KR20150079858A - 사이클로필린 a에 의한 심혈관 질환의 검사 방법 - Google Patents

사이클로필린 a에 의한 심혈관 질환의 검사 방법 Download PDF

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히로아키 시모카와
기미오 사토
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고쿠리츠다이가쿠호진 도호쿠다이가쿠
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Abstract

본 발명은 신규의 심혈관 질환의 검사 방법을 제공하는 것을 주요한 목적으로 하는 것을 과제로 한다. 이러한 과제를 해결하는 수단으로서, 인간 혈액 검체 중의 사이클로핀 A 단백질의 농도를 측정하는 공정 및 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정을 포함하는 심혈관 질환의 검사 방법을 제공한다.

Description

사이클로필린 A에 의한 심혈관 질환의 검사 방법{METHOD FOR TESTING FOR CARDIOVASCULAR DISEASE WITH CYCLOPHILIN A}
본 발명은 주로 심혈관 질환의 검사 방법에 관한 것이다. 또, 심혈관 질환의 검사 키트 및 심혈관 질환의 치료 방법에도 관한 것이다.
여러 가지 리스크 인자에 의해 유발되어 진행되는 동맥 경화증은 동맥 내강의 비후에 의해 혈류가 차단되고, 대동맥류, 협심증, 심근경색, 뇌경색 등의 심혈관 질환의 원인으로 된다. 심혈관 질환이 중독화된 경우에는, 환자의 죽음에도 이어지기 때문에 조기에 진단하여 적절한 처치를 실시하는 것이 바람직하다. 심혈관 질환의 환자가 호소하는 자각 증상의 하나로, 가슴의 통증, 불쾌감을 들 수 있다. 그러나 가슴의 통증 등을 호소하는 환자 중, 극히 일부가 실제로 심혈관 질환을 발증 또는 발증할 가능성이 있음에 불과하기 때문에 의사에 의한 감별 진단을 실시할 필요가 있다.
심혈관 질환의 유무의 검사는 예를 들면, 심장 카테터 검사나 혈관 조영 검사(앤지오그래피)에 의해 정밀하게 검사할 수 있다. 그러나 심장 카테터 검사는 카테터의 혈관으로의 삽입을, 혈관 조영 검사는 조영제의 혈관으로의 도입을 각각 실시할 필요가 있어서, 피험자 및 의료 종사자의 양쪽의 부담이 크다. 나아가서는, 검사 실시의 비용을 부담하기 때문에 나라 등이 지출하는 의료비의 증대로 이어져 버린다. 따라서, 자각 증상을 호소하는 모든 환자에 대하여 정밀 검사를 실시하는 것은 곤란하다.
그래서 정밀 검사에 앞서서 주로 문진을 통한 감별 진단이 실시되고 있다. 그러나 문진에 기초하는 감별 진단은 의사의 경험에 의존하는 부분이 커서, 정확도가 충분하다고는 할 수 없다.
지금까지, 심혈관 질환의 검사에 있어서, 트로포닌 T, 고감도 CRP(C반응성 단백) 등의 바이오마커가 유용한 것이 보고되어 있다. 혈중의 트로포닌 T의 상승은 급성 심근경색에 대하여 높은 진단능을 갖는다. 그러나 트로포닌 T를 이용하여 중독화되어 있지 않은 심혈관 질환의 유무를 검사하는 것은 곤란하다. 또, 고감도 CRT는 각종 염증성 질환으로도 상승하는 점에서 비특이적이고, 측정 환경이 갖추어진 현재에도 일상적인 심혈관 질환의 감별 진단에 사용될 만큼 신뢰성이 높은 바이오마커는 아니다.
따라서, 간편하고, 또한 높은 정확도를 갖고 심혈관 질환을 검사할 수 있는 방법이 요구되고 있는 것이 현상이다.
사이클로필린 A(CyPA) 단백질은 사이클로스포린(Cyclosporin)에 결합하는 샤프롱 단백질을 코드한다. ApoE-/-마우스에 있어서 앤지오텐신Ⅱ에 의해 유발된 복부 대동맥류 모델에 있어서, 사이클로필린 A 단백질은 산화 스트레스 산생을 촉진하고, 복부 대동맥류 모델의 발생에 필수인 것이 시사되어 있다(비특허 문헌 1). 그 밖에, 사이클로필린 A 단백질에 대해서는, 혈관 협착증으로의 관여(비특허 문헌 2), 아테롬성 동맥 경화증으로의 관여(비특허 문헌 3), 활성 산소종의 증산으로의 관여(비특허 문헌 4, 5)도 보고되어 있다.
그러나 사이클로필린 A 단백질은 상기 이외에도, HIV바이러스(AIDS)의 감염, C형 간염 바이러스의 복제 등의 다양한 기능을 갖는 것도 알려져 있다. 이와 같은 기능에 기초하여 감염학의 분야에서의 창약(drug development)이 최근 착안되고 있다. 또한, 사이클로필린 A 단백질의 심혈관 질환의 바이오마커로서의 유용성은 지금까지 알려져 있지 않다. 예를 들면, 현실의 심혈관 질환, 특히, 인간의 심혈관 질환에 있어서의, 심혈관 질환의 존재와 혈액 등에 있어서의 사이클로필린 A 단백질의 농도의 상관은 전혀 알려져 있지 않다.
비특허 문헌 1: Satoh K et al. Nat Med. 2009; 15(6): pp 649-656. 비특허 문헌 2: Satoh K et al. Circulation 2008;117:3088-3098. 비특허 문헌 3: Nigro P, Satoh K, et al. J Exp Med. 2011;208;53-66. 비특허 문헌 4: Satoh K, et al. Antioxidants & Redox signaling 2010;12:675-682. 비특허 문헌 5: Satoh K, Shimokawa H, et al. Circ J 2010;74:2249-2256.
본 발명은 신규의 심혈관 질환의 검사 방법을 제공하는 것을 주요한 목적으로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 바, 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하고, 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 심혈관 질환의 발증의 가능성을 판정할 수 있는 것을 발견했다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여 더욱 검토를 거듭함으로써 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 하기에 열거하는 양태의 발명을 포함한다.
항 1. 피험 대상에 유래하는 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 공정 및,
측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 피험 대상에 있어서 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정을 포함하는 심혈관 질환의 검사 방법.
항 2. 상기 판정 공정은 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도가 미리 설정한 컷오프값 이상인 때, 피험 대상에 있어서 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정인 항 1에 기재된 검사 방법.
항 2-1. 상기 판정 공정은 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도가 15ng／mL 이상인 때, 피험 대상에 있어서 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정인 항 1에 기재된 검사 방법.
항 3. 상기 판정 공정은 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도가 건강한 검체로부터 취득한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 비하여 큰 경우에, 피험 대상에 있어서 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정인 항 1에 기재된 검사 방법.
항 4. 상기 검체가 혈장인 상기 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 검사 방법.
항 5. 심혈관 질환이 허혈성 심질환, 대동맥류 및 폐 고혈압증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 상기 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 검사 방법.
항 6. 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 심혈관 질환의 검사 키트.
항 7. 피험 대상에 유래하는 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 공정,
측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 피험 대상에 있어서 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정 및,
심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정된 피험 대상에 심혈관 질환을 치료 및／또는 심혈관 질환의 진행의 예방을 하기 위한 처리를 실시하는 공정을 포함하는 심혈관 질환의 치료 방법.
항 8. 피험 대상에 유래하는 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도 및 심근 트로포닌 T 단백질의 농도를 측정하는 공정 및,
측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도 및 심근 트로포닌 T 단백질의 농도에 기초하여 피험 대상에 있어서 허혈성 심질환이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정을 포함하는 허혈성 심질환의 검사 방법.
항 9. 피험 대상에 유래하는 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도 및 C반응성 단백질의 농도를 측정하는 공정 및,
측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도 및 C반응성 단백질의 농도에 기초하여 피험 대상에 있어서 허혈성 심질환이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정을 포함하는 허혈성 심질환의 검사 방법.
항 10.피험 대상에 유래하는 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도 및 피험 대상의 삼첨판의 압격차(TRPG)를 측정하는 공정 및,
측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도 및 TRPG에 기초하여 피험 대상에 있어서 폐 고혈압증이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정을 포함하는 폐 고혈압증의 검사 방법.
