KR20150125846A - 순환전압전류법을 이용한 생물막 형성량의 측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 순환전압전류법을 이용한 생물막 형성량의 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 미생물 대사과정 중에만 발생하는 물질인 아세트산염을 직접 전기화학적으로 측정하여 생물막 형성량을 산정함으로써, 종래의 전기화학적 생물막 측정법의 장점은 유지함과 동시에 외부요인에 의한 영향을 배제하여 생물막의 신뢰성 높은 직접 측정이 가능하다.

Description

순환전압전류법을 이용한 생물막 형성량의 측정 방법{A method for detection of biofilm formation using cyclic voltammetry}

본 발명은 순환전압전류법을 이용한 생물막 형성량의 측정 방법에 관한 것이다.

미생물은 생태계 내에서 서식환경의 특성에 따라 부유생활을 하거나 어떠한 표면에 부착하여 서식하는데, 표면에 부착되어 서식하는 미생물의 대형 군집화, 영양분의 고갈, 산성도나 온도의 변화 그리고 항생제와 같은 독성물질의 유입과 같은 서식환경의 변화에 반응하여 생물막(Biofilm)이라 불리는 얇은 막을 형성한다. 상기 생물막은 막 형상의 3차원 구조체로서, 미생물은 이를 형성하여 스스로를 외부 환경으로부터 보호한다. 최근 십여 년의 연구결과 모든 미생물이 서식환경에 따라 생물막을 형성할 수 있다는 게 확인되었다. 생물막은 미생물이 스스로 분비한 EPS(Extracellular Polymeric Substance) 라는 물질로 이루어져 있다. EPS는 단백질(Protein), 다당류(Polysaccharides), DNA(Deoxyribonucleic acid), 지질(Lipids) 및 부식질(Humic) 물질 등으로 이루어져 있고, 부착성을 띄어 표면에 강하게 부착된다. 생물막 전체 유기물 구성의 50~90%가 EPS로 이루어져 있기 때문에 생물막은 미생물과 전혀 다른 물리화학적인 성질을 갖는다. 생물막의 형성은 부유활동을 하던 미생물의 표면부착 → 미생물 monolayer 형성 → 미생물 군락 형성 → 3차원 구조를 갖춘 성숙 생물막 형성 → 생물막의 탈리 및 새로운 표면으로 전이의 발달단계를 거치게 된다.

이러한 생물막 형성은 다양한 산업 분야에서 문제점을 유발한다. 예를 들면, 공장 파이프에 형성된 생물막이 벗겨져 해당 공장의 생산물에 혼합되는 경우, 생산물의 오염을 발생시킬 뿐만 아니라, 상기 생산물이 식품인 경우에는 인체에 치명적인 위험인자로 작용할 수 있다. 또한 열교환기 표면에 생긴 바이오필름은 열전달 효율을 떨어뜨린다. 나아가 금속 표면과 같은 구조물 표면에 바이오필름이 형성되는 경우, 금속의 부식을 초래하고 시설의 부패를 유발할 수 있다. 특히 다양한 금속 및 콘크리트와 같은 물질이 부식으로 인해 손상될 경우 재건을 위해 큰 비용이 소모되기 때문에 경제적으로 큰 문제가 될 수 있다. 이와 같은 문제 해결을 위한 기술을 개발하는 것은 환경, 수처리, 보건 및 의료 분야 등 다양한 분야에 있어서 기술적 과제로 인식되어 있으며, 지난 수십 년간 다양한 연구가 진행되었으나, 수분이 존재하는 표면에서 미생물에 의하여 자연적으로 형성되는 생물막은 한번 형성되면 기존의 물리적 방법 및 고분자 약품의 투입과 같은 화학적 방법으로는 완전하게 제거되지 않아, 생물막에 의한 오염 방지 및 제어에 대해 현재까지 만족할 만한 수준의 해결 방법이 개발되지 못하고 있는 실정이다.

한편, 생물막은 탈리와 전이가 지속적으로 이루어지기 때문에 개체 수와 생물막의 두께가 일정하게 항상 유지되지는 않지만, 최초 성숙단계에 단위면적당 미생물의 개체 수는 10⁷~10⁸ cells/cm² 정도이고, 형성된 생물막의 두께는 40~60㎛ 정도이다. 생물막 형성을 측정하는 것은, 수도관망내부 내지 의료/보건 장비 등에 있어서 생물막에 의한 피해를 미연에 방지할 수 있기 때문에 다양한 각도에서 생물막에 측정에 대한 연구가 이루어지고 있다. 하지만 생물막은 접근하여 확인하기 어려운 관 내부와 같은 표면에 주로 형성되기 때문에 측정 자체에 여러 가지 한계가 있는 실정이다.

