KR20150125137A

KR20150125137A - 실크 피브로인 나노입자를 함유하는 화상치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법

Info

Publication number: KR20150125137A
Application number: KR1020140051812A
Authority: KR
Inventors: 박찬흠; 이옥주; 김정호; 이정민; 주형우; 문보미; 박현정; 김동욱; 이민채; 김수현; 유현승; 서준혁; 박초희
Original assignee: 한림대학교 산학협력단; (주)시지바이오
Priority date: 2014-04-29
Filing date: 2014-04-29
Publication date: 2015-11-09

Abstract

본 발명은 실크 피브로인 나노입자를 함유하는 화상치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표면이 매끄럽고 구형에 가깝게 제조된 실크 피브로인 나노입자를 스티렌-아이소프렌-스티렌 코폴리머 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스와 혼합하여 화상치료용 하이드로콜로이드 드레싱을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

실크 피브로인 나노입자를 함유하는 화상치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법{METHOD OF PREPARING HYDROCOLLOID DRESSING FOR TREATMENT OF BURN CONTAINING SILK FIBROIN NANOPARTICLE}

화상은 주로 열에 의해 피부와 피부 부속기에 생긴 손상을 의미한다. 화상은 신체에 열이 가해짐으로써 발생하며, 이때 열이 가해진 강도와 접촉된 시간, 접촉한 생체조직의 열전도 능력에 따라 화상의 깊이와 정도가 결정된다. 화상은 조직 손상의 깊이에 따라 표피층만 손상된 경우를 1도 화상, 표피 전부와 진피의 대부분을 포함한 손상을 2도 화상, 표피, 진피의 전 층과 피하 지방층까지 손상된 경우를 3도 화상으로 구분한다. 화상을 입게 되면 손상 받은 조직에서 프로스타글라딘, 히스타민, 활성산소 등의 염증매개 물질들이 방출되고, 심한 경우 면역기능이 떨어져 감염의 가능성이 커진다.

화상 치유는 드레싱(dressing)재를 사용하여 촉진할 수 있다. 이상적인 화상 드레싱은 화상 조직의 탈수를 방지하고 먼지나 미생물의 침투에 대한 방어 효과를 가지고 있어야 하며, 가스 투과에 유리하고 습윤환경을 유지해야 한다. 또한 비점착성의 특징을 가짐으로써 드레싱 제거 시에 2차적인 손상을 유발하지 않아야 한다. 현재 사용되고 있는 드레싱의 종류는 거즈 드레싱(gauze dressing), 투명 필름 드레싱(thin transparent film dressing), 칼슘알지네이트 드레싱(calcium alginate dressing), 폴리우레탄 폼 드레싱(polyurethane foam dressing), 하이드로화이버 드레싱(hydrofiber dressing), 하이드로콜로이드 드레싱(hydrocolloid dressing), 하이드로겔 드레싱(hydrogel dressing), 항균 드레싱(antimicrobial dressing) 등이 사용되고 있다.

과거에는 거즈와 반창고를 주로 사용하였으나, 최근에는 습윤성 하이드로콜로이드 드레싱 형태의 다양한 생체 재료를 응용한 드레싱이 많이 이용되고 있다. 하이드로콜로이드는 원자나 보통 분자보다는 대체로 크지만 맨눈으로 보기에는 매우 작은 입자로 이루어진 물질. 또는 그 물질이 기체, 액체, 고체 속에서 분산되어 있는 상태를 말한다. 일반적으로 액체 특히 물을 분산매로 하고 물과의 친화성이 좋은 콜로이드를 하이드로콜로이드라고 한다. 합성고분자 화합물 중에는 친수성 화합물의 수용액이 하이드로콜로이드이며, 천연고분자물질은 젤라틴, 콜라겐, 카르복시메틸 셀룰로오즈 등이 물에 용해되어서 하이드로콜로이드를 형성한다. 이러한 물질들을 이용하여 만든 드레싱을 하이드로콜로이드 드레싱이라고 한다. 이러한 드레싱은 화상부위의 삼출액으로 인해 팽윤 되면서 하이드로콜로이드 상태가 되고 화상치료에 적합한 드레싱재가 된다. 예로, 대한민국 특허출원 제10-2010-0079669호에서는 활성 약물을 함유시키기 위한 하이드로콜로이드 제제에 대하여 기술하고 있다. 생체 재료는 생체 내 혹은 생체 외에서 생체안정성(biostability), 생체친화성(bioaffinity), 생체적합성(biocompatibility)의 조건을 만족시켜야 한다. 현재 쓰이고 있는 생체 재료는 금속, 무기물, 합성 고분자 및 천연 고분자 등이 있다. 금속, 무기물에는 티타늄(titanium), 스테인레스강(stainless steel), 세라믹(ceramic) 등이 있고, 합성고분자에는 PVA(polyvinyl alcohol), PCL(polycaprolactone), PEO(polyethylene oxide) 등이 있으며, 천연 고분자에는 콜라겐, 실크 피브로인(silk fibroin) 등이 있다. 이들 중 천연 고분자를 이용한 생체 재료 개발이 많이 진행되고 있다.