본 발명에 의해 신규의 심혈관 질환의 검사 방법을 제공할 수 있다. 본원 발명의 검사 방법에 의해 심혈관 질환을 간편하고, 또한 높은 정확도를 갖고 검사할 수 있어서, 정밀한 검사나 적절한 처치가 필요한 환자를 판별하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 본 발명의 검사 방법에 의해 심혈관 질환이 의심되는 개개의 환자에 적합한 처치를 종래에 비하여 용이하게 선택하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 사이클로필린 A(Cyclophilin A) 단백질의 혈장 중 농도(CyPA 레벨)마다의 관동맥 협착을 갖는 환자(Patients with coronary stenosis) 및 기질성 협착을 갖지 않는 환자(Patients with organic stenosis)에 대하여 환자수의 비율(Patients(％))의 분포를 나타낸다.
도 2는 CyPA 레벨과 혈관 조영에 의해 판별할 수 있는 관동맥 질환의 중증도의 상관을 상자 수염 그림(box-and-whisker)에 의해 나타낸다. (a) 기질성 협착 있음(Stenosis)(혈관 내강의 협착이 직경의 51％ 이상)의 환자(N＝189)와, 기질성 협착 없음(No stenosis)의 환자(N＝131)에 있어서의 CyPA 레벨의 상자 수염 그림이다. CyPA 레벨은 관동맥 협착을 갖는 환자(P＜0.001)에서 상승했다. (b) 기질성 협착 없음의 환자(No stenosis), 관동맥 1지병변(1-VD)의 환자, 관동맥 2지병변의 환자(2-VD), 관동맥 3지병변군의 환자(3-VD)에 있어서의 CyPA 레벨의 상자 수염 그림이다. 1-VD, 2-VD, 3-VD의 각 군에 있어서, 대조군(협착 없음)과 비교하여 CyPA 레벨이 상승해 있었다(모두 P＜0.001). CyPA 레벨은 관동맥 협착 있음의 환자 간에서 병변수의 증가에 동반하여 연속적으로 증가했다(경향 분석 P＜0.001).
도 3은 CyPA 레벨에 기초하는 사분위군과, 협착 관상 동맥의 병변수 및 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 증례의 비율의 상관을 나타낸다. 각 사분위군에 있어서의 CyPA 레벨은 이하와 같았다. 제 1 사분위군(Q1): 6.1ng／mL 이하; 제 2 사분위군(Q2): 6.2~9.6ng／mL; 제 3 사분위군(Q3): 9.7~17. .4ng／mL; 제 4 사분위군(Q4) 17. .5ng／mL 이상. (a) CyPA 레벨에 기초하는 사분위군(Quartiles of plasma Cyclophilin)에 속하는 환자에 있어서의 협착 관상 동맥의 병변수(Number of steotic coronary arteries)의 평균값을 나타낸다. CyPA 레벨은 제 1 사분위군(Q1)에 비하여 제 3 사분위군(Q3)(P＜0.001) 및 제 4 사분위군(Q4)(P＜0.001)에 있어서 상승해 있었다. 보다 상위(CyPA 레벨이 높은)의 사분위군에 속하는 환자에 있어서, 협착 관상 동맥의 수는 증가했다. (b) CyPA 레벨에 기초하는 사분위군에 속하는 환자에 있어서의 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 증례의 비율(Requirement for Cardiovascular Intervention(％))을 나타낸다. 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 비율은 제 1 사분위군(Q1)에 비하여 제 3 사분위군(Q3)(P＜0.001) 및 제 4 사분위군(Q4)(P＜0.001)에 있어서 상승해 있었다.
도 4는 CyPA 레벨과, 기질성 관동맥 협착의 판정 및 심혈관으로의 치료 개입의 필요성의 판정에 대해서의 수신자 동작 특성 곡선(ROC곡선, ROC curve) 및 C-통계량을 나타낸다. 가로축은 특이성(Specifity)을 나타내고, 세로축은 감도(Sensitivity)를 각각 나타낸다. (a) ROC곡선은 표준 대조에 있어서의 침습적 정량적 관동맥 조영(CAG)과 비교하여 1 이상의 혈관에서의 50％ 이상의 기질성 관동맥 협착(Coronary organic stenosis)을 판정하기 위한 CyPA 레벨의 판정능을 나타낸다. C-통계량(c-statistic)은 0.80(95％ 신뢰 구간: 0.75~0.85)이었다. (b) ROC곡선은 표준 대조에 있어서의 침습적 정량적 관동맥 조영(CAG)과 비교하여 장래의 심혈관 인터벤션(Cardiovascular intervention)을 판정하기 위한 CyPA 레벨의 판정능을 나타낸다. C-통계량은 0.79(95％ 신뢰 구간: 0.74~0.85)이었다.
도 5는 CyPA의 혈장 중 농도와 심혈관 질환의 리스크 인자의 상관을 나타낸다. 고혈압(Hypertension), 당뇨병(Diabetes), 끽연(Smoking), 고지혈증(Dyslipidemia) 및 68세 이상의 가령(Age(＞68 yrs))의 리스크 인자가 존재하는 경우에는, 유의하게 CyPA의 혈장 중 농도는 증가했다. 한편, 성차(Sex, 여성(female) 또는 남성(male))에 의한 증감은 없었다.
도 6은 CyPA 레벨 및 특정한 리스크 인자(Risk Factor)에 기초하는 심혈관 질환의 오드비(Odds Ratio)를 나타낸다. 로지스틱 회귀 모델은 연령, 성별, 체격 지수(BMI)로 조정했다(Adjusted with Age, Sex, and BMI). 연속 변수의 오드비는 1병변 증가에 대한 것이다.
도 7은 베이스라인(Baseline)기 및 팔로우업(Follw-up)기에서의 CyPA 레벨의 변화를 나타낸다. 치료 환자수: n＝42, 평균 팔로우업 기간: 273일간.
도 8은 급성 심근경색의 환자로부터 취득한 관동맥 시료에 있어서의 CyPA의 면역 염색도를 나타낸다. 얇은 섬유성 피막(thin fibrous cap) 직하에서의 CyPA의 고발현이 관찰되었다. (b)는 (a)의 확대도를 나타낸다. 바: 500마이크로미터.
도 9는 CyPA 레벨(Plasma CyPA)과 혈관 조영에 의해 판별할 수 있는 대동맥류의 유무의 상관을 상자 수염 그림에 의해 나타낸다. (a) 대동맥류(Aortic Aneurysm)가 존재하는 환자와, 대조(Control)(대동맥류 및 심혈관 질환 없음(No Aneursym, No CAD)의 환자에 있어서의 CyPA 레벨의 상자 수염 그림이다. CyPA 레벨은 대동맥류가 존재하는 환자에서 상승했다(P＜0.001). (b) 대동맥류 및 관동맥 질환 없음(No Aneursym(-), No CAD(-))의 환자, 직경 55㎜ 이하의 대동맥류(Aortic Aneurysms(＜55㎜))가 존재하는 환자, 직경 55㎜ 이상의 대동맥류(Aortic Aneurysms(＞55㎜))가 존재하는 환자에 있어서의 CyPA 레벨의 상자 수염 그림이다.
도 10은 CyPA 레벨과, 기질성 관동맥 협착의 판정 및 심혈관으로의 치료 개입의 필요성의 판정에 대해서의 수신자 동작 특성 곡선(ROC곡선, ROC curve) 및 C-통계량을 나타낸다. 가로축은 특이성을 나타내고, 세로축은 감도를 각각 나타낸다. ROC곡선 하부 면적(AUC: area under the curve)에 의해 산출되는 C-통계량은 0.756이었다.
도 11은 CyPA 레벨(Plasma CyPA)과 폐 고혈압증의 유무의 상관을 상자 수염 그림에 의해 나타낸다. 폐 고혈압증(PH)이 존재하는 환자와, 대조(Control)의 환자에 있어서의 CyPA 레벨의 상자 수염 그림이다. CyPA 레벨은 폐 고혈압증이 존재하는 환자에서 상승했다(P＜0.001).
도 12는 폐 고혈압증 환자의 무재발 생존율(Event-free survival ratio)을 나타낸다. 가로축은 무재발 기간(No event period)을 일수(days)에 의해 나타낸다. CyPA 레벨이 22ng／mL 이상이었던 환자는 22ng／mL 미만이었던 환자와 비교하여 유의하게 무재발 생존율이 높았다(P＜0.001).
도 13의 (a) CyPA 레벨 측정의 재현성을 나타낸다. 환자군 전체에서 CyPA 레벨 측정의 복제 시행(Plasma CyPA ＃1 및 Plasma CyPA ＃2)은 높은 상관성을 나타냈다(R＝0.92). 나타나 있는 값은 각 시료의 측정된 CyPA농도의 절대값을, 마찬가지로 시험한 표준 혈장 풀의 측정값으로 나눈 값을 나타낸다. (b) 환자군(n＝320)에 있어서의 CyPA 레벨과 고감도 CRP값의 도트 그림. 양자의 사이에 상관은 보이지 않는다.