상기와 같이 생물막을 측정하려는 시도는 1981년 Knudsen J.G.와 1988년 Chenoweth J.M.이 관내부의 생물막 형성으로 인한 산업용 냉각탑의 열 전달 저하를 측정하고자 하는 것으로부터 시작되었다. 냉각탑 관 내부에 형성된 생물막이 일정두께이상 형성되면 열 전달 효율이 감소된다. 따라서 생물막 두께가 10 ㎛이상 형성되었을 때 1~1.5% 열 전달이 감소하는 현상을 이용하여 생물막 형성을 간접적으로 측정하는 방법이다. 이는 산업용 냉각탑 열 교환기의 생물막 측정에 사용되는 기술로, 비교적 간단한 시스템 구성과 관망을 해체하지 않고 지속적으로 측정 가능하다는 장점이 있지만, 생물막이 일정두께 이상 형성되어야 측정할 수 있다는 단점이 있다(Knudsen J.G., 1981, Somerscales EFC & Knudsen JG (Eds) Fouling of Heat Transfer Equipment, Hemisphere Publishing Corporation, Washington, pp. 57.).

1988년 Pinheiro M.M.은 마이크로메타에 바늘을 연결하여 생물막의 두께를 직접 측정하였다. 이 측정법은 바늘로 물과 생물막 사이의 계면에서부터 생물막의 기층까지의 두께를 재는 방법으로, 생물막의 두께를 정확히 측정할 수 있으나 관 내부에 바늘을 삽입하기 위해서는 관망을 부분적으로 분해해야 하는 단점이 있었다(Pinheiro M.M. et al., 1988, Can. J. Chem. Eng., vol. 66, pp. 63-67.).

1990년 Characklis W.G.는 관 내부에 생물막이 형성될 때 관 내부 표면의 거칠기가 증가되는 것을 이용하여, 표면 거칠기 증가에 따른 두 지점의 유체의 압력강하를 측정하여 생물막을 측정하였다. 이 방법은 열 전달 측정법과 같이 산업용 냉각 탑에서 사용되고 있으며, 10 ㎛이상 생물막이 형성되었을 때 10~15% 가량의 압력강하가 나타난다고 보고되었다(Characklis W.G. et al., 1990, Characklis WG, Marshall K (Eds) Biofilms, John Wiley & Sons, New York, pp. 265-340.). 그 외에도 생물막 형성을 확인하기 위한 적외선 흡수피크 측정 기술, 광섬유 장치를 이용한 광학적 변화측정 기술 등이 보고된 바 있다.

한편, 전기화학적인 방법을 이용한 생물막의 측정은 2002년 Christiani에 의해 제안되었다. 이는 금속표면에 생물막이 형성될 경우 자연부식과 다른 부식현상인 미생물부식(Microbiologically Influenced Corrosion, MIC)이 발생하고, 이로 인한 금속표면의 전위차를 열린회로전위(Open Circuit Potential, OCP)로 측정하는 방법이다. 금속표면의 생물막을 형성하는 미생물의 종류에 따라, 혐기성 미생물의 경우 미생물 내의 효소가 금속표면의 환원반응을 촉진하고, 호기성 미생물의 경우 미생물의 호흡에 의해 산화를 촉진시키는데, 이때 변화하는 전위를 열린회로전위를 이용하여 측정하여 생물막을 관찰한다. 또 다른 전기화학적인 측정방법으로 분극저항 측정법이 있다. 이는 생물막 형성이 진행됨에 따라 수용액에서 금속표면으로 산소확산이 저해되고, 산소확산을 하기 위해서 감소한 산소농도에 비례하여 더 많은 에너지가 필요하게 된다. 이때 더 필요한 에너지를 저항값의 증가로 나타낸 것이 분극저항이라 하며, 분극저항의 증가량으로 생물막의 형성을 간접적으로 측정하였다(Cristiani P. et al., 2002, Proceedings of the International Specialized Conference on Biofilm Monitoring, Porto, pp. 197-200.).

그 동안 제시되고 연구된 열 전달, 압력강하를 이용한 측정방법은 관망내부의 생물막에 의한 오염에 초점이 맞춰져 있어 다양한 환경에 적용하기가 적합하지 않고, 생물막 형성 초기를 감지하기 어려운 문제가 있다. 광섬유 장치를 이용한 광학적 변화측정법은 장치의 설치 및 운용이 어렵고, 측정데이터를 얻기 위해서 전문적인 기술 및 시간이 필요한 단점이 있다. 이에 비해 전기화학적 생물막 측정법은 상대적으로 손쉽고 빠르게 측정할 수 있으며 높은 감도로 생물막 형성을 초기에 감지할 수 있는 장점이 있으나, 생물막 형성에 의한 현상을 간접적으로 측정하는 것이므로, 다른 물질에 의한 부식, 분극저항 증가나 표면 덮임에 의한 영향과 생물막에 의해 나타나는 영향을 구분하기 어려운 단점이 있다.

