체 상에서 단백질 분자의 부분에 상응하는 많은 펩타이드를 동시에 합성하고, 펩타이드가 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안에 펩타이드를 항체와 반응시킴으로써 측정될 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 공지되어 있고 기술되어 있으며, 예를 들면, 문헌[U.S. 특허 제4,708,871호; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; 및 Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]을 참조한다. 유사하게, 입체배좌 에피토프는, 예를 들면, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 입체배좌 구조를 측정함으로써 용이하게 동정된다. 문헌(Epitope Mapping Protocols, 상기 참조)을 참조한다. 합성 항원, 예를 들면, 폴리에피토프, 플랭킹(flanking) 에피토프 및 기타 재조합 또는 합성적으로 유도되는 항원도 상기 정의 내에 포함된다. 예를 들면, 문헌[Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; 및 Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998]을 참조한다. (이의 교시 및 내용은 모두 본원에 인용에 의해 포함된다).

"면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은, 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 전개를 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 통상적으로, 면역 또는 면역학적 반응은, 하기 효과들 중 하나 이상을 포함한다: 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 지시되는, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증진되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소되도록 치료학적 또는 보호성 면역학적 (기억) 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 증상의 수, 증상 중증도의 감소, 또는 병원체 감염과 연관된 증상 중 하나 이상의 결여, 바이러스혈증 개시의 지연, 감소된 바이러스 존속, 전체 바이러스 부하의 감소 및/또는 바이러스 배출의 감소에 의해 입증될 것이다 .

본원에서, "특이적으로 면역반응하는"은, PPV5A의 감염을 특징으로 하는 항원은 인식하지만 엄격한 챌린지 대조군을 특징으로 하는 항원과는 반응하지 않는, 면역반응성 단백질 또는 폴리펩타이드를 말한다. 잠재적 PPV5A 면역반응성 단백질 또는 다른 폴리펩타이드의 특이성을 측정하기 위해, 다양한 면역검정법(ELISA, IFA, 웨스턴 블롯)이, 유전적으로 유사한 바이러스를 함유하는 동물 혈청에 대해 단백질을 시험하는데 이용된다. 또한, 이 단백질은, 발현 방법(배큘로바이러스, Sf9 세포 등)과 관련된 단백질을 함유하는 물질에 대한 다양한 면역검정법으로 시험된다.

본원에서 사용되는 "약제학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체" 또는 "부형제"로는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항원 보강제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 및 흡착 지연제 등이 포함된다. 일부 바람직한 실시형태에서, 그리고, 특히 동결건조된 면역원성 조성물을 포함하는 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 안정화제는 동결건조 또는 냉동-건조를 위한 안정화제를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 항원 보강제를 함유한다. 본원에서 사용되는 "항원 보강제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예를 들면, Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유-중-수 에멀젼, 수-중-유 에멀젼, 수-중-유-중-수 에멀젼을 포함할 수 있다. 에멀젼은, 특히, 경성(light) 액상 파라핀 오일(유럽 약전 타입); 이소프레노이드 오일, 예를 들면, 스쿠알란 또는 스쿠알렌; 알켄, 특히, 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 생성되는 오일; 선형 알킬 그룹, 보다 구체적으로는 식물성 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트를 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르; 분지된 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히, 이소스테아르산 에스테르에 기초할 수 있다. 오일을 유화제와 병용하여 에멀젼을 형성한다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히, 소르비탄의 에스테르, 만나이드의 에스테르(예를 들면, 안하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르, 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르(이는 임의로 에톡실화된다), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히, Pluronic 제품, 특히, L121이다. 문헌[Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) 및 Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다. 예시적 항원 보강제는 문헌("Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995)의 제147면에 기술된 SPT 에멀젼 및 동일 문헌의 제183면에 기술된 에멀젼 MF59이다.

항원 보강제의 추가의 예는, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이다. 유리한 항원 보강제 화합물은, 가교된, 특히, 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 용어 카보머로 알려져 있다(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). 또한, 당업자는, 적어도 3개의 하이드록실의 수소 원자가, 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 불포화된 지방족 라디칼로 대체되는, 적어도 3개의 하이드록실 그룹, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실 그룹을 갖는 폴리하이드록실화된 화합물과 가교된 이러한 아크릴 중합체를 기술하는, U.S. 특허 제2,909,462호를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 라디칼, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화된 그룹이다. 불포화된 라디칼은, 그 자체가 다른 치환체, 예를 들면, 메틸을 함유할 수 있다. 상품명 Carbopol ; (BF Goodrich, Ohio, USA)로 시판되는 제품이 특히 적절하다. 이들은 알릴 슈크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교된다. 이들 중에서 Carbopol 974P, 934P 및 971P을 언급할 수 있다. Carbopol 971P의 사용이 가장 바람직하다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에는 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA(Monsanto)가 있다. 이들 중합체의 수중 용해는, 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체가 포함될 항원 보강제 용액을 제공하기 위해 중화될, 바람직하게는 생리학적 pH로 중화될 산성 용액을 유도한다.

추가의 적합한 항원 보강제로는, 특히, RIBI 항원 보강제 시스템(Ribi Inc.), 블록 공중합체(CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 항원 보강제, 이. 콜라이로부터의 열-불안정 장독소(재조합 등), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 무라밀 디펩타이드, 또는 천연 발생 또는 재조합 사이토킨 또는 이의 유사체 또는 내인성 사이토킨 방출 자극제가 포함되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

항원 보강제는 약 100μg 내지 약 10mg/용량의 양, 바람직하게는 약 500μg 내지 약 5mg/용량의 양, 더욱 바람직하게는 약 750μg 내지 약 2.5mg/용량의 양, 가장 바람직하게는 약 1mg/용량의 양으로 첨가될 수 있는 것으로 예상된다. 대안으로, 항원 보강제는 최종 생성물의 용적에 의해 약 0.01 내지 50%의 농도, 바람직하게는 약 2% 내지 30%의 농도, 더욱 바람직하게는 약 5% 내지 25%의 농도, 더욱 더 바람직하게는 약 7% 내지 22%의 농도, 가장 바람직하게는 10% 내지 20%의 농도로 존재할 수 있다.

"희석제"는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 및 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는, 특히, 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는, 특히, 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리염을 포함한다.

"단리된"은 자연 상태로부터 "사람의 손에 의해" 변경되는 것을 의미하고, 즉, 자연에서 발생하는 경우 이의 최초 환경으로부터 변화 또는 제거 또는 변화 및 제거되는 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "단리되지" 않지만, 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는, 상기 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이 "단리된다".

"안전성"은, 백신접종 후 백신접종된 동물에서의 불리한 결과의 부재를 말하고, 살아있는 바이러스-기반 백신의 병독성 백신으로의 잠재적 전환, 임상적으로 유의한 부작용, 예를 들면, 지속적이고 전신적인 질병 또는 백신 투여 부위에서의 허용되지 않는 염증을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "백신접종" 또는 "백신접종하는" 또는 이의 변형은, 동물에게 투여되는 경우 PPV5A에 대해 동물에서 면역 반응을 - 직접적으로 또는 간접적으로 - 유발하거나 유발할 수 있는, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여를 포함하는 프로세스를 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명과 관련하여 "사망률"은, PPV5A 감염 및/또는 PPV5A 감염에 의해 강력해지는 다른 유기체와의 공동-감염에 의해 야기되는 사망을 말하고, 감염이 너무 심해서 고통을 겪는 것을 막고 인도적인 종말을 제공하도록 동물이 안락사되는 상황을 포함한다.

"약독화"는 병원체의 병독성 감소를 의미한다. 본 발명에서 "약독화"는 "비병원성"과 동의어이다. 본 발명에서, 약독화된 바이러스는, PPV5A 감염의 임상 징후를 야기시키지는 않지만 표적 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있도록 병독성이 감소된 것이며, 또한, 비-약독화된 PPV5A로 감염되고 약독화된 바이러스를 투여받지 않은 동물의 "대조군 그룹"과 비교하여 약독화된 PPV5A로 감염된 동물에서 임상 징후가 발생정도 또는 중증도 면에서 감소되는 것을 의미한다. 이러한 맥락에서, 용어 "감소/감소된"은 상기 정의된 대조군 그룹과 비교하여 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 더욱 더 바람직하게는 50%, 더욱 더 바람직하게는 60%, 더욱 더 바람직하게는 70%, 더욱 더 바람직하게는 80%, 더욱 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 감소를 의미한다. 따라서, 약독화된 비병원성 PPV5A 스트레인은, 변형된 살아있는 PPV5A 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물로 포함시키기에 적합한 것이다.

"사멸된" 또는 "불활성화된"은, PPV5A 바이러스를 죽게하고/하거나 그러지 않으면 증식할 수 없게 하는 물리적 또는 화학적 작용제로 처리되는 것을 의미한다. PPV5A는 통상의 수단, 예를 들면, 열, 방사선 또는 자외선 존재 하에서의 프소랄렌에 의해 사멸될 수 있다. PPV5A는 종래의 수단에 의해, 예를 들면, 이로 제한됨이 없이, 이원성 에틸렌이민(BEI), 베타-프로피오락톤, 포르말린, 글루테르알데하이드 및/또는 나트륨 도데실 설페이트를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 하나 이상의 화학적 불활성화제를 이용한 화학적 불활성화를 통해 불활성화될 수 있다. 이들 바이러스의 병독성 스트레인을 약독화시키는 방법 및 불활성화된 바이러스 제제를 제조하는 방법은 당해 분야에 알려져 있으며, 예를 들면, U.S. 4,567,042 및 4,567,043에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 PPV5A로부터의 항원은, 특히 변형되고/되거나 약독화된 살아있는 바이러스 제제 또는 사멸되거나 불활성화된 바이러스 제제인 전체 바이러스의 형태로 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 "항체"는, 본 발명의 PPV5A 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 CDR 서열을 포함하는 화합물을 포함하는, 항-PPV5A 항체, 예를 들면, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 사람화된, 사람, 돼지 및 CDR-절편이식된 항체를 포함한다. 용어 "에 대해 특이적인"은, 본 발명의 항체의 가변 영역이 배타적으로 PPV5A 폴리펩타이드를 인식하고 결합한다는 것(즉, 폴리펩타이드 과에서 발견되는 서열 동일성, 상동성 및 유사성에도 불구하고 관련된 폴리펩타이드로부터 하나의 PPV5A 폴리펩타이드를 구별할 수 있다는 것)을 의미하고, (임의로) 항체의 가변 영역 밖의 서열, 그리고, 특히, 항체 분자의 불변 영역에 있는 서열과의 상호작용을 통해 다른 단백질(예를 들면, 에스. 아우레우스 단백질 A 또는 ELISA 기술에서의 다른 항체)와 상호작용하는 것이 허용된다. 본 발명의 항체의 결합 특이성을 측정하기 위한 스크리닝 검정법은 당해 분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 실시된다. 이러한 검정법에 대한 종합적인 논의를 위해, 문헌[Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6]을 참조한다. 항체가, 본 발명의 PPV5A 폴리펩타이드로부터 단편이 유도된 상기 PPV5A 폴리펩타이드에 대해 우선적으로 특이적인 한, 본 발명의 PPV5A 폴리펩타이드의 단편을 인식하고 결합하는 항체도 고려된다. 명확성의 목적을 위해서, "항체"는, 항원에 대한 면역 반응의 결과로서 특정 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 말한다. 면역글로불린은, "불변" 및 "가변" 영역을 갖는 "경쇄" 및 "중쇄" 폴리펩타이드 쇄로 구성된 혈청 단백질이며, 불변 영역의 조성에 기초하여, 클래스(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 분류된다. 항체는, 예를 들면, Fv, Fab', F(ab')2 및 단일 쇄를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 하나 이상의 항체 단일 쇄 폴리펩타이드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 합성 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에서 "유효 용량"은, 항원이 투여되는 동물에서 임상 증상의 감소를 수득하는 면역 반응을 유발하거나 유발할 수 있는 항원의 양을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "유효량"은, 조성물과 관련하여 동물에서 감염의 중증도 또는 질환의 발생정도를 감소시키거나 완화시키는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 양을 의미한다. 특히, 용량당 플라크 형성 단위(PFU)의 수 또는 동등가의 측정값으로 측정되는 약독화된 살아있는 바이러스 제제의 유효량은, 중간 조직 배양 감염 용량(TCID50), 즉, 접종된 민감한 세포 배양물의 50%에서 병리학적 변화를 생성시킬 병원성 작용제의 양에 의해 모니터링된다. 사멸된 백신 또는 항원성 아단위에 대해, 유효량은, 상대적인 항원 함량(RAC), 즉, 유효 용량당 항원의 포함 수준을 말한다. 대안으로, 치료요법과 관련하여, 용어 "유효량"은 질환 또는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 지속기간을 감소시키거나 개선시키거나, 질환 또는 장애 진행을 예방하거나, 질환 또는 장애의 퇴행을 유발하거나, 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 재발, 전개, 발병 또는 진행을 예방하거나, 또는 다른 치료요법 또는 치료학적 제제의 예방 또는 치료를 증진시키거나 개선시키기에 충분한 치료요법의 양을 말한다.

