KR20150110908A - 진세노사이드 Rg3를 함유하는 간독성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 GSH 함량 증가 및 Nrf2 핵 이동을 매개함으로써 간독성을 해독할 수 있는 Rg3를 유효성분으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 조성물은 독성으로부터 간을 보호하는 효과가 탁월하며, 천연성분으로 체내 부작용도 없기 때문에 간독성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 용도로 사용할 수 있으며, 나아가 간독성 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품학적 용도로 사용할 수 있는 장점이 있다.

Description

진세노사이드 Rg3를 함유하는 간독성 질환 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING HEPATOTOXICITY DISEASE COMPRISING GINSENOSIDE RG3}

본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Mrp 유전자의 차별적 조절을 통하여 간-신장 배설을 촉진하고 담즙 순환을 억제함으로서 간독성을 해독할 수 있는 Rg3를 유효성분으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라에서는 식생활의 서구화와 생활양식의 변화로 비만, 고혈압, 당뇨병, 간질환, 심혈관계 질환 등의 생활습관병이 가장 큰 문제가 되고 있다. 그 중 현대인들은 불규칙적인 식사, 과다한 음주 및 흡연 등으로 인하여 간기능이 손상되거나 심하면 간질환으로 발전하는 경우가 빈번하게 일어나고 있다. 급성간염, 만성간염, 간경화, 알콜성 지방간, 간암 등과 같은 간기능의 손상 및 간질환은 인체에 치명적인 영향을 미치며 또한 회복하기도 어렵다.

간은 물질대사에 중요한 역할을 하는데, 유해 화학물질에 의해 간이 손상을 입으면 간 기능이 저하된다. 따라서, 유해물질로부터 간 손상을 방지하고 손상된 간 보호를 위한 소재개발에 다양한 연구가 수행되었다. 이러한 연구로는 표고버섯추출, 칡의 카네킨 및 양파추출물이 간 보호기능을 갖는 것으로 보고되었다. 또한 우리나라의 경우 간질환은 간염 바이러스의 보균이나 음주습관 때문에 발생되는 예가 많은데, 특히 과음, 폭음, 잦은 음주 형태의 알코올 섭취는 대부분이 음주 후 숙취 제거를 위한 음료나 약물의 섭취로 이어지는 경향이 많다. 따라서 숙취제거를 위한 음료나 약물에 대한 관심 증가와 더불어 이와 관련된 연구가 많이 수행되어져 왔으나, 그 효과가 두드러지게 나타나는 것은 의외로 적다. 이와 관련된 연구로는 혈중 알코올 농도와 숙취해소에 관한 한방 기능성 음료, 헛개나무 추출물 등에 관한 연구가 있다.

이러한 간 손상을 억제하고 간 보호를 위해 각종 제제 형태의 의약품이 개발되었으나 대부분 부분적인 효과가 있기는 하지만 약효가 미미하고, 일부는 고가의 생약제를 사용함으로써 이용효율이 떨어진다는 단점이 있다.

한편, 아세트아미노펜은 전 세계적으로 많이 이용되고 있는 진통제로, 상용량에서 체내로 투여된 아세트아미노펜은 설페이트와 글루쿠론산(glucuronic acid) 포합체를 형성하여 정상적으로 간에서 대사되어 신장을 통해 배설된다. 아세트아미노펜은 4g/day 이하(성인기준)에서는 안전하지만, 과량 투여 시 (6 g/day 이상, 성인기준) 사람과 동물에서 간의 GSH 함량을 감소시켜, 간과 신장에 치명적인 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 간에서 아세트아미노펜은 시토크롬(cytochrome) p450에 의해 대사되어지고, 여러 가지 대사산물을 형성하게 되는데, 특히 아세트아미노펜은 친전자성 화합물인 N-아세틸-p-벤조퀴논-이민 (NAPQI)으로 산화되고, 이것은 GSH와 결합하여 신장으로 배설되나 지나친 생성은 글루타티온을 고갈시킨다. 즉, 아세트아미노펜이 고용량 투여되는 경우, 간 glutathione S-transferase (GST)에 의하여 글루타티온(glutathione)과 포합하여 acetaminophen mercapturate로 뇨 중으로 배설되면서 간 글루타티온이 결여되므로 해독능이 감소되어 반응성이 강한 물질이 생성되며 이 반응성 물질이 간조직과 반응하여 간손상 또는 괴사를 유발한다.

