KR20150084862A

KR20150084862A - 면역조절용 사퀴나비어-no

Info

Publication number: KR20150084862A
Application number: KR1020157013049A
Authority: KR
Inventors: 페르디난도 니콜레티
Original assignee: 온코녹스 에이피에스
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2015-07-22
Also published as: AU2013349804A1; US20150283127A1; CN104822379B; CN104822379A; BR112015011299A2; EP2922545A1; EP2922545B1; HK1212895A1; WO2014079868A1; JP2015537023A; MX2015006249A; IL238866A0; CA2891771A1; JP6283680B2

Abstract

자가면역 질환, 특히 염증유발 사이토카인에 의해 조정되는 질환의 치료에 유용한 사퀴나비어의 질산 에스테르, 이의 무독성 염, 용매화물 또는 결정성/다형성 형태에 관한 것이다. 치료될 수 있는 상기 질환의 예는 특발성 애디슨병, 자가면역 간염, 담즙성 간경변증, 원발 경화성 담관염, 길리안바레증후군, 하시모토 갑상선염, 건선, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 루프스, 허혈 재관류의 제1형 당뇨병 및 포도막염, 이식편 대 숙주 질환, 이식편 거부반응, 내외독소혈증 및 통풍성 관절염을 포함한다.

Description

면역조절용 사퀴나비어-NO{Saquinavir-NO for immunomodulation}

본 발명은 면역계의 장애에 의해 야기되는 질환의 치료에 사용되기 위한 사퀴나비어의 질산 에스테르에 관한 것이다.

사퀴나비어 (((2S)-N-[(2S,3R)-4-[(3S)-3-(tert-부틸카르바모일)-데카히드로이소퀴놀린-2-일]-3-히드록시-1-페닐부탄-2-일]-2-(퀴놀린-2-일포르마미도)부탄디아미드) (약칭: Saq)는 인체 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV) 프로테아제 억제제이고, 이는 고활성 항바이러스 요법(Highly Active Anti-Retroviral Therapy: HAART)의 성분으로서 일상적으로 사용된다. 상기 사퀴나비어의 강력한 항바이러스 효과 이외에도, 이 약물은 또한 종양 세포에 강력하게 영향을 미친다 (Toschi et al., 2011). 여전히, Saq의 적용은 그 독성으로 인해 제한되고 있으며(Flexner, 1998), Saq의 항암 특성을 유지하면서 부작용을 줄이려는 아이디어로, 상기 약물의 질산 산화물 (NO)-개질된 버전, 사퀴나비어-NO (Saq-NO)의 세대가 시작되었다. 이 약제는 모체 약물(parental drug)에 대한 NO의 공유 결합에 의하여 생성되고 (Maksimovic-Ivanic et al., 2009 및 WO 2010 / 012466), 연구를 통해, Saq에 비해, 흑색종, 성상 세포종, 전립선 암 세포 및 다양한 인체 다제내성 종양 세포주(multidrug resistant tumor cell lines)를 포함하는 다양한 종양에 대해 우수한 항암 특성을 가지면서도, 그 치료를 받은 쥐에게는 아무런 독성을 가하지 않는다는 것이 보여져 왔다 (Maksimovic-Ivanic et al., 2009; Mijatovic et al., 2011; Rothweiler et al., 2010; Donia et al., 2010; Mojic et al., 2012). 또한, Saq-NO는 그의 모체 약물의 항-HIV 효능은 유지하였다 (Canducci et al., 2011). 이러한 연구들은 Saq-NO가 항-종양 및 항-HIV 치료제로서 가능성을 가짐을 의미한다.

본 발명에서 밝혀진 바에 따르면, 하기 화학식 I을 갖는 사퀴나비어의 질산 에스테르(이하에서 NO-사퀴나비어, Saq-NO 또는 OX-1001로서 지칭됨)는:

사퀴나비어-NO

흥미있는 면역조절 특성을 갖는데, 즉, 다클론성으로 활성화되고(polyclonally-activated) 항원 자극된(antigen stimulated) T 세포들에서 다양한 사이토카인들(cytokines)의 생성을 강력하게 조절한다. Saq-NO는 Th1, Th2,및 염증유발 및 항염증 사이토카인(pro- and anti-inflammatory cytokines)의 생성을 조절할 수 있다. 이 효과는 다클론성으로 자극된 면역 세포들(SPC and LNC) 또는 정제된 T 세포 (CD4+ 세포)의 혼합군에서, 그리고, 항원 자극된 T 세포 (뇌염 유발성 MBP-특이성 세포)에서 마찬가지로 강력하다. 상기 Saq의 면역조절 특성은 건강한 개체의 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) (Delmonte, 2007) 및 Saq로 미리 치료된 쥐의 비장 세포(spleen cells) (Pacifici et al.,1997)를 사용한 시험관 내 및 생체 외 조건(in vitro and ex vivo conditions)에서 연구되어 왔고, 상반되는 결과들이 얻어졌음이 언급되어야 한다. PMA 및 이오노마이신(ionomycin)으로 자극된 인체 PBMC에서, 3 개의 사이토카인들, 즉, IL-2, IFN-감마 및 TNF-알파가 연구되었다 (Delmonte, 2007). 이 연구로부터, Saq는 10 내지 20 μM 범위의 농도에서 TNF-알파의 생성에 영향 없이 IL-2의 합성 및 IFN-감마 생성을 하향 조절한다는 것이 확인되었다. 동시에, Saq는 5 내지 20 mM 범위의 농도에서 PHA 또는 항-CD3-유도 증식을 억제하였다. 대조적으로, 쥐에서 수행된 생체 외 연구에서, Saq로 미리 치료된 쥐로부터 얻은 비장 세포들은 대조 쥐의 비장보다 더 많은 IFN-감마 및 IL-2를 분비하였다 (Pacifici, 1997). 반대로, IL-1 베타, IL-10 및 TNF-알파 생성은 Saq에 대한 생체 내(in vivo) 노출에 의해 조절되지 않았다 (Pacifici, 1997). 따라서, 우리의 시험관 내 연구 결과는, NO-혼성(NO-hybridization)이, 더욱 넓고 더욱 큰 정도의 면역조절(미분획(unfractionated) 비장 세포 및/또는 정제된 새앙쥐 CD4 T 세포들에서의 IFN-감마, IL-17, TNF-알파, IL-4 및 IL-10의 시험관 내 억제를 포함함)을 가져오는 Saq의 완전한(profound) 면역약리학적 개질을 유도함을 나타낸다(도 2 및 3). Saq-NO의 상기 효과는 Saq의 효과보다 더욱 강하고 더욱 큰 정도이며, 일부 사이토카인의 경우 이 효과가 2.5 및 5 mM의 농도에서 이미 관찰가능하였다. Saq의 경우 정제된 CD4+ T 세포로부터의 IL-17 분비에 대한 억제 효과를 제외하고는 이들 농도에서 어떠한 효과도 없음이 나타났다 (도 3). 추가적으로, 분자 연구 결과, Saq-NO는 (Saq는 아님) S6 키나아제의 인산화(phosphorylation)를 억제한다는 것이 밝혀졌다 (도 4). 이러한 데이터들이 취합되어, Saq-NO가 Saq보다 다양하고 대체적으로 더욱 강한 면역 조절 효과를 부여받은 신규 화학 물질(chemical entity)임을 입증한다.