하지만, 하이드로콜로이드 드레싱도 제거 시에 점착성 물질에 대한 면역반응과 새로운 육아조직의 손상 등을 초래할 수 있는 문제점을 발생할 수 있다. 이러한 문제점을 보완할 수 있으면서 화상 치료 효과가 뛰어난 하이드로콜로이드 드레싱 개발이 요구되고 있다.

대한민국 특허출원 제10-2010-0079669호

따라서 본 발명은 2차 감염을 예방할 수 있고 수분의 손실을 막을 수 있는 습윤 드레싱으로, 면역반응의 유발이 없고 조직의 손상 없이 제거가 쉬우면서도 활성산소의 농도를 낮추어 화상 치유를 촉진할 수 있는 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱(피복재)의 제조 방법을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

i) 누에고치 또는 견섬유로부터 실크 피브로인 용액을 얻는 단계;

ii) 상기 (i) 단계에서 얻어진 실크 피브로인 용액으로부터 물을 제거하여 실크 피브로인 멤브레인을 얻는 단계;

iii) 상기 단계 (ii)에서 얻어진 실크 피브로인 멤브레인을 분쇄 후 볼 밀링(ball milling)하여 실크 피브로인 나노입자를 얻는 단계;

iv) 스티렌-아이소프렌-스티렌(styrene-isoprene-styrene) 코폴리머를 녹인 후 이에 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 및 상기 단계 (iii)에서 얻어진 실크 피브로인 나노입자를 첨가하여 혼합하는 단계; 및

v) 상기 단계 (iv)에서 얻어진 혼합물을 폴리우레탄 필름에 도포하는 단계;를 포함하는 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱을 제조한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 누에고치 또는 견섬유로부터 실크 피브로인(silk fibroin) 용액을 얻는 단계를 포함한다.

실크 피브로인은 누에고치 또는 견섬유로부터 정련 과정을 거쳐 얻을 수 있고, 당 분야에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행될 수 있다. 실크 피브로인의 정련 과정은, 예를 들면 누에고치 또는 견섬유에서 세리신(sericin)을 제거한 후 얻어진 실크 단백질 또는 실크 단백질 복합체 용액을 탈염 및 건조하여 얻을 수 있다. 여기에서 상기 실크 단백질 또는 실크 단백질 복합체 용액은 브롬화리듐(LiBr), 염화리듐(LiCl₂), 염화아연(ZnCl₂) 또는 염화칼슘(CaCl₂) 중 적어도 하나의 화합물 또는 이를 포함한 에탄올 수용액으로 이루어진 차오트로픽(chaotropic) 염을 사용하여 용해하는 것이 바람직하다. 얻어진 실크 피브로인 용액으로부터 염은 투석으로 제거될 수 있다.

실크 피브로인은 천연 고분자로서 생체적합성이 뛰어나고 면역반응이 없는 특성을 가지고 있다. 특히, 실크 피브로인은 물에 용해되는 장점이 있어 다른 합성고분자들을 용해시키기 위한 유기용매의 독성으로부터 안전한 장점을 가지고 있다.

본 발명은 실크 피브로인 용액으로부터 물을 제거하여 실크 피브로인 멤브레인(membrane)을 얻는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 실크 피브로인 용액을 몰드(mold)에 채운 다음 물을 증발시켜 실크 피브로인 멤브레인을 얻을 수 있다.

