KR20150068235A - Microalgae comprising increased lipid contents using salt stress and process for preparing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 염류 스트레스를 이용하여 지질함량을 증가시킨 미세조류 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 미세조류인 클로렐라 소로키니아나 HS에 염류 스트레스를 가하는 단계를 포함하는 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS, 상기 클로렐라 소로키니아나 HS를 포함하는 바이오매스 및 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a microalgae having an increased lipid content by using salt stress and a method for producing the microalgae. More particularly, the present invention relates to a microalgae having a lipid content by adding salt stress to a microalga, chlorella norovirus A method for producing the increased chlorella microorganism HS, a method for producing chlorella microorganism HS by using the biomass including the chlorella microorganism HS and the chlorella microorganism HS, To a process for producing the same.
최근 전세계적으로 화석에너지의 고갈과 지구온난화에 직면하여, 미국을 포함하는 선진국을 중심으로 환경 친화적인 바이오, 수소, 태양 등의 신재생에너지 활용 및 확산을 위한 정책 입안과 함께 이들 신재생에너지의 공급과 사용을 촉진하고 있다. 국내에서도 신재생에너지 개발에 많은 노력을 하고 있지만, 현재 연구단계에 머물고 있는 실정이다. 바이오 에너지는 재생가능하며, 이산화탄소를 고정함으로서 지구온난화 가속현상을 감소시킬 수 있는 장점이 있는데, 현재로서는 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오디젤 등에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.Faced with exhaustion of global fossil fuels and global warming in recent years, with the aim of promoting environmentally friendly use of renewable energy such as bio, hydrogen, and solar energy in developed countries including the United States, Supply and use. Although Korea is making a lot of efforts to develop new and renewable energy, it is currently in the research stage. Bio-energy is renewable and has the advantage of reducing the acceleration of global warming by fixing carbon dioxide. Currently, bioethanol, bio-butanol, bio-diesel and so on are actively researched.
상기 바이오 에너지 중에서도, 가장 활발하게 연구가 진행되고 있는 것은 바이오 디젤이다. 바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산(fatty acid)의 트랜스에스테르화(transesterification) 과정에 의해 메틸 에스터 또는 에틸 에스터 형태로 전환되어 생성되는데, 150℃의 인화점을 가지고 있어 경유(64℃)에 비해 불이 잘 붙지 않고, 낮은 온도에서 휘발성이 높은 휘발유(45℃)보다 안정적이기 때문에 비가연성 액체로 분류되며, 고온에서 불이 붙기 때문에 안정성이 더 높다고 할 수 있다. 또한, 경유와 달리 바이오디젤은 연소될때 발암물질 및 돌연변이를 일으키는 유해 가스 방출량이 적으며 기타 배출물이 현적하게 낮은 비독성 에너지로 알려져 있다. Among the above-mentioned bioenergies, biodiesel is one of the most actively studied. Biodiesel is produced by transesterification of fatty acids contained in biomass into methyl ester or ethyl ester forms. It has a flash point of 150 ° C, which is lower than light oil (64 ° C) (45 ° C) at low temperatures, so it is classified as a non-flammable liquid and the stability is higher because it is ignited at high temperatures. In addition, unlike diesel, biodiesel is known to have low levels of toxic gases that cause carcinogens and mutations when burned, while other emissions are reasonably low in non-toxic energy.