당해 분야에 알려진 바와 같이 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉 참조 서열과 참조 서열과 비교되는 소정의 서열 사이의 상호작용을 지칭한다. 서열 동일성은 소정의 서열 및 참조 서열을 최고의 서열 유사성이 나타내도록 최적으로 정렬한 후 소정의 서열을 참조 서열과 비교함으로써 측정되며, 필요한 경우 갭을 도입하면서 이러한 서열들의 스트링 사이에서의 매칭으로 측정된다. 이러한 정렬 시, 서열 동일성은 위치-대-위치 기준으로 확인되며, 예를 들면, 서열은 특정 위치에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우 그 위치에서 "동일"하다. 이어서, 이러한 위치 동일성의 총 수를 참조 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 잔기의 총수로 나누어 서열 동일성 %를 수득한다. 서열 동일성은, 이로 제한됨이 없이, 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), 이의 교시가 참조로 본원에 포함됨]에 기재된 방법을 포함한 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 서열 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이에 가장 큰 매칭을 갖도록 고안된다. 서열 동일성을 측정하는 방법은 소정의 서열들 사이의 서열 동일성을 측정하는 공개된 컴퓨터 프로그램에서 체계적으로 정리된다. 이러한 프로그램의 예는, 이로 제한됨이 없이, GCG 프로그램 패키지 [Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)], BLASTP, BLASTN 및 BLASTX [Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)]를 포함한다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원 [BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이의 교시가 참조로 본원에 포함됨]으로부터 공개적으로 이용가능하다. 이들 프로그램은 소정의 서열과 참조 서열 사이의 최고 수준의 서열 동일성을 나타내도록 디폴트 갭 웨이트를 사용하여 서열들을 최적으로 정렬한다. 예를 들면, 참조 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도, 예를 들면, 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95% "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드는, 소정의 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 뉴클레오타이드 서열의 100개 뉴클레오타이드 당 15 포인트 이하, 바람직하게는 10 포인트 이하, 더욱 더 바람직하게는 5 포인트 이하의 돌연변이를 가질 수 있는 것을 제외하고는, 소정의 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 달리, 참조 뉴클레오타이드 서열에 비해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에서, 참조 서열의 뉴클레오타이드의 15%, 바람직하게는 10%, 더욱 더 바람직하게는 5% 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 참조 서열의 총 뉴클레오타이드의 15%, 바람직하게는 10%, 더욱 더 바람직하게는 5% 이하의 뉴클레오타이드의 수가 참조 서열로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 참조 서열 내 뉴클레오타이드 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속 그룹 내에 점재된 이들 말단 위치 사이의 어디에서도 일어날 수 있다. 유사하게, 참조 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들면, 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95% 서열 상동성을 갖는 소정의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는, 소정의 폴리펩타이드 서열이 참조 아미노산 서열의 100개 아미노산 당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 더욱 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변형을 가질 수 있는 것을 제외하고는, 폴리펩타이드의 소정의 아미노산 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 달리, 참조 아미노산 서열에 비해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 소정의 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해, 참조 서열의 아미노산 잔기의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 더 바람직하게는 5% 이하가 결실되거나 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 참조 서열의 아미노산 잔기의 총수의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 잔기의 수가 참조 서열로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 변형은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치 또는 참조 서열 내 잔기 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속 그룹 내에 점재된 이들 말단 위치 사이의 어디에서도 일어날 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 그러나, 보존적 치환은 서열 동일성을 결정할 때는 매칭에 포함되지 않는다.

본원에서 사용되는 "서열 상동성"은 2개의 서열의 관계를 측정하는 방법을 지칭한다. 서열 상동성을 측정하기 위해서, 2개 이상의 서열이 최적으로 정렬되며, 필요한 경우 갭이 도입된다. 그러나, "서열 동일성"과는 대조적으로, 보존적 아미노산 치환은 서열 상동성을 측정할 때 매칭으로 계수된다. 달리, 참조 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해서, 참조 서열 내의 아미노산 잔기의 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95%는 또 다른 아미노산을 갖는 보존적 치환과 매칭되거나 이를 포함해야 하거나, 참조 서열 내의 총 아미노산 잔기 (보존적 치환을 포함하지 않음)의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 더 바람직하게는 5% 이하가 참조 서열 내로 삽입될 있다. 바람직하게는, 상동성 서열은 상동성 아미노산을 암호화하는 적어도 50개 , 더욱 바람직하게는 100개, 더욱 더 바람직하게는 250개, 더욱 더 바람직하게는 500개 뉴클레오타이드의 스트레치를 포함한다.

"보존적 치환"은 아미노산 잔기를 전체 기능성이 유의하게 변화하지 않도록 크기, 소수성 등을 포함한 유사한 특징 또는 특성을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 이는 또한 보존적 아미노산 치환을 초래하는 뉴클레오타이드 치환을 의미할 수 있다.

B. 담체 분자

본 발명의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드가 접합되거나 공유적으로 결합될 수 있는 담체 분자는 바람직하게는 상기된 것들이다. 동물 사용에 바람직한 담체는 소 혈청 알부민 및 키홀 림펫 헤모시아닌이다. 바람직하게는, 담체 단백질 자체가 면역원이다.

본 발명의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드는 당해 분야에 공지된 임의의 편리한 방법에 의해 담체에 공유적으로 커플링될 수 있다. 문헌 [Schneerson et al, J. Experimental Medicine, 152, 361-376 (1980)]에 기재되는 바와 같은 대칭적 링커, 예를 들면, 아디프산 디하이드라지드 또는 문헌 [Fattom et al, Infection and Immunity, 56, 2292-2298 (1988)]에 기재되는 바와 같은 헤테로이작용성 링커, 예를 들면, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트의 사용이 본 발명의 범위에 속하며 한편 임의의 링커의 사용은 피하지만 대신에 본 발명의 PPV5A 펩타이드를 담체 분자에 직접적으로 커플링하는 것이 바람직하다. 이러한 커플링은 문헌 [Landi et al J. Immunology, 127, 1011-1019 (1981)]에 기재되는 바와 같이 환원적 아미노화에 의해 달성될 수 있다.

평균 분자량으로 정의되는 면역원성 조성물의 크기는 다양하며 선택된 PPV5A 단백질(들) 또는 펩타이드(들) 및 PPV5A 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 담체에의 커플링 방법에 의존적이다. 따라서, 1,000 달톤 (10³)과 같이 작거나 10⁶ 달톤보다 클 수 있다. 환원적 아미노화 커플링 방법에서, PPV5A 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 분자량은 통상 5,000 내지 500,000의 범위 또는 그 이상이다; 예를 들면, 서열번호 4의 캡시드 단백질에 대해 분자량은 약 80,000 달톤으로 예상되며, 이는 60개의 단량체성 단백질로 구성된 바이러스 유사 입자 (VLP)를 형성하는 것으로 예상된다.

본 발명의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 담체 분자, 즉 펩타이드, 이의 유도체 및 유사체, 및 펩타이드 모사체는, 이로 제한됨이 없이, 고체상 합성법을 포함한 당해 분야에 알려진 다양한 방법에 의해 또는 용액에 의해 생성될 수 있다 [Nakanishi et al., 1993, Gene 137:51-56; Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154; Neurath, H. et al., Eds., The Proteins, Vol II, 3d Ed., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976), 본원에 참조로 전부 포함됨].

본 발명의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드 또는 본 발명의 항체 또는 이의 결합부는 주사가능한 용량으로 희석제 중의 용액 또는 현탁액에 의해 약제학적 또는 수의학적 담체와 함께 투여될 수 있다.

이러한 분자의 안정성 및 효능은 CVB (Center for Veterinary Biologics)에 의해 기재되고 규제되는 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 절차에 따라 측정된다. 이러한 분자의 독성 및 치료 효능은, 예를 들면, LD₅₀ (집단의 50%에 대해 치명적인 용량)을 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 따라 측정될 수 있다.

본 발명의 백신은 다가 또는 일가일 수 있다. 다가 백신은 다수의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드의 담체 분자와의 면역-접합으로부터 제조된다.

하나의 양상에서, PPV5A 단백질 또는 펩타이드 조성물은, 바람직하게는 면역자극제와 병용되는 면역화 유효량의 면역원성 접합체 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 본 문맥에서 사용되는 "면역자극제"는, 특정 항원과 병용된 특정 증강 효과이든 또는 단순히 면역 반응의 하나 이상의 요소의 활성에 따른 독립적 효과이든, 면역계의 활성을 증강시키는 능력을 갖는 임의의 화합물 또는 조성물을 포함하는 것으로 의도된다. 면역자극 화합물은, 이로 제한됨이 없이, 무기 겔, 예를 들면, 수산화알루미늄; 표면활성 물질, 예를 들면, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올; 폴리음이온; 펩타이드; 오일 에멀젼; 알룸, 및 MDP를 포함한다. 이들 물질을 사용하는 방법은 당해 분야에 알려져 있으며, 소정의 백신에 대한 자극제의 최적량을 측정하는 것을 당업자의 능력 범위 내에 있다. 하나 초과의 면역자극제가 소정의 제형에 사용될 수 있다. 면역원은 또한 리포솜에 포함되거나, 백신 제형에 사용하기 위한 폴리사카라이드 및/또는 다른 중합체와 접합될 수 있다.

조성물은, 필요한 경우, 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 디바이스에 제시될 수 있다. 팩은, 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들면, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 디바이스는 투여, 바람직하게는 포유동물, 특히 돼지에 투여하기 위한 지침서를 동반할 수 있다.