본 발명은 실크 피브로인 멤브레인을 분쇄 후 볼 밀링하여 실크 피브로인 나노입자를 얻는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 실크 피브로인 멤브레인을 1차로 분쇄기(mixer)로 분쇄한 다음 분쇄된 실크 피브로인을 볼 밀링(ball milling)하여 더 작고 표면이 매끄러운 실크 피브로인 나노입자를 제조한다. 1차 분쇄 후의 실크 피브로인 입자는 깨진 듯한 입자 구조를 가지며 입자들이 서로 뭉쳐서 존재하는 반면에 볼 밀링을 거치면 실크 피브로인 입자가 구형에 가까워지면 표면이 매끄러워 실크 피브로인 입자들이 서로 뭉치는 현상 없이 고루 분산된 하이드로콜로이드 드레싱을 제조할 수 있다.

본 발명에서 실크 피브로인 나노입자는 바람직하게는 400 내지 600 nm, 더 바람직하게는 450 내지 550 nm의 평균 입자크기를 갖는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 보다 균일한 입자크기의 실크 피브로인 나노입자를 얻기 위하여 볼 밀링하여 얻은 나노입자를 체(sieve)로 거르는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 스티렌-아이소프렌-스티렌(styrene-isoprene-styrene) 코폴리머를 녹인 다음 이에 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) 및 실크 피브로인 나노입자를 첨가하여 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 스티렌-아이소프렌-스티렌 코폴리머는 하이드로콜로이드에 접착성 및 유연성을 부여하고, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스는 콜로이드를 형성할 수 있도록 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 스티렌-아이소프렌-스티렌 코폴리머 100 중량부를 기준으로, 바람직하게는 50 내지 70 중량부의 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 및 1 내지 10 중량부의 실크 피브로인 나노입자가 혼합되고, 더 바람직하게는 60 내지 65 중량부의 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 및 1.5 내지 7 중량부의 실크 피브로인 나노입자가 혼합된다. 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스가 50 중량부 미만으로 포함될 경우 습윤환경 유지의 어려움이 있을 수 있으며, 70 중량부를 초과하여 포함될 경우 성형에 어려움이 있을 수 있다. 실크 피브로인 나노입자가 1 중량부 미만으로 포함될 경우 화상 치료 효과가 미미해 질 수 있고, 10 중량부를 초과하여 포함되더라도 투입에 따른 상승 효과가 적기 때문에 경제상 바람직하지 않다.

본 발명은 스티렌-아이소프렌-스티렌(styrene-isoprene-styrene) 코폴리머에 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및 실크 피브로인 나노입자를 첨가하여 얻어진 혼합물을 폴리우레탄 필름에 도포하는 단계를 포함한다.

혼합물을 폴리우레탄 필름에 도포하는 것은 당 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들면 열 롤러(heating roller)를 사용하여 도포할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱은 화상 부위의 2차 감염을 예방할 수 있고 수분의 손실을 막으면서도, 면역반응의 유발이 없고 조직의 손상 없이 제거가 쉬우며 활성산소의 농도를 낮추어 화상 치유를 촉진할 수 있다.

도 1a는 실크피브로인 멤브레인을 1차 분쇄한 입자, 도 1b는 1차 분쇄 후 볼 밀링 과정을 거친 입자를 전자주사현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2는 하이드로콜로이드 드레싱의 수분 흡수율 그래프이다(C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 3은 하이드로콜로이드 드레싱의 팽윤도 그래프이다(C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 4는 하이드로콜로이드의 세포 적합성을 나타낸 사진이다(C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 5는 랫트에 화상을 유발하고, 치료과정을 촬영한 사진이다(G: 비교예 1, C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 6은 화상 치료 과정 중 화상부위 면적의 변화를 나타낸 그래프이다(G: 비교예 1, C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 7은 화상 치료 과정 중 얻은 조직을 H&E 염색하고 현미경으로 200배 확대하여 촬영한 사진이다(G: 비교예 1, C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 8은 화상 치료 과정 중 얻은 조직을 MT 염색하고 현미경으로 200배 확대하여 촬영한 사진이다(G: 비교예 1, C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 9는 화상 치료 과정 중 얻은 조직의 PCNA 발현을 현미경으로 200배 확대하여 촬영한 사진이다(G: 비교예 1, C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 10은 IL-10, IL-1 alpha의 발현 정도를 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(G: 비교예 1, C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2).
도 11은 화상치유 조직의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(G: 비교예 1, C: 비교예 2, S1: 실시예 1, S2: 실시예 2)

이하에서 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 다만 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 및 2

실크 피브로인 나노입자를 함유하는 하이드로콜로이드 드레싱을 다음의 단계에 따라 제조하였다.