도 14는 고감도 CRP값이 높은 환자군(high hsCRP) 및 고감도 CRP값이 낮은 환자군(low hsCRP)의 각각에 있어서의 CyPA 레벨과 혈관 조영에 의해 판별할 수 있는 관동맥 질환의 중증도의 상관을 나타낸다. (a) 고감도 CRP값이 높은 환자군(1m㎎／L 이상(hsCRP＞1m／L), n＝141)에서는 관동맥 1지병변(1-VD)의 환자, 관동맥 2지병변의 환자(2-VD), 관동맥 3지병변군의 환자(3-VD)의 각 군에 있어서, 기질성 협착 없음(No stenosis)의 환자군과 비교하여 CyPA 레벨이 상승해 있었다(모두 P＜0.001). (b) 고감도 CRP값이 낮은 환자군(1㎎／L 미만(hsCRP＜1㎎／L), n＝179)에서는 관동맥 1지병변(1-VD)의 환자, 관동맥 2지병변의 환자(2-VD), 관동맥 3지병변군의 환자(3-VD)의 각 군에 있어서, 기질성 협착 없음(No stenosis)의 환자군과 비교하여 CyPA 레벨이 상승해 있었다(모두 P＜0.001). 어느 쪽의 환자군에 있어서도 CyPA 레벨은 병변수의 증가에 동반하여 연속적으로 증가했다.
도 15는 고감도 CRP값에 기초하는 사분위군(Quartile of plasma hsCRP)과, 협착 관상 동맥의 병변수(Number of stenotic coronary arteries) 및 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 증례의 비율(Requirement for cardiovascular intervention(％))의 상관을 나타낸다. (a) 고감도 CRP값에 기초하는 사분위군에 속하는 환자에 있어서의 협착 관상 동맥의 병변수의 평균값을 나타낸다. 제 1 사분위군(Q1)과 제 4 사분위군(Q4)의 사이에 유의차는 보이지 않았다(P＝0.107). (b) 고감도 CRP값에 기초하는 사분위군에 속하는 환자에 있어서의 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 증례의 비율(Requirement for Cardiovascular Intervention(％))를 나타낸다. 제 1 사분위군(Q1)과 제 4 사분위군(Q4)의 사이에 유의차는 보이지 않았다(P＝0.086). 심혈관으로의 치료 개입이란, 경피 관동맥 인터벤션(percutaneous coronary intervention(PCI)), 관동맥 바이패스 수술(coronary artery bypass grafting(CABG))을 포함한다.
도 16은 CyPA 레벨에 기초하는 사분위군마다 및 고감도 CRP값에 기초하는 사분위군마다의 Gensini스코어(Gensini score)의 상관을 나타낸다. (a) CyPA 레벨에 기초하는 사분위군마다의 Gensini스코어의 상관을 나타낸다. (b) 고감도 CRP값에 기초하는 사분위군마다의 Gensini스코어의 상관을 나타낸다.
1. 심혈관 질환의 검사 방법
본 발명은 심혈관 질환의 검사 방법을 제공한다. 본 발명의 검사 방법에 의해 검사되는 심혈관 질환은 심장 및 혈관에 있어서의 질환이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 특히, 동맥 경화증(예를 들면, 아테롬성 동맥 경화증.) 및 동맥 경화증에 기인하는 협심증, 심근경색 등의 허혈성 심질환(관동맥 질환이라고도 한다.), 대동맥류(예를 들면, 흉부 대동맥류, 복부 대동맥류), 뇌경색, 폐 고혈압증(폐 동맥성 폐 고혈압증) 등의 폐 동맥 질환 등의 질환을 들 수 있다. 동맥 경화증이나 동맥 경화성 질환은 여러 가지 리스크 인자(예를 들면, 끽연, 지질 이상증(고지혈증), 고혈압, 당뇨병, 가령 등.)에 의하여 과잉하게 산생되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이 산화 스트레스로서 혈관 벽에 있어서의 염증, 비후를 유발함으로써 발증 및 진행한다고 생각되고 있는 혈관의 협착 또는 폐색을 동반하는 질환이다.
본 명세서에 있어서, “검사”란, 피험 대상에 있어서의 심혈관 질환의 유무의 검사 및 심혈관 질환의 리스크의 검사를 포함한다. “리스크의 검사”란, 장래 심혈관 질환을 발증할 가능성의 유무의 검사, 판정을 포함한다. “검사”는 “판정”으로 환언할 수도 있다.
본 발명의 검사 방법은,
(ⅰ) 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 공정 및,
(ⅱ) 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 심혈관 질환의 발증의 가능성을 판정하는 공정을 포함한다.
우선, 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정한다(공정(ⅰ)).
검체는 본 발명의 검사 방법의 피험 대상에 유래한다. 검체는 피험 대상에 유래하는 혈액 검체를 적합하게 사용할 수 있고, 혈액 검체에는 예를 들면, 혈액(전혈) 및 혈액에 유래하는 혈청, 혈장 등이 포함된다. 본 발명의 바람직한 양태의 하나에 있어서, 검체는 혈장이다.
검체는 당업자에게 공지의 방법으로 채취할 수 있다. 예를 들면, 혈액은 주사기 등을 이용한 채혈에 의하여 채취할 수 있다. 또한, 채혈은 의사, 간호사 등의 의료 종사자가 실시하는 것이 바람직하다. 혈청은 혈액으로부터 혈구 및 특정한 혈액 응고 인자를 제거한 부분이고, 예를 들면, 혈액을 응고시킨 후의 상청(supernatant)으로서 얻을 수 있다. 혈장은 혈액으로부터 혈구를 제거한 부분이고, 예를 들면, 혈액을 응고시키지 않는 조건 하에서 원심 분리에 제공했을 때의 상청으로서 얻을 수 있다. 검체는 피험 대상의 동맥 유래, 정맥 유래, 말초 혈관 유래 중 어느 하나이어도 좋다.
피험 대상은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 인간을 포함하는 포유류가 예시된다. 비인간 포유류로서는, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 양, 말 등을 들 수 있다. 본 발명의 검사 방법의 바람직한 피험 대상은 인간이다. 피험 대상이 인간인 경우, 가슴의 통증이나 불쾌감의 자각 증상을 갖는 자 등의 심혈관 질환의 존재가 의심되는 자가 특히 바람직한 피험 대상이다. 피험 대상의 성별, 연령, 인종은 특별히 한정되지 않는다.
사이클로필린 A(CyPA) 단백질은 PPIA(Peptidylprolyl isomerase A) 유전자좌에 코드되고, 사이클로스포린(Cyclosporin)에 결합하는 샤프롱 단백질을 코드한다. 사이클로필린 A 단백질의 구조는 공지이다. 예를 들면, 인간 사이클로필린 A 단백질 및 마우스 사이클로필린 A 단백질의 아미노산 배열은 미국 생물 공학 정보 센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 GenBank에, 하기의 액세션 번호로 등록되어 있다(복수의 리비전(revision)이 등록되어 있는 경우, 최신의 리비전을 가리킨다고 이해된다.):
인간 사이클로필린 A 단백질: NP_066953,
마우스 사이클로필린 A 단백질: NP_032933.
ApoE-/-마우스에 있어서 앤지오텐신Ⅱ에 의해 유발된 복부 대동맥류 모델에 있어서, 사이클로필린 A 단백질은 산화 스트레스 산생을 촉진하고, 복부 대동맥류 모델의 발생에 필수인 것이 시사되어 있다(비특허 문헌 1). 그러나 현실의 심혈관 질환, 특히, 인간의 심혈관 질환에 있어서의 심혈관 질환의 존재와 혈액 등에 있어서의 사이클로필린 A 단백질의 농도의 상관은 전혀 알려져 있지 않다.