C. 항원 보강제

하나 이상의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 면역원성을 더욱 증가시키기 위해, 또한 하나 이상의 항원 보강제를 포함할 수 있다.

항원 보강제는 이전에 기재되거나 당해 분야에 공지된 임의의 기술에 의해 정제될 수 있다. 바람직한 정제 기술은 실리카겔 크로마토그래피, 특히 문헌 [W. Clark Still et al, J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978)]에 기재되는 바와 같은 "섬광" (신속) 크로마토그래피 기술이다. 그러나, HPLC를 포함한 다른 크로마토그래피 방법이 항원 보강제의 정제에 사용될 수 있다. 또한, 항원 보강제를 정제하는데 결정화도 이용될 수 있다. 일부의 경우에, 분석 순도의 생성물이 합성으로부터 직접적으로 수득되므로 정제가 필요하지 않다.

본 발명의 백신 조성물은 항원 보강제를 보강된 조성물을 생성하기 위한 공지된 기술에 따라 적합한 멸균 조건 하에 PPV5A 단백질(들) 또는 펩타이드(들)과 물리적으로 혼합함으로써 제조된다. PPV5A 단백질(들) 또는 펩타이드(들)과 항원 보강제의 복합체 형성은 장쇄 알킬 화합물 항원 보강제 상에 존재하는 양전하에 정전기적으로 이끌리는 접합체 상의 네트 음전하의 존재에 의해 촉진된다.

D. 생리학적-허용가능 비히클

본 발명의 백신 조성물은 다른 약제학적 폴리펩타이드 조성물에 대해 사용되는 것과 유사한 기술을 이용하여 제형화될 수 있다. 따라서, 항원 보강제 및 PPV5A 단백질(들) 또는 펩타이드(들) (바람직하게는 담체 분자에 접합되고/되거나 항원 보강제와 혼합됨)은 동결건조된 형태로 저장되고 투여 전에 현탁액을 형성하기 위해 생리학적으로 허용되는 비히클에 재구성된다. 대안으로, 항원 보강제 및 접합체는 비히클에 저장될 수 있다. 바람직한 비히클은 멸균 용액, 특히 멸균 완충 용액, 예를 들면, 포스페이트 완충된 염수이다. 항원 보강제 및 접합체를 면역원성 조성물의 면역학적 유효성을 개선하도록 배합하는 임의의 방법이 적합하다.

본 발명의 백신의 단일 용량의 용적은 다양하나 일반적으로 통상의 백신에 일반적으로 사용되는 범위 내에 있을 것이다. 단일 용량의 용적은 바람직하게는 상기 언급된 접합체 및 항원 보강제의 농도로 약 0.1 ml 내지 약 3 ml, 바람직하게는 약 0.2 ml 내지 약 1.5 ml, 더욱 바람직하게는 약 1.0 ml이다.

본 발명의 백신 조성물은 임의의 편리한 수단으로 투여될 수 있다.

E. 제형

담체 분자에 커플링된 PPV5A 단백질(들) 또는 펩타이드(들)을 포함하는 면역원성 접합체는 PPV5A의 하나 이상의 혈청형에 대한 면역화를 위한 백신으로 사용될 수 있다. 생리학적으로 허용되는 비히클 중에 면역원성 접합체를 포함하는 백신은 PPV5A에 의한 감염의 치료 또는 예방을 위해 사람, 바람직하게는 돼지를 면역화시키는데 유용한다.

면역원성 접합체로의 면역화에 의해 본 발명의 면역원성 접합체에 대해 생성된 항체는 PPV5A의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 항이디오타입 항체의 수동 면역요법 및 생성에 사용될 수 있다.

조성물이 투여되는 피험체는 바람직하게는, 이로 제한됨이 없이, 소, 말, 양, 돼지, 가금 (예: 닭), 염소, 고양이, 개, 햄스터, 마우스 및 래트를 포함한 동물이며, 가장 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 제형은 하나 이상의 면역원성 조성물 또는 이에 대한 항체의 유효 면역량 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 백신은 하나 이상의 면역원성 조성물의 유효 면역량 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 제형은 투여 모드에 적합해야 한다.

필요한 경우, 면역원성 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 지연 방출 제형, 또는 산제일 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다.

F. 유효 용량

본원에서 기재되는 화합물은 PPV5A-연관된 질환을 치료하기 위해 치료학적 유효 용량으로 피험체에게 투여될 수 있다. 용량은 백신이 투여되는 숙주 및 숙주의 크기, 체중 및 나이와 같은 인자에 의존적일 것이다.

사용될 본 발명의 면역원성 접합체 또는 항체의 정확한 양은 투여 경로 및 피험체의 특성 (예: 종, 나이, 크기, 질병의 단계/수준)에 의존적일 것이며, 의사의 판단 및 각각의 피험체의 상황에 따라 표준 임상 기술에 따라 결정되어야 한다. 유효 면역량은 피험체에서 PPV5A 감염 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양이다. 유효 용량은 또한 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도되는 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있으며, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 다양할 수 있다.

조성물의 면역원성은 당해 분야에 알려진 임의의 면역검정으로 조성물로 면역화시킨 후 시험 피험체의 면역 반응을 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 체액성 (항체) 반응 및/또는 세포-매개된 면역의 생성이 면역 반응의 표시로서 취해질 수 있다. 시험 피험체는 동물, 예를 들면, 돼지, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 토끼, 소, 말, 양 및 가금 (예: 닭, 오리, 거위 및 칠면조)를 포함할 수 있다.

시험 피험체의 면역 반응은 다양한 접근법, 예를 들면, 공지된 기술, 예를 들면, 효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 면역블롯, 면역침전 등에 의해 검정되는 면역원성 접합체에 대한 생성된 면역 혈청의 반응성; 또는 감염성 질환 매개물의 수준을 검정하기 위한, 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 정량적 PCR, 바이러스 분리 또는 당해 분야에 공지된 다른 기술로 측정되는, 병원체에 의한 감염으로부터 면역화된 숙주의 보호 및/또는 면역화된 숙주에서 병원체에 의한 감염에 기인한 증상의 약화에 의해 분석될 수 있다. 감염성 질환의 수준은 또한 면역글로불린이 지시되는 항원의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 감염성 질환 매개물의 수준 감소 또는 감염성 질환의 증상의 약화는 조성물이 효과적이라는 것을 나타낸다.

본 발명의 치료제는 동물에서 생체내 사용 전에 목적하는 치료 또는 예방 활성에 대해 시험관내에서 시험될 수 있다. 예를 들면, 특정 치료제의 투여가 필요한지를 결정하는데 이용될 수 있는 시험관내 검정은 특정 질환 또는 장애를 갖는 피험체로부터 배양된 세포주 또는 세포로부터의 적당한 세포가 치료제에 노출되거나 달리는 투여되고 세포에 대한 치료제의 효과가 관측되는 시험관내 세포 배양 검정을 포함한다.

대안으로, 치료제는 이를 감염성 질환 매개물에 의한 감염에 민감하나 감염성 질환 매개물로 감염되지 않은 (피험체 또는 배양된 세포주로부터 배양된) 세포와 접촉시키고, 세포를 감염성 질환 매개물에 노출시킨 후, 치료제와 접촉된 세포의 감염율이 치료제와 접촉되지 않은 세포의 감염율보다 낮은지의 여부를 측정함으로써 검정될 수 있다. 세포의 감염성 질환 매개물로의 감염은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검정될 수 있다.

또한, 치료제는 항체가 지시되는 분자의 수준을 동물 모델 피험체에서 치료 이전, 동안 또는 후에 적합한 시간 간격으로 측정함으로써 평가될 수 있다. 분자량의 임의의 변화 또는 변화의 부재는 피험체에 대한 치료의 효과로 확인되고 이와 연관될 수 있다. 분자의 수준은 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물을 사용한 PPV5A에 대한 동물의 백신접종 후, 당해 분야에 공지된 임의의 결합 검정이 생성된 항체와 특정 분자 사이의 결합을 평가하는데 이용될 수 있다. 이들 검정은 또한 특정 항원에 대해 높은 친화도 또는 특이성을 나타내는 항체를 선별하기 위해 수행될 수 있다.

G. 검출 및 진단 방법

본 발명의 천연 PPV5A, 약독화된 바이러스, 단백질 또는 펩타이드의 사용으로부터 생기는 항체 또는 이의 결합부는 샘플 중 PPV5A의 존재를 검출하는데 유용하다. 이러한 검출 방법은 본 발명의 천연 PPV5A, 약독화된 바이러스, 단백질 또는 펩타이드에 대해 생성된 분리된 항체 또는 이의 결합부를 제공하는 단계, 분리된 항체 또는 이의 결합부에 다량의 PPV5A 바이러스를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 첨가하는 단계 및 PPV5A 바이러스에 결합된 분리된 항체 또는 이의 결합부를 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 이의 결합부는 또한 샘플 중의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드의 존재를 검출하는데 유용하다. 이러한 검출 방법은 천연 PPV5A, 약독화된 바이러스, 단백질 또는 펩타이드에 대해 생성되는 분리된 항체 또는 이의 결합부를 제공하는 단계, 분리된 항체 또는 이의 결합부에 다량의 PPV5A 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 첨가하는 단계 및 PPV5A 단백질 또는 펩타이드에 결합된 분리된 항체 또는 이의 결합부를 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

결합쌍의 구성원인 특정 분자에 결합하는 면역글로불린, 특히 항체 (및 이의 기능적 활성 단편)은 본원에서 기재되는 바와 같이 진단제 및 예후제로서 사용될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 결합쌍의 구성원의 측정 및 임상 적용시 이러한 측정의 이용을 제공한다. 본 발명에서의 면역글로불린은, 예를 들면, 생물학적 샘플 중 항원의 검출에 사용됨으로써 면역글로불린이 결합하는 분자의 이상 수준 및/또는 이러한 분자의 이상 형태의 존재에 대해 피험체가 시험될 수 있다. "이상 수준"은 신체의 일부 또는 질환을 갖지 않는 피험체로부터의 유사한 샘플에 존재하거나 존재를 나타내는 표준 수준과 비교하여 증가되거나 감소된다는 것을 나타낸다. 본 발명의 항체는 또한 진단 또는 예후 기술에 사용하기 위한 키트에 시약으로서 포함될 수 있다.

하나의 양상에서, PPV5A 천연 또는 약독화된 바이러스, 단백질 또는 펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 PPV5A 감염에 대한 진단, 예후 또는 스크리닝에 사용될 수 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 피험체에서 이로부터 유도되는 샘플에 대한 항체의 면역특이적 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 이때 항체는 PPV5A 단백질 또는 펩타이드에 면역특이적으로 결합하고, 감염 질환 매개물을 갖지 않는 피험체로부터의 유사한 샘플에서의 면역특이적 결합 수준에 비해 면역특이적 결합의 수준 증가가 PPV5A의 존재를 나타내는, PPV5A 감염 또는 이에 대한 면역의 존재를 진단 또는 스크리닝하는 방법을 제공한다.

PPV5A 펩타이드 또는 이의 길항제의 존재를 검출하기 위한 적합한 검정의 예는, 이로 제한됨이 없이, ELISA, 방사선면역검정, 겔-확산 침전 반응 검정, 면역확산 검정, 응집 검정, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정 또는 면역전기영동 검정을 포함한다.