(1) 실크 피브로인 수용액의 제조

누에고치(Bombyx mori)를 0.02M 탄산나트륨에 넣고 100℃에서 30분 동안 가열하여 세리신 단백질을 제거한 후 증류수로 세척하여 정련된 순수한 실크 피브로인을 얻었다. 추출된 실크 피브로인을 염화 칼슘, 에탄올, 증류수를 1:2:8의 비율로 혼합한 용액에 95℃에서 2시간 동안 15 (w/v)%로 용해시켜 실크 피브로인 용액 얻었다. 얻어진 실크 피브로인 용액의 염을 제거하기 위해 여과 후 72시간 동안 투석하여 최종적으로 8 중량%의 실크 피브로인 수용액을 얻었다.

(2) 실크 피브로인 나노입자의 제조

8 중량% 실크 피브로인 수용액을 사각의 몰드(mold)에 가득 채운 후 30℃ 인큐베이터에 보관하여 물을 모두 증발시켜 100% 실크 피브로인 멤브레인을 만들었다. 실크 피브로인 멤브레인을 분쇄기에 넣고 1차 분쇄시킨 후, 볼 밀링(ball milling)하여 입자를 더 작고 부드럽게 만들어 주었다. 분쇄한 입자를 체로 걸러서 평균 입자크기가 500 nm의 나노입자를 얻었다. 1차 분쇄 후 얻어진 입자와 볼 밀링 후 얻어진 입자를 전자주사현미경(SUPRA55V VP-FESEM, Carl Zeiss, Germany)으로 촬영하여 각각 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

(3) 하이드로콜로이드 드레싱의 제조

190-200℃로 예열된 반응조에 60g의 스티렌-아이소프렌-스티렌(styrene-isoprene-styrene, SIS) 코폴리머(기룡통상)를 넣고 30분간 교반하여 녹였다. 스틸렌-아이소프렌-스틸렌이 다 녹으면 이에 각각 39g의 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(고려 CMC)와 1g의 상기에서 제조된 실크 피브로인 나노입자 혼합물(이하에서 “실시예 1”), 및 36g의 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스와 4g의 실크 피브로인 나노입자 혼합물(이하에서 “실시예 2”)을 투입 후 30분간 충분히 교반하였다. 교반이 끝난 다음 폴리우레탄 필름에 열 롤러를 이용하여 도포하였다. 도포 후, 하이드로콜로이드의 온도가 내려가며 경화가 되었고, 경화가 된 하이드로콜로이드에 이형지를 붙였다. 다음으로 제작된 하이드로콜로이드 드레싱을 포장 후 25 kGray의 감마선에서 멸균하였다.

비교예 1 및 2

의료용 거즈(DAE HAN MEDICAL)를 비교예 1으로, 실크 피브로인 나노입자가 함유되지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일한 방법으로 제조된 하이드로콜로이드 드레싱을 비교예 2로 사용하였다.

실험예 1: 물리적 특성 분석

제조된 하이드로콜로이드 드레싱의 물리적 특성을 분석하기 위하여 수분 흡수율 및 팽윤도를 측정하였다.

실험예 1-1: 수분 흡수율

제조된 하이드로콜로이드 드레싱의 수분 흡수력을 확인하기 위해 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 흡수된 하이드로콜로이드 드레싱 무게(Ws)와 건조된 하이드로콜로이드 드레싱 무게(Wd)차를 흡수된 하이드로콜로이드 드레싱의 무게(Ws)로 나누어 백분율로 나타냈다.

도 2로부터 볼 수 있듯이, 실시예 1은 수분 흡수율이 42.58±8.4로 비교예 2의 56.54±6.2에 비해 적은 결과를 나타냈다. 하지만 실시예 2는 57.14±12.3으로 비교예 2에 비해 소폭 상승한 결과를 나타냈다.

실험예 1-2: 팽윤도

제조된 하이드로콜로이드 드레싱이 일정 시간 동안 용액 속에 침지되었을 때의 용적변화율을 확인하기 위해 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 건조된 하이드로콜로이드 드레싱 무게(Wd)와 팽윤된 하이드로콜로이드 드레싱 무게(Ws)차를 건조된 하이드로콜로이드 드레싱 무게(Wd)로 나누어 나타냈다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 비교예 2가 1.33±0.33, 실시예 1이 0.76±0.25, 및 실시예 2가 1.5±0.36의 팽윤도를 나타내어, 실시예 2가 비교예 2과 비교하여 팽윤력이 좋다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 세포독성 MTT 실험

본 발명 드레싱의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT 실험을 수행하였다.