또한, 독성물질에 대한 간 해독화에서 Nrf2에 의해 매개되는 Mrp family (multidrug resistance-associated protein) 트랜스포터는 반응성 독성 물질의 배설 및 축적에 관여한다. Mrp2는 간독성원인물질인 아세트아미노펜의 중간반응물질 NAPQI를 간으로부터 담즙으로의 배설을 촉진하여 문맥 순환을 통해 독성물질이 배설되지 않아 간독성을 증가시킨다. 그러나, Mrp3는 기저막 (basolateral membrane)을 따라 혈류를 통해 신장으로의 배설을 촉진한다. 따라서 간에서의 Mrp3의 발현 증가와 Mrp2의 억제는 아세트아미노펜에 의해 생성된 반응성 독성 중간 대사체를 효과적으로 배설하여 간독성을 방어할 수 있다.

전 세계적으로 급성간질환에 의한 주사망원인은 오용된 아세트아미노펜 복용은 보고되어 있다. 아세트아미노펜으로 인한 간독성유발 후 적절한 조치가 취해지지 않으면 간기능상실과 후속적으로 사망을 유발한다. 이에, 산업적으로 이용가능하고 경제적인 효율이 높으면서, 간 독성(손상)에 대한 치료와 예방 효과가 우수한 천연물 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

그 중 본 발명자들이 연구 대상으로 선택한 천연물질 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 사포닌을 일컫는 말로, 인삼 사포닌은 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며, 약리효능도 특이하여 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 '진세노사이드(Ginsenoside)'라 불린다. 또한, 진세노사이드는 아글리콘 잔기를 기준으로 다음과 같이 3가지 부류로 분류하고 있다. 첫째는 프로토파낙사디올(Ra1,Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, Rh2 등), 둘째는 프로토파낙사트리올(Re, Rg1, Rg2, Rf, Rh1 등), 셋째로는 올레아놀릭(Ro) 진세노사이드로 분류한다. 이러한 인삼 사포닌은 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당의 수 또는 결합 위치에 따라 약리적 효과가 상이한 것으로 보고되고 있다. 예를 들면, 진세노사이드 Rh2는 20(R)-진세노사이드-Rh2[20(R)-Rh2]와 20(S)-진세노사이드-Rh2[20(S)-Rh2]의 2가지의 입체 이성질체가 존재하는데, 골다공증 치료효과에 대한 20(R)-진세노사이드-Rh2[20(R)-Rh2]와 20(S)-진세노사이드-Rh2[20(S)-Rh2]의 작용을 조사한 결과, 20(R)-Rh2 만이 골다공증 치료에 효과가 있음이 밝혀진 바 있고(Liu et al.,2009), 반면 항암활성에 대해서는 20(R)-Rh2에 비해 20(S)-Rh2가 암세포 증식을 억제하고, 세포주기 중 G1 단계를 어레스트하여 우수한 항암활성을 갖는다는 사실이 밝혀진 바 있다(Zhang et al.,2011).

그러나 아직까지 진세노사이드의 간 독성 관련 효과는 보고된 바 없다.

본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 독성 방어 효능을 나타내는 진세노사이드 Rg3의 새로운 용도를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드 Rg3를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간독성 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

이에 더하여, 본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 치료제를 제공한다.

나아가 본 발명은 진세노사이드 Rg3를 함유하는 조성물을 간독성 질환의 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간독성 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3는 인삼 추출물로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 간독성은 아세트아미노펜의 대사물질인 NAPQI(N-acetyl-para-benzoquinone imine)에 의해 유도되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3는 Mrp 유전자의 차별적 조절을 통하여 간-신장 배설을 촉진하고 담즙 순환을 억제함으로써 간독성을 해독하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 및 간성혼수로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 개체는 사람, 소, 돼지, 말, 양, 염소, 닭, 오리 등의 포유동물일 수 있다.