검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하기 위한 수단은 특별히 한정되는 것은 아니다. EIA법(Enzyme immunoassay), ELISA법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), 웨스턴 블로팅법, 단백질 어레이법 등을 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
간략화를 위해, 시판하는 키트를 이용하여 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정할 수도 있다. 예를 들면, 인간 유래의 사이클로필린 A 단백질을 검출하는 경우, Cusabio Biotech사(Cusabio Biotech Co., Ltd, 중국)가 제조하는 Cyclophilin A ELISA Kit(상품 번호: CSB-E09920H), 마우스 유래의 사이클로필린 A 단백질을 검출하는 경우, Cusabio Biotech사가 제조하는 Cyclophilin A ELISA Kit(상품 번호: CSB-E09920M)를 사용할 수 있다. 시판하는 키트를 이용하는 경우, 제조자가 제공하는 지시서에 따르는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
측정되는 사이클로필린 A 단백질의 농도는 대조에 대한 상대값(대조는 당업자가 임의로 설정할 수 있다.), 또는 검체의 단위량당의 중량(예를 들면, ng／mL)으로 나타나는 절대량 중 어느 하나이어도 좋다. 검사 방법의 정밀도 및 정확도가 높아진다는 관점에서, 측정되는 사이클로필린 A 단백질의 농도는 절대량인 것이 바람직하다.
이렇게 하여 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 측정된다.
이어서, 측정한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성을 판정한다(공정(ⅱ)).
본 발명의 양태의 하나에 있어서, 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도가 정상인 유래의 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도에 비하여 큰 경우에, 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 있다고 판정한다. 정상인 유래의 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도는 당업자가 적절히 측정할 수 있다. 통상은 0~9ng／mL 정도, 특히, 3~9ng／mL 정도라고 생각된다.
본 발명의 바람직한 양태의 하나에 있어서, 측정한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 미리 설정한 컷오프값 이상인 경우에, 피험자는 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정할 수 있다. 후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 사이클로필린 A 단백질의 농도가 미리 설정한 컷오프값 이상인 경우에, 피험자에 있어서 유의하게 심혈관 질환이 존재한다.
상기 컷오프값은 여러 가지 통계 해석 수법에 의해 구할 수 있다. 심혈관 질환의 환자에 있어서의 중앙값 또는 평균값, ROC곡선 해석에 기초하는 값 등이 예시된다. 컷오프값을 복수 설정할 수도 있다.
본 발명의 다른 양태에 있어서, 심혈관 질환이 허혈성 심질환인 경우에는, 사이클로필린 A 단백질의 농도가 약 15ng／mL 이상, 바람직하게는 약 9.7ng／mL 이상인 경우, 특히, 약 17. .5ng／mL 이상인 경우에, 피험자는 허혈성 심질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정할 수 있다. 본 발명의 또다른 양태에 있어서, 심혈관 질환이 폐 고혈압증인 경우, 사이클로필린 A 단백질의 농도가 약 22ng／mL 이상인 경우에, 치료를 실시한 경우의 예후가 불량하다고 판정할 수 있다.
본 발명의 검사 방법은 다른 공지의 또는 장래적으로 발견될 심혈관 질환의 검사 방법과 조합해도 좋다. 예를 들면, 혈압 측정, 심박수 측정, 심전도 계측 등의 심혈관의 상태를 검사하기 위한 통상의 수단과 조합할 수 있다.
또, 예를 들면, 검사되는 심혈관 질환이 허혈성 심질환(관동맥 질환)인 경우(특히, 심근경색인 경우), 본 발명의 검사 방법의 양태의 하나는, 검체 중의 심근 트로포닌 T 단백질의 농도를 측정하는 공정(심근 트로포닌 T 검사)을 포함하는 검사 방법으로 할 수 있다. 심근 트로포닌 T 검사의 구체적인 수단은 공지이고, 통상은 검체 중의 심근 트로포닌 T 단백질의 농도가 약 0.1ng／mL 이상인 경우에 양성으로 평가되고 피험 대상은 허혈성 심질환을 발증해 있을 가능성이 높다고 판정된다. 본 발명의 검사 방법의 이와 같은 양태에 있어서는, 심근 트로포닌 T 검사가 양성인 경우에 추가하여, 심근 트로포닌 T 검사가 음성이고, 또한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 정상인 유래의 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도에 비하여 큰 경우; 특히, 심근 트로포닌 T 검사가 음성이고, 또한 측정한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 미리 설정한 컷오프값 이상(예를 들면, 약 15ng／mL 이상)인 경우에도 피험 대상은 허혈성 심질환을 발증해 있을 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
검사되는 심혈관 질환이 허혈성 심질환(관동맥 질환)인 경우(특히, 심근경색인 경우), 본 발명의 검사 방법의 다른 양태의 하나는, 검체 중의 C반응성 단백질(C-reactive protein, CRP)의 농도를 측정하는 공정을 포함하는 검사 방법으로 할 수 있다. CRP를 측정하는 수단은 공지이다. 바람직하게는, 미량의 CRP농도를 측정할 수 있는 고감도 CRP(hsCRP) 검사에 의해 측정하는 것이 바람직하다. 통상은 검체 중의 고감도 CRP값이 1㎎／L 이상인 경우에, 피험 대상은 심근경색 등의 심혈관 질환을 발증할 리스크가 있거나, 또는 발증해 있을 가능성이 있다고 판정된다(예를 들면, 하기 문헌 참조: Ridker PM. Am Heart J 2004; 148: S19-S26.; Ridker PM, Cook N. Circulation 2004; 109: 1955-1959.). 본 발명의 검사 방법의 이와 같은 양태에 있어서는, 고감도 CRP(hsCRP) 검사가 양성(전형적으로는, 고감도 CRP값이 1㎎／L 이상)인 경우에 추가하여, 고감도 CRP(hsCRP) 검사가 음성(전형적으로는, 고감도 CRP값이 1㎎／L 미만)이고, 또한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 정상인 유래의 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도에 비하여 큰 경우; 특히, 고감도 CRP값이 음성이고, 또한 측정한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 미리 설정한 컷오프값 이상(예를 들면, 약 15ng／mL 이상)인 경우에도, 피험 대상은 심혈관 질환을 발증할 리스크가 있거나, 또는 발증해 있을 가능성이 있다고 판정할 수 있다.
또한, 심근 트로포닌 T 단백질 및 C반응성 단백질의 구조는 공지이다. 예를 들면, 인간 심근 트로포닌 T 단백질, 마우스 심근 트로포닌 T 단백질, 인간 C반응성 단백질 및 C반응성 단백질의 아미노산 배열은 미국 생물 공학 정보 센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 GenBank에, 하기의 액세션 번호로 등록되어 있다(복수의 리비전(revision)이 등록되어 있는 경우, 최신의 리비전을 가리킨다고 이해된다.):
인간 심근 트로포닌 T 단백질: NP_000355,
마우스 심근 트로포닌 T 단백질: NP_001123646,
인간 C반응성 단백질: NP_000558,
마우스 C반응성 단백질: NP_031794.
또, 검사되는 폐 고혈압증인 경우, 본 발명의 검사 방법의 다른 양태의 하나는, 피험 대상의 삼첨판의 압격차(TRPG)를 측정하는 공정을 포함하는 검사 방법으로 할 수 있다. TRPG는 심장 초음파 검사에 의해 측정할 수 있다. TRGP란, 심장으로부터 밀어내어진 혈액으로의 압력과, 판을 지난 후의 혈액으로의 압력의 차를 가리키고, 심초음파 검사에 의해 산출할 수 있다. 통상은 TRPG가 약 50㎜Hg 이상인 경우에, 피험 대상은 폐 고혈압증을 발증해 있을 가능성이 높다고 판정된다. 본 발명의 검사 방법의 이와 같은 양태에 있어서는, TRPG가 약 50㎜Hg 이상인 경우에 추가하여, TRPG가 약 50㎜Hg 미만이고, 또한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 정상인 유래의 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도에 비하여 큰 경우; 및 TRPG가 약 50㎜Hg 이하이고, 또한 측정한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 미리 설정한 컷오프값 이상(예를 들면, 약 15ng／mL 이상)인 경우에도, 피험 대상은 폐 고혈압증을 발증해 있을 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
이렇게 하여 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 판정된다.
심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 있다고 판정된 피험 대상은 심장 카테터 검사, 혈관 조영 검사법(앤지오그래피: X선 혈관 조영 검사법, 컴퓨터 단층 촬영(CT) 혈관 조영 검사법, 핵자기 공명(MR) 혈관 조영 검사법 등이 포함된다.) 등의 정밀 검사에 의한 심혈관 질환의 유무의 정밀 검사 및／또는 병소(lesion)부의 확정을 실시하는 것이 바람직하다.