세포 성장을 확인하기 Cell Counting Kit-8을 사용하여 측정하였다. 세포배양에 사용된 배지는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 10% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가해 사용하였다. 세포분열을 위해서 트립신-EDTA(GIBCO, USA)와 인산완충액(PBS)을 사용하였다. 실험에 사용된 세포는 NIH3T3 섬유아세포와 U2OS 골육종 세포를 사용하였고, 각각 5×10³ cell/ml로 96 well plate에 분주하였다. 1, 3, 5일 각각에 CCK-8 용액을 배양액의 1/10씩 넣은 다음 2시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양한 후 1.5 ㎖ 튜브에 용액을 옮기고 나서 초음파 세척기로 5분간 용해하였다. 용해된 용액을 96 well에 100 ㎕씩 분주하고 ELISA 플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 드레싱은 세포 적합성에 문제가 없었다.

실험예 3: 화상 치유 효과 동물 실험

본 발명 드레싱의 화상치료 효과를 확인하기 위하여 동물 실험을 진행하였다.

모든 실험군에 럼푼(rompun)과 케타민(ketamine)을 1:2로 혼합한 마취액 1.5 ㎖을 복강 주사하여 전신 마취시킨 후 랫트(rat)의 등 부위 털을 제거하였다. 2도 화상을 유도하기 위해 60℃의 1 × 1.5 cm 크기의 가열판를 이용하여 등의 네 부위에 15초간 처리했다. 각 화상 부위에 의료용 거즈(비교예 1), 및 비교예 2, 실시예 1 및 2의 드레싱을 덮은 후 랫트의 활동이나 이물질을 제거하기 위한 행동으로 드레싱이 떨어지는 것을 방지하기 위해 필름 드레싱(3M Tegaderm^™ Film)을 하고, Surgifix 붕대를 사용하였다. 드레싱은 3주 동안 2일마다 교체하였으며, 이 기간 동안 OHP필름을 사용하여 화상 조직의 면적을 기록하고, INNERVIEW 2.0 software (INNERVIEW, Korea)를 사용하여 면적을 측정하였다. 각각의 실험군은 1, 3, 7, 14 및 21일차에 3마리의 동물을 희생시킨 다음 화상 부위의 조직을 적출하여 조직학적 관찰 및 유전자 분석을 시행하였다.

드레싱 후 1일, 3일, 7일, 14일 및 21일에 육안으로 관찰(도 5)하여 그 측정 결과를 도 6에 그래프로 나타내었다.

육안 관찰 결과 화상 치유 기간 중 비교예 1의 경우 7일차에 염증반응에 의한 팽창이 일어난 반면, 실시예 1이나 실시예 2의 경우 3일차에 팽창이 일어난 후 상처 부위가 7일차부터 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 비교예 2보다 실시예 1 및 실시예 2에서 21일차에서 상처 면적이 감소하는 것이 관찰되었다.

실험예 3-1: 조직학적 관찰(H&E 염색, MT 염색 및 IHC 염색)

화상 유발 후 1, 3, 7, 14 및 21일차에 동물을 희생시켜 화상 전체가 포함된 조직을 적출하고, 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후, 화상으로 인한 손상 조직을 취하여 탈수 후에 파라핀으로 포매하였다. 조직 절편기를 이용하여 조직을 5 ㎛의 두께로 박절하고 슬라이드에 붙여 파라핀 제거 및 함수과정을 거친 후, 헤마토자일린-에오신(hematoxylin-eosin, H&E) 염색, Masson's trichrome(MT) 염색 및 Immunohistochemistry(IHC) 염색을 실시하였다. 이를 이용하여 화상 조직의 상피 재생(epidermal growth), 염증 반응, 신생혈관 증식(neo-vascular proliferation) 및 교원질(collagen)의 침착 정도를 관찰하였다.