이러한 바이오 디젤은 미세조류를 이용하여 생물학적으로 생산할 수 있다고 알려져 있다. 미세조류는 식물에 비하여 태양에너지의 이용효율이 25배 높기 때문에, 사료 또는 비료의 용도로 사용되고 있으며, 특히 녹조류에 속하는 스피룰리나(Spirulina sp.), 클로렐라(Chlorella sp.), 두날리엘라(Dunaliella sp.), 노스톡(Nostoc sp.) 등은 건강식품으로도 이용되고 있다. 이러한 미세조류는 태양에너지의 이용효율이 우수하기 때문에, 지질의 함량이 우수한 미세조류는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있다. 이처럼 지질의 함량이 우수한 미세조류로는 보트리오코코스(Botryococcus sp.)와 키오키트리움(Schiochytrium sp.)이 알려져 있는데, 상기 미세조류는 정상적인 생활환경에서는 지질의 함량이 높지 않지만, 영양공급이 중단된 상태에서 일정시간이 경과하면, 세포내에 지질을 축적하는 특성을 나타낸다. 이러한 특성을 이용하여 상기 미세조류를 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있으나, 상기 미세조류의 지질함량을 증가시키기 위해서는 상기 미세조류를 배양하여 증식하는 제1공정과, 상기 증식된 미세조류에 영양공급을 중단하고 일정시간 동안 배양하여 세포내 지질함량을 증대시키는 제2공정이 수행되어야 하는데, 상기 제2공정에는 과다한 시간이 요구되기 때문에 아직까지는 바이오디젤의 산업적 생산에 사용되지 못하고 있으므로, 바이오 디젤의 생산을 위한 지질함량이 우수한 미세조류의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
It is known that such biodiesel can be produced biologically using microalgae. Microalgae are used for feed or fertilizer because the use efficiency of solar energy is 25 times higher than that of plants. Especially, Spirulina sp.), Chlorella (Chlorella sp .), Dunaliella sp .), Nostoc sp .) are also used as health foods. Since these microalgae have excellent utilization efficiency of solar energy, microalgae having high lipid content can be used as biomass for the production of biodiesel. Botryococcus sp . And Schiochytrium sp . Are known microalgae having excellent lipid content. Although the microalgae do not have a high lipid content in a normal living environment, When a certain period of time elapses from the state, it shows a property of accumulating lipids in the cells. In order to increase the lipid content of the microalgae, the microalgae may be cultured and proliferated. In the first step, the microalgae may be used as biomass for the production of biodiesel, A second step of increasing the intracellular lipid content must be performed. However, since the second step requires an excessive time, it can not be used for industrial production of biodiesel until now. Therefore, Development of microalgae with excellent lipid content for the production of biodiesel is urgently required.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 지질함량이 우수한 미세조류를 개발하고자 예의 연구노력한 결과 높은 염류의 농도에서도 정상적으로 증식할 수 있는 미세조류로 알려진 클로렐라 소로키니아나 HS를 높은 염류를 포함하는 배지에서 배양할 경우, 그의 세포내 지질함량이 약 3.4배 증가하므로, 이처럼 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS를 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have made extensive efforts to develop microalgae having excellent lipid content. As a result, it has been found that when chlorella norovirus or HS, which is known as microalgae that can normally grow at a high salt concentration, is cultured in a medium containing high salt , And its intracellular lipid content is increased about 3.4 times. Thus, it has been confirmed that chlorella norovirus or HS having an increased lipid content can be used as a biomass for the production of biodiesel, thus completing the present invention.
본 발명의 하나의 목적은 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS의 제조방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for producing chlorella sorokiniana HS having an increased intracellular lipid content.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide chlorella sorokiniana HS having an increased intracellular lipid content prepared by the above method.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS를 포함하는 바이오매스를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biomass comprising chlorella norovirus or HS having an increased intracellular lipid content.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a method for producing biodiesel using the biomass.
본 발명자들은 바이오 디젤의 생산을 위한 지질함량이 우수한 미세조류를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 클로렐라 소로키니아나 HS(KCTC 12171BP)에 주목하게 되었다.The present inventors paid attention to Chlorella norovirus HS (KCTC 12171BP) while carrying out various studies to develop microalgae having excellent lipid content for the production of biodiesel.