본 발명에 따른 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 조성물은 독성으로부터 간을 보호하는 효과가 탁월하며, 천연성분에서 기원한 간독성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 용도로 사용할 수 있으며, 나아가 간독성 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품학적 용도로 사용할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 20(S)-ginsenoside Rg3의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 H4IIE 세포에서 NAPQI로 인한 독성에 대해 Rg3가 방어효과를 나타내는 지 알아본 결과이다.
도 3은 Rg3의 GCLC 및 GCLM 유전자 발현 및 GSH 함량에 미치는 영향을 알아본 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Rg3 처리에 따른 Nrf2 핵 전좌 여부를 면역블롯 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Rg3에 의한 GCL 유전자 발현에서 Nrf2 활성 여부가 미치는 영향을 알아본 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Nrf2가 결핍된 세포에서 Rg3와 함께 NAPQI를 처리한 후 GSH 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Rg3 처리에 따른 MRP 패밀리의 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Rg3 처리에 따른 MRP 패밀리의 유전자 발현에서 Nrf2 손실이 미치는 영향을 분석한 결과이다.

본 발명은 간 독성에 대한 진세노사이드 Rg3의 새로운 용도에 관한 것으로서, 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 진세노사이드 Rg3는 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 인삼 또는 홍삼으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있고, 또는 화학적 합성으로 합성된 것을 사용할 수 있으며, 하기와 같은 구조식을 갖는다(도 1 참조).

본 발명에서는 간 독성 관련 진세노사이드 Rg3의 효과를 확인하기 위해 다양한 실험들을 수행하였는데, 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 간 독성을 야기하는 고용량의 NAPQI를 세포에 처리하고 Rg3와 함께 배양한 결과, Rg3가 NAPQI에 의해 고갈된 GSH 함량을 증가시키며, 독성반응으로 인한 AST 및 ALT 수치를 감소시킴을 확인하였다(도 2 및 도 6 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, Rg3가 GSH 합성에 관여하는 유전자인 GCL(GCLC, GCLM 등)의 mRNA의 발현을 증가시키고(도 3 참조), 이로 인해 해독화 및 항산화 유전자의 전사 인자로 잘 알려진 Nrf2의 핵 내 전좌(translocation)가 매개되는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). 그리고 Rg3에 의해 신장 배설에 관여하는 유전자인 Mrp1 및 Mrp3의 mRNA 발현이 증가되고, Mrp2 mRNA는 억제되며, 이는 Nrf2에 의해 조절되는 것임을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).

이때, 본 발명자들은 NAPQI(N-acetyl-para-benzoquinone imine)를 이용하여 간 독성을 유도하고 이에 대한 Rg3의 효과를 알아보았는데, NAPQI는 아세트아미노펜의 대사물질로서 GSH와 결합하여 신장으로 배설되기 때문에 NAPQI의 지나친 생성은 글루타티온을 고갈시키는 문제점이 있다.

GSH는 트리펩타이드(tripeptide)로 과산화수소, 유리기와 결합하여 간세포 내에서 해독작용을 하며, 이 작용에서 중요한 요소는 대사산물 형성속도와 GSH 합성속도 간 균형으로, 이러한 균형이 깨져 GSH 함량이 감소하면 과산화수소가 축적되고 생체막의 구성성분인 고도불포화지방산의 과산화반응이 시작되게 되는 것이다.

상기로부터 본 발명의 진세노이드 Rg3는 Nrf2의 핵 전좌를 증가시킴으로써 GSH 함량을 증가시키고, Mrp 패밀리 유전자의 발현를 증가시켜 간 독성에 대한 방어 효과를 나타낼 수 있는 것임을 알 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 진세노사이드 Rg3은 간 독성으로 인한 질환을 예방, 개선, 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물의 제조에 사용할 수 있으며, 그러므로 간독성 치료제로 사용될 수도 있고, 간독성 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품의 제조에도 사용할 수 있다.