(1) H&E 염색

조직 절편을 자일렌으로 파라핀 제거 후 100, 90, 80, 70% 에탄올과 증류수로 각각 5분간 함수시켰으며, 증류수로 세척한 후 사용하였다. Harris 헤마토자일린으로 3분간 염색하였고, 증류수로 조직을 5분간 세척하였다. 세척이 끝난 조직을 에오신으로 5분간 염색 후, 70, 80, 90 및 100% 에탄올 및 자일렌을 이용하여 탈수한 후에 Shandon Synthetic Mountant(Thermo scientific, USA)로 봉입하였다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 1일과 3일차에는 상피 및 일부 진피, 모낭의 열에 의한 괴사가 모든 군에서 일어났다. 7일 후, 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 2는 괴사된 조직 밑 상피의 재생을 위한 세포 군집이, 비교예 1보다 증가하였고, 특히 실시예 2의 경우 괴사조직이 거의 없어진 것을 확인할 수 있었다. 14일 후, 비교예 1 및 비교예 2에 비해 실시예 1 및 실시예 2의 경우 가피(crust)의 형성이 적고 고르게 형성되어있는 것을 확인하였다. 21일 후, 비교예 1과 비교예 2는 가피가 남아있고 상피의 재생이 적은 반면, 실시예 1 및 실시예 2의 경우 상피의 재생이 많이 관찰되고, 케라틴 형성도 관찰되었다.

(2) MT 염색

조직 절편을 자일렌으로 파라핀 제거한 후 100, 90, 80 및 70% 에탄올과 증류수로 각각 5분간 함수시켰으며, 증류수로 세척한 후 사용하였다. 60℃의 Bouin's(IMEB, USA) 용액에 한 시간 동안 조직을 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. 반응과 세척이 끝난 조직을 다시 Biebrich scarlet-acid fuchsin, phosphomolybdic-phosphotungstic acid, aniline blue stain solution(IMEB, USA)으로 각각 5분간 처리한 후 증류수로 세척하였다. 70, 80, 90, 100% 에탄올 및 자일렌을 이용하여 탈수한 후 Shandon Synthetic Mountant(Thermo scientific, USA)로 봉입하였다.

도 8에서 볼 수 있듯이, 1일과 3일차에는 화상으로 인한 콜라겐 형성이 없는 반면, 7일차의 경우 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1에서 상처 내 미성숙 섬유화 전층이 넓은 반면 실시예 2는 미성숙 섬유화 전층이 얇고 콜라겐이 많이 침착 되어 있는 것을 확인할 수 있다. 하지만 14일차 이후부터는 실시예 1도 콜라겐 형성이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 21일차에는 실시예 1 및 실시예 2에서 케라틴 형성과 많은 양의 콜라겐 형성을 확인하였다.

(3) IHC 염색

조직 절편을 자일렌으로 파라핀 제거 후 100, 90, 80 및 70% 에탄올과 증류수로 각각 5분간 함수시켰으며, 증류수로 세척한 후 90℃, 1× 시트르산 완충액(citrate buffer)에 10분간 침지시켰다. 다음으로 PBST(PBS containing 0.1% Tween-20) 완충액으로 세척 후 normal blocking serum을 이용하여 blocking후 1차 항체(anti-PCNA mouse)를 사용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. PBST 완충액으로 1차 항체를 세척한 후 2차 항체(anti-mouse rabbit)를 30분간 처리하고 나서 PBS로 세척한 다음 ABC reagent(VECTASTAIN^® ABC KIT)로 처리하였다. DAB solution을 처리 후 0.1M PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다. 헤마토자일린으로 3분간 염색하였고, 증류수로 조직을 5분간 세척하였다. 세척이 끝난 조직을 에오신으로 5분간 염색 후, 70, 80, 90, 100% 에탄올 및 자일렌을 이용하여 탈수한 후에 Shandon Synthetic Mountant (Thermo scientific, USA)로 봉입하였다.

도 9에서 볼 수 있듯이, 비교예 1 보다 실시예 1 및 실시예 2에서 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1 및 실시예 2에서는 각질생성세포를 형성하는 기저층에서 PCNA의 발현이 집중적으로 형성되어있는 것을 확인하였다. 기저층은 모세혈관으로부터 영양분을 공급받아 지속적인 세포분열을 통해 새로운 세포를 만들어내 피부 표면으로 밀어 올려 새로운 피부를 생성하는 역할을 하는데 실크 피브로인을 함유하는 하이드로콜로이드 드레싱이 세포의 생성을 촉진하여 이러한 결과가 나온 것으로 생각되었다.

실험예 3-2: RT ( real time )- PCR 에 의한 유전자 발현 확인

화상 치유 과정에 관여하는 성장인자의 변화를 확인하고자 조직 재생에 관여하는 성장인자인 TGF-beta(transforming growth factor beta), PDGF(platelet-derived growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 발현 정도를 RT(real time)-PCR로 확인하였다.