또, 특히 정밀 검사에 의해 심혈관 질환이 존재할 개연성이 높다고 판정된 경우에, 심혈관 질환을 치료 및／또는 진행의 예방을 하기 위한 적절한 처치를 실시하는 것이 바람직하다. 적절한 처치로서는, 혈관 확장제, 항혈소판제 등의 투여 등에 의한 심혈관 질환의 진행을 억제하는 내과적 처치, 벌룬이나 스텐트 등을 이용한 병변부의 협착을 넓히기 위한 혈관 내에서 치료를 실시하는 처치(혈관 내 치료); 병변부를 제거하는 수술, 병변부의 대체 조치를 도입하는 수술(바이패스 수술, 인공 혈관의 도입, 자가 혈관의 이식 등.) 등의 외과적 처치 등을 들 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 심혈관 질환이 허혈성 심질환(관동맥 질환)인 경우, 경피 관동맥 인터벤션(percutaneous coronary intervention(PCI))이나 관동맥 바이패스 수술(coronary artery bypass grafting(CABG))을 적합한 예로서 들 수 있다. 또, 끽연, 지질 이상증(고지혈증), 고혈압, 당뇨병 등의 심혈관 질환의 리스크 인자를 시정하기 위한 지도나 의료 처치를 실시할 수도 있다.
심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 낮다고 판정된 피험 대상은 적당한 경과 관찰을 실시하고, 경과에 따른 처치를 실시하는 것이 바람직하다.
2. 키트
본 발명은 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 심혈관 질환 검사용 키트도 제공한다.
검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하기 위한 수단으로서는 예를 들면, 상기의 EIA법, ELISA법, 웨스턴 블로팅법, 단백질 어레이법 등에 의해 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 수단이 예시되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트에 포함되는 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하기 위한 수단은 예를 들면, 정상인 유래의 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도에 비하여 큰지 작은지를 평가할 수 있는 수단인 것, 또는 측정한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 15ng／mL 이상인지의 여부를 평가할 수 있는 수단인 것이 바람직하다. 측정한 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도가 15ng／mL 이상인지의 여부를 평가할 수 있는 수단인 것이 특히 바람직하다.
또, 본 발명의 키트에는 필요에 따라서 다른 성분을 포함시킬 수 있다. 다른 성분은 예를 들면, 검체를 채취하기 위한 도구(예를 들면, 주사기.), 포지티브 컨트롤 시료 및 네가티브 컨트롤 시료 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 검사 방법을 실시하기 위한 순서를 기록한 서면 등을 포함할 수도 있다.
또한, 사이클로필린 A 단백질 이외의 심혈관 질환의 바이오마커를 측정하기 위한 수단을 포함시켜도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 키트가 검사하는 심혈관 질환이 허혈성 심질환(관동맥 질환)인 경우(특히, 심근경색인 경우), 본 발명의 키트의 양태의 하나는, 검체 중의 심근 트로포닌 T 단백질의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 키트로 할 수 있다. 해당 수단은 검체 중의 심근 트로포닌 T 단백질의 농도가 1㎎／L 이상인지의 여부를 평가할 수 있는 수단인 것이 바람직하다.
본 발명의 키트가 검사하는 심혈관 질환이 허혈성 심질환(관동맥 질환)인 경우(특히, 심근경색인 경우), 본 발명의 키트의 양태의 하나는, 검체 중의 C반응성 단백질(C-reactive protein, CRP)의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 키트로 할 수 있다. 해당 수단은 미량의 CRP농도를 측정할 수 있는 고감도 CRP(hsCRP) 검사를 실시할 수 있는 수단인 것이 바람직하다. 또, 해당 수단은 검체 중의 C반응성 단백질의 농도가 1㎎／L 이상인지의 여부를 평가할 수 있는 수단인 것이 바람직하다.
본 발명의 키트는 상법에 따라, 필요에 따라서 상기 성분을 구비하는 것으로 제작할 수 있다.
키트의 사용 형태는 특별히 한정되지 않지만, 상기 검사 방법에 이용하는 것이 바람직하다. 상기 검사 방법에 이용한 경우, 검사를 용이하게 실시하는 것이 가능하게 된다.
3. 치료 방법
본 발명은 심혈관 질환의 치료 방법도 제공한다. 발명에서 말하는 “치료”란, 심혈관 질환의 치료 및 증상의 경감 및 재발 방지를 위한 유지 요법을 포함한다.
본 발명의 치료 방법은,
(ⅰ) 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 공정,
(ⅱ) 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 검체가 유래하는 피험 대상에 있어서 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정 및,
(ⅲ) 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정된 피험 대상에 심혈관 질환을 치료 및／또는 심혈관 질환의 진행의 예방을 하기 위한 처치를 실시하는 공정을 포함한다.
공정(ⅰ) 및 공정(ⅱ)는 상기 “1.”란에 기재된 측정 공정 및 판정 공정을 실시한다.
이어서, 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정된 피험 대상에 심혈관 질환을 치료 및／또는 심혈관 질환의 진행의 예방을 하기 위한 처치를 실시한다(공정(ⅲ)). 공정(ⅱ)와 공정(ⅲ)의 사이에 심장 카테터 검사, 혈관 조영 검사법(앤지오그래피: X선 혈관 조영 검사법, 컴퓨터 단층 촬영(CT) 혈관 조영 검사법, 핵자기 공명(MR) 혈관 조영 검사법 등이 포함된다.) 등의 정밀 검사에 의한 심혈관 질환의 유물의 정밀 검사 및／또는 병소부의 확정을 실시할 수 있다.
심혈관 질환을 치료 및／또는 심혈관 질환의 진행의 예방을 하기 위한 처치로서는, 혈관 확장제, 항혈소판제 등의 투여 등에 의한 심혈관 질환의 진행을 억제하는 내과적 처치, 벌룬이나 스텐트 등을 이용한 병변부의 협착을 넓히기 위한 혈관 내에서 치료를 실시하는 처치(혈관 내 치료); 병변부를 제거하는 수술, 병변부의 대체 조치를 도입하는 수술(바이패스 수술, 인공 혈관의 도입, 자가 혈관의 이식 등.) 등의 외과적 처치 등을 들 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 심혈관 질환이 허혈성 심질환(관동맥 질환)인 경우, 경피 관동맥 인터벤션(precutaneous coronary intervention(PCI))이나 관동맥 바이패스 수술(coronary artery bypass grafting(CABG))을 적합한 예로서 들 수 있다. 또, 끽연, 지질 이상증(고지혈증), 고혈압, 당뇨병 등의 심혈관 질환의 리스크 인자를 시정하기 위한 지도나 의료 처치를 실시할 수도 있다.
이렇게 하여 심혈관 질환이 치료된다.
(실시예)
이하에, 실시예 등에 기초하여 본 발명을 보다 상세히 설명하는데, 본 발명은 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
관동맥 질환과 사이클로필린 A 단백질의 혈장 중의 농도의 상관을 검증했다.
1. 방법
환자군
2007년 11월부터 2011년 10월의 기간에 도호쿠 대학 병원(센다이시)에 선택적 관동맥 조영(CAG)을 위해 파견된 관동맥 질환(CAD)의 증상 또는 징후를 갖는 환자에 있어서, CyPA의 예후값에 대해서의 적극적 관찰 연구를 실시했다. 또한, 환자가 복수회 혈관 조영을 실시한 경우, 최초의 혈관 조영 연구 시에 얻어진 데이터만에 기초하여 해석을 실시했다. 판막증 또는 선천성 심질환을 갖는 환자 및 불안정 협심증 또는 심근경색의 환자는 제외했다. 협심증 및 운동 부하 심전도 및 심근의 방사성 핵종 이미징에 기초하는 허혈의 징후를 갖는 320명이 환자군을 구성했다. 해당 연구는 윤리 심사 위원회의 승인 하에서 실시되고, 참가하고 있는 모든 환자로부터 서면에 의한 인폼드 콘센트(informed consent)의 동의를 얻었다.
관동맥 조영
관찰기(베이스라인기)에 선택적 관동맥 조영 검사를 혈관 조영 데이터 시스템에 의한 측정 결과를 이용하여 실시했다. 환자의 CyPA혈장 레벨에 대하여 맹검화된 2명의 심장 내과의가 혈관 조영을 평가했다. 관동맥 협착의 정도는 미국 심장 협회 책정의 기준에 기초하여 혈관 내강의 협착이 직경의 51％ 이상인 경우에, 임상적으로 유의하게 협착을 나타내고 있다고 평가했다. 환자는 CAD의 중증도에 따라서 다음과 같이 군분류했다: 임상적으로 유의한 기질성 협착을 갖지 않는 군, 관동맥 1지병변(vessel disease, VD)군, 관동맥 2지병변군, 관동맥 3지병변군. 좌관동맥 전하행지, 좌관동맥 회선지 및 우관상 동맥을 관찰하고, 협착 관상 동맥의 수를 0~3-VD로서 평가했다. 좌관동맥 주간부에서의 협착은 2-VD로서 평가했다. 혈장 중의 CyPA 레벨과 관동맥 협착수의 상관을 해석하고, CAD의 중증도를 평가했다.