본 발명에서 "간독성 질환"이란 간 손상 유발인자 등 유해한 자극에 의해 간독성이 유발됨으로 인한 질환을 말하며, 예를 들면, 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수 질환일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 간독성 질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 간독성 질환의 발달을 저지시킴;

(2) 간독성 질환의 확산을 예방함;

(3) 간독성 질환을 경감시킴;

(4) 간독성 질환의 재발을 예방함; 및

(5) 간독성 질환의 증상을 완화함(palliating).

본 발명의 약학적 조성물은 진세노사이드 Rg3 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 진세노사이드 Rg3 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 진세노사이드 Rg3는 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 간독성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품도 제공할 수 있는데, “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 간독성 질환 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 진세노사이드 Rg3를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 진세노사이드 Rg3를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 진세노사이드 Rg3를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 진세노사이드 Rg3와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 진세노사이드 Rg3와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이, GSH 함량 증가, Nrf2 핵 전좌 증가, Mrp 패밀리 유전자 발현 증가 등의 효과를 가지기 때문에, 간독성 질환 개선에 효과적이다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

나아가 본 발명은 진세노사이드 Rg3를 함유하는 조성물을 간독성 질환의 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간독성 질환의 치료방법을 제공한다.

이때, 상기 "개체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 사람, 소, 돼지, 말, 양, 염소, 닭, 오리 등의 가축일 수 있고, 가장 바람직하게는 인간을 말한다.

상기에서 투여는 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것이며, 상기 치료학적 유효량은 간독성 질환 또는 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 진세노사이드 Rg3 성분에 대한 치료학적 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임이 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

또한, 본 발명의 치료방법에서 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실험예 ]

본 발명의 실시예는 하기와 같은 조건 및 방법으로 수행되었다.

1. 세포 배양

H4IIE(ATCC CRL-1548, American Type Culture Collection) 세포는 10% FCS(fetal calf serum), 50 units/mL 페니실린, 및 50 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 5% CO₂ 로 습한 공기를 조성한 37℃에서 배양하였다. 야생형 및 Nrf2가 소실된 MEF(Murine embryonic fibroblast)는 10% FBS(fetal bovine serum), 4mML-glutamine, Hepes, 50 units/mL 페니실린, 및 50 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)에서 37℃로 배양하였다.

2. ALT 및 AST 수치 측정

간 손상 마커인 ALT(Alanine Aminotransferase) 및 AST(Aspartate Aminotransferase)의 활성은 배양액에서 cobas 6000 chemistry analyzer(Roche, Mannheim, Germany) 기기를 이용하여 측정하였다.

3. 글루타티온 분석

세포 파쇄액의 GSH 수치는 GSH BIOXYTECH GSH-400 (Oxis International Inc., Portland, OR, USA) 키트를 이용하여 제공되는 프로토콜에 따라 측정하였다.

4. RT - PCR

TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 세포에서 총 RNA를 추출하고, 공지된 방법으로 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 증폭을 수행하였다(M. K. Kwak et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003. 305(3):662-70). 증폭 사이클 수는 대수기를 확인하기 위한 각 프라이머 쌍마다 경험적으로 결정하였으며, GCLC, GCLM, Mrp1, Mrp3, 및 β-actin에 대한 선택적 프라이머 쌍은 대략 55℃의 Tm 값 및 50% 이하로 GC 염기를 함유하도록 설계하였다. 또한, 선택된 뉴클레오티드 서열의 특이도를 확인하기 위해 BLAST 검색을 수행하였으며, 증폭된 DNA의 밴드 강도는 UV transilluminator 에서 영상화한 후 비교하였다.

5. 면역 블롯 분석

SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 면역 분석은 세포의 핵 단백질 및 용해물에서 공지된 방법에 따라 수행하였다(M. K. Cho et al. Mol Cell Biol. 2007. 27(17): 6195-6208; M. K. Cho et al. Hepatology. 2003. 37(3):686-95). 영상화 결과는 ECL chemiluminescence detection kit (Amersham Biosciences, Amersham, UK)를 이용하여 현상하였고, 단백질의 동량 로딩은 β-actin 또는 lamin A 면역 블롯으로 확인하였으며, 단백질 수치의 변화는 Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics Inc, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 측정하였다.