특정 분자에 대한 면역검정은 전형적으로 샘플, 예를 들면, 생물학적 유체, 조직 추출물, 새로이 수거된 세포 또는 배양 세포의 용해물을 검출가능하게 표지된 항체의 존재 하에서 인큐베이션하는 단계 및 결합된 항체를 당해 분야에 잘 알려진 다수의 기술 중 임의의 기술에 의해 검출하는 단계를 포함할 것이다.

소정의 항체의 결합 활성은 잘 알려진 방법에 따라 측정될 수 있다. 당업자는 통상의 실험을 이용하여 각각의 측정에 대한 이용되는 최적 검정을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 PPV5A의 검출 또는 측정을 위한 진단 키트에 관한 것이다. 하나 이상의 용기에 항-PPV5A 항체 및, 임의로, 항체에 대한 표지된 결합 파트러를 포함하는 진단 사용을 위한 키트가 제공된다. 대안으로, 항-PPV5A 항체는 (검출가능한 마커, 예를 들면, 화학발광, 효소, 형광 또는 방사성 모이어티로) 표지될 수 있다. 따라서, 본 발명은 항-PPV5A 항체 및 대조군 면역글로불린을 포함하는 진단 키트를 제공한다. 특정 실시형태에서, 용기의 이전의 화합물 중 하나는 검출가능하게 표지될 수 있다. 키트는 임의로 용기에 표준 또는 대조군으로 사용하기 위한 키트의 항체에 의해 인식되는 PPV5A 바이러스, 단백질 또는 펩타이드의 예정량을 추가로 포함할 수 있다.

H. 피험체에게 투여

투여 경로는, 이로 제한됨이 없이, 비강, 경구 (예: 음료수), 진피내 또는 근육내를 포함한다. 근육내 투여가 특히 바람직하다. 당업자는 본 발명의 조성물이 또한 1개, 2개 또는 그 이상의 용량으로 다른 투여 경로에 의해 투여될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 이러한 다른 경로는 피하, 피부내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 경막내, 기관내, 심장내, 엽내, 척수내, 폐내 또는 질내를 포함한다. 목적하는 치료 기간 및 치료 효율에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 1회 또는 수회 또는 간헐적으로, 예를 들면, 수일, 수주 또는 수개월 동안 1일 단위로 및 상이한 용량으로 투여될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내고자 포함된다. 당업자는 하기 실시예에 기재되는 기술이 본 발명의 실시에 잘 작용하는 본 발명자들에 의해 밝혀진 기술을 나타내므로, 이의 실시에 대해 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러나, 당업자는 본 기재에 비추어 많은 변화가 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재되는 특정 실시형태에 가해질 수 있고 여전히 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

본원은 동일 날짜에 출원된 발명의 명칭 "돼지 파르보바이러스 5B, 이의 방법 및 백신"의 출원 (대리인 문서 번호 BIC-1153, 이의 내용이 전부 본원에 참조로 포함됨)과 관련된다.

실시예

재료 및 방법

재료의 공급원 : 3마리 돼지 유래의 조직 균질물(homogenate)을 특이한 질병 발생 조사로부터 수득하였다. 농장에서의 임상 병력은, 휴식시에도 존재했지만 이동하는 동안에는 과대했던 전신 근육 떨림을 갖는 200lb의 돼지였다. (현미경적 병변에 기초하여) 바이러스 작용제임을 시사하였으나 단지 매개물 X(비-표준 돼지 열 바이러스 연관된 페스티바이러스)의 동정을 초래한 수의학적 진단 실험실에서의 광범위한 시험 후, 이들 동물에서 CNS 징후의 근본 원인을 결정하는 것을 돕기 위해, 본 발명자들에게 샘플을 제공하였다.

DNA 및 단백질 분석 : 병에 걸린 돼지 유래의 샘플의 DNA 분석은, Operon(Huntsville AL)에 의해 실행되는, 454 Life Sciences(Branford CT)로부터의 고속 대량 서열분석("454 기술")을 이용하여 수행되었다. 샘플은 바이러스 입자 보호 핵산의 뉴클레아제 처리를 통해 바이러스 서열이 농축되었고, 이어서, 추출, 랜덤 증폭 및 고속 대량 서열분석하였고, 일반적으로 문헌[Victoria et. al PLoS pathogen 2008 Sep 26;4(9):e1000163]에 기술되는 바와 같이 수행하였다.

생성된 서열을 먼저 BLASTx 분석에 의해 파르보비래대 과의 분지 구성원으로서 특성확인하였다. 서열을 Sequencher 소프트웨어를 사용하여 어셈블링하고, 표적화된 서열분석과 커플링된 이들 DNA 분석 결과는, PPV5A로서 명명되는 바이러스의 추정적 완전 암호화 서열인 서열번호 1의 DNA 서열을 수득하였다. Sequencher 소프트웨어를 사용한 DNA 서열의 추가 분석은, 바이러스 레플리카제(서열번호 2), 개방 판독 프레임 "ORF3"(서열번호 3) 및 바이러스 캡시드 단백질(서열번호 4)를 포함하는, 다른 파르보바이러스 종에서 발견된 것들에 상응하는 3개의 추정적 암호화 영역의 동정을 초래하였다.

실시예 1: 신규한 바이러스의 동정

상이한 주(state)로부터의 2마리의 비관련 돼지의 폐 균질물 샘플에서 454 기술(바이러스 메타유전학)에 의해 DNA 서열을 동정인하였다. BLASTn 및 BLASTx 분석은, 레플리카제 유전자 (REP)의 보존된 영역에서 최대 67%의 뉴클레오타이드 동일성으로 돼지 파르보바이러스 4와 가장 밀접한 동일성을 보였고, 한편, 캡시드(CAP) 암호화 영역은 뉴클레오타이드 수준에서 인식할 수 있는 매칭을 나타내지 않았다. 단백질 수준에서, 추정적 레플리카제 단백질은 약 60%의 아미노산 동일성을 나타냈고, 캡시드 단백질에서는 약 50%의 동일성을 나타냈다. 바이러스는 신규 종인 돼지 파르보바이러스 5A(PPV5A)로 명명되었다. 캡시드 암호화 서열에 기초하여 특정 프라이머가 개발되었으며, 조직 및 병리학적/임상학적 특성이 유사한 균질물의 PCR 기반 스크리닝은 샘플의 약 16%에서 작용제의 존재를 나타냈다. 보고된 임상 징후 및 스크리닝된 조직과 연관된 바이러스학 데이터에 기초하여, 수개의 다른 바이러스 작용제 및 임상 병리학/조직병리학으로 통계학적으로 유의한 연관성이 관찰되었다.

실시예 2: 신규한 파르보바이러스로서 PPV5A 의 동정 및 계통발생 분석

다중 공지의 바이러스 종의 추정적 레플리카제(REP) 및 캡시드(VP1/CAP) 단백질 둘 다에 대한 쌍-방식의 아미노산 동일성이 도 5에 도시된다. REP 및 CAP 둘 다에 대해 가장 밀접하게 관련된 (각각, 약 60% / 50%) PPV4에 대한 PPV5A 서열 동일성은 PPV5A를 새로운 종으로서 지명하는 것을 지지한다.

계통발생 분석(도 6)은, 이 바이러스가, CAP 단백질의 보존된 영역에 기초하여, 파르보비리대 과 및 파르보바이러스 속 내의 신규한 새로운 종임을 나타낸다. 더욱 보존된 REP 단백질 서열을 사용하여 유사한 결과가 달성된다(도시하지 않음).

실시예 3: 질환의 작용제로서의 PPV5A 의 확인

바이러스를 증폭시키고 신규한 파르보바이러스와 PRRSV의 공동-감염이 증가된 임상 호흡기 징후를 초래하였는지를 결정하기 위한 시도에 있어서, ISU로부터의 3개의 PPV5A PCR 양성 조직 균질물을 사용하여 제왕절개-유도된-초유-무섭취(CDCD) 동물을 접종하였다. 본 연구에서, 신규한 파르보바이러스를 함유하는 조직 균질물로 접종된 그룹에서 예상치 못한 높은 수치의 사망률(20 내지 22%)이 존재하였고, 캡시드 암호화 영역을 표적화하는 PPV5A-특이적 PCR을 이용하여 혈청에서 높은 역가의 PPV5A를 동정하였다. 이어서, 본 연구에서 1마리 동물 유래의 조직을 사용하여 CDCD 돼지를 챌린지하여 임상 징후를 재현하였다. 본 연구에서, 고역가의 바이러스혈증을 갖는 전신 감염이 대부분의 감염 동물에서 주목되었다. PPV5A를 함유하는 접종물이 투여된 그룹에서, 사망률(20%), 파행, 감소된 평균 1일 증가, 발열, 및 육안적 및 현미경적 병변 둘 다의 높은 발생정도가 존재하였다.

실시예 4: PPV5A 의 배양, 단리 및 정제

PCR 양성 조직(예를 들면, 비장, 뇌, 폐, 소장 등)의 작은 절편을 멸균 유발 및 유공을 이용하여 분쇄한다. 분쇄된 조직을, HEPES 완충액 및 항생제를 함유하는 변형된 EMEM 5 내지 10ml에 재현탁시키고, 청징화하여 큰 조직 덩어리를 제거한다. 상청액을 수집하고, 일련으로 다수의 필터를 통과시킴으로써 세균을 포함하는 큰 입자의 대부분을 제거한다. 추가로, PCR 양성 동물로부터의 분변 샘플 현탁물 및 혈청도 바이러스 단리를 위해 일련의 여과로 프로세싱한다.

여과물의 희석물을 트립신으로 처리하거나 처리하지 않은 상태로 두고, 특정 온도에서 6-웰 플레이트 중의 확립된 일차 세포 배양물(하기 열거됨) 상에 흡착시킨다. 접종물을 흡기시키고, 2ml의 신선한 유지 배지(maintenance media)로 대체한다. 이어서, 플레이트를 33 내지 37℃에서 5% CO₂ 대기에서 인큐베이션하고, 모의(플레인 배지) 접종된 대조군과 비교하여 세포병변 효과, 예를 들면, 세포 원형화, 세포-세포 융합, 슬라우잉(sloughing), 세포 클러스터링 등을 매일 관찰한다. 잠재적 양성 웰을 PCR에 의해 바이러스 성장/단리에 대해 스크리닝한다.

바이러스의 단리에 유용한 확립된 세포주는 다음을 포함하였다: 특히, ST(돼지 고환), SK6(돼지 신장), BHK-21(베이비 햄스터 신장), VIDO R1(태아 돼지 망막), PK-15 NADC(돼지 신장), PK/WRL(돼지 신장), HRT-180(사람 결장직장 선암종), Hep2(사람 상피), Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장) 및 RK-13(토끼 신장).

공정에 유용한 일차 세포 배양물은 하기를 포함한다: 특히, 배아 돼지 폐, 신장, 고환, 기관 및 소장 배양물.

바이러스가 단리됨에 따라, 이는 다중 라운드의 플라크 정제 또는 제한 희석에 의해 정제되고, 다량으로 증폭되며, 동물 실험을 위한 스톡 배양물을 생성한다.