화상의 중심부분을 채취하여 액체 질소로 급속동결 후 -80℃에서 분석하기 전까지 보관했다. RNA-Bee(TEL-TEST, USA)를 이용하여 화상 조직에서 추출한 RNA로부터 Maxime RT Premix(Oligo dT primer) kit(Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. quantitative polymerase chain reaction(qPCR)은 Roter-Gene SYBR Green PCR reagent system(Qiagen, Germany)을 사용하여 측정하였다. 각각의 프라이머(primer) 서열 정보는 다음과 같다.

도 10에서 볼 수 있듯이, IL-10(interleukin 10)은 각질 형성 세포의 사이토카인의 하나로서 염증반응을 완화시켜 줌으로써 지나친 염증반응에 의한 피부괴사를 막아준다고 알려져 있다. 이러한 IL-10의 발현양상을 관찰한 결과 실험에 사용한 모든 군에서 1일차에 비해 7일차에서 발현양상이 줄어들었다가, 14일차와 21일차에 순차적으로 증가하는 양상을 나타냈다. 다만 특이한 점은 실시예 2의 경우 다른 실험군과 다르게 1일차에서 발현이 적은 것이 관찰되었다. 다음으로 1차 염증반응에 관여하는 사이토카인으로 다른 사이토카인을 촉진하여 혈관 내피세포 유착 및 각질형성세포 증식에 촉진하는 IL-1α(interleukin 1 alpha)의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과 실시예 2의 경우 1일차를 제외한 7일, 14일, 21일차에서 다른 군에 비해 IL-1α의 발현이 증가하는 양상을 확인하였다. 이러한 IL-1α의 발현 촉진으로 인해 실시예 2의 화상 치유 효과가 좋은 것으로 생각되었다.

실험예 3-3: Reactive Oxygen Species 측정

본 발명 조성물의 화상치료 효과를 확인하기 위하여 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 측정하였다.

각각의 드레싱 처리 화상조직을 분쇄 후 PBS용액에 30 mM의 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(Sigma-Aldrich, U.S.A)을 넣고 30분 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm에서 10분 동안 돌린 다음 상층액을 버리고 새로운 PBS를 300 ㎕ 넣고 초음파 세척기로 5분간 용해하였다. 다시 한번 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm에서 10분 동안 돌린 후 상층액을 96 well plate에 200 ㎕씩 분주하고 ELISA 플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 485 nm와 530 nm 사이에서 흡광도를 측정하였다.

도 11에서 볼 수 있듯이, 실시예 1 및 실시예 2의 경우 비교예 1 및 비교예 2에 비해 ROS 발현이 줄어들었고, 실크 피브로인의 농도가 높을수록 ROS 발현이 더 줄어드는 것을 관찰하였다.

Claims

i) 누에고치 또는 견섬유로부터 실크 피브로인 용액을 얻는 단계;
ⅱ) 상기 (i) 단계에서 얻어진 실크 피브로인 용액으로부터 물을 제거하여 실크 피브로인 멤브레인을 얻는 단계;
ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 얻어진 실크 피브로인 멤브레인을 분쇄 후 볼 밀링(ball milling)하여 실크 피브로인 나노입자를 얻는 단계;
ⅳ) 스티렌-아이소프렌-스티렌(styrene-isoprene-styrene) 코폴리머를 녹인 후 이에 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 및 상기 단계 (ⅲ)에서 얻어진 실크 피브로인 나노입자를 첨가하여 혼합하는 단계; 및
v) 상기 단계 (ⅳ)에서 얻어진 혼합물을 폴리우레탄 필름에 도포하는 단계;를 포함하는 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)의 실크 피브로인 나노입자의 평균 입자크기가 400 내지 600 nm인 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅳ)에서 스티렌-아이소프렌-스티렌 코폴리머 100 중량부에 대하여 50 내지 70 중량부의 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 및 1 내지 10 중량부의 실크 피브로인 나노입자가 혼합되는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법.
제3항에 있어서, 스티렌-아이소프렌-스티렌 코폴리머 100 중량부에 대하여 60 내지 65 중량부의 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 및 1.5 내지 7 중량부의 실크 피브로인 나노입자가 혼합되는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조된 실크 피브로인 함유 화상 치료용 하이드로콜로이드 드레싱.