6. siRNA 녹다운( Knockdown )

Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 제공 프로토콜에 따라 H4IIE 세포를 랫트 Nrf2 대항 siRNA 또는 대조군 siRNA(20 nM)로 일시적으로 트랜스펙션시킨 다음, 단백질 샘플에서 Nrf2 녹다운(knockdown)되었는지 확인하였다.

7. 통계분석

처리군 간의 현저한 차이를 평가하기 위해 One-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 사용하였다. 처리에 따른 각각의 현저한 효과에 대해, 다수 군(group) 평균값의 비교를 위해 Newman-Keuls test를 수행하였다. 모든 통계 분석은 양쪽검정하였다.

[실시예 1]

NAPQI 에 대한 Rg3 의 보호 효과

고용량의 NAPQI는 간 독성을 야기하기 때문에 Rg3가 NAPQI로 유도된 독성에 대해 간 보호 효과를 나타내는 지 알아보기 위해, 0~10 μg/mL의 Rg3로 24시간 동안 H4IIE 세포를 전처리 하고 NAPQI(400 μM)와 함께 6시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, NAPQI 처리된 세포의 상청액에서 Rg3 처리 양에 의존적으로 ALT 또는 AST 누출이 저해되는 것으로 나타났다.

또한, 여분의 NAPQI는 빠르게 GSH를 고갈시키기 때문에 남아있는 NAPQI는 간 괴사로 이어진다. 이에, 0~10 μg/mL의 Rg3와 함께 24시간 배양하여 전처리한 H4IIE 세포에 NAPQI(400 μM)를 2시간 동안 처리하고 GSH 수치를 측정하였다.

그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, NAPQI에 의해 저해된 GSH 수치는 대조군의 60%였으나, Rg3로 전처리된 세포는 NAPQI에 의해 저해된 GSH 수치를 역전시키는 것으로 나타났다.

상기 결과는 Rg3가 NAPQI에 대한 간 보호 작용을 할 수 있음을 의미한다.

[실시예 2]

GSH 합성 유전자 발현 및 GSH 함량에 대한 Rg3 의 효과 분석

GSH 합성에서 속도 제어 단계인 GCL(glutamate cysteine ligase)은 환원된 형태의 GSH의 생합성을 조절하므로 GSH 생산에서 GSH 합성의 역할을 알아보기 위해, 세포를 0~10 μg/mL의 Rg3와 함께 12시간 배양하고 RT-PCR 방법으로 GCLC 및 GCLM 유전자 발현 수치를 분석하였다. 유전자 산물의 밴드 강도는 β-actin으로 정량화 및 정규화하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 3~10 μg/mL로 Rg3를 처리했을 때 GCLC 및 GCLM mRNA 수치가 각각 4.5배 및 3배로 현저하게 증가했다.

또한, 이와 같은 유전자 유도가 GSH 수치의 증가로 이어지는 것인지 알아보기 위해, 세포 파쇄액을 0~10 μg/mL의 Rg3와 함께 24시간 배양 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, Rg3 처리 양에 의존적으로(1 μg/mL 처리 시 포화됨) GSH 수치가 증가하였다.

따라서, GSH 함량의 현저한 증가는 Rg3에 의해 GCLC 및 GCLM의 유전자가 유도됨으로써 이루어지는 것임을 알 수 있다.

[실시예 3]

Rg3 - 매개된 Nrf2 의 핵 전좌

Nrf2는 해독화 효소 발현에 대한 핵심 전사인자로서 GCLC 및 GCLM의 전이활성에서 중요한 역할을 함. 따라서 Rg3가 Nrf2 핵 전좌를 유도하는지 알아보기 위해, 0~10 μg/mL의 Rg3와 함께 8시간 배양한 H4IIE 세포의 핵에서 Nrf2 및 대조군 Lamin A의 발현을 각각에 대한 항체를 이용하여 면역블롯 방법으로 분석하였으며, densitometry를 스캐닝하여 그래프화하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, Rg3 양에 의존적으로 Nrf2의 핵 전좌가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

상기 결과는 Rg3에 의한 Nrf2 활성이 GCLC 및 GCLM의 조절과 관련 있음을 의미한다.