면역 염색
CyPA면역 염색은 기출의 수법(Jin ZG et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:1186-1191; Suzuki J et al., Circ Res. 2006;98:811-817; Satoh K et al., Circulation. 2008;117:3088-3098)에 준하여 실시했다. 구체적으로는, 파라포름알데히드 고정한 동결 절편을 1차 항체(항 인간 CyPA폴리클로날 항체, 1:1000 희석; BIOMOL Research Laboratories사제)와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이어서, 퍼옥시다제 표식 스트렙트아비딘(1:1000 희석; Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 상품 번호016-030-084) 및 NovaRed substrate키트(Vector Laboratories사제, 상품 번호SK-4800)를 사용했다. 시료는 헤마톡실린을 이용하여 카운터스테인(대비 염색)했다. 음성 대조로서, 1차 항체에 대신하여 비특이적 IgG를 이용했다.
베이스라인 측정
베이스라인 측정값은 도호쿠 대학 의학부 순환기 내과의 데이터베이스로부터 2011년 12월 7일에 실시한 기계 검색에 의해 취득했다. 팔로우업 시점까지 사망한 환자는 없었다.
모든 환자에 있어서, 심근경색의 이력, 혈관 재생 수술의 이력, 협심증, 고혈압, 뇌졸중, 또는 일과성 뇌허혈 발작, 당뇨병, 끽연 상황을 포함하는 병력을 기록했다. 심혈관 질환의 리스크 인자는 고혈압, 당뇨병, 끽연, 가령 및 지질 이상증에 대하여 평가했다. 혈압이 140／90㎜Hg 이상, 또는 강압약의 복용 이력이 있는 환자를 고혈압의 리스크 인자 있음으로 평가했다. 공복 시 혈당값이 126㎎／dl 이상, 또는 혈당 강하약이나 인슐린의 복용 이력이 있는 환자를 당뇨병의 리스크 인자 있음으로 평가했다. LDL콜레스테롤값이 140㎎／dl 이상, 또는 지질 저하약을 복용하고 있는 환자를 지질 이상증의 리스크 인자를 갖는다고 평가했다.
공복 시의 혈액 샘플은 반듯이 누운 환자의 주정맥으로부터 CAG 전에 채혈했다. 혈장 샘플은 취득 후 30분 이내의 혈액 샘플을 EDTA처리한 후에 2, 500g으로 10분간 원심 분리하는 것으로 취득하고, 일정 분량씩 －80℃로 보존했다.
CyPA 레벨은 Human Cyclophilin A ELISA kit(Cusabio Biotech사제, 상품 번호CSB-E09920H)를 이용하여 제조자의 지시서에 따른 샌드위치법에 기초한 면역 측정법에 의해 측정했다. 검출 한계는 0.78ng／mL이었다. 분석 전체에 걸쳐서 반복 측정 간의 CyPA 레벨은 고도로 상관해 있었다(R＝0.92).
고감도 CRP(hsCRP)는 샌드위치법에 기초하여 측정했다(Roche Diagnostics사). 다른 측정값은 자동 분석 장치를 이용하여 측정한 시료로부터 취득했다.
통계 분석
CyPA 레벨에 따라서 군분류된 대상 환자의 베이스라인 특성은 빈도 및 백분율, 연속 변수에 대해서는 평균값 및 표준 편차, 또는 치우친 분포를 갖는 변수에 대해서는 중앙값과 사분위수 범위로서 나타냈다. 베이스라인 특성은 이산 변수에 대해서는 카이제곱 검정을, 연속 변수에 대해서는 Wilcoxon 또는 kruskal-Wallis의 순위합 검정을 이용하여 사분위군 간에서 비교했다.
추가의 CyPA분석은 혈관 조영의 결과에 의해 정의된 서브 그룹 간에서 실시했다. 2군간 비교는 스튜던트의 t검정을 이용하여 실시했다. 다군간 비교는 평균값에 대하여 분산 분석(ANOVA) 후의 Dunnett의 다중 비교를 이용하여 실시했다. 수신자 동작 특성(ROC) 곡선은 CAG 전에 취득한 혈장 CyPA측정의 감도와 특이성을 평가하고, CAD의 존재와 중증도를 판정하는 능력을 비교하기 위해 산출했다.
로지스틱 회귀 분석은 연령, 성별, 끽연 상태, 당뇨병의 유무, 고혈압의 유무, 또는 LDL콜레스테롤값에 의해 조정한 후, CyPA 레벨과 CAD상태 간의 관련성을 추정하기 위해 이용했다. 조정 오드비는 CyPA 레벨 15ng／mL 이상과, 사분위 간의 양쪽에서 구했다. 모델 성능의 평가에는 ROC곡선 하의 면적(C-통계량)을 이용하여 구해지는 식별능 및 Hosmer-Lemeshow적합도 검정에 의하여 나타나는 교정을 이용했다. 분석은 CyPA 레벨을 카테고리컬 변수로서 취급하고, 최저 사분위를 다른 3개의 사분위수의 대조로서 이용하여 실시했다. 구한 P값은 양측 P값이고, P값이 0.05 이하를 통계학적으로 유의를 나타내는 것으로 했다. 통계 분석은 SPSS버전 19.0(시카고, 일리노이주, 미국)과 JMP버전 9.02(캐리, 노스캐롤라이나주, 미국)을 이용하여 실시했다.
2. 결과 및 고찰
도 1은 사이클로필린 A(CyPA) 단백질의 혈장 중 농도(이하, 단순히 “CyPA 레벨”로 기재하는 경우도 있다.)마다의 환자에 있어서의 관동맥 협착의 유무의 분포를 나타낸다. CyPA 레벨은 관동맥 간질성 협착을 갖는 환자에 있어서, 협착이 없는 환자와 비교하여 유의하게 높았다.
도 2는 CyPA 레벨과 혈관 조영에 의해 판별할 수 있는 관동맥 질환의 중증도의 상관을 나타낸다. CyPA 레벨은 혈관 조영에 의해 판별할 수 있는 관동맥 질환의 중증도에 따라서 증가했다(p＜0.001).
협착 관상 동맥의 수와 CyPA의 혈장 중 농도의 상관을 평가하기 위해, CyPA의 혈장 중 농도에 의해 모든 증례를 4군으로 나누었다. 표 1은 각 사분위군에 속하는 환자의 임상적 배경 및 검사값을 나타낸다. 상위의(CyPA의 혈장 중 농도가 높은) 사분위군에 속하는 환자는 고령이고, 또한 임상적으로 유의한 관동맥 질환의 증상을 갖는 경향이 있었다(p＜0.001). 제 4 사분위군에 있어서는, 고혈압 및 당뇨병의 유병률이 높고, 추정 사구체 여과율(eGFR)의 약간의 감소를 나타냈다.
[표 1]
Figure pct00001

도 3에 CyPA 레벨에 기초하는 사분위군과, 협착 관상 동맥의 병변수 및 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 증례의 비율의 상관을 나타낸다. 상위의(CyPA 레벨이 높은) 사분위군에 속하는 환자는 유의하게 협착 관상 동맥의 병변수가 현저히 증대해 있었다(P＜0.001). 또, 경피 관동맥 인터벤션(percutaneous coronary intervention(PCI))이나 관동맥 바이패스 수술(coronary artery bypass grafting(CABG)) 등의 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 증례의 비율(Requirement for PCI or CABG during follow up period(％))은 제 4 사분위군에 있어서, 다른 하위의 사분위군과 비교하여 유의하게 높았다.
CyPA 레벨에 기초하여 ROC곡선 및 C-통계량을 산출했다. 결과를 도 4에 나타낸다. ROC곡선은 CyPA의 레벨이 기질성 관동맥 협착의 판정(C-통계량＝0.802) 및 심혈관으로의 치료 개입의 필요성의 판정(C-통계량＝0.793)에 유용한 것을 나타내고 있다.
도 5에 CyPA 레벨과 심혈관 질환의 리스크 인자의 상관을 나타낸다. 종래의 심혈관 질환의 리스크 인자인 고혈압, 당뇨병, 끽연, 고지혈증 및 가령(68세 이상)이 존재하는 환자에서는 CyPA 레벨은 상승했다(모두 P＜0.001).