한편, 본 발명자들은 전기화학적인 방법을 이용한 생물막의 측정과 관련하여 종래 순환전압전류법을 이용한 수중 생물막 측정에 관한 기술을 연구한 바 있으나(황병준, 이성호, Journal of Sensor Science and Technology, Vol. 21, No. 5 (2012) pp. 374-378), 순환전압전류법을 생물막 측정에 활용할 수 있을 것이라는 가능성만을 확인하였을 뿐, 구체적으로 생물막의 어떠한 요인에 의해 측정이 가능한 것인지는 확인하지 못한 바 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 종래의 연구를 보다 발전시킨 결과, 생물막의 미생물에 의해 생산된 아세트산염이 전기화학적인 측정법을 적용하기에 적합한 대상 요인임을 발견하였으며, 이를 순환전압전류법으로 측정함으로써 종래의 전기화학적 생물막 측정법의 장점은 유지함과 동시에 외부요인에 의한 영향을 배제하여 생물막의 신뢰성 높은 직접 측정이 가능함을 확인하였다.

본 발명의 목적은 순환전압전류법을 이용한 생물막 형성량의 측정방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생물막 내의 미생물이 생산한 아세트산염을 전기화학적인 측정 대상으로 하여 이를 직접 측정함으로써 외부요인에 의한 영향을 배제하고 신뢰성 높은 생물막 형성량 측정방법을 제공함에 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 생물막이 형성된 작업전극(working electrode) 및 상대전극(counter electrode)을 전해질 용액 내에 위치시키는 제1단계; 상기 작업전극 및 상대전극의 양단에 변화하는 전압을 인가함으로써 상기 작업전극에 변화하는 전위를 순환전압전류법에 따라 인가하는 제2단계; 상기 생물막 내의 미생물이 생산한 아세트산염의 산화-환원반응으로 얻어지는 순환전압전류곡선을 측정하는 제3단계; 및 상기 제3단계에서 측정된 순환전압전류곡선으로부터 생물막 형성량을 산정하는 제4단계를 포함하는 생물막 형성량의 측정방법을 제공한다.

본 발명은 작업전극 상에 형성된 생물막에서 생성된 아세트산염을 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV)을 이용하여 직접 측정하는 것으로, 보다 구체적으로 작업전극의 인가전위범위 내에서 산화환원이 일어나지 않는 전해질 용액을 사용하여, 생물막에 의한 전류변화(즉, 아세트산염에 의한 전류변화)만을 측정하는 것이다.

앞서 설명한 종래 생물막의 전기화학적 측정방법의 경우, 생물막에 의해 발생하는 현상을 전기화학적으로 측정하는 간접적 측정법이다. 그로 인해 외부요인에 의한 영향과 생물막에 의한 영향을 구별하는데 어려움이 있었다. 하지만 본 발명은 미생물 대사과정 중에만 발생하는 물질인 아세트산염을 직접 전기화학적으로 측정하여 생물막 형성량을 산정하는 것이므로, 외부요인에 의한 영향을 배제하고 생물막 형성을 직접적으로 측정할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 따른 생물막 형성량의 측정방법은, 이온선택성 전극이나 병렬형 미소전극과 접목하여 간단한 장비구성으로 아세트산염을 측정함으로써 호기성 미생물, 황산염을 형성하는 혐기성 미생물 그리고 기타 특이대사산물을 발생하는 미생물에 의한 생물막을 감지하는 기술로 활용될 수 있다. 또한 여러 종의 미생물이 혼합되어 형성되는 생물막을 각각 감지하여, 생물막에 의한 오염으로 발생하는 피해를 미연에 방지하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 상기 제1단계는 생물막이 형성된 작업전극(working electrode) 및 상대전극(counter electrode)을 전해질 용액 내에 위치시키는 단계로서, 전기화학적 분석을 수행하기 위한 셀(전기화학셀)을 형성하는 단계이다.

전기화학적 분석에 있어서, 전기적 회로를 완성시키기 위해 2개의 전극이 사용될 수 있으며, 이를 각각 작업전극 및 상대전극이라 한다. 상기 작업전극이란 목적하는 반응(예를 들어, 관찰하고자 하는 산화-환원 반응으로, 본 발명에 있어서는 아세트산염 반응)이 일어나는 전극으로, 분석 대상이 되는 전극이다. 상기 상대전극이란 전기적 회로를 완성하기 위한 전극이다.

상기 작업전극 및 상대전극은 각각 독립적으로 백금전극 또는 금전극일 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 전해질 용액이란 작업전극에서 목적하는 반응이 발생하면서 산화 또는 환원이 일어날 때, 이와 대응하는 전자의 이동을 통해 전기적 회로가 완성되도록 상대전극에서 이와 대응할 수 있는 반응이 일어나는 물질을 의미한다. 바람직하기로 상기 전해질 용액은 상기 아세트산염의 표준전극전위에서 산화-환원반응이 발생하지 않는 것일 수 있다. 본 발명은 작업전극에 인가되는 전위 범위에서 오로지 아세트산염의 산화-환원 반응만이 발생함을 특징으로 하므로, 따라서 아세트산염의 산화-환원 반응이 배제된 채 상기 전해질 용액을 이루는 각종 이온, 물분자 등이 작업전극에서 반응이 일어나는 것은 바람직하지 않다. 아세트산염의 표준전극전위는 -290mV인데, 만약 전해질 용액으로 염화칼륨 수용액이 사용될 경우, 이의 표준전극전위는 1230mV이므로, 이는 아세트산염의 표준전극전위에서 산화-환원반응이 발생될 수 있다. 이에 관한 보다 구체적인 설명은 후술한다.