[실시예 4]

Rg3 에 의한 GCLC 및 GCLM 유도에서 Nrf2 의 역할 분석

Rg3가 Nrf2의 활성화를 매개하여 GCLC 및 GCLM 유전자의 발현에 영향을 미치는지 규명하기 위해, H4IIE 세포에 Nrf2를 표적으로 하는 siRNA(Nrf2-유전자 녹다운) 또는 대조군 siRNA를 일시적 트랜스펙션시킨 다음 Rg3를 3 μg/mL 첨가 또는 무첨가하여 배양하였다. 그리고 RT-PCR 방법으로 GCLC와 GCLM의 mRNA 수치를 측정하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 12시간 동안 Rg3 (3 μg/mL) 처리한 대조군에서 GCLC와 GCLM mRNA 수치가 증가된 반면, Nrf2 유전자를 녹다운한 세포에서는 Rg3 처리에 따른 GCLC 및 GCLM 유전자 발현의 변화가 없는 것으로 나타났다.

이에, mRNA 수치 변화가 단백질 발현 변화를 동반하는지 알아보기 위해, Rg3 (3 μg/mL) 처리 후 24시간 배양한 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 대조군으로 β-actin을 로딩하였다.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, mRNA 수치 결과와 일치하게 Rg3가 GCLC와 GCLM 단백질 발현을 각각 4.5배 및 3배 상승시킨 반면, Nrf2-유전자가 녹다운된 세포에서는 이러한 Rg3에 의한 GCLC와 GCLM 발현 유도가 감소되는 것으로 나타났다.

또한, Nrf2-siRNA 트랜스펙션된 세포에서 GCLC와 GCLM의 기저점(baseline) 대조군 발현이 매우 낮게 나타나 웨스턴 블롯 방법으로 유전자 녹다운이 되었는지 알아본 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, Nrf2 siRNA 트랜스펙션 48시간 후 유전자가 녹다운되었음을 확인하였다.

다음으로, Nrf2의 역할을 알아보기 위해, 야생형 대조군(Nrf2+/+) 또는 Nrf2-녹아웃군(Nrf2-/-) 마우스의 MEF 세포에 Rg3(3 μg/mL)를 첨가 또는 무첨가하고 12시간 배양하여 Rg3에 의해 유도된 유전자 발현을 분석했다.

그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, Rg3는 야생형 대조군(Nrf2+/+)에서 GCLC와 GCLM mRNA 레벨을 3배 정도 증가시킨 반면, 이러한 유도가 Nrf2-녹아웃 군(Nrf2-/-)에서는 감쇄되는 것으로 나타났다. 그리고 도 5e에 나타낸 바와 같이, Rg3는 야생형 대조군(Nrf2+/+)에서 GCLC와 GCLM 단백질 발현을 각각 4배 및 3.4배 증가시켰으나, Nrf2-녹아웃군(Nrf2-/-)에서는 그렇지 않았다.

상기로부터 Rg3에 대한 유전자 발현에서 대조군 및 Nrf2 결핍군(Nrf2-녹아웃군) 간의 차이가 있으므로, Nrf2 활성화가 NAPQI 독성을 완화시키는 Rg3에 의한 유전자 유도에 중요함을 알 수 있다.

[실시예 5]

Nrf2 -유전자 녹다운군에서 NAPQI 대항하는 Rg3 가 GSH 수치에 미치는 영향 분석

감소된 GSH 다혈증은 GSH 다혈증 및 세포 독성 상태에서 세포 생존에 필요하다. NAPQI에 대한 Rg3의 GSH 수치 반전에서 Nrf2의 역할을 규명하기 위해, Nrf2-표적 siRNA 또는 대조군 siRNA를 일시적 트랜스펙션시켜 Nrf2를 녹아웃 시킨 H4IIE 세포에 Rg3를 첨가(3 μg/mL) 또는 무첨가하고 24시간 배양한 다음, NAPQI (200 μM)를 처리하여 2시간 배양한 후 GSH 수치를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, NAPQI 처리 즉시 GSH 수치가 저해되었으며, 대조군(도 6의 Control siRNA)에서는 Rg3 전처리에 의해 이러한 효과가 현저하게 반전되는 것을 알 수 있었다. 그러나 Nrf2-녹아웃 군(도 6의 Nrf2 siRNA)에서는 Rg3가 NAPQI-매개된 GSH 저해를 반전시키지 못하는 것으로 나타났다.