CyPA 레벨에 기초하는 코호트의 분할은 CyPA 레벨과 CAD의 상관을 재차 나타내는 것으로 되었다. 연령(age), 성별(sex) 및 종래의 심혈관 질환의 리스크 인자(cardiovascular risk factor)(끽연 습관(smoking status), 당뇨병의 유무(presence or absence of diabetes), 고혈압의 유무(presence or absence of hypertension), 지질 이상증의 유무(presence or absence of dyslipidemia)에 의해 조정(Adjusted for Cardiovascular Risk Factors)한 로지스틱 회귀 분석에 있어서, 제 2 사분위군(Quartile 2), 제 3 사분위군(Quartile 3) 및 제 4 사분위군(Quartile 4)은 CyPA 레벨이 가장 낮은 제 1 사분위군과 비교하여 CAD의 리스크 증가와의 상관이 보였다(오드비(Odds Ratio): 1. 73, 9.94, 10.29. 경향 분석의 P값＜0.001). 이 결과는 다시 고감도 CRP값에 의해 조정한 경우(Adjusted for Cardiovascular Risk Factors and hsCRP)에 있어서도 유의했다.(오드비, 1. 84, 10.53 및 10.78. 경향 분석의 P값＜0.001.). 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002

도 6에 CyPA 레벨 및 기지의 심혈관 질환의 리스크 인자의 로지스틱 회귀 모델로부터 구해지는 오드비를 나타낸다. 몇 가지의 기지의 심혈관 질환의 리스크 인자는 연령, 성별, 체격 지수(BMI)로 조정한 로지스틱 회귀 모델에 있어서, CAD와 상관이 보였다. 당뇨병 및 고혈압은 각각 CAD의 리스크 증가와 상관해 있었다. 기지의 기지 인자의 각각 및 CyPA 레벨을 단변량 로지스틱 회귀 분석에 산입했다. 고감도 CRP값이 포함되어 있던 이 모델에서는 CyPA 레벨이 15ng／mL 이상인 것이 심혈관 질환의 상태와 현저히 상관하여 남았다(오드비＝6.20, P＜0.001).
또한, 다변량 해석에 의해 기지의 리스크 인자(연령, 성별, 끽연, 고혈압, 당뇨병 및 hsCRP)에 추가하여, CyPA 레벨 15ng／mL 이상인 것이 심혈관 질환의 상태와 현저히 상관하는 것이 명백하게 되었다(표 3).
[표 3]
Figure pct00003

CyPA 레벨을 산입하는 것으로 로지스틱 회귀 모델의 전체적인 퍼포먼스가 대폭으로 향상되었다. CyPA 레벨은 기지의 심혈관 리스크 인자(연령, 성별, 끽연, 고혈압, 당뇨병, 지질 이상증)에 추가되었을 때에는 C-통계량이 0.807에서 0.870으로 향상했다. 고감도 CRP값을 베이스라인 모델에 산입한 경우, C-통계량은 0.807에서 0.873으로 향상했다. 적합도 검정을 이용한 평가에서는 CyPA 레벨의 산입은 판정 모델의 판정능을 저감시키지 않았다. 즉, CyPA 레벨은 성별, 가족의 허혈성 질환의 병력, 고혈압 및 당뇨병의 유무, 끽연 상태, 체격 지수(BMI), eGFR 및 혈장 지질 레벨이 제공되는 이상의 정보를 제공한다.
고감도 CRP가 양성(혈장 중의 농도가 1㎎／L 이상)인 141명의 환자를 제외한 경우에도 결과에 큰 변화는 없었다. 고감도 CRP값이 1㎎／L 미만인 환자에 있어서, CyPA 레벨에 대하여 제 4 사분위군에 속하는 환자에서는 CAD에 대해서의 조정 오드비는 제 1 사분위군과 비교하여 13. 2이었다(95％ 신뢰 구간: 3. 2~53. 9, P＜0.001). 또한, 15ng／mL 이상의 CyPA 레벨로 한 경우에도 조정 오드비가 5. 9(95％ 신뢰 구간: 2. 3~14. 8, P＜0.001)인, 유효성이 높은 예후 마커인 상태이었다. 고감도 CRP값이 1. 000 이상인 환자에 있어서도, 동일한 경향이 인정되고, CAD의 예측을 위한 바이오마커로서, 이들의 조합 유용성이 시사된다.
치료 결과를 판정하는 바이오마커로서의 CyPA 레벨
CyPA 레벨은 성별, 고혈압, 당뇨병, 지질 이상증, 끽연 등, 아테롬성 동맥 경화의 리스크 인자에 따라서 증가한다(도 6). 해당 리스크 인자는 모두가 산화 스트레스를 유도하는 것이다. 그래서 리스크 인자를 제어한 후의 치료 결과의 바이오마커로서의 CyPA 레벨의 유용성에 대하여 검토했다.
리스크 요인을 제어하기 위한 약제를 첨가한 후의 팔로우업 조사를 실시했다. 치료 후의 환자(n＝42)에 있어서, 베이스라인기와 팔로우업기(평균 팔로우업 기간: 273일간)에서 취득한 시료에서의 CyPA 레벨을 비교한 바, 치료 후에 유의한 감소가 관찰되었다(p＝0.003). 결과를 도 7에 나타낸다. 즉, 아테롬성 동맥 경화의 리스크 인자를 제어하는 치료법이 관동맥 질환의 환자에 있어서의 CyPA 레벨을 감소시킨 것에서, CyPA 레벨이 전신의 산화 스트레스나 투약에 의한 치료 효과를 평가하기 위해서도 유용한 것이 시사되었다.
CyPA와 아테롬성 동맥 경화 불안정 플라크
관동맥의 동맥 경화성 플라크에 있어서의 CyPA의 축적을 관찰했다. 결과를 도 8에 나타낸다. 심근경색 환자의 관상 동맥에 강한 CyPA의 발현이 관찰되었다. 특히, CyPA의 고발현이 아테롬성 동맥 경화 플라크가 얇은 선유성 피막 직하에 관찰되었다. 이것은 분비된 CyPA가, 고도 관동맥의 동맥 경화성 플라크가 축적되는 것을 시사하고 있다.
[실시예 2]
대동맥류와 질환과 사이클로필린 A 단백질의 혈장 중의 농도의 상관을 검증했다.
1. 방법
환자군
실시예 1의 환자군 중, 화상 진단에 의해 흉부 대동맥류 또는 복부 대동맥류의 존재가 인정되는 환자를 대동맥류가 존재하는 환자군으로 했다(N＝60). 실시예 1의 환자군 중, 관동맥 질환 및 대동맥류 중 어느 하나도 존재가 인정되지 않는 환자를 대조군으로 했다(N＝69).
통계 분석
실시예 1에 기재된 방법에 준하여 실시했다.
2. 결과 및 고찰
도 9는 CyPA 레벨과 CT 등의 화상 진단에 의해 판별할 수 있는 대동맥류의 유무의 상관을 나타낸다. CyPA 레벨은 대동맥류가 존재하는 환자에 있어서 유의하게 높았다(P＜0.001). 수술의 필요성이 높다고 판정되는 직경 55㎜ 이상의 대동맥류가 존재하는 환자에 있어서, CyPA 레벨이 특히 높은 경향이 보였다.
CyPA 레벨에 기초하여 대동맥류의 판정에 대해서 ROC곡선 및 C-통계량을 산출했다. 결과를 도 10에 나타낸다. ROC곡선은 CyPA의 레벨이 대동맥류의 판정(C-통계량＝0.756)에 유용한 것을 시사하고 있다.
[실시예 3]
폐 고혈압증과 질환과 사이클로필린 A 단백질의 혈장 중의 농도의 상관을 검증했다.
1. 방법
환자군
2008년~2011년의 사이에 도호쿠 대학 병원(센다이시)에서 실시된 우심 카테터 검사 시에 폐 고혈압의 환자(N＝130) 및 대조 환자(N＝25)로부터 취득한 혈장 시료를 이용했다. 대조 환자는 심초음파 검사에 의해 폐 고혈압증이 의심되었지만, 우심 카테터 검사(평균 폐동맥압(mPAP)＜25㎜Hg)에 의해 제외된 환자로 이루어진다.
베이스라인 측정, 통계 분석
실시예 1에 기재된 방법에 준하여 실시했다.
2. 결과 및 고찰
도 11은 CyPA 레벨과 폐 고혈압증의 유무의 상관을 나타낸다. CyPA 레벨은 폐 고혈압증이 존재하는 환자에 있어서 유의하게 높았다(p＜0.001).