실시예 5: 불활성화된 바이러스 및 백신의 제조

약 35 내지 39℃에서 그리고 2 내지 15mM BEI의 존재 하에, 더욱 바람직하게는 약 10 mM BEI의 존재 하에 불활성화를 수행한다. 불활성화는 적어도 24시간, 24 내지 72시간 이하 동안 수행한다. 이어서, 용액 내의 불활성화제를 중화시키는 작용제의 등량; 예를 들면, 티오황산나트륨을 등량으로 첨가한다. 불활성화된 바이러스 제제를, 예를 들면, 문헌[Preuss, T., et al., Comparison of Two Different Methods for Inactivation of Viruses in Serum, CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, (1997), 504-508 또는 Bahnemann, H.G., Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine, VACCINE, (1990), 299-303]에 개시되는 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 따라 제조한다. 일단 불활성화된 바이러스가 제조되면, 이 물질은 최종 백신 제형을 위해 담체 제제와 함께 배합된다.

실시예 6: 약독화된 바이러스 및 백신의 제조

약독화된 바이러스 제제는, 예를 들면, 문헌(Vaccine Protocols, 2nd edition; Robinson, Husdon, Cranage, eds, Humana Press 2003)에 개시되는 바와 같이, 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조된다. 예를 들면, " ... 병독성 상실과 면역원성 보유 사이에 허용가능한 균형이 도달될 때까지 야생형 바이러스를 조직 배양물/동물 숙주에 광범위하게 계대시킨다 ... "

약독화된 바이러스는 다중 라운드의 플라크 정제 또는 제한 희석으로 정제된다. PCR 검정, 딥(deep) 서열분석 또는 면역형광 검정을 이용하여 배양 물질의 특이성을 측정한다.

약독화된 바이러스 백신은, 정제된 약독화된 바이러스 제제를 담체 제제와 배합함으로써 제조된다.

실시예 7: 캡시드 단백질을 포함하는 아단위 백신의 제조

서열번호 4의 캡시드 단백질은, 다양한 단백질 발현 시스템에서의 클로닝된 서열번호 4 또는 이의 단편의 발현에 의해 제조되었다.

배큘로바이러스 발현: 서열번호 4의 PPV5A 캡시드 단백질은, 일반적으로, 문헌 [Kost et al. (6), 2012]에 개시된 방법에 따라 배큘로바이러스 발현 시스템으로 발현되었다. 단백질은, 초기 정제시 불용성 분획 내에서 소량으로 발견되었다. 수율 및 용해도를 증가시키기 위한 방법은, 대안의 완충 조건(예를 들면, 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드), 대안의 결합 및 정제 조건(예를 들면, 코발트 또는 니켈 친화성 컬럼, 음이온 또는 양이온 교환 컬럼) 또는 대안의 발현 조건(예를 들면, 온도, 시간, 대안 세포주)의 이용을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

세균 발현: 서열번호 4의 PPV5A 캡시드 단백질은, 일반적으로, EMD Chemicals Inc.의 노바젠(Novagen) 사용자 프로토콜 TB184에 개시된 방법에 따라 세균 발현 시스템에서 발현되었다. 이 방법은, 생성된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 세균 벡터[EMD Chemicals Inc., 2011 (7)]에 함유된 내재된 HIS-태그의 첨가를 포함하였다. 세균 발현된 HIS-태그된 캡시드 단백질을 일반적으로 문헌[GE Healthcare, 2012 (8)]에 개시된 방법에 따라 정제하였고, 수득된 생성물을 실시예 8에 기술되는 바와 같이 PPV5A 특이적 항체를 생성하는데 사용하였다.

약독화된 아단위 백신은, 정제된 캡시드 단백질 제제를 담체 제제와 배합함으로써 제조되었다.

실시예 8: PPV5A 에 특이적으로 결합하는 항체의 제조

PPV5A에 특이적으로 결합하는 항체는, 토끼를 PPV5A 바이러스의 항원성 제제 또는 캡시드(서열번호 4) 단백질 또는 이의 단편의 아단위 단백질 제제로 면역화시킴으로써 제조된다. 접종된 토끼로부터의 혈청 샘플을, PPV5A 항원에 결합하는 폴리클로날 항체에 대해 스크리닝한다. 항원에 대해 항체를 생성하는 것으로 측정된 접종된 마우스로부터의 비장을 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성한다. 이어서, 하이브리도마를, PPV5A 항원에 대한 결합에 대해 스크리닝한다.

폴리클로날 항체: 실시예 7에 따라 제조된 HIS-태그된 세균 발현된 캡시드 단백질을, 커스텀 항체 생산 서비스(custom antibody production service) (Rockland Antibodies and Assays; Gilbertsville, PA)로 2마리의 뉴질랜드 화이트 토끼를 면역화시키는데 사용하였다. 토끼를 대략 100μg의 항원/토끼로 D0, D7, D14 및 D28에서 면역화시켰다. D0 및 D7 접종은 진피내 투여되었고, D14 및 28에서 제공된 접종은 피하 투여되었다. 완전 프로인트 항원 보강제를 제1 접종에 사용하였고, 불완전 프로인트 항원 보강제를 후속 접종에 사용하였다. 2마리 토끼 모두로부터의 혈청 샘플을 면역화 전 및 면역화 후 38일째 및 45일째에 수집하였다.

폴리클로날 항체 제제를 Rockland Antibodies and Assays에 의해 항-PPV5A 특이성에 대해 스크리닝하였다. 면역형광 검정(IFA), 웨스턴 블롯, 및 효소-링크된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 정제되거나 부분적으로 정제된 PPV5A 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 항체를 생성하였다. 각각의 검정의 특이성에 대한 파라미터는 하기와 같았다: 웨스턴 블롯 특이성은, 예측된 88.8kDa 크기 단백질의 검출에 의해 측정되었으며, IFA 특이성은 비감염된 세포에 대한 비교로 측정되었으며, ELISA 특이성은 비-관련 단백질과 함께 플레이트를 코팅함으로써 측정되었다.

모노클로날 항체: 실시예 7에 따라 제조된 HIS-태그를 갖는 배큘로바이러스 발현된 캡시드 단백질을 커스텀 항체 생산 서비스(Rockland Antibodies and Assays; Gilbertsville, PA)로 Balb/c 마우스에서 모노클로날 항체를 생성하는데 사용한다. 마우스를 커스텀 항체 생산 시설에 의해 고안된 표준 프로토콜에 따라 다양한 PPV5A 항원 제제로 면역화시킨다. 접종 후 면역 반응은 커스텀 항체 생산 시설에 의해 모니터링되며, 하이브리도마 생성을 위한 항체 후보물을 선별한다. 모노클로날 항체 생성을 위한 표준 프로토콜은, 예를 들면, 문헌[Gabriele et al. (9), p.117-135]에 개시되어 있는 바와 같이 당업자에게 익히 알려져 있다.

하이브리도마는, 증식기까지 하이브리도마 배지에서 배양된 B-세포 종양 세포를, 문헌[Gabriele et al. (9), p.117-135]에 개시되는 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 PPV5A 항원에 대한 항체를 생성하는 것으로 측정된 접종된 마우스로부터 수거된 비장 세포와 배합함으로써 생성된다. 융합 및 하이브리도마 배양 후, 하이브리도마를, PPV5A 항원에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 항-PPV5A 생산성 하이브리도마를 선별한다. 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체는, 문헌[Gabriele et al. (9), p.209-232]에 개시되는 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한다.

PPV5A에 대해 특이적인 고친화성 항체가 동정되고, 이러한 항체가 결합하는 에피토프, 다른 관련 바이러스 종에 대한 항체의 특이성을 측정하는 것을 포함하여 추가로 특성확인되며, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 면역학적 기술, 예를 들면, ELISA, 웨스턴블롯 분석 및 에피토프 맵핑[문헌: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 이용하여 PPV5A 바이러스 항원(들)에 대해 높은 특이성을 갖는 적합한 고친화성 항체가 선별된다.

실시예 9: PPV5A 에 대한 진단 검정

ELISA 검정: 실시예 8에 따라 제조된 항체를, ELISA 절차를 이용한 생물학적 샘플 중의 PPV5A를 측정하는데 사용한다. 이 검정은 하기와 같이 수행한다:

서열번호 4의 캡시드 단백질로부터 선택된 코팅 항원을 코팅 완충액(0.05M 탄산-중탄산 완충액; pH 9.6) 중에 희석하여 8ng/μl의 최종 농도를 달성한다. 플레이트(높은 단백질 결합 96-웰 ELISA 플레이트 Phenix 카탈로그 번호 MPG-655061)를 50μl/웰의 코팅 항원으로 코팅한다. 플레이트를 밀봉시키고 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 코팅 용액을 제거하고, 플레이트를 200μl/웰의 PBST(1X PBS + 0.05% Tween-20)로 3회 세척한다. 플레이트를 300μl/웰의 차단 용액(PBS 중의 0.5% w/v 탈지 분유)으로 코팅하고, 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 200μl/웰의 PBST로 3회 세척한다. 샘플을 차단 용액 중에 1:100으로 희석시키고, 100μl/웰의 혈청 샘플을 플레이트에 가한다. 플레이틀 밀폐시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 혈청 샘플을 제거하고, 플레이트를 200μl/웰의 PBST로 3회 세척한다. 이차 항체[HRP-접합된-염소 항-돼지 IgG (H+L); Jackson Immuno-Research 114-035-003]를 차단 용액 중에서 1:10,000으로 희석시키고, 100μl/웰로 플레이트를 코팅하는데 사용한다. 플레이트를 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이차 항체를 제거하고, 플레이트를 200μl/웰의 PBST로 3회 세척한다. 플레이트를 50μl/웰의 TMB(3,5,3',5'-테트라메틸벤지딘; KPL 카탈로그 번호 53-00-01)로 코팅한다. 플레이트를 실온에서 어두운 곳에서 대략 10분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 50μl/웰의 정지 용액(2M H₂SO₄; KPL 카탈로그 번호 50-85-04)으로 코팅한다. 광학 밀도를 450nm에서 판독한다.

PCR 검정: PPV5A에 대한 겔-기반 PCR 및 qPCR 검정을 최적화하였다. 이들 검정은 하기와 같이 수행한다: qPCR 검정을 위해, 각각의 반응은, 하기 시약들을 가함으로써 준비된다: 10μl/2X SsoFast 프로브 슈퍼믹스(BioRad, 카탈로그 번호 172-5233)의 반응, 5μl/DEPC-처리된 물의 반응, 1μl/6μM 농도의 전방 프라이머 (AAT GCG TGT GCT TAC GCT TA: 서열번호 6)의 반응, 1μl/6μM 농도의 후방 프라이머 (TGG GTT CGA ATA TGA AGA GG: 서열번호 7)의 반응, 1μl/4μM 농도의 프로브 (6-FAM/TC ATC AGG AAC CCT GGA GTG ATC TCA /BHQ_1: 서열번호 8)의 반응 및 2μl/추출된 DNA의 반응. 반응은 T100 열 사이클러(T100 thermal cycler; Bio-Rad) 상에서 2분 동안 95℃에서의 1 사이클 동안 수행하고, 이어서, 2개의 온도(5초 동안 95℃, 이어서, 5초 동안 60℃)에서의 40 사이클 동안 수행된다. 데이터는, CFX96 광학 이미지화 시스템(Bio-Rad)를 사용하여 판독된다. 겔-기반 검정을 위해, 각각의 반응을 하기 시약들을 가함으로써 준비한다: 12.5μl/2X AmpliTaq Gold Mastermix(Applied Biosystems, 카탈로그 번호 4302758)의 반응, 8.0μl/DEPC-처리된 물의 반응, 1.25μl/10μM 농도의 전방 프라이머(GTA CTA TGA ATT TCC AAA CGA TCT TCC TTT CG: 서열번호 9)의 반응, 1.25μl/10μM 농도의 후방 프라이머(TTA CAC CAA ATC TGG GAC TCT AAA CAG GC: 서열번호 10)의 반응 및 2μl/추출된 DNA의 반응. 반응은 T100 열 사이클러(Bio-Rad) 상에서 95℃에서 5분 동안 1 사이클 이후 하기 온도: 30초 동안 95℃, 30초 동안 60℃ 및 45초 동안 72℃에서의 40 사이클 동안, 이어서, 72℃에서 10분 동안 최종 연장이 수행된다.