염화칼륨 수용액을 전해용액으로 사용하여 순환전압전류법으로 전위를 1230mV 미만 범위에서 변화시킬 경우 칼륨 염, 염소 염, 물 분자의 표준전극전위보다 작은 전위가 인가되기 때문에 반응이 일어나지 않지만, 290mV의 표준전극전위를 갖는 아세트산 염은 반응하여 산화, 환원이 일어나고 순환전압전류곡선에서 전류변화를 일으키게 된다.

아세트산염의 표준전극전위에서 산화-환원반응이 발생하지 않는 전해질 용액은 K⁺, Na⁺, Ca^{2 +}, Ba^{2 +}, Al^{3 +}, Li⁺, Zn^{2 +} 및 Fe^{2 +}으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 양이온 및 Cl^-, Br^-, NO₃ ^-, S^{2 -} 및 SO₄ ^{2 -}으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 음이온을 함유하는 수용액일 수 있다. 예를 들어, 염화칼륨(KCl) 수용액이 대표적이다.

상기 생물막은 부유활동을 하던 미생물이 작업전극 표면에 부착되어 형성되는 것으로, 본 발명에 있어서 분석 대상이 되는 물질이다. 상기 미생물은 대사과정 중에 아세트산염을 생성할 수 있는 미생물이라면 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Flavobacterium sp., Mycobacterium sp. 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

한편 전기화학측정법에 있어서는 작업전극에 전위를 얼마나 정확한 범위에서 가해줄 수 있는지가 매우 중요하다. 일반적으로 전기화학측정법을 사용할 때 2-전극 전기화학셀과 3-전극 전기화학셀을 사용할 수 있다. 작업전극과 상대전극으로만 이루어진 2-전극 전기화학셀에 있어서, 전위차계(Potentiostat)를 이용하여 전위를 인가하여 전류를 흐르게 하면 하기 수학식 1과 같이 전류(I)와 전해용액의 저항 (R)의 곱만큼 전위(E)가 낮아지게 된다.

[수학식 1]

E = I × R (1)

이때 낮아진 전위를 IR강하라 하며, 처음 인가했던 전위보다 낮은 전위가 흐르게 된다. 이러한 IR강하는 전위를 불안정하게 하는 현상으로, 작업전극의 전위를 일정하게 유지하기 위해서는 3-전극 전기화학셀을 사용함이 보다 바람직할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 있어서 상기 제1단계는 작업전극의 전위강하를 측정하여 이의 전위를 계속적으로 보정하도록 하는 기준전극(reference electrode)을 전기적 회로에 추가할 수 있다. 전극 전기화학셀에서 상기 기준전극을 추가하여 3-전극 전기화학셀을 구성하는 경우, 전류를 기준전극으로 흐르게 하여 작업전극의 전위강하를 측정하여 전위를 계속적으로 보정하여 전위를 일정하게 유지시킬 수 있다. 상기와 같은 3-전극 전기화학셀을 이용하면 매우 작은 전위변화까지도 제어할 수 있어 측정의 신뢰도를 높일 수 있는 이점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 기준전극은 은-염화은 기준전극(silver-silver chloride electrode), 포화 칼로멜 기준전극(saturated calomel electrode) 또는 표준 수소 기준전극(standard hydrogen electrode)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

물질의 표준전극전위(E⁰)는 물질의 특성 중 하나로, 어떤 물질이 산화-환원되는 정도에 관한 척도이다. 25℃, 1기압에서 전기화학 셀의 작업전극 표면에서 전위를 인가하면 산화체(O)는 작업전극과 전자를 교환하며 환원체(R)가 되어 하기 반응식 1과 같이 전기화학평형을 이루게 된다.

[반응식 1]

O + ne ↔ R

상기 반응식 1에서 오른쪽으로 진행되는 반응(환원)과 왼쪽으로 진행되는 반응(산화)의 속도가 같을 때, 작업전극의 전위를 표준전극전위라 한다. 표준전극전위는 일반적으로 수소전극에 대한 값을 기준으로 나타나며, 발열 반응의 경우 그 전위가 양의 값, 흡열반응의 경우 전위가 음의 값을 나타낸다. 하기 반응식 2에 따른 반응은 아세트산염과 물 분자의 반응으로, 본 발명의 목적 반응이며, -290mV의 표준전극전위를 갖고 있다. 그러므로 본 발명에 있어서 작업전극에 290mV의 전위를 가해주었을 때 아세트산염과 물분자의 반응이 시작되고, 전위가 줄어드는 경우 오른쪽에서 왼쪽방향으로 반응이 이루어질 수 있다. 이와 같이 본 발명에서 작업전극 상에서 이루어지는 아세트산염의 반응에 대한 개요도를 도 9에 나타내었다.