상기 클로렐라 소로키니아나 HS(KCTC 12171BP)는 높은 농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서도 정상적으로 증식할 수 있기 때문에, 축산폐수의 효과적인 정화에 사용되는 미세조류이고, 본 발명자들은 상기 클로렐라 소로키니아나 HS를 축산폐수로부터 최초로 분리동정하여 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2012-0073061호, 2012년 7월 4일). 상기 클로렐라 소로키니아나 HS는 배지에 포함된 염류의 농도가 증가하면 균체의 수는 감소하지만, 균체 자체의 부피가 증가하여 건조중량을 증가시키는 특성을 나타내는데, 이처럼 균체의 부피가 증가되는 원인이 세포내 지질함량의 증가에 기인한 것으로 예상하고 이를 확인하고자, 전자현미경을 이용하여 세포내 구성성분의 변화를 측정하고, 세포내 지질함량의 변화를 측정하였다. 그 결과, 높은 농도의 염류를 포함하는 배지에서 배양된 균체는 정상 농도의 염류를 포함하는 배지에서 배양된 균체에 비하여, 지질의 함량이 현저하게 증가함을 확인하였다. 뿐만 아니라, 상기 균주를 염류를 포함하지 않는 배지에서 배양할 경우에는 균체내에 지질이 축적되지 않으나, 상기 균주를 염류를 포함하는 배지에 접종하고 배양하면, 균체내에 지질이 축적됨을 확인하였다.Since the chlorella norovirus HS (KCTC 12171BP) can be normally propagated in livestock wastewater containing a high concentration of salts, it is a microalgae used for effective purification of livestock wastewater. The present inventors have found that chlorella norovirus or HS It has been separated and identified from the livestock wastewater for the first time and applied for a patent (Korean Patent Application No. 2012-0073061, July 4, 2012). When the concentration of the salt contained in the culture medium is increased, the number of the cells decreases, but the volume of the cells increases and the dry weight thereof increases. In the case of chlorella norovirus, In order to confirm that this is due to an increase in lipid content, changes in intracellular constituents were measured using an electron microscope and changes in the intracellular lipid content were measured. As a result, it was confirmed that the cells cultured in the culture medium containing a high concentration of salt significantly increased the lipid content compared with the culture medium cultured in the culture medium containing the salt at the normal concentration. In addition, when the strain is cultured in a medium containing no salt, lipids are not accumulated in the cells. However, when the strain is inoculated and cultured in a medium containing salts, lipids are accumulated in the cells.
이처럼, 클로렐라 소로키니아나 HS는, 종래의 보트리오코코스(Botryococcus sp.)와 키오키트리움(Schiochytrium sp .)과 같은 미세조류에서 지질함량을 증대시키기 위하여 영양공급을 중단하고 일정시간 동안 배양하여 세포내 지질함량을 증대시키는 공정을 수행하지 않고, 고농도의 염류를 포함하는 배지에서 배양하거나 또는 염류가 없는 배지에서 배양하다가 필요한 경우 고농도의 염류를 추가하는 것만으로도 세포내 지질의 함량을 현저하게 증가시킬 수 있고, 이처럼 세포내 지질의 함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용될 수 있다. 따라서, 클로렐라 소로키니아나 HS는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스의 경제적인 생산에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
As such, Chlorella norovirus HS can be produced by using conventional Botryococcus sp . And Schiochytrium sp . ), The nutrient supply is discontinued and the cells are cultured for a certain period of time, so that the cells are cultured in a culture medium containing a high concentration of the salt without increasing the lipid content in the cell, , And if necessary, the content of lipids in the cell can be remarkably increased only by adding a high concentration of salt, and when the content of lipids in the cell is increased, chlorella norovirus HS can be used as biomass for the production of biodiesel Lt; / RTI > Therefore, chlorella norovirus HS can be used for economical production of biomass for the production of biodiesel.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP)의 배양시, 1 내지 20%(w/v)의 염류를 가하는 단계를 포함하는, 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS의 제조방법을 제공한다.
In one embodiment for achieving the above object, the present invention Chlorella Thoreau Kearney Ana HS (Chlorella The present invention also provides a method for producing chlorella sorokiniana HS having an increased lipid content, comprising the step of adding 1 to 20% (w / v) of salt during culturing of sorokiniana HS (KCTC 12171BP).
본 발명의 용어 "클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP)"란, 단세포로서 존재하는 클로렐라 속(Chlorella sp.)에 속하고, 고농도의 염류를 포함하는 환경에서도 정상적으로 증식할 수 있는 담수조류의 일종을 의미한다.Terms of this invention "Chlorella Thoreau Kearney Ana HS (Chlorella sorokiniana HS) (KCTC 12171BP) "refers to a species of freshwater alga belonging to the genus Chlorella sp. existing as a single cell and capable of normally multiplying even in environments containing high concentrations of salts.
본 발명에 있어서, 상기 클로렐라 소로키니아나 HS는 처음부터 지속적으로 고농도의 염류를 포함하는 배지에서 배양하거나 또는 염류가 없는 배지에서 배양하다가 고농도의 염류를 추가하여 배양할 경우, 상기 염류로 인하여 클로렐라 소로키니아나 HS 균체 내부에 지질축적이 유도되므로, 결과적으로 염류를 포함하지 않은 배지에서 배양된 것보다 약 2 내지 4배 높은 함량의 지질을 포함할 수 있다. 이때, 사용되는 염류의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 20%(w/v)가 될 수 있다.