실시예 10: 돼지에서의 PPV5A 백신의 효능의 평가

돼지에서 적어도 하나의 PPV5A 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 물질의 구성물(원형 PPV5A 백신)의 효능을 평가하기 위해서, 3개의 그룹으로 무작위 배정된 5주령의 제왕절개-유도된-초유-무섭취(CDCD) 동물을 사용하는 무작위 연구(표 2 참조)가 수행된다. 동물은 연구 0일(D0) 및 D14일에 조성물 또는 위약(포스페이트 완충된 염수; PBS)으로 백신접종된다. 동물은, D28에 PPV5A를 포함하는 것으로 알려진 물질로 챌린지된다. 임상 관찰, 직장 온도, 체중 측정 및 혈액 수집이 모니터링된다. D56에 동물을 부검하여 육안 병변을 평가한다. PPV5A 백신의 효능은, 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 사망률(%), 바이러스혈증(역가 및 지속기간), 혈청전환(역가 및 지속기간) 및 임상 징후를 통계학적으로 비교함으로써 측정된다.

[표 2]

본원에 개시되고 청구되는 조성물 및 방법 모두는 본 개시의 관점에서 과도한 실험 없이 제조되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 바람직한 실시형태의 관점에서 기술되었지만, 당업자에게는 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 조성물 및 방법, 그리고, 상기 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변화를 가할 수 있음이 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 모두 관련된 소정 작용제가, 본원에 기술된 작용제를 대체할 수 있고, 한편, 동일하거나 유사한 결과를 달성할 것임이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체물 및 변형은, 하기 특허청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.