[반응식 2]

CH₃COO^- + 3H₂O ↔ CO₂ + HCO₃ ^- + 8H⁺ + 8e, E⁰=-290mV

한편, 전해질 용액으로 염화칼륨(KCl) 수용액을 사용하는 경우, 염화칼륨은 수용액 내에서 칼륨 염(K⁺)과 염소 염(Cl^-)으로 100% 해리될 수 있다. 물은 1230mV의 표준전극전위를 갖고, 칼륨 염의 표준전극전위는 하기 반응식 3과 같이 2930mV 의 전위가 인가되었을 때 칼륨으로 환원되고, 염소 염은 하기 반응식 4와 같이 1360mV 의 전위가 인가되었을 때 염소 기체로 산화될 수 있다.

[반응식 3]

K⁺ + e ↔ K, E⁰=-2930mV

[반응식 4]

Cl₂ + 2e ↔ 2Cl^-, E⁰=1360mV

상기 제2단계는 상기 작업전극 및 상대전극의 양단에 변화하는 전압을 인가함으로써 상기 작업전극에 변화하는 전위를 순환전압전류법에 따라 인가하는 단계로, 작업전극의 전위를 특정 범위 내에서 순환적으로 변화시켜가면서 분석대상물질인 아세트산염의 산화-환원반응을 유도하는 단계이다.

본 발명의 순환전압전류법에 대해 보다 구체적으로 설명한다. 3-전극 전기화학 셀을 이용한 전기화학시스템에서 작업전극의 전위를 도 1a과 같이 일정 범위 내에서 삼각파 형태로 반복적으로 변화시킬 때, 전위변화범위 내에 표준전극전위를 갖고 있는 어떤 물질이 전해질 용액 내 또는 전극표면에 있다면, 그 물질의 산화, 환원 반응을 유도하게 된다. 상기 물질이 반응함에 따라 도 1b과 같은 전류변화를 확인할 수 있다. 이때 물질의 표준전극전위에서 산화, 환원 반응이 활발하게 일어나 전류-전위 곡선의 기울기가 증가하게 된다. 전류-전위 곡선의 전류변화폭은 산화, 환원반응을 일으키는 물질의 양과 밀접한 관계가 있어, 전류폭을 관찰하여 물질의 많고 적음을 상대적으로 확인할 수 있다. 이를 순환전압전류법이라 한다.

상기 제2단계에 있어서, 작업전극 및 상대전극 각각의 양단에 전압을 인가하는 경우 작업전극에 특정 전위가 인가될 수 있다. 이때, 상기 전압을 변화시키는 경우 이와 함께 작업전극의 전위도 함께 변화될 수 있다. 본 발명에 있어서 분석 대상이 되는 전극은 작업전극이고, 여기에 인가되는 전위에 따라 아세트산염의 반응을 측정하는 것을 본 발명의 기본 원리로 한다. 따라서, 작업전극에 특정 전위 범위를 제어가능하도록 인가할 수 있는 수단을 사용함이 바람직하며, 일례로써 전위차계(potentiostat)를 이용할 수 있다.

상기 제2단계의 변화하는 전위의 인가 범위는, 아세트산염의 산화-환원반응이 발생하되 전해질 용액의 염 및 물의 산화-환원반응은 발생하지 않는 범위일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명은 외부적 영향은 배제한 채 오로지 생물막 요인만을 직접적 측정 대상으로 하므로, 작업전극에 인가되는 전위 범위에서 오로지 아세트산염의 산화-환원 반응만이 발생함이 바람직하다.

예를 들어, 염화칼륨 수용액을 전해용액으로 사용하여 순환전압전류법으로 전위를 1230mV 미만 범위에서 변화시킬 경우, 칼륨 염, 염소 염, 물 분자의 표준전극전위보다 작은 전위가 인가되기 때문에 반응이 일어나지 않지만, 290mV의 표준전극전위를 갖는 아세트산염은 반응하여 산화, 환원이 일어나고, 이로써 아세트산염에 의해 전류변화를 일으킬 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 변화하는 전위의 인가 범위는, 아세트산염의 표준전극전위(290mV)를 기준으로 ±100mV 내지 ±900mV로 인가할 수 있다. 예를 들어, 전위차계를 이용하여 아세트산염의 표준전극전위를 기준으로, ±500mV의 범위로 전위를 인가하는 경우, 약 -200mV에서부터 약 800mV의 전위를 순환하면서 작업전극에 변화하는 전위를 인가할 수 있다. 이때 상기 범위에는 아세트산염의 표준전극전위가 포함되므로, 아세트산염의 산화-환원 발생으로 전류의 변화가 측정될 수 있다. 다만, 전위의 범위를 ±100mV 보다 작게 하는 경우, 전류의 변화가 크지 않아 이를 제대로 측정하기 어려울 수 있으며, ±900mV 보다 크게 하는 경우, 전해질 용액에 의한 산화-환원 반응이 발생하여 외부적 요인이 개입될 여지가 있다. 상기 전위의 인가 범위는 사용하는 전해질 용액에 따라 이의 산화-환원 반응이 발생하지 않을 수 있는 범위 내로 당업자가 적절히 선택할 수 있다.