도 12는 베이스라인기에 CyPA 레벨이 22ng／mL 이상이었던 환자와, 22ng／mL 미만이었던 환자의 무재발 생존율(Event-free survival ratio)을 나타낸다. CyPA 레벨이 22ng／mL 이상이었던 환자는 유의하게 무재발 생존율이 높았다(P＜0.001).
이상의 결과는 CyPA 레벨이 폐 고혈압증의 치료 효과의 평가 및 예후의 판정의 바이오마커로서도 유용한 것을 시사하고 있다.
[실시예 4]
사이클로필린 A 단백질의 혈장 중의 농도와 고감도 CRP값(hsCRP값)의 상관을 평가했다.
1. 방법
환자군
실시예 1과 같은 환자군에서 평가를 실시했다.
측정 수법, 베이스라인 측정, 통계 분석
실시예 1에 기재된 방법에 준하여 실시했다. Gensini스코어의 산출은 하기 문헌에 기재된 방법에 준하여 실시했다: Gensini GG. Am J Cardiol 1983; 51: 606.
2. 결과 및 고찰
결과를 도 13에 나타낸다. 도 13a는 복수 시행에 있어서의 CyPA 레벨 측정의 재현성을 나타낸다. 도 13b는 환자군(n＝320)에 있어서의 CyPA 레벨과 고감도 CRP값의 도트 그림을 나타낸다. 도 13b로부터 명백한 바와 같이, CyPA 레벨과 고감도 CRP값의 사이에 상관은 보이지 않았다.
표 4는 고감도 CRP값 및 관동맥 질환(CAD)의 유무로 분류한 환자의 임상적 배경 및 검사값을 나타낸다. 고감도 CRP값이 높은(1㎎／L 이상, n＝141; 즉, 양성인) 환자군 및 고감도 CRP값이 낮은(1㎎／L 미만, n＝179; 즉, 음성인) 환자군에 있어서, CyPA 레벨의 유의차는 관찰되지 않았다(P＝0.511). 또한, 해당 2환자군의 사이에서 혈관 조영 소견(angiographic findings) 및 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 환자의 비율(Requirement for PCT or CABG during follow up period(％))에 대해서도 유의차가 없었다(각각 P＝0.602 및 P＝0.348).
[표 4]
Figure pct00004

도 14는 고감도 CRP값이 높은 환자군 및 고감도 CRP값이 낮은 환자군의 각각에 있어서의 CyPA 레벨과 혈관 조영에 의해 판별할 수 있는 관동맥 질환의 중증도의 상관을 나타낸다. 상기 2환자군 중 어느 하나에 있어서도, CyPA 레벨은 관동맥 질환(CAD)의 중증도와 상관이 보였다. 고감도 CRP값이 높은 환자군 및 고감도 CRP값이 낮은 환자군 중 어느 하나에 있어서도, CAD의 중증도가 높은 환자에 있어서 CyPA 레벨은 높았다.
도 15는 고감도 CRP값에 기초하는 사분위군과, 협착 관상 동맥의 병변수 및 심혈관으로의 치료 개입이 필요한 증례의 비율의 상관을 나타낸다. 협착 관동맥의 수는 고감도 CRP값의 제 4 사분위군에서 약간 증가했다. 그러나 P값에 의해 나타나는 그 유의성(P＝0.107)은 CyPA 레벨의 제 4 사분위군(P＜0.001, 도 3a)과 비교하여 작았다. 또, 고감도 CRP값의 사분위군은 장래의 심혈관으로의 치료 개입의 필요성과는 강한 상관을 나타내지 않았다.
도 16은 CyPA 레벨에 기초하는 사분위군마다 및 고감도 CRP값에 기초하는 사분위군마다의 Gensini스코어의 상관을 나타낸다. CyPA 레벨의 제 4 사분위군에 있어서, Gensini스코어의 유의한 증가가 보였다(P＜0.001, 도 16a). 고감도 CRP값의 제 4 사분위군에 있어서도, Gensini스코어의 유의한 증가가 보였다(P＝0.007, 도 16b). CyPA 레벨은 고감도 CRP값과 비교하여 관상 동맥 아테롬성 동맥 경화증의 중증도를 평가하는 지표로서 우수해 있는 것이 명백하게 되었다.
또한, Gensini스코어는 CAD의 중증도를 나타낸다(예를 들면, 하기의 문헌 참조: 0zaki Y, Imanishi T, Taruya A, Aoki H, Masuno T, Shiono Y, et al. Circ J 2012; 76: 2412-2418. 및 Gensini GG. Am J Cardiol 1983; 51: 606.).
고감도 CRP값이 낮은 179명의 환자 중에서 95명(53. 1％)은 CAD를 갖고 있었다.(표 4). 이들의 환자 사이에서 CAD를 갖는 환자에서는 CyPA 레벨의 미디언값(17. .1ng／㎖)과 비교하여 유의한 상승이 보였다(P＜0.001). 고감도 CRP값이 높은 141명의 환자 중에서 94명(66.7％)이 CAD를 갖고 있었다(표 4). 이들의 환자 사이에서 CAD를 갖는 환자에서는 CyPA 레벨의 미디언값(16.1ng／mL)은 CAD를 갖지 않는 환자의 CyPA 레벨의 미디언값(8. 0ng／mL)과 비교하여 유의한 상승이 보였다(P＜0.001). 한편, CyPA 레벨의 사분위는 고감도 CRP값과 상관하지 않았다(P＝0.103, 표 1).
[고찰]
흉통 등의 비특이적인 증상을 호소하는 환자 중, 심전도 변화나 고감도 CRP값, 심근 토포로닌 T값 등의 종래의 지표가 양성인 환자는 심근경색 등의 심혈관 질환의 개연성이 높다고 하여 통상 전문 시설로 긴급 반송된다. 또, 심전도의 파형에 이상이 보이지 않는 경우이어도 환자가 전형적인 흉부 증상의 기왕력이나 동맥 경화의 위험 인자를 갖는 경우에는 협심증 등의 질환을 의심하여 재차 정밀 검사를 실시할 수 있다. 그러나 이와 같은 환자에 해당되지 않지만, 관동맥의 완전 폐색을 초래하기 일보 직전 등의 중독의 증상인 환자인 경우도 있다. 즉, 종래의 검사 방법에서는 높은 정확도를 갖고 감별을 실시할 수 없는 현상이 있다. 또, 트로포닌 T값이 양성이 되기 위해서는, 심근괴사, 즉, 심근경색이 실제로 발증하고, 또한 발증 후 수시간 이상 경과하지 않으면 양성이 되지 않기 때문에 트로포닌 T를 이용한 검사 방법에서는 위음성이 많다는 실정도 있다.
도 14에 나타내는 바와 같이, 고감도 CRP값이 1㎎／L 이상인 환자군과 1㎎／L 미만인 환자군의 2군으로 나누어도 혈장 중 CyPA 레벨은 어느 쪽의 군에 있어서도 관동맥 질환의 유무 및 중증도와 높게 상관했다. 따라서, 혈장 중의 CyPA 레벨을 이용하여 관동맥 유의 협착의 유무나 심근경색의 가능성 등의 심혈관 질환을 종래 방법과 비교하여 높은 정확도를 갖고 예측할 수 있는 것이 강하게 시사된다.
혈장 중의 CyPA 레벨을 전신의 동맥 경화, 심근경색을 발증할 수 있는 증례 등의 심혈관 질환을 스크리닝할 수 있는 바이오마커로 이용하는 것으로 지금까지 이상으로 구할 수 있는 생명이 증가하는 것이 기대된다. 또, 혈장 중의 CyPA 레벨은 치료 효과의 평가에 있어서도 유용한 것이 기대된다.

Claims (6)

  1. 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 공정 및,
    측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 기초하여 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성을 판정하는 공정을 포함하는
    심혈관 질환의 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 판정 공정은 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도가 미리 설정한 컷오프값 이상인 때, 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정인
    검사 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 판정 공정은 측정한 사이클로필린 A 단백질의 농도가 건강한 검체로부터 취득한 사이클로필린 A 단백질의 농도에 비하여 큰 경우에, 심혈관 질환이 발증해 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정인
    검사 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검체가 혈장인
    검사 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    심혈관 질환이 허혈성 질환, 대동맥류 및 폐 고혈압증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인
    검사 방법.
  6. 인간 혈액 검체 중의 사이클로필린 A 단백질의 농도를 측정하는 수단을 포함하는
    심혈관 질환의 검사 키트.
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