참조문헌

하기 참조문헌은, 이들이, 본원에 제시되는 것에 보충하여 예시적 절차 또는 다른 상세한 설명을 제공하는 정도로, 구체적으로 본원에 인용에 의해 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA, INC. <120> PORCINE PARVOVIRUS 5A, METHODS OF USE AND VACCINE <130> 10-0150-PCT <150> US 13/796,621 <151> 2013-03-12 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5853 <212> DNA <213> Porcine parvovirus 5A <400> 1 tatttgcagg cttttccctg atattgggaa gattcctggg gtgactcctg agcggtatat 60 ttatgctgta aacgtgagta cccgtaatgg gcaaaagtgg ccgaaagttg ggaccgaggg 120 gccattggct gcaggtgtct tacaggggga ggcccttttc cgtgagaccc ttaaagaggt 180 ccggaaggtg tgccggctgc cgcaagaccc cccatctttt ctttcaattg gagaaagttg 240 attccaaagg gggtcttcac cttcattttt gtattagtgt tgctgctggc actcctagag 300 atgtgtcttc gatgtttaaa gccattgagc gtcgagtttc cttttactac tttggtgtag 360 agggcttgac tttttttact cctcataaaa ataagcatgg ggcttggaag agtaatgatg 420 agggctttat tgtgaattat cttcttaaaa aattgccttt gtctgagtgt gtgtatgcgt 480 ggactaatat ggatggggtg attggcgatg cctgtctgaa tgaagataag cgcagggaat 540 tgttgtctga gcgtcaagat cagggagtca ttaaagagct cactgctcct acttttaaag 600 ctgctacggg tgataaaatg ttgagtgtgg tggattggat gtgtgataat gatgtgacta 660 cggagcgccg atgggaggaa atatcggctg cgtccctgta ctctttcctt gctaccccag 720 ctggcactca tttggctaaa cagtgtctta gagctgcgaa tcagcgtatt gtgagcacta 780 aaacctcttg gttgagtctc tgtaaatttg ccagtgaaaa ggagcttcgt gcttttcaaa 840 atggggatcc tgagttgtct tcagacaaca ataggatcta ttacttattt gctatgaata 900 attactgccc tgatatggcc agtatgattt tcttttggtg gtctatgcgc caaacgggta 960 agagaaacag tatttggctg tttggacctg ctacaaccgg taaaaccaat ttagcaagtg 1020 ctattgcaca tactgctgcc agttatgggt gtgttaactg gaataacgca aatttcccgt 1080 ttcaagacat tgtgaatgtg caactgggtt ggtgggagga aggaaagatg acagaggatg 1140 tggttgaatg tgctaaggca ttgctagggg gaagtaatgt aagagttgac cgcaaatgta 1200 tgcaatctgc ggaagtgcaa tctcctcctt ttattatcac atccaatacg gatatgtgcc 1260 ttgtttctca aggcagttac atcagttttg agcaccagca gcctctccag gatagaatga 1320 ttaaatttga gtttaaccat gttcttcctg gcaatttcgg cctcatttct gaagatgaag 1380 ttgtggcctt cttcagaaat ggtgcttata atgtgttgaa gcatgcgtac atgagaaagg 1440 cccagctttt tgctctcggt ccagcttcct tgccatataa gccccctacg ggtgaattag 1500 tgtgtataga ccaagctaag tctccttctc cctctgcttc tcgccgcagt gtgagaaatt 1560 ggatgacgtg tccccctgat cctgtccagg acgatcccgc tgaactggac gagtattttc 1620 ctccagatac tcctccagag gattgtcctt gtcctatttc tcctgtgagg gagtcttgtc 1680 cctcgccagg gccttgccct acccctcctc gcaaaaaaca acggaagagc aagcattgct 1740 ccttgtctgt ctctgcgggt aaagttcctg tggtggttgt gggtgattct gactcagtcc 1800 cccccgaaga aaaagaaaaa gaggaagttt ccgtggggga atcccaggat ccacaactgt 1860 actgggacct aactctcagt caatccgacg ttcctgtgcc tgaagacgag agtacccagt 1920 ttcctgacga cgctgtggac gcttctgatc tcattgctga acagtagtta aggtatgagc 1980 cgttctactc aaagagatct ttggtctttg ttaagggaga gacttgaaag gtataaggat 2040 cgagttaaat attatggtat tttggtgcca gaacgtcctt ctaccttagc atcttatttt 2100 agtaaagacc cacctccaga tcctccaact gttaaatttg ataaacccta tcaggatgta 2160 gatagattct ggtttccaac agacgattat actgactggt atgtctggca tggagaggac 2220 agacctccta gatttaccga gcattccggt gttcagggtt ttaaaactag gtgtgagggg 2280 gggcttcctt taatgcccag tgatcccaaa ttttgcccca tacaaaattt ttgggatcag 2340 ttcgctaatt ttgatgaggg gtctccgtcc acccagatcg gtgagagtgt ttcatggagt 2400 gatcattttg gaagtcccga tccctctcat catcaggagg tgagggatgc tgatgaagtt 2460 acttccgagc ggcagcaata taaaaatagg attgtcacct tactaagaaa agtttattgg 2520 gctaagcagt ggtctgggaa attacaaatt aatgttcctt ccctcgaaag cctttatgag 2580 cagatcccct atatgctagc ctatatggac gccgataatt ggcgtcagaa tttgttagct 2640 gctaaaactc tgcgaaccac tttggaagca ttttcctgtg ttccagatcc ttccacgtgc 2700 gatgtcacaa tctccacacc cctatctggt gaaacggatc ccgcctcttt tgcaaaatac 2760 ttatgttccc ttgtatgcaa caggtctcaa gaaaaagaac aggcgcagac gccttctttg 2820 tctccatcta agcaaaaagg gcagatgtca agtcctgatt ctgcatcgat ctcccaacct 2880 ccccctgaaa gtcacaagga tagactgctt cctaaaactg atccccttca ggaagcaggg 2940 ccccttcccg ctccccctac agctcagaag cctattatct ctaagggtgc aggcggtgga 3000 gggtcgtctg gcttcataat ccctccaaaa cctcctagcc ccgatcatac taaagatccc 3060 ccccctcctc ctcctccctc tccaattcct cctcctacat ctgcgcctga cgcagaggag 3120 cacgagctag agcgtgctaa gcaggagaaa caagaggaag 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gacccaccct tcagcccgga 4860 cctaggactc tgtctcatgc cgtacgcaga cccgatggtt ccaccgtggt cacggctaat 4920 gcgtgtgctt acgcttacac ccaggagaat cctcatcagg aaccctggag tgatctcaat 4980 gtcagacata ccatgtatag gttagcctat caacgtcaaa aaggttttca gcaacccggg 5040 gaccctcttc atattcgaac ccatgcttgt tatggggacg gggatgttac cattccaaaa 5100 gaagagtcct tatggcctac tgttctgggt agttgcacag aaaagtcccc tgcctgttta 5160 gagtcccaga tttggtgtaa aacaccaaat gtggacatgg tctatggaga acacacaccc 5220 cctcttgctt tatggggtat gcatgctccc ccaccccatg tatttctcag gatgcttgct 5280 caagagggtc ctcctaatgt cagtacttgc agaccggctc aatctggtca gaccttcatc 5340 aatcaatatg gtcagtttct cctctgtttt accatggtat gggaagttaa gcctagaccc 5400 aagtccatca agcagtggaa tccacgtccg cccatcagca ttcctgttgg tcagtctggt 5460 cctgctttca ttctcgatca agatggctac taccgtctcc cagaacatgt ctggtctgcc 5520 agggaacgta tccgcagcaa acgctagtgc ccccagcaat acacttacta cagtattgat 5580 gtgtcaggca ttctggttga ttgttttatt ttggctccgc ctactgtatg gcccatgtaa 5640 acgcatctat tatgaaaata aaatacgtca attgctgatg taattcgtgt tgtaattctt 5700 gttttgaaaa gcgcatattt tcttgccggt ctgagtaaca ccacctatga catcatataa 5760 atttgattac gtaacttcct ctttttactt ccgtcttttt ttgattacgc aatatacaca 5820 attctagcag ttaactatta cacaatatca cac 5853 <210> 2 <211> 626 <212> PRT <213> Porcine parvovirus 5A <400> 2 Met Gly Lys Ser Gly Arg Lys Leu Gly Pro Arg Gly His Trp Leu Gln 1 5 10 15 Val Ser Tyr Arg Gly Arg Pro Phe Ser Val Arg Pro Leu Lys Arg Ser 20 25 30 Gly Arg Cys Ala Gly Cys Arg Lys Thr Pro His Leu Phe Phe Gln Leu 35 40 45 Glu Lys Val Asp Ser Lys Gly Gly Leu His Leu His Phe Cys Ile Ser 50 55 60 Val Ala Ala Gly Thr Pro Arg Asp Val Ser Ser Met Phe Lys Ala Ile 65 70 75 80 Glu Arg Arg Val Ser Phe Tyr Tyr Phe Gly Val Glu Gly Leu Thr Phe 85 90 95 Phe Thr Pro His Lys Asn Lys His Gly Ala Trp Lys Ser Asn Asp Glu 100 105 110 Gly Phe Ile Val Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Glu Cys 115 120 125 Val Tyr Ala Trp Thr Asn Met Asp Gly Val Ile Gly Asp Ala Cys Leu 130 135 140 Asn Glu Asp Lys Arg Arg Glu Leu Leu Ser Glu Arg Gln Asp Gln Gly 145 150 155 160 Val Ile Lys Glu Leu Thr Ala Pro Thr Phe Lys Ala Ala Thr Gly Asp 165 170 175 Lys Met Leu Ser Val Val Asp Trp Met Cys Asp Asn Asp Val Thr Thr 180 185 190 Glu Arg Arg Trp Glu Glu Ile Ser Ala Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Leu 195 200 205 Ala Thr Pro Ala Gly Thr His Leu Ala Lys Gln Cys Leu Arg Ala Ala 210 215 220 Asn Gln Arg Ile Val Ser Thr Lys Thr Ser Trp Leu Ser Leu Cys Lys 225 230 235 240 Phe Ala Ser Glu Lys Glu Leu Arg Ala Phe Gln Asn Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Leu Ser Ser Asp Asn Asn Arg Ile Tyr Tyr Leu Phe Ala Met Asn Asn 260 265 270 Tyr Cys Pro Asp Met Ala Ser Met Ile Phe Phe Trp Trp Ser Met Arg 275 280 285 Gln Thr Gly Lys Arg Asn Ser Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr 290 295 300 Gly Lys Thr Asn Leu Ala Ser Ala Ile Ala His Thr Ala Ala Ser Tyr 305 310 315 320 Gly Cys Val Asn Trp Asn Asn Ala Asn Phe Pro Phe Gln Asp Ile Val 325 330 335 Asn Val Gln Leu Gly Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Glu Asp Val 340 345 350 Val Glu Cys Ala Lys Ala Leu Leu Gly Gly Ser Asn Val Arg 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Gly Ser Pro Asp Pro Ser His His Gln Glu Val Arg Asp Ala Asp 145 150 155 160 Glu Val Thr Ser Glu Arg Gln Gln Tyr Lys Asn Arg Ile Val Thr Leu 165 170 175 Leu Arg Lys Val Tyr Trp Ala Lys Gln Trp Ser Gly Lys Leu Gln Ile 180 185 190 Asn Val Pro Ser Leu Glu Ser Leu Tyr Glu Gln Ile Pro Tyr Met Leu 195 200 205 Ala Tyr Met Asp Ala Asp Asn Trp Arg Gln Asn Leu Leu Ala Ala Lys 210 215 220 Thr Leu Arg Thr Thr Leu Glu Ala Phe Ser Cys Val Pro Asp Pro Ser 225 230 235 240 Thr Cys Asp Val Thr Ile Ser Thr Pro Leu Ser Gly Glu Thr Asp Pro 245 250 255 Ala Ser Phe Ala Lys Tyr Leu Cys Ser Leu Val Cys Asn Arg Ser Gln 260 265 270 Glu Lys Glu Gln Ala Gln Thr Pro Ser Leu Ser Pro Ser Lys Gln Lys 275 280 285 Gly Gln 290 <210> 4 <211> 792 <212> PRT <213> Porcine parvovirus 5A <400> 4 Met Gln Arg Ile Asn Ser Gly Glu Gly Glu Gly Glu Arg Gly Gly Phe 1 5 10 15 Val Leu Pro Ser His His Tyr Thr Gly Pro Arg Asn Pro Val Pro Ala 20 25 30 Gly Lys Pro Ala Asp Pro Val Asp Glu Ser Ser Ala Arg His Asp Ile 35 40 45 Arg Tyr Gly Gln Arg Leu Lys His Gly Asp Trp Pro Tyr Leu Trp Gly 50 55 60 Lys Asp Leu Asp Asn Ala Gln Arg Asp Glu Ile Ile Lys Ala Leu His 65 70 75 80 Ser His Val Lys Val Gly Thr Gln Leu Ala Gly Asn Ile Val Arg Ser 85 90 95 Ile Trp Lys Ala Lys Glu Leu Leu Thr Glu Pro Val Tyr Glu Leu Leu 100 105 110 Lys Ser Ile Leu Pro Pro Ser Asp Leu Ser Lys Val Pro Leu Pro His 115 120 125 Ser Gln Gln Thr Asp Arg Thr Glu Asp Pro Glu Thr Pro Gly Glu Thr 130 135 140 Arg Gly Thr Gly Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Arg Pro Ser Gly Ser 145 150 155 160 Thr Glu Asp Gly Gly Gly Pro Ser Ser Glu Ser Arg Leu Pro Gly Ser 165 170 175 Lys Val Pro Val Asp Pro Ser Ala Thr Thr Ser Glu Ala Lys Arg Gln 180 185 190 Arg Thr Glu Glu Gly Met Asp Ile Ser Ser Cys Gly Pro Gly Gly Ile 195 200 205 Ser Ala Ser Gly Ala Ala Ser Asn Asn Ser Gly Leu Ala Cys Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Thr Asn Leu Gly Thr Glu Ser Leu Val Ser Gly Cys Gln 225 230 235 240 Phe Gly Lys Asn Ser Val Ile Thr Ser Ser Phe Arg Arg Cys Leu Ile 245 250 255 Ser Pro Trp Pro Asp Lys Tyr Cys Cys Ser Ser Ala His Asp Leu Ile 260 265 270 Pro Gly Val Val Tyr Glu Thr Pro Trp Cys Tyr Tyr Asp Leu Asn Val 275 280 285 Ile Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Pro Ser Ala Trp Gln Arg Leu Leu Glu 290 295 300 Asp Tyr Asp Ala Phe Arg Pro Lys Ser Leu Lys Val Thr Ile Gln Ser 305 310 315 320 Leu Val Leu Lys Met Ser Val Lys Val Gln Lys Lys Gln Thr Thr Val 325 330 335 Gln Asp Ser Gln Ser Ala Thr Ile Ala Ile Phe Glu Asp Lys Asp Tyr 340 345 350 Asp Tyr Pro Tyr Val Met Gly Gly Gly Gln Lys Thr Val Pro Gly His 355 360 365 Leu Pro Gly Gln Pro Tyr Asn Leu Pro Lys Tyr Ser Tyr Arg Thr Leu 370 375 380 Gly Ser Val Lys Glu Ser Asn Arg Ala Ser Met Gly Gly Ser Gly Tyr 385 390 395 400 Thr Phe Lys Ser Asn Gln Asp Thr Glu Leu Phe Leu Leu Glu Thr His 405 410 415 Asp Ala Thr Leu Ile Arg Gly Gly Gly Thr Phe Glu Gln Tyr Tyr Glu 420 425 430 Phe Pro Asn Asp Leu Pro Phe Glu Asn Leu Thr Gln Tyr Pro Trp Asp 435 440 445 Ile Arg Arg Gln Asp Asn Pro Leu Tyr Gln Gln Arg Ile Thr Val Met 450 455 460 Ser Gly Ser Asp Arg Asp Thr Val Gly Ile Leu Asp Gly Asp Phe Tyr 465 470 475 480 Ser Pro Phe Arg Phe Lys Gly His Asp Arg Pro Ala Met Trp Leu Pro 485 490 495 Gly Gln Arg Leu Ile Gln Gly Lys Phe Ile Asp Thr His Pro Ile Pro 500 505 510 Asn Thr Gly Arg Ser Gly Val His Pro Asn Asp Phe His Thr Arg Gly 515 520 525 Asp Gly His Gly Asp Thr His Arg Thr His Glu Glu Arg Ile Tyr Ser 530 535 540 Leu Asp Thr Gly Leu Ala Ala Met Pro Arg Ala Ala His Arg Pro Thr 545 550 555 560 Leu Gln Pro Gly Pro Arg Thr Leu Ser His Ala Val Arg Arg Pro Asp 565 570 575 Gly Ser Thr Val Val Thr Ala Asn Ala Cys Ala Tyr Ala Tyr Thr Gln 580 585 590 Glu Asn Pro His Gln Glu Pro Trp Ser Asp Leu Asn Val Arg His Thr 595 600 605 Met Tyr Arg Leu Ala Tyr Gln Arg Gln Lys Gly Phe Gln Gln Pro Gly 610 615 620 Asp Pro Leu His Ile Arg Thr His Ala Cys Tyr Gly Asp Gly Asp Val 625 630 635 640 Thr Ile Pro Lys Glu Glu Ser Leu Trp Pro Thr Val Leu Gly Ser Cys 645 650 655 Thr Glu Lys Ser Pro Ala Cys Leu Glu Ser Gln Ile Trp Cys Lys Thr 660 665 670 Pro Asn Val Asp Met Val Tyr Gly Glu His Thr Pro Pro Leu Ala Leu 675 680 685 Trp Gly Met His Ala Pro Pro Pro His Val Phe Leu Arg Met Leu Ala 690 695 700 Gln Glu Gly Pro Pro Asn Val Ser Thr Cys Arg Pro Ala Gln Ser Gly 705 710 715 720 Gln Thr Phe Ile Asn Gln Tyr Gly Gln Phe Leu Leu Cys Phe Thr Met 725 730 735 Val Trp Glu Val Lys Pro Arg Pro Lys Ser Ile Lys Gln Trp Asn Pro 740 745 750 Arg Pro Pro Ile Ser Ile Pro Val Gly Gln Ser Gly Pro Ala Phe Ile 755 760 765 Leu Asp Gln Asp Gly Tyr Tyr Arg Leu Pro Glu His Val Trp Ser Ala 770 775 780 Arg Glu Arg Ile Arg Ser Lys Arg 785 790 <210> 5 <211> 726 <212> PRT <213> Porcine parvovirus 4 <400> 5 Lys His Gly His Trp Pro His Leu Trp Ala Pro Phe Val Asp Arg Gln 1 5 10 15 Met Ser Gln Glu Ile Gln Gln Val Leu Lys Gly Ser Thr Lys Leu Ser 20 25 30 Gln Lys Leu Leu Ala Asn Phe Ile Ile Ala Leu Trp Arg Ala Lys Glu 35 40 45 Lys Ile Gly Ala Pro Ile Tyr Glu Ile Val Lys Gly Val Phe Pro Ser 50 55 60 Val Asp Lys Lys Thr Val Glu Ser Leu Leu Pro His Pro Asp Pro Ile 65 70 75 80 Pro Ala Pro Pro Ser Ser Pro Gln Arg Gly Ser Lys Arg Ala Ser Pro 85 90 95 Pro Gln Ser Pro Asn Ala His Asp Glu Asp Thr Met Ser Gly His Lys 100 105 110 Arg Gln Lys Thr Met Glu Val Glu Ser Glu Cys Asp Lys Ser Leu Leu 115 120 125 Cys Pro Thr Gln Asn Ala Gly Ala Asp Phe Glu Leu Cys Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Ala Thr Asn Glu Lys Gly Thr Trp Val Gly Gly Thr Gln Phe 145 150 155 160 Thr Asp Thr Ser Ile Arg Thr Phe Gly Thr Arg Arg Cys Val Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Pro Asp Thr Tyr Cys Ser Met Met Ser Gly Asp Ala Ile Pro 180 185 190 Ser Ile Ile Phe Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Tyr Asp Leu Asn Ile Met 195 200 205 Ser Cys His Phe Ser Pro Ser Ala Phe Gln Thr Leu Ile Glu Asp Tyr 210 215 220 Asp Ala Phe Arg Pro Arg Ser Leu Thr Val His Leu Lys Glu Leu Val 225 230 235 240 Ile Lys Asp Val Cys Gln Gln Gln Gly Leu Gln Ala Glu Gln Val Ser 245 250 255 Asp Asn Asn Ser Ala Thr Leu Leu Ala Phe Glu Asp Val Asn Tyr Glu 260 265 270 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Gly Gly Gln Val Ser Val Pro Gly His Leu 275 280 285 Pro Gly Gln Pro Tyr Gln Leu Pro Lys Tyr Ser Tyr Arg Thr Val Gly 290 295 300 Lys Pro Asp Pro Asn Ser Gly Phe Val Pro Gly Arg Asn Thr His Pro 305 310 315 320 Asp Gln Gly Pro Gly His Pro Lys Ala Ser Lys Thr Ile Trp Tyr Ser 325 330 335 Gln Tyr Leu Glu Thr Gln Asp Thr Glu Phe Tyr Ile Leu Glu Asn His 340 345 350 Lys Ala Thr Ile Leu His Ser Gly Asn Thr Phe Ser Gln His Tyr Asn 355 360 365 Phe Pro Asp Leu Pro Phe Glu Gln Leu Thr Gln Tyr Met Trp Asp Ala 370 375 380 Arg Arg Gln Asp Asn Pro Leu Ile Asp Gln Arg Ile Gln Val Met Ser 385 390 395 400 Arg Met Tyr Asp Asp Gly Pro Gln Lys Thr Phe Ala Ile Lys Val Asn 405 410 415 Pro Tyr Ile Val Pro Phe Thr Val Lys Ser Thr Ser Arg Pro Ala Met 420 425 430 Phe Leu Ala Gly Gly Arg Phe Lys Asp Gly Asp Tyr Ser Ile Thr Gly 435 440 445 Pro Gly Asp Arg Asp Lys Thr Ser Phe Lys Tyr Tyr Asn Asp Pro Pro 450 455 460 Trp Ile Ile Thr Arg Asp Thr Tyr Leu Phe Ser Ser Asp Leu Ala Lys 465 470 475 480 Thr Glu Arg Glu Gln Pro Gly Pro Arg Gln Gly Asp Thr Val Val Arg 485 490 495 Thr Pro Asp Gly Thr Leu Ile Val Thr Thr Asn Ala Leu Ala Tyr Gly 500 505 510 Tyr Thr Thr Glu Tyr Leu Lys Asn Ile Pro Leu Leu Ser Ser Lys Tyr 515 520 525 His Gly Val Glu Asn Phe Arg Leu Ala Val Glu Asn Glu Arg Gly Tyr 530 535 540 Ser Met Pro Gly His Pro Ser His Ile Arg Glu Thr Leu Phe Arg Gly 545 550 555 560 Lys Leu Pro Ser Glu Ile Arg Glu Ser Thr Ile Lys Ser Glu Asp Gln 565 570 575 Arg Lys Glu Ile Thr Phe Pro Asp Tyr Met Gly Ser Val Asn Glu Lys 580 585 590 Thr Thr Ala Asn Leu Glu Ser Gln Ile Trp Ser Gln Ile Pro Asn Thr 595 600 605 Asp Ile Thr Glu Lys Cys Thr Thr Pro Pro Leu Ser Ile Trp Gly Met 610 615 620 Lys Asn Pro Pro Pro Met Val Phe Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Gly 625 630 635 640 Pro Pro Arg Arg Ser Ala Cys Ser Gly Ser Ile Pro Ser Asn Thr Tyr 645 650 655 Leu Asn Gln Tyr Cys Gln Phe Leu Leu Thr Tyr Glu Met Glu Trp Asp 660 665 670 Val Ile Lys Arg Thr Arg Lys Thr Val Arg Trp Asn Pro Ile Pro Pro 675 680 685 Pro Gln Ile Pro Met Gly Pro Asn Asn Leu Pro Val Tyr Ile Leu Asn 690 695 700 Lys Glu Gly Gln Tyr Arg Met Pro 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<213> Porcine parvovirus 4 <400> 11 Leu Val Ile Ala Val Arg Gln Ala Glu Ala Leu Phe Arg Glu Leu Gln 1 5 10 15 Lys Glu Leu Arg Lys Ser Cys Arg Leu Gly Val Asp Pro Gly Ile Phe 20 25 30 Met Gln Leu Glu Glu Val Asp Ser Lys Gly Gly Leu His Leu His Trp 35 40 45 Cys Val Ser Val Ser Ala Gly Thr Pro Arg Asp Val Leu Thr Ile Phe 50 55 60 Lys Asn Thr Glu Lys Lys Val Ser Gln Tyr Tyr Phe Gly Val Glu Gly 65 70 75 80 Leu Ser Phe Phe Val Pro His Lys Asn Lys His Gly Ala Trp Lys Ser 85 90 95 Thr Asp Glu Gly Phe Ile Tyr Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Leu Pro Leu 100 105 110 Lys Glu Cys Leu Tyr Ala Trp Thr Thr Ile Gly Gly Ala Ile Gly Asp 115 120 125 Ala Cys Leu Asn Thr Asp Lys Arg Lys Glu Leu Leu Asp Asn Arg Gln 130 135 140 Asp Pro Ala Val Ile Glu Glu Leu Ser Ala Pro Met Tyr Lys Cys Ala 145 150 155 160 Thr Gly Glu Lys Met Leu Asp Ile Val Gln Trp Leu Val Asp Asn Asn 165 170 175 Ile Cys Ser Glu Ser Arg Trp Glu Asn Lys Asn Ala Leu Ser Leu Tyr 180 185 190 Ser Phe Leu Ala Thr Gln Ala Gly Gly Tyr Met Ala Lys Gln Cys 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Ser 405 410 415 Glu Glu Val Lys Ser Phe Phe Arg Met Gly Ala Lys Leu Ala Ala Gln 420 425 430 Pro Asp Ile Met Asn Cys Pro Ile Phe Lys Lys Gly Pro Ala Ser Ile 435 440 445 Arg His Leu Val Pro Val Gly Glu Ile Pro Pro Pro Lys Glu Met Lys 450 455 460 His Lys Arg Gln Pro Leu Tyr Met Arg Ala Glu Pro Asp Glu Ile Gln 465 470 475 480 Asp Asn Pro Glu Glu Leu Asp His Trp Phe Glu Glu Glu Ala Pro 485 490 495