상기 제3단계는 상기 생물막 내의 미생물이 생산한 아세트산염의 산화-환원반응으로 얻어지는 순환전압전류곡선을 측정하는 단계로서, 상기 제2단계에서의 변화하는 전위에 따른 아세트산염의 산화-환원반응으로 인한 전류변화를 측정하는 단계이다.

상기 제2단계와 같은 순환전압전류법으로 얻는 전류(Current) - 전위(Potential) 곡선을 순환전압전류곡선(Cyclic voltammogram)이라 하며, 그 일례로는 앞서 설명한 도 1b과 같다.

본 발명의 일 실시에에 있어서, 생물막이 형성된 작업전극을 3-전극 전기화학 셀에 설치하고, 염화칼륨 수용액을 전해용액으로 사용하고, 이 시스템을 -200mV에서부터 약 800mV로 전위를 변화시켜가면서 순환전압전류법으로 측정함으로써, 그 결과인 순환전압전류곡선을 도 6과 같이 얻었다. 상기 도 6에 나타난 바와 같이, 생물막이 형성되지 않은 경우에는 아무런 전류 변화가 없었지만, 생물막이 형성된 경우에는 전류 변화가 발생함을 확인할 수 있으며, 이로써 외부의 환경적 요인은 배제된 채 오로지 생물막을 직접적으로 측정할 수 있음을 확인하였다(실시예 3).

상기 제4단계는 상기 제3단계에서 측정된 순환전압전류곡선으로부터 생물막 형성량을 산정하는 단계로서, 순환전압전류곡선을 기-측정된 결과와 상대적으로 비교하여 생물막 형성량을 측정하는 단계이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 순환전압전류법으로 측정된 순환전압전류곡선의 경우, 생물막의 형성 정도에 따라 아세트산염의 농도가 증가함으로써 전류의 세기도 더 크게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, 아세트산염의 표준전극전위인 290mV에서의 전류와 생물막 형성량의 관계를 나타낸 도 7의 경우, 생물막 형성량이 많아질수록 290mV의 전위값에서의 전류량이 증가하는 것을 확인할 수 있다(실시예 3). 이를 통하여 본 발명에 따른 측정방법은 전류 변화를 통한 생물막 형성 여부를 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 전류량의 크기를 비교하여 생물막의 형성 정도까지도 측정할 수 있다.

본 발명은 기판 및 상기 기판 상에 생물막이 형성된 전극을 포함하는 작업전극; 상대전극; 상기 작업전극과 상대전극이 위치하는 전해질 용액; 및 상기 작업전극, 상대전극 및 전해질 용액을 수용하는 셀을 포함하는 전기화학셀;

상기 전기화학셀에 전기적으로 연결되어 상기 작업전극 및 상대전극의 양단에 변화하는 전압을 인가함으로써 상기 작업전극에 변화하는 전위를 순환전압전류법에 따라 인가하는 전위차계; 및

상기 생물막 내의 미생물이 생산한 아세트산염의 산화-환원반응으로 얻어지는 순환전압전류곡선을 측정하고 이로부터 생물막 형성량을 산정하는 컴퓨터를 포함하는 생물막 형성량 측정기를 제공한다.

본 발명에 따른 생물막 형성량의 측정방법은 상기 생물막 형성량 측정기를 통해 수행될 수 있다.

상기 생물막 형성량 측정기에 있어서, 상기 전해질 용액은 상기 아세트산염의 표준전극전위에서 산화-환원반응이 발생하지 않는 것임이 바람직하다.

나아가, 상기 전기화학셀은 작업전극의 전위강하를 측정하여 이의 전위를 계속적으로 보정하도록 하는 기준전극을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 미생물 대사과정 중에만 발생하는 물질인 아세트산염을 직접 전기화학적으로 측정하여 생물막 형성량을 산정함으로써, 종래의 전기화학적 생물막 측정법의 장점은 유지함과 동시에 외부요인에 의한 영향을 배제하여 생물막의 신뢰성 높은 직접 측정이 가능하다.

도 1a는 순환전압전류법에 있어서 작업전극의 전위를 일정 범위 내에서 삼각파형태로 반복적으로 변화시키는 것을 나타낸 예시적인 그래프이며, 도 1b는 순환전압전류법으로 얻어지는 전류 - 전위 곡선인 순환전압전류곡선을 나타낸 예시적인 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 작업전극의 제조 공정에 대한 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 완성된 작업전극의 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 완성된 3-전극 전기화학셀의 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물의 배양정도와 생물막 형성정도를 관찰한 광학현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 생물막에 대한 순환전압전류곡선이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 아세트산염의 표준전극전위인 290mV에서의 전류와 생물막 형성량의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 8은 Pseudomonas aeruginosa wild type과 rpoN type의 생물막에 대한 순환전압전류곡선을 비교한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 작업전극 상에서 이루어지는 아세트산염의 반응에 대한 개요도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 전기화학셀의 제작

본 발명에 따른 생물막 형성량을 측정하는 방법에 사용되는 예시적인 전기화학셀을 다음과 같이 제작하였으며, 특히 전기화학셀에 장착되는 작업전극에 대한 공정의 개요를 도 2에 나타내었다.