상기 결과는 NAPQI 독성에 대한 간세포에서 Rg3가 GSH 조절을 하기 위해서는 Nrf2가 필요함을 의미한다.

[실시예 6]

Rg3 에 의해 유도되는 Mrp 패밀리의 유전자 발현 차이 분석

다수의 계(system)에서 GCL와 Mrp는 동시 발현하므로 상기 두 유전자들은 대등하게 조절되는 것으로 볼 수 있다. Mrp 패밀리 수송 발현은 APAP(acetaminophen) 간 독성에 감염되기 쉽게 변형시키는 APAP 대사산물의 유출을 결정하므로, Rg3(1~10 μg/mL)를 12시간 동안 처리하여 Rg3에 의해 유도된 Mrp 패밀리 mRNA 수치를 정량적인 RT-PCR 방법으로 측정하였다. 이때, β-actin을 대조군으로 유전자 산물을 정규화하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, Rg3가 차별적으로 Mrp mRNA 수치를 조절하는 것을 알 수 있다. 간에서 Mrp1 및 Mrp3의 mRNA 수치는 Rg3 처리 양에 의존적으로 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 반면 Mrp2는 억제되었다.

상기 Rg3가 Mrp 유전자 발현에 미치는 영향을 보았을 때, Rg3가 NAPQI 대사산물의 담즙으로의 수송을 저해하고, 소장상피세포 기저막(basolateral membrane)으로의 유출을 야기할 수 있을 것으로 보인다.

[실시예 7]

Nrf2 결핍이 Rg3 에 의한 Mrp 패밀리 수송 유전자 발현 조절에 미치는 영향 분석

Mrp 패밀리 유전자는 Nrf2 표적 유전자로 알려져 있으므로, Nrf2 발현이 저하(녹다운) 또는 제거된(녹아웃) 세포에서 Rg3에 의한 Mrp 패밀리 유전자 조절 효과를 알아보았다. 먼저, H4IIE 세포에 대조군 siRNA(Nrf2 +/+) 또는 Nrf2-특이적 siRNA(Nrf2 -/-) 를 일시적으로 트랜스펙션시키고, Rg3를 3μg/mL 첨가 또는 무첨가하여 12시간 배양한 후 RT-PCR 방법으로 mRNA 수치를 평가한 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 대조군 siRNA로 트랜스펙션된 세포에서 Rg3가 Mrp1 및 Mrp3 mRNA 수치를 증가시키는 반면, Nrf2-siRNA 트랜스펙션된 세포에서는 이러한 Rg3의 조절이 관측되지 않았다.

또한, 야생형(Nrf2+/+) 또는 Nrf2-결핍 마우스(Nrf2-/-)의 MEF 세포에 Rg3를 3μg/mL 첨가 또는 무첨가하여 12시간 배양한 후 RT-PCR 방법으로 mRNA 수치를 평가한 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 야생형 MEF에서는 Mrp1 및 Mrp3 mRNA 수치가 Rg3에 의해 증가된 반면, Nrf2-녹아웃된 MEF에서는 Rg3에 의한 이러한 유도가 관찰되지 않았다.

상기 결과는 Nrf2가 결핍된 모델에서 Rg3에 의한 Mrp 패밀리의 mRNA 수치 증가가 관찰되지 않으므로, Nrf2가 Rg3에 의한 유전자 유도에 필요함을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (7)

1. 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 Rg3는 인삼 추출물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 간독성은 아세트아미노펜의 대사물질인 NAPQI(N-acetyl-para-benzoquinone imine)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 및 간성혼수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 Rg3는 Mrp 유전자의 차별적 조절을 통하여 간-신장 배설을 촉진하고 담즙 순환을 억제함으로써 간독성을 해독하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 및 간성혼수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품.

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