In the present invention, when the above-mentioned chlorella norovirus HS is cultured in a culture medium continuously containing a high concentration of salts or cultured in a salt-free medium and cultured in the presence of a high concentration of a salt, the chlorella norovirus Since lipid accumulation is induced in the quinia or HS cells, it may result in a lipid content of about 2 to 4 times higher than that cultured in medium containing no salt. At this time, the concentration of the salt to be used is not particularly limited, but it is preferably 1 to 20% (w / v).
본 발명의 용어 "염류"란, 산과 염기가 결합된 결합산물을 의미한다. 미세조류의 배양환경 중에 상기 염류가 증가하면, 미세조류내의 삼투압이 저하되어 미세조류 내부의 수분이 배양환경으로 유출되기 때문에 상기 배양환경내의 염류의 농도가 높을 수록 미세조류의 성장이 감소하게 되고, 일정 수준 이상인 경우에는 미세조류가 사멸하게 된다. The term "salt" of the present invention means a bonded product in which an acid and a base are bonded. Since the osmotic pressure in the microalgae is lowered and the water inside the microalgae flows out to the culture environment when the salt is increased in the culture environment of the microalgae, the growth of the microalgae is decreased as the concentration of the salt in the culture environment is higher, If it is above a certain level, microalgae will be killed.
본 발명에 있어서, 상기 염류는 클로렐라 소로키니아나 HS의 배양배지에 첨가되어 클로렐라 소로키니아나 HS내의 지질함량을 증가시키는 수단으로 사용되는데, 상기 염류는 클로렐라 소로키니아나 HS 세포내 지질의 함량을 증가시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘(MgCl2), 황산마그네슘(MgSO4), 황산칼슘(CaSO4), 황산칼륨(K2SO4), 탄산칼슘(CaCO3), 브로민화마그네슘(MgBr2) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
In the present invention, the salts are added to the culture medium of chlorella norovirus or HS to increase the lipid content in chlorella norovirus or HS. These salts increase the content of lipids in chlorella norovirus or HS cells as it can not specifically limited, preferably sodium chloride (NaCl), magnesium chloride (MgCl 2), magnesium sulfate (MgSO 4), calcium sulfate (CaSO 4), potassium sulfate (K 2 SO 4), calcium carbonate (CaCO 3 ), magnesium bromide (MgBr 2 ), etc. may be used alone or in combination.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다. The term "cultivation" of the present invention means a series of activities in which microorganisms are grown under moderately artificially controlled environmental conditions.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 클로렐라 소로키니아나 HS를 배양하는 방법을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 배양방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다.In the present invention, the culture may be interpreted to mean a method of culturing chlorella norovirus or HS, and the culture method may be carried out using methods well known in the art. Specifically, the culturing can be carried out continuously in a batch process or an injection batch or a repeated batch batch process.
상기 클로렐라 소로키니아나 HS를 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시켜야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 주로 CO2와 카보네이트이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 클로렐라 소로키니아나 HS 배양용 배지로는 NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, 구연산, EDTA Na2, 암모늄 페릭 시트레이트 그린(Ammonium ferric citrate green), Na2CO3 및 트레이스 금속용액(H3BO3, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, Co(NO3)2.6H2O)을 포함하는 BG11 배지를 사용할 수 있다.
In order to cultivate chlorella norovirus or HS, it is necessary to meet the survival requirement of a specific strain in a proper manner by controlling temperature, pH and the like under aerobic conditions in an ordinary medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin and the like . The carbon source that can be used is mainly CO 2 and carbonate, and a mixed sugar of glucose and xylose can be used as a carbon source. In addition, sugars and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose, , Oils and fats such as sunflower oil, castor oil, coconut oil and the like, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture. Nitrogen sources that may be used include inorganic sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine and glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or their decomposition products, defatted soybean cake or decomposition products thereof . These nitrogen sources may be used alone or in combination. The medium may include potassium phosphate, potassium phosphate and the corresponding sodium-containing salts as a source. Potassium which may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts. As the inorganic compound, sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate and calcium carbonate may be used. Finally, in addition to these materials, essential growth materials such as amino acids and vitamins can be used. For example, as a culture medium for chlorella norovirus HS culture, NaNO 3 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, CaCl 2 .2