실리콘 웨이퍼 표면에 절연층으로써 질화막을 성장시킨 후 질화막 표면과 금과의 접착력을 개선하기 위해서 크롬을 증착한 뒤 금을 증착하였다. 증착된 금 표면에 AZ1512 양성감광제(AZ1512 Photoresistor, Clariant, Swiss)를 500 rpm에서 5초, 4000 rpm에서 30초 스핀코팅하여 1.2㎛의 두께로 코팅하였다. 그 후 감광제를 경화시키기 위해 105℃로 예열된 핫플레이트 상에서 90초간 초벌구이를 진행하였다. 가열된 웨이퍼를 약 5분간 대기상태에 두어 안정화 과정을 거친 후 노광기를 이용하여 전극과 단자형상의 마스크를 진공접촉시켜 8초간 365.4nm 파장대의 자외선을 조사하였다. AZ 300 MIF 현상액(AZ 300 MIF Photoresist Developer, az Electronic Materials, Germany)으로 60초간 현상한 뒤, 현상된 영역의 불필요한 증착층을 불산과 물을 부피기준으로 1:2로 혼합한 용액을 이용하여 제거하였다. 금 박리제(Gold Stripper,Hyodong Chemicak Eng. Co., LTD., Korea)로 증착된 금층을 제거하고 크롬 박리제(Chrome mask Etchant, Osgood Court, U.S.A.)로 접착력개선을 위해 증착 된 크롬층도 제거하여 단자와 전극을 형성하였다.

단자와 전극이 형성된 웨이퍼를 SU-8음성감광제(SU-8 2050, NIPPON KAYAKU Co., Japan)를 500 rpm으로 5초, 1000 rpm으로 30초 스핀코팅하여 160㎛두께로 코팅한 뒤 65℃의 핫플레이트에서 5분간 초벌구이하고 95℃에서 30분간 재벌구이 하여 경화시킨 뒤, 대기상태에서 안정화시켰다. 안정화를 거친 후 노광기를 이용하여 절연층 형상의 마스크를 진공접촉시켜 17초간 365.4 nm 파장대의 자외선을 조사하고 SU-8 현상액으로 절연층을 현상하고 65℃의 핫플레이트에서 5분간 초벌구이하고 95℃에서 12분간 재벌구이하여 경화시킴으로 절연층을 형성하였다. 완성된 작업전극을 도 3에 나타내었다.

상기 제작된 작업전극, 백금 상대전극 (Platinum Wire Counter Electrode, Digi-Ivy Inc., U.S.A.), 은/염화은 기준전극 (Ag/AgCl KCl saturated Reference Electrode, Digi-Ivy Inc., U.S.A.)을 PVC로 가공 제작된 셀 캡(Cell cap)에 장착하고 글라스 셀(Glass cell, Digi-Ivy Inc., U.S.A.)과 결합하여 3-전극 전기화학셀을 제작하였다. 이를 도 4에 나타내었다.

실시예 2: Pseudomonas aeruginosa 배양

영하 70℃에 냉동보관중인 Pseudomonas aeruginosa wild type과 rpoN type의 균주(이화여대 나노바이오공학과 제공)를 각각 상온에서 해동하여 100 ㎍/ml의 카르메니실린(carbenicillin)이 포함된 5ml의 멸균배지(LB broth)에 최종농도가 1%(v/v)가 되게 접종하고 37℃로 설정된 진탕배양기에 넣고 200 rpm으로 17시간 진탕배양 하여 10⁹ cells/ml로 배양하였다.

진탕배양된 균주를 10㎕ 채취하여 형광현미경으로 배양정도를 확인하여, Ø 100 mm의 페트리 디쉬에 IPA(Isopropyl Alcohol)로 세정한 상기 실시예 1의 작업전극을 100 ㎍/ml의 카르메니실린이 포함된 15 ml의 멸균배지(LB broth)와 넣고 진탕배양된 Pseudomonas aeruginosa를 1%(v/v)가 되도록 접종하였다. 균주가 접종된 페트리 디쉬를 37℃로 설정된 배양기에 넣고 시간대 별로 수거하여 각각 2, 4, 6, 8, 12, 24 시간 동안 생물막을 형성시켰다. 형성된 생물막은 관찰을 용이하게 하기 위하여 1% 농도의 Crystal violet으로 염색하여 광학현미경으로 배양정도와 생물막 형성정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

형성된 생물막을 현미경을 통해서 관찰하였을 때, wild type의 경우 6시간부터 두께 5㎛정도의 얇고 투명한 점액질형태의 생물막이 관찰되었고, 이후 시간이 점차 흐를수록 얇은 생물막은 점점 두텁게 쌓여가는 것을 관찰할 수 있었다. 24시간 배양하였을 때의 막의 두께는 약 80㎛정도로 확인되었다.

rpoN type의 경우 12시간 정도 배양되었을 때 두께 5㎛정도의 얇은 막이 형성됨을 관찰하였다.