Claims (27)

1. 하기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드:
   a) 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드;
   b) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드;
   c) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역학적으로 유효한 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는, 서열번호 1과 80% 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드;
   d) 서열번호 1의 30개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 서열번호 1의 핵산 서열의 단편인 폴리뉴클레오타이드; 또는
   e) 서열번호 1의 30개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 면역학적으로 유효한 활성의 아미노산 서열을 암호화하는, 서열번호 1의 핵산 서열의 단편인 폴리뉴클레오타이드.
2. 하기 폴리펩타이드를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드:
   a) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
   b) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4와 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역학적으로 유효한 활성을 갖는 폴리펩타이드;
   c) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열의 단편인 폴리펩타이드;
   d) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하고, 면역학적으로 유효한 활성을 갖는, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열의 단편인 폴리펩타이드; 또는
   e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 87-1967, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1975-2844, 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2845-5547의 서열에 포함된 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질 단편인 폴리펩타이드.
3. a) 서열번호 1의 핵산 서열, 또는
   b) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역학적으로 유효한 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는, 서열번호 1과 80% 동일한 핵산 서열
   을 포함하는, 단리된 돼지 파르보바이러스 5A(PPV5A).
4. 제3항에 있어서, 약독화된 비-병독성 형태의 PPV5A를 포함하는, PPV5A.
5. 제3항의 PPV5A의 사멸되거나 약독화된 형태를 포함하는, 병독성 PPV5A에 의한 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신.
6. 제3항의 PPV5A의 사멸되거나 약독화된 형태의 아단위를 포함하는, 병독성 PPV5A에 의한 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신.
7. 제6항에 있어서, 상기 아단위가 서열번호 4의 캡시드 단백질인, 백신.
8. 제6항에 있어서, 상기 아단위가 서열번호 4의 폴리펩타이드의 면역학적-유효 단편인, 백신.
9. 제2항의 폴리펩타이드의 면역학적-유효량, 및 약제학적- 또는 수의학적-허용가능 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 면역원성 제제.
10. 제3항의 PPV5A의 면역학적-유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
11. 제2항의 폴리펩타이드의 면역학적-유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
12. 제5항의 백신의 면역학적-유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
13. 제6항의 백신의 면역학적-유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
14. 제7항의 백신의 면역학적-유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5A 감염에 의해 야기된 질환에 대해 보호 면역을 제공하는, 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5A 감염에 의해 야기된 질환에 대해 보호 면역을 제공하는, 방법.
17. 제12항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5A 감염에 의해 야기된 질환에 대해 보호 면역을 제공하는, 방법.
18. 제13항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5A 감염에 의해 야기된 질환에 대해 보호 면역을 제공하는, 방법.
19. 제14항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5A 감염에 의해 야기된 질환에 대해 보호 면역을 제공하는, 방법.
20. 서열번호 1의 서열을 갖는 돼지 파르보바이러스 5A 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 PPV5A 폴리펩타이드에는 특이적으로 결합하나 상이한 파르보바이러스에 의해 암호화된 폴리펩타이드에는 결합하지 않는, 단리된 항체.
21. 생물학적 샘플 중의 PPV5A의 존재를 확인하는 방법으로서,
    a) 상기 생물학적 샘플을 제21항의 항체와 접촉시키는 단계, 및
    b) 상기 항체와 PPV5A 폴리펩타이드 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 복합체의 존재가 상기 생물학적 샘플 중의 PPV5A의 존재를 나타내는, 방법.
22. 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
23. 제22항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
24. 제20항의 항체를 발현하는 하이브리도마.
25. 생물학적 샘플 중의 PPV5A의 존재를 확인하기 위한 진단 키트로서,
    a) 제21항의 항체, 및
    b) 상기 항체와 PPV5A 폴리펩타이드 사이의 복합체의 형성을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 키트.
26. a) PPV5A 감염과 연관된 하나 이상의 질환에 대해 동물을 면역화시키기에 유효한 하나 이상의 면역원성 PPV5A 펩타이드;
    b) 하나 이상의 담체 또는 항원 보강제 분자;
    c) 면역원성 조성물을 포장하기 위한 컨테이너;
    d) 인쇄된 지침서의 세트; 및
    e) 동물에게 면역원성 조성물을 투여할 수 있는 디스펜서
    를 포함하는, 면역원성 키트.
27. 제26항에 있어서, 다른 돼지 병원성 바이러스 또는 세균으로의 감염과 연관된 질환을 야기하는 하나 이상의 상기 바이러스 또는 세균에 대해 상기 동물을 면역화시키기에 유효한 하나 이상의 면역원성 단백질을 추가로 포함하는, 면역원성 키트.

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