더욱 구체적으로, Saq-NO는 자가면역 질환(autoimmune disease)의 발병에 관여하는 염증유발 사이토카인의 생성, 구체적으로 새앙쥐 SPC, 쥐(rat) LNC 및 정제된 새앙쥐 CD4+ 세포에서 INF-감마, IL-17, TNF-알파, IL-4, IL-10 및 TNF 생성을 하향 조절한다는 것이 밝혀졌다.

중요하게는, Saq-NO는 MBP-특이성 T 세포에서 IFN-g 및 IL-17의 생성을 억제할 수 있었고, 이러한 발견은 중추 신경계(central nervous system: CNS) 자가면역에서의 Saq-NO의 치료적 적용을 지지한다. IFN-g 및 IL-17-생성 세포, Th1 및 Th17 세포 각각은 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS) 및 그것의 동물 모델 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE)의 발병과정에서 중요한 발병 개체들이다 (El-behi et al., 2010; Fletcher et al., 2010; Jager et al., 2010). 중요하게는, Saq-NO는 생체 외 재자극된 DLNC뿐만 아니라, 생체 내 재자극된 SCC에서 IFN-g 및 IL-17 생성을 억제하였고, 이는 성숙하는 그리고 성숙한 작동체(mature effector) Th1 및 Th17 세포들 모두를 강력하게 억제함을 의미한다. 상기 DLNC 및 SCC 생존능(viability)에 대한 효과가 IFN-g 및 IL-17 방출에 대한 효과에 비해 제한됨에도 불구하고, 이러한 효과는 또한 CNS 자가면역에서의 Saq-NO의 치료적 특성을 뒷받침하는 데, 이는 그것이 CNS 염증의 제한에 기여하기 때문이다. 또한, Th1 및 Th17 세포들은, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 호흡기관 염증(respiratory inflammation), 전신성 낭창(systemic lupus) 및 동종이식편 거부반응(allograft rejection)을 포함하는, 다른 장기 특이성 및 전신성 자가면역과 염증 장애(organ-specific and systemic autoimmune and inflammatory disorders)에 중요하다 (Afzali et al., 2007).

Saq-NO는 CD4+ T 세포 내 S6 인산화를 줄이는 데, (반면에 Saq의 이 효과는 훨씬 더 약함), 이는 T 세포 내 사이토카인 생성에 대한 각각의 효과와 부합한다. 상기 관찰된 감소된 S6의 인산화는, Saq-NO가 S6K 활성화에 영향을 미치고, 이러한 효과는 사이토카인 생성에 중요한 영향을 미친다는 것을 의미한다. 실제로, S6K 활성 및 S6 인산화반응은 면역 세포들 내 사이토카인 생성과 관련이 있다 (Lee et al., 2010; Melino et al., 2008; Cao et al., 2008).

Saq-NO는, 이하 보고된 실험 부분에서 실시예의 방식으로 기록된 바와 같이, 다발성 경화증의 두 개의 잘 알려진 모델들에서 강한 예방 및 치료 효과를 발생시키게 되는 완전한(profound) 면역조절 효능을 갖는다.

결과적으로, Saq-NO는 사이토카인의 생성의 조절장애(dysregulation)가 포함된 장기 특이성 및 전신성 자가면역 질환의 치료에 사용되기에 유용하다.

상기 질환의 예는 특발성 애디슨병(idiopathic addison's disease), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 담즙성 간경변증(biliary cirrhosis), 원발 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 길리안바레증후군 (Guillain-Barre syndrome), 다발성 경화증, 시신경염(optical neuritis), 하시모토 갑상선염(Hashimoto’s thyroiditis), 건선(psoriasis), 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 전신성 홍반성 루프스(systemic lupus erythematous), 제1형 당뇨병(diabetes mellitus) 및 포도막염(uveitis)을 포함한다.

또한, Saq-NO는 허혈 재관류(ischemia-reperfusion), 이식편 대 숙주 질환(graft versus host Diseases)의 치료, 및 이식편 거부반응(graft rejection), 내외독소혈증(endo and exo-toxemia) 및 통풍성 관절염(gouty arthritis)의 예방에 유용하다.

또한, 본 발명은 적합한 캐리어(carrier)/부형제(excipients)를 갖는 혼합물(admixture) 중에 Saq-NO를 포함하는 약제학적 조성물(pharmaceutical compositions)을 제공한다. 본 발명의 조성물은 임의의 잘 알려진 경로로, 특히 경구, 비경구(parenteral), (눈을 포함하는) 국소성, 경피성(transdermal), 직장(rectal) 경로로 투여될 수 있다.

투여량은 치료될 병, 환자의 체중, 성별 및 나이에 따른 광범위한 한도 내에서 달라질 수 있다. 보통 단일 투여(single administration)로서든, 또는 2 번 또는 3번 나눈 일일 투여로서든, 어떻게든 날마다 10 내지 1000 mg의 범위일 수 있다. 5-500 mg, 특히 100-250 mg의 1회 투여량(Unit doses)이 사용될 수 있다.

포도막염의 치료를 위하여, 점안액(eye-drops)이 투여 형태로 더 바람직할 수 있다. 국소성/안약 제형(topical/ophthalmic formulations) 중의 활성 성분의 농도는 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.1 내지 2%의 범위일 수 있다. 히알루론산염(hyaluronates), 타마린드씨다당(tamarind seed polysaccharide) 등과 같은 적합한 부형제가 편리하게 사용될 수 있다. 대안적으로, 살균 용액의 유리체강내(intra-vitreal) 투여가 사용될 수 있다. 적합한 투여량은 주사 당 0.1 내지 10 mg의 범위일 수 있다.

다른 투여 형태, 예를 들어 경구 또는 비경구 제형들에서의 투여량은 환자의 상태(질환의 심각성 및 개선의 정도), 체중, 나이 및 성별뿐만 아니라 독물학적, 약물 동태학적(pharmacokinetics) 및 약동학적(pharmacodynamic) 특성에 따라 임의의 숙련된 개업 의사에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 상기 투여량은 모체 화합물 사퀴나비어에 대한 임상 실무에서 이미 알려진 것과 유사할 수 있다.

또한, Saq-NO의 무독성 염, 용매화물(solvates) 또는 결정성/다형성 형태가 Saq-NO 대신에 사용될 수도 있다.

도 1은 Saq-NO의 다양한 농도의 존재 하에서, ConA(1 μg/ml)로 자극된 쥐(rat) LNC의 사이토카인 생성 및 생존능에 대한 Saq-NO의 영향을 보여준다.
도 2는 새앙쥐 SPC의 사이토카인 생성 및 생존능에 대한 Saq-NO 및 Saq의 영향을 보여준다.
Saq 또는 Saq-NO의 다양한 농도의 존재 하에서, ConA(2.5 μg/ml)로 자극된, BALB/c 및 C57BL/6로부터 분리되었음.
도 3은 Saq 또는 Saq-NO의 다양한 농도의 존재 하에서, 항-CD3 및 항-CD28(둘 다 1 μg/ml)로 자극된 C57BL/6 쥐 SPC로부터 정제된 새앙쥐 CD4+ 세포들의 사이토카인 생성 및 생존능에 대한 Saq-NO 및 Saq의 영향을 보여준다.
도 4는 Saq 또는 Saq-NO의 부존재(대조군) 또는 존재하에서, 항-CD3 및 항-CD28(둘 다 1 μg/ml)로 미치료되거나(중간군 (medium)) 또는 항-CD3 및 항-CD28(둘 다 1 μg/ml)로 자극된 C57BL/6 쥐로부터 정제된 새앙쥐 CD4+ 세포들 내 S6 인산화에 대한 Saq -NO 및 Saq의 영향을 보여준다.
도 5는 MBP 특이성 T 세포의 IFN-g 및 IL-17 생성 및 생존능에 대한 Saq-NO 및 Saq의 영향을 보여준다.
도 6은 CFA 내 MOG35-55 펩티드 및 백일해 독소(pertussis toxin)로 면역화하고, 10 mg/kg Saq-NO, Saq 또는 부형제(vehicle)로 후기 예방적 요법 또는 치료적 요법하에서 치료된 C57Bl6 쥐의 MOG-유도된 EAE의 임상 경과 및 체중 증가에 대한 Saq-NO로의 후기 예방적(late prophylactic) 치료(A) 또는 치료적 치료(B)의 영향을 보여준다.
도 7은 C57Bl6 쥐의 MOG-유도된 EAE의 성장에 대한 테스트 화합물의 영향을 보여준다.
도 8은 SJL 쥐의 PLP-유도된 EAE의 임상 경과 및 체중 증가에 대한 Saq-NO로의 후기 예방적 치료의 영향을 보여준다.
도 9는 포도막염의 실험적 모델을 지칭한다 (포인트(point) 1.11 및 2.7 참조):
A/ 면역화(immunization) 14일 후의 EAU 군의 조직학적 망막 부분(histological retinal sections)으로서, 광수용체 변성(photoreceptor degeneration)과 더불어 구조 파괴(architecture disruption)를 나타내고, 모든 망막층에 영향을 주는 약간의 손상을 나타낸다.
B/ 대조군의 조직학적 부분으로서, 전형적인 층상 형태 및 정돈된 망막 층을 나타낸다. GCL: 신경절 세포층(ganglion cell layer); IPL: 내망상층(inner plexiform layer); OPL: 외망상층(outer plexiform layer); INL: 내핵층(inner nuclear layer); ONL: 외핵층(outer nuclear layer); PIS: 광수용체 내부 분획(photoreceptor inner segments); POS: 광수용체 외부 분획(photoreceptor outer segments).
C/ Saq-NO 치료된 군의 조직학적 부분으로서, 면역화 14 일 후의 Saq-NO 치료된 쥐에게 정상적인 망막 형태가 나타난다.
도 10은 포도막염 모델의 조직병리학 점수(histopathology scores)를 보여주고, 10μg/kg의 Saq-NO에 의한 치료는 상기 조직병리학적 점수를 상당히 개선시킨다. * P<0.05.
도 11은 포도막염 모델의 생체 내 산화 질소의 생성을 보여준다. EAU 군에서는, 계의(systemic) 아질산염(nitrites)의 생성량이 대조군 쥐들에 비하여 상당히 증가됨을 보여주었다(*** p<0.001). 반면에, Saq-NO로 치료된 쥐들은 EAU 군에 비하여 계의 산화 질소의 생성이 감소하였다. P=0.51.

실험 부분

1. 재료 및 방법

1.1 시약

RPMI-1640 배지 및 태반 혈장(foetal calf serum: FCS)을 PAA Laboratories (Pasching, Austria)로부터 입수하였다. DMSO를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 입수하였다. Saq를 Hoffman-La Roche로부터 구매하였다. Saq-NO를 OncoNox (Copenhagen, Denmark)로부터 구하였고, 전술된 바와 같이 합성하였다 (Maksimovic-Ivanic et al., 2009).

1.2 세포 및 세포 배양(cell cultures)

실험 동물들(C57BL/6 쥐, BALB/c 쥐 및 Dark Agouti 쥐)을 생물학적 연구를 위한 기관 "Sinisa Stankovic"의 "Animal House Facility" (Belgrade, Serbia)로부터 구하였다. 비장 세포(Spleen cells: SPC)를 새앙쥐 비장으로부터 분리시켰고, 림프절 세포(lymph node cells: LNC)을 미치료된 동물의 쥐 자궁 경부의 림프절로부터 구하였다. 배출 림프절 세포(draining lymph node cells: DLNC)를 수초 염기성 단백질(myelin basic protein) (기니 피그 MBP, Alexander Fluegel 교수(University of Goettingen, Germany)로부터 선물받은 종) 및 완전 프로인트 항원보강제(complete Freund's adjuvant) (CFA, Difco, Detroit, MI)에 의한 쥐의 면역화 8-10 일 후의 슬와 림프절(popliteal lymph nodes)로부터 구하였다. 상기 장기들을 기계적으로 파괴하여, 40-μm 나일론 메쉬 필터에 통과시켰고, 생성된 현탁액(suspension)을 원심분리기에 의해 수집하였다. 비장으로부터 얻은 단일 세포 현탁액의 적혈구 세포를 RBC Lysis Buffer (eBioscience, San Diego, CA)를 사용하여 용해시켰다. CD4+ 세포를 CD4 (eBioscience) 및 IMag SAv particles plus (BD Biosciences, San Diego, CA)에 대하여 특이적인 바이오틴 결합 항체를 사용하여 SPC로부터 정제하였다. 얻어진 CD4 개체의 순도는 유동 세포 분석법(flow cytometry)에 의해 결정 시 97%보다 컸다. 24-웰 플레이트 중, SPC 및 LNC를 5 x 106/ml/웰(well)에서, DLNC를 2.5 x 106/ml/웰에서, CD4+ 세포를 1 x 106/ml/웰에서 접종하였다. 척수(spinal cords: SC)에 침투된 세포를, 쥐가 실험적 자가면역 뇌수막염(experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE)의 심각한 임상 증상(clinical signs)을 겪고 있을 때, MBP+CFA로 면역화된 쥐의 SC로부터 구하였다. 쥐들을 살균된 PBS로 관류시키고, SC를 균질화시켜, 30% Percoll (Sigma-Aldrich)에 맞춰, 70% Percoll 성분(gradient) 위에 놓았다. 50 분 동안 870 g로 원심분리한 다음, 상기 SC 세포(SCC)를 40%/70% Percoll 계면으로부터 회수하였고, 이를 RPMI-1640 매질 내에서 세척하였다. SCC를 96-웰 플레이트의 0.5 x 106/200 μl/웰에서 접종하였다. SPC 및 LNC를 2.5 μg/ml 콘카나발린 A(concanavalin A: ConA, Sigma-Aldrich)로, DLNC는 MBP(10 ng/ml)로, CD4+ 세포는 항-CD3 및 항-CD28 항체 (각각 1 μg/ml, 둘 다 eBioscience로부터 입수함)로 자극시켰고, SCC는 미처리 상태로 두었다.

1.3. 세포 생존능 분석

미토콘드리아의 활성 분석에 의하여 SPC, LNC, DLNC 및 SCC의 생존능을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT)의 포르마잔으로의 미토콘드리아 의존적 환원(mitochondrial-dependent reduction)을 사용하였다. 적절한 처리 후에, SPC 및 LNC를 튜브에 수집하고, 스핀 다운(spin down)하고, 상청액(supernatants)을 제거하였고, 상기 세포 펠렛들을 0.5 μg/ml MTT (Sigma-Aldrich) 용액 중에 용해시켰다. 37℃에서 30 분 동안 MTT로 배양을 지속하였고, 세포들을 한번 더 원심분리하였다. 상기 펠렛들에 DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. MTT 분석에서의 흡수도( absorbances)는 자동화된 마이크로플레이트 리더(microplate reader: LKB 5060-006, LKB, Vienna, Austria)를 사용하여, 570540 nm (690 nm에서 보정)에서 측정되었다.

1.4. 사멸 세포의 검출

새앙쥐 SPC 내 세포사멸(apoptosis)의 검출은 제조사의 제안에 따라 Annexin V-FITC (Biotium, Hayward, CA)에 의한 세포들의 염색(staining)에 의해 수행되었다. Annexin V-FITC에 대해 양성인 세포들이 세포사멸로 간주되었다. 염색된 세포들은 FACSCalibur cytometer (BD Biosciences)에 의해 획득되었고, CellQuest Software (BD Biosciences)을 사용하여 분석되었다.

1.5 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)

세포 배양 상청액 중의 사이토카인 농도는, 제조사의 지시에 따라, MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Rochild, Denmark) 및 항-사이토카인 결합(paired) 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 결정되었다. 새앙쥐/쥐 IL-17, 새앙쥐 IL-10, 새앙쥐 TNF, 새앙쥐 IL-4 (eBioscience), 새앙쥐 IFN-γ, 쥐 IFN-γ, 쥐 IL-4 (R&D, Minneapolis, MN), 쥐 IL-10 및 쥐 TNF (BD Biosciences)에 대하여 샘플들을 두 번씩 분석하였다. 그 결과를 적합한 재조합형 사이토카인(recombinant cytokines)의 기지의 농도를 기준으로 만들어진 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.

1.6 면역 블럿( Immunoblot )

전세포 용해물(Whole-cell lysates)을 62.5 mM 트리스-HCl (pH 6.8; 2% w/v 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate: SDS), 10% 글리세롤, 50 mM 디티오트레이톨 (DTT), 0.01% w/v 브로모페놀 블루, 1 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드 또는 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), 1 μg/ml 아프로티닌 및 2 mM EDTA를 함유한 용액 중에서 제조하였고, (로우리 단백질 분석(Lowry protein assay)에 의해 측정된) 20 μg의 단백질을 함유한 샘플들을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기이동시켰다(electrophoresed). 상기 샘플들을, 반건조 블럿팅 시스템(semi-dry blotting system, Fastblot B43, Biorad, Muenchen, Germany)을 사용하여, 5 mA/cm²에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 전기-전사(electro-transfer)시켰다. 상기 블럿들을 PBS 0.1% Tween-20 중의 5% w/v 탈지 분유로 차단하고, S6 및 인산화된-S6 (Ser240/244) (둘 다 Cell Signaling Technology, Boston, MA로부터 입수함)에 대한 특이적 항체(specific antibodies)로 1: 500 희석비에서 탐침시키고, 이후 1:10000 희석비에서 2차 항체로 배양하였다 (ECL 당나귀 항-토끼 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)-연결됨, GE Healthcare, Buckinghamshire, England, UK). 검출은 화학 발광(ECL, GE Healthcare)에 의해 수행되었고, 사진들은 X-선 필름(Kodak, Rochester, NY)에 의해 제작되었다. 농도계측(densitometry)은 Scion Image alpha 4.0.3.2 (Scion Corporation, Frederick, MD)으로 수행되었다.

1.7 동물들

7 내지 8 주된 수컷 C57Bl6 쥐들 및 6 내지 7 주된 암컷 SJL 쥐들(Harlan Laboratories srl, San Pietro al Natisone, Udine, Italy)을 상기 실험에 사용하였다. 이들은 음식(Harlan Global Diet 2018) 및 물에 대해 자유롭게 접근 가능한 표준 실험실 조건(비특정 병원체 부재(non specific pathogen free))하에 계속 있었고, 연구 시작 전 이들의 환경에서 적어도 1주 적응하도록 하였다.

동물들을 비특정 병원체 부재 조건 하에서 제한적으로 접근 가능한 설치류 우리 안에서 사육하였다. 20 - 24℃의 온도, 30 - 70%의 상대 습도(RH), 10-30 환기/시간 및 자연 명암주기(natural dark:light cycle)를 유지하도록 자동적으로 제어된 환경 조건을 설정하였다.

1.8 MOG -유도된 EAE 의 유도

MOG35-55를 Genemed 합성(San Francisco CA)에 의해 합성하였다. 쥐들을, 1 mg의 Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco, Detroit, MI, USA)을 갖는 CFA 중에서 에멀전화되어 1:1 에멀전으로 제조된 200μg MOG로 면역화하였다. 각각의 쥐에게, 겨드랑이 림프절들로 배출되는 두 개의 위치에 나누어서, 200μl 에멀전의 피하 주사를 주었다. 백일해 독소(Calbiochem, Nottingham, UK)를 보조제(coadjuvant)로서 사용하였고, 이를, 면역화 후 0 일 및 2 일에 200 ng/쥐의 투여량으로 복막 내(i.p.) 투여하였다. 상기 쥐들을 면역화 후 30 일 까지 이들의 체중 및 EAE 임상 증상들을 측정함으로써 매일 관찰하였다. 이러한 임상 등급 메기기는 치료를 알지 못하는 관찰자에 의해 수행되었다: 0 = 질환의 증상 없음; 0.5 = 일부 꼬리 마비; 1 = 꼬리 마비; 1.5 = 꼬리 마비 + 일부 한쪽 뒷다리 마비; 2 = 꼬리 마비 + 뒷다리 약해짐 또는 부분 뒷다리 마비; 2.5 = 꼬리 마비 + 부분 뒷다리 마비 (낮아지는 골반); 3 = 꼬리 마비 + 완전한 뒷다리 마비; 3.5 = 꼬리 마비 + 완전한 뒷다리 마비 + 실금(incontinence); 4 = 꼬리 마비 + 뒷다리 마비 + 앞다리의 약해짐 또는 부분 마비; 5 = 빈사 상태(moribund) 또는 죽음.

상기 연구는 4 개의 군들을 포함하였는 데, 각각의 군은 10 마리의 동물로 이루어졌다. 모든 군들은 전술된 면역화 절차에 따라 CFA 내 MOG35-55 펩타이드 및 백일해 독소로 면역화되었고, 하기 치료들이 배정되었다:

상기 후기 예방적 치료는 면역화 후 7 일에 시작하여, 30 일까지 계속하였고; 상기 치료 요법은 질환의 시작에 시작하여, 23 일 연속하여 계속하였다.

1.9 EAE 의 유도 및 임상 점수

PLP (139-151)를 Genemed 합성(San Francisco CA)에 의해 합성하였다. EAE를 J. St. Louis et al(4)에 의해 기술된 바와 같이 유도하였다. 쥐들을, 6 mg/ml의 Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco, Detroit, MI, USA)을 갖는 CFA 중에서 에멀전화되어 1:1 에멀전으로 제조된, 75 μg PLP로 면역화하였다. 각각의 쥐는, 겨드랑이 및 서혜 림프절 내로 배출되는 4 개의 지점에 걸쳐 나누어서, 200 μl 에멀전의 피하 주사를 맞았다. 백일해 독소(Calbiochem, Nottingham, UK)를 보조제로서 사용하였고, 이를 면역화 후 0 일 및 2 일에 200 g/쥐의 투여량으로 복막 내 투여하였다. 상기 쥐들을 면역화 후 30 일까지 이들의 체중 및 EAE의 임상 증상들을 측정함으로써 매일 관찰하였다. 이러한 임상 등급 메기기는 치료를 알지 못하는 관찰자에 의해 수행되었다: 0 = 질환의 증상 없음; 0.5 = 일부 꼬리 마비; 1 = 꼬리 마비; 1.5 = 꼬리 마비 + 일부 한쪽 뒷다리 마비; 2 = 꼬리 마비 + 뒷다리 약해짐 또는 부분 뒷다리 마비; 2.5 = 꼬리 마비 + 부분 뒷다리 마비 (낮아지는 골반); 3 = 꼬리 마비 + 완전한 뒷다리 마비; 3.5 = 꼬리 마비 + 완전한 뒷다리 마비 + 실금; 4 = 꼬리 마비 + 뒷다리 마비 + 앞다리의 약해짐 또는 부분 마비; 5 = 빈사 상태 또는 죽음.

7/8 쥐들의 4 개의 군들이 다음과 같이 7 일에서부터 30 일까지 후기 예방적 요법하에서 치료되었다:

군 1: 사퀴나비어 10 mg/Kg (매일 1회 복막 내)

군 2: Saq-NO 10 mg/Kg (매일 1회 피하에(s.c.))

군 3: Saq-NO 20 mg/Kg (매일 1회 복막 내)

군 4: DMSO/H2O (vehicle) (매일 1회 복막 내)

1.10 통계 분석

통계 분석을 위해 학생들의 테스트를 수행하였다. 0.05 미만의 p 값이 통계학적으로 중요한 것으로 간주되었다.

1.11 위스타 쥐의 실험적 자가면역 우베오레티니티스 (experimental autoimmune uveoretinitis : EAU)의 발달에 대한 사퀴나비어 -NO (OX-1001)의 영향

재료 및 방법:

동물들

(8 주된) 암컷 위스타 쥐들(n=28)을 Pasteur Institute(Algiers, Algeria)로부터 구매하였다. 이러한 쥐들을 실험의 시작 전에 1주 동안 이들의 새로운 환경에 적응시키고, 12 시간 명암 주기 및 음식과 물에 자유롭게 접근 가능한 정상적인 조건 하에서 유지하였다.

이러한 동물들을 4 개의 군으로 나누었다:

대조군 (n=6) : 치료받지 않은 동물들로 이루어짐.

부형제 군 (n=6) : 면역화 날로부터 시작하여 20%의 DMSO의 복막 내 주사(intraperitoneal injection)를 매일 맞음.

망막 미정제 추출물 면역화된 쥐들(Retinal crude extract immunized rats) (EAU 군으로서 지칭됨, n=8): 완전 프로인트 항원보강제; CFA (v/v) 중에서 에멀전화된 망막 미정제 추출물을 갖는 200 μL의 단일 피하 주사(subcutaneous injection)를 맞고, 치료되지 않은 채로 방치됨.

Saq -NO (기준) 치료된 쥐들 (n=8): 면역화 일로부터 시작하여 10 μg/kg의 Saq-NO의 복막 내 주사를 매일 맞음.

망막 미정제 추출물의 준비:

신선한 bovine 안구를 (n =20) 실험에 사용하였다. 이들은 오라 세라타(ora serrata)의 바로 뒤쪽에서 절단되었고, 이후 유리체(vitreous)를 망막 박리(retinal detachment)의 야기 없이 제거하였다. 상기 망막들을 주의깊게 제거하여, PBS(pH 7.4) 중에 넣었다. 이후, 이들에 연속적인 열 충격(-20℃ 및 + 37℃)을 3번 가하여, 망막 항원을 빼내었다. 이를 4000 rpm으로 15 분 동안 원심분리 후 망막 미정제 추출물을 얻었고, 추가 이용시까지 -20℃에서 보존하였다.

실험적 자가면역 포도막염(Experimental Autoimmune Uveitis :EAU)의 유도

동물들을, 200 μL의 총부피 중 백일해 독소 없이 1 mg/mL 의 M. tuberculosis H37Ra를 함유한, 동일 용량의 완전 프로인트 항원보강제 CFA로 에멀전화된, 100 μL의 망막 미정제 추출물로 피하상에 면역화하였다. 상기 동물들은 면역화 후 14일에 희생되었다. 마찬가지로, 각 군의 모든 쥐들 또한 희생되었다.

혈장(plasma) 수집

EDTA 함유관에서 심장천자(cardiac puncture)에 의해 각 실험군으로부터 혈액을 수집하였다. 3000 rpm으로 10 분간 원심분리 후, 혈장을 수집하고, 이를 그리스 반응(Griess reaction)에 의해 아질산염이 결정될 때까지 -45℃에서 보관하였다.

조직학적 연구를 위한 안구 수집

조직학적 분석을 위하여, 각 군의 안구에서 세포핵을 제거하였고, 이를 10% 포스페이트 완충된 포름알데히드로 고정시켰다. 5 μm 두께의 조직 부분을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 조직 부분을 표준 현미경(Zeiss)을 사용하여 시험하였고, X40 배율에서 디지털 카메라를 사용하여 사진을 찍었다. 조직학적 기준은 구조상의 변화의 정도를 기준으로 하였다. 상기 조직학적 점수를 다음과 같이 현미경 시험에 의해 반정량적으로(semi-quantitatively) 평가하였다:

형태의 변화 없음, 0; 망막 내 외핵층(ONL)의 작은 형태 변화, 1; INL의 퇴화(atrophy), 2; INL의 소실, 3; 및 전체 망막층의 손상, 4.

아질산염 수준 측정:

혈장 내 NO 생성의 지표로서 아질산염의 수준을 결정하기 위하여, 분광 측정기(spectrophotometer)를 사용한, 그리스 반응을 사용하였다. 간단하게는, 100 μL의 각각의 샘플을 50 μL의 그리스 시약(5% 설판일아미드, 0.5% 나프틸에틸렌디아민 디히드로클로라이드, 및 20% HCl)과 혼합하였다. 이러한 샘플들을 20 분 동안 실온에서 배양하였고, 543 nm에서의 흡광도(absorbance)를 분광 측정기에 의해 판독하였다. 상기 아질산염 농도를 (0-200 μmol/ml) 사이의 아질산 나트륨((NaNO2)으로 구성된 표준 곡선을 사용하여 결정하였다.

2 결과

2.1 Saq -NO는 쥐 LNC 및 새앙쥐 SPC 내 사이토카인의 생성을 억제함.

Saq-NO의 면역 세포 내 사이토카인 생성을 조절할 수 있는 가능성을 조사하기 위하여, 쥐 LNC를 Saq-NO의 다양한 농도의 존재하에서 ConA로 24 시간 동안 자극하였고, IFN-g, IL-4, IL-17, IL-10 및 TNF의 수준를 무세포 배양 상청액 중에서 결정하였다. 대조군 미치료된 세포들과 비교시, Saq-NO는 IL-4를 제외하고는 모든 시험된 사이토카인의 배출을 투여량에 의존적으로(dose-dependently) 억제하였다 (도 1). LNC 생존능은 Saq-NO의 최고의 투여량에만 영향을 받았지만, 그 차이가 미치료된 대조군과 비교시, 통계학적으로 중요한 수준에는 미치지 않았다 (도 1). 또한, 사이토카인 생성에 대한 Saq-NO의 효과를 새앙쥐 SPC 내에서 시험하였다. 여기에서, Saq-NO를 Saq와 동시에 적용하였고, 사이토카인 생성 및 세포 생존능에 대한 이들의 영향을 비교하였다. 추가적으로, 쥐의 두 품종들, 다시 말하면 각각 원형의 Th2 및 Th1 쥐들인 BALB/c 및 C57BL/6 쥐들을 사용하였다 (Lohoff et al., 1998). Saq-NO는 IFN-g, IL-4, IL-17, IL-10 및 TNF의 배출에 대하여 Saq보다 더욱 깊은 영향을 미쳤고, 그 영향은 BALB/c 쥐와 C57BL/6 쥐 사이에는 구별하기 어려웠다(도 2). Saq-NO가 미트콘드리아 활성 분석에 의해 결정시, SPC 생존능을 통계학적으로 상당히 억제함에도 불구하고, 그 효과는 사이토카인의 생성에 대해 관찰된 영향에 비해서는 작았다. 더욱이, 사이토카인에 대한 Saq-NO의 영향은 SPC 생존능에 대해 영향을 미치지 않는 시약의 농도로 분명히 드러났다(도 2). SPC에 대한 Saq-NO 및 Saq의 세포활성 영향은, AnnexinV 염색 및 세포형광측정기(cytofluorimetry)에 의해 측정시, 최고의 약 투여량이 적용된 경우조차 유사하고 통계학적으로 의미가 없었다 (하기 표 참조).

표. Saq-NO 및 Saq로 치료된 새앙쥐 SPC 내 세포사멸

흥미롭게도, Saq-NO는 IFN-g, IL-4, IL-17 및 TNF의 생성을 억제한 반면, 새앙쥐 SPC 내 IL-10의 생성은 자극하였다. 이러한 결과는 Saq-NO가 면역 세포 내 사이토카인 생성에 강하게 영향을 미친다는 것을 의미한다. Saq-No가 주로 면역억제 효과를 가지지만, 상기 시약의 종- 및 사이토카인- 특이적 효과 또한 있다.

2.2 Saq -NO는 새앙쥐 CD4 + 세포 내 사이토카인의 생성을 억제함.

CD4+ 세포들을 C57BL/6 SPC로부터 정제하였고, Saq-NO의 다양한 농도의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28 항체로 24 시간 동안 자극하였다. 사이토카인 생성에 대한 Saq-NO의 영향을 CD4+ 세포 생존능에 대한 그것의 영향 및 동일 파라미터에 대한 Saq의 영향과 비교하였다. Saq-NO는 CD4+ 세포 내 IFN-g, IL-4 및 IL-17의 생성을 Saq 보다 더욱 효과적으로 억제하였다(도 3). IL-10에 대한 Saq-NO 및 Saq의 영향은 유사하게 강력했지만, 상기 시약들 둘 다 TNF 방출을 조절하지는 않았다(도 3). Saq-NO는 세포 생존능을 통계학적으로 상당히 억제하였지만, 그 효과는 사이토카인 생성에 대한 그것의 효과보다는 여전히 낮았다. 따라서, Saq-NO는 T 세포 사이토카인 생성에 직접적으로 영향을 미친다.

2.3 Saq -NO는 S6 인산화를 억제함.

사이토카인 생성에 대한 Saq-NO의 관찰된 영향에 대한 원인일 수 있는 세포 내의 징후를 결정하려는 시도에서, S6 키나아제 활성의 측정값으로서 S6 인산화의 수준을 면역블럿에 의해 검출하였다. CD4+ 세포들을 Saq-NO 또는 Saq의 존재하에서 24 시간 동안 항-CD3 및 항-CD28로 자극하였고, 이후 세포 용해물을 얻고, 이를 분석하였다. Saq-NO(Saq는 아님)는 CD4+ 세포 내 S6 인산화를 감소시켰고(도 4), 따라서, 이는 S6 키나아제 활성이 Saq-NO-특이적이고, 사이토카인 생성과 관련된 T 세포 내 목표물일 수 있음을 제안한다.

2.4 Saq -NO는 사이토카인 IFN -g 및 IL-17의 MBP -특이적 생성을 억제함

다음으로, 본 발명자들은 IFN-g 및 IL-17의 뇌염유발물질(encephalitogen)-특이적 생성에 대한 Saq-NO의 영향을 결정하였다. 쥐들을 MBP+CFA 및 DLNC로 면역화하였고, 유도성 단계에서 그리고 EAE의 피크에서, 각각, 동물들로부터 SCC를 분리하였다. DLNC를 시험관 내에서 MBP로 재자극한 반면, SCC는 자극하지 않았고, 양쪽 세포 개체군(cell populations) 둘 다를 Saq-NO 또는 Saq의 다양한 농도의 존재 하에서 배양하였다. 결과적으로, Saq-NO는, DLNC 내 Saq보다 더욱 큰 정도로, IFN-g 및 IL-17 방출을 억제하였다 (도 5). 또한, Saq-NO는 DLNC 생존능에 영향을 미치지만, 그 영향은 IFN-g 및 IL-17 생성에 대한 그것의 영향보다 훨씬 더 적었다(도 5).

또한, Saq-NO는 SCC로부터 IFN-g 및 IL-17 방출을 강하게 억제하였다 (도 5). 따라서, Saq-NO는 T 세포의 항체 특이적 사이토카인 생성을 효과적으로 조절하였다.

2.5 C57Bl6 쥐 내 MOG -유도된 EAE 의 발달(development)에 대한 테스트 화합물의 효과

테스트 화합물에 대한 장기적인 복막 내 치료는 쥐의 임상 상태에 의해 판단시 충분히 견딜만한 것으로 보였다. 체중 변화가 질환의 임상 점수에 기여한다 (도 6A-B).

MOG-EAE 모델은 잘 작동하였다. EAE의 주된 증상(Classical signs)은 면역화 후 12일 이내 부형제-치료된 대조군에서 EAE의 주된 진행성 증상과 함께 나타났다 (도 7A-B 참조).

10 mg/Kg의 투여량에서의 Saq-NO의 후기 예방적 치료는 질환의 임상 진행을 개선하였고, 그렇게 치료된 쥐들은, 부형제 치료된 쥐들에 비하여 상당히 낮은 누적 점수 및 질환의 지속 시간을 나타내었다 (도 7A). 또한, 완전 치료 요법하에서 10 mg/Kg의 투여량으로 Saq-NO로 치료된 쥐들도, 부형제 치료된 쥐들에 비하여 누적 점수 및 질환의 지속 시간의 상당한 감소를 나타내어, 질환의 임상 진행을 개선하는 것으로 나타났다 (도 7B). 대조적으로, 사퀴나비어로에 의한 치료는 대조군에 비하여 질환의 진행을 약하게 감소시켰다. 후기 예방적 치료의 중단 시기에, 쥐들을 11 일 동안 더 관찰하였는 데, 부형제 및 사퀴나비어 치료된 쥐들은 질환의 중증도(severity)를 동일하게 유지하였고, Saq-NO로 치료된 쥐들은 치료 중단 후 9일 이내 부형제 치료된 쥐들의 임상 점수에 이르는 강한 질환이 생겼다 (도 7A-B).

2.6 SJL 쥐 내 PLP -유도된 EAE 의 발달에 대한 테스트 화합물의 영향

테스트 화합물에 의한 장기적인 복막 내 치료는 쥐의 임상 상태에 의해 판단시 충분히 견딜만한 것으로 보였다. 체중 변화가 질환의 임상 점수에 기여한다 (도 8A).

PLP-EAE 모델은 잘 작동하였다. EAE의 주된 증상은 면역화 후 15일 이내 부형제-치료된 대조군에서, EAE의 주된 진행성 증상과 함께 나타났으며, 이어서 연구가 진행됨에 따라, 재발 및 회복이 나타났다 (도 8B 참조).

10 mg/Kg의 투여량에서 Saq-NO에 의한 후기 예방적 치료는 질환의 임상 진행을 개선하였고, 그렇게 치료된 쥐들은, 부형제 치료된 쥐들에 비하여 상당히 낮은 누적 점수 및 질환 지속 시간을 나타내었다 (도 8B). 높은 투여량의 Saq-NO (20 mg/Kg) 및 사퀴나비어로 치료된 쥐들은, 부형제로 치료된 쥐들에 비하여 더욱 낮으면서도 그다지 크지 않은 누적 점수 및 지속 시간을 갖는 질환의 온화한 진행을 나타내었다.

치료의 중단 시기에, 쥐들을 20 일 동안 더 관찰하였다. 부형제 치료된 쥐들은 질환의 재발성 감퇴(relapsing remitting) 진행을 계속한 반면, 모든 테스트된 화합물로 치료된 쥐들 및 가장 분명하게는 10 mg/Kg의 투여량으로 Saq-NO로 치료된 쥐들은, 치료 중단 후 5일 이내 이미, 부형제 치료된 쥐들의 임상 점수에 이르는 강한 질환으로 발전하였다 (도 8B).

2.7 Saq -NO의 투여는 실험적 자가면역 포도막염을 개선함:

모든 망막층에 영향을 주는 손상 및 광수용체 변성으로 특징지어지는 망막 조직의 주요한 구조적 파괴가, 치료되지 않고 남아있었던 망막 항원으로 면역화된 쥐들에게서 관찰되었다 (도 9). 이와 유사한(superimposable) 조직학적 변화가 부형제로 치료된 면역화된 쥐들의 군에서 관찰되었다 (데이터 미도시). 대조적으로, Saq-NO의 투여는 대조군 쥐들에서 관찰되는 것과 유사한 망막 조직의 층상구조 외관을 나타내어 조직학적 구조를 상당히 개선하였다 (도 9).

Saq-NO(10 μg/kg, 매일)로의 치료는 포도막염 임상 점수를 상당히 개선하였고, 상기 질환의 병리학적 징후(pathological manifestations)를 개선하였다 (P<0.05) (도 10).

2.8 Saq -NO의 투여는 EAU 동안 순환하는 아질산염 수준에 영향을 미치지 않는다:

산화 질소(nitric oxide)는 그것의 최종 대사 산물(아질산염, nitrites)을 측정함으로써 모든 군들의 생체 내에서 평가되었다. 그 결과는 유도된 EAU 동안 대조 동물들에 비하여 아질산염의 상당히 많은 생성을 나타내었다 (6.08±0.64 대 10.42±1.84). 10 μg/kg의 Saq-NO의 매일 투여는, EAU 군에 비하여 아질산염 NO의 순환 수준을, 상당히는 아니나, 다소 감소시켰다 (도 11).

이러한 데이터는, OX-1001 (Saq-No)에 의한 예방 치료가 Wistar 쥐들 내 EAU의 발달을 예방한다는 것을 입증한다. 이러한 데이터는, 인간에게 나타나는 몇몇 형태의 면역염증 포도막염의 치료용 신규 약제로서 OX-1001 (Saq-No)의 사용을 보장한다.

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Claims

자가면역 질환(autoimmune diseases)의 치료에 사용되기 위한 사퀴나비어의 질산 에스테르로서, 상기 사퀴나비어의 질산 에스테르의 무독성 염, 용매화물 또는 결정성/다형성 형태를 포함하는 자가면역 질환 치료용 사퀴나비어의 질산 에스테르.
제1항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 염증유발 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 생성의 하향 조절에 반응하는 자가면역 질환 치료용 사퀴나비어의 질산 에스테르.
제2항에 있어서, 상기 염증유발 사이토카인은 INF-감마, IL-17, TNF-알파, 또는 IL-10인 자가면역 질환 치료용 사퀴나비어의 질산 에스테르.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 특발성 애디슨병(idiopathic addison's disease), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 담즙성 간경변증(biliary cirrhosis), 원발 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 길리안바레증후군 (Guillain-Barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto’s thyroiditis), 건선(psoriasis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 전신성 홍반성 루프스(systemic lupus erythematous), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 시신경염(optical neuritis), 제1형 당뇨병(diabetes mellitus) 및 포도막염(uveitis), 허혈 재관류(ischemia-reperfusion), 이식편 대 숙주 질환(graft versus host diseases), 이식편 거부반응(graft rejection), 내외독소혈증(endo and exo-toxemia) 및 통풍성 관절염(gouty arthritis) 중에서 선택되는 자가면역 질환 치료용 사퀴나비어의 질산 에스테르.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 포도막염인 자가면역 질환 치료용 사퀴나비어의 질산 에스테르.
장기 특이성 및 전신성 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 사이토카인 생성의 조절장애(dysregulated)를 겪고 있는 환자에게 유효량의 Saq-NO를 투여하는 단계; 및 상기 환자를 치료하는 단계;를 포함하는 치료 방법.
제6항에 있어서, 상기 질환은 안질환(ophthalmic disease)인 치료 방법.
제7항에 있어서, 상기 질환은 포도막염인 치료 방법.
적합한 캐리어(carrier)를 갖는 혼합물 중의 활성 성분으로서 사퀴나비어의 질산 에스테르를 포함하는 국소성 안약 제형(topical ophthalmic formulations).