실시예 3: 순환전압전류법 측정

상기 실시예 2의 생물막이 형성된 작업전극을 상기 실시예 1의 3-전극 전기화학 셀에 장착하고, 이에 대하여 순환전압전류법으로 측정하였다.

기준전극에 필링용액(3M CaCl)을 채워 하루정도 안정화시켰다. 상기 전기화학셀에 전해질 용액으로 1M의 염화칼륨(KCl) 수용액 25ml를 넣은 뒤, 전위차계(Potentiostat, versa stat II, Princeton Applied Research, USA)에 상기 전기화학셀을 연결하였다.

측정 소프트웨어로는 전기화학 신호 분석프로그램 Versa Studio V2(Princeton Applied Research, USA)를 사용하였으며, 전위범위는 -200mV에서 800mV 범위에서 전위 주사 속도 100 mV/s (step: 1 mV)의 순환전압전류법으로 실시하였다.

상기와 같이 염화칼륨 수용액을 전해질 용액으로 사용했을 때 측정된 Pseudomonas aeruginosa wild type 생물막의 순환전압전류곡선을 도 6에 나타내었다. 대조군으로 작업전극 상에 아무것도 형성되지 않은 경우(0 hour)의 순환전압전류곡선에서는 전류의 변화가 나타나지 않음을 볼 수 있다. 이는 염화칼륨 수용액은 인가한 전위범위인 -200~800mV에서 산화, 환원반응이 일어나지 않기 때문이다.

반면, 작업전극 표면에 Pseudomonas aeruginosa가 배양된 경우(2~24 hours), 순환전압전류곡선에서 인가 전압의 변화에 따라 전류가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이는 생물막 내의 미생물에 의해 발생된 아세트산염이 상기 전위범위에서 산화-환원됨으로써, 순환전압전류곡선에 전류의 변화가 나탄 것이다.

나아가 아세트산염의 표준전극전위인 290mV에서의 전류와 생물막 형성량의 관계를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 생물막 형성량이 많아질수록 290mV의 전위값에서의 전류량이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이는 생물막 내의 아세트산염이 물분자와 반응하여 이산화탄소, 중탄산염, 수소 이온 그리고 전자를 내놓는 산화반응을 함으로써, 작업전극표면에서의 농도불균형으로 해리된 전해용액의 이온이 작업전극으로 이동하여 전류가 증가하는 현상이다. 즉, 생물막 형성량이 늘어날수록 아세트산염의 양도 늘어나며, 따라서 산화되는 물질의 양이 늘어남으로써 전류 값이 증가하는 것을 관찰 할 수 있다. 이러한 관계를 이용하여 전류량을 비교함으로써 생물막 형성량을 측정할 수 있음을 확인하였다.

또한 wild type과 rpoN type의 순환전압전류곡선을 비교하여 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, wild type은 rpoN type보다 동이 배양 시간에서 상대적으로 생물막 형성량이 많기 때문에 wild type의 전류 값이 rpoN type보다 더 높게 나타남을 확인할 수 있다.

Claims (10)

1. 생물막이 형성된 작업전극(working electrode) 및 상대전극(counter electrode)을 전해질 용액 내에 위치시키는 제1단계;
   상기 작업전극 및 상대전극의 양단에 변화하는 전압을 인가함으로써 상기 작업전극에 변화하는 전위를 순환전압전류법에 따라 인가하는 제2단계;
   상기 생물막 내의 미생물이 생산한 아세트산염의 산화-환원반응으로 얻어지는 순환전압전류곡선을 측정하는 제3단계; 및
   상기 제3단계에서 측정된 순환전압전류곡선으로부터 생물막 형성량을 산정하는 제4단계를 포함하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 전해질 용액은 상기 아세트산염의 표준전극전위에서 산화-환원반응이 발생하지 않는 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 전해질 용액은 K⁺, Na⁺, Ca^{2 +}, Ba^{2 +}, Al^{3 +}, Li⁺, Zn^{2 +} 및 Fe²⁺으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 양이온 및 Cl^-, Br^-, NO₃ ^-, S^{2 -} 및 SO₄ ^{2 -}으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 음이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 제2단계의 변화하는 전위의 인가 범위는, 아세트산염의 산화-환원반응이 발생하되 전해질 용액의 염 및 물의 산화-환원반응은 발생하지 않는 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 제2단계의 변화하는 전위의 인가 범위는, 아세트산염의 표준전극전위를 기준으로 ±100mV 내지 ±900mV로 인가하는 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 제1단계는 작업전극의 전위강하를 측정하여 이의 전위를 계속적으로 보정하도록 하는 기준전극(reference electrode)을 전기적 회로에 추가하는 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 Pseudomonas sp., Bacillus sp., Flavobacterium sp., Mycobacterium sp. 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 작업전극 및 상대전극은 각각 독립적으로 백금전극 또는 금전극인 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 기준전극은 은-염화은 기준전극(silver-silver chloride electrode), 포화 칼로멜 기준전극(saturated calomel electrode) 또는 표준 수소 기준전극(standard hydrogen electrode)인 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 제2단계의 변화하는 전위의 인가는 전위차계(potentiostat)를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물막 형성량의 측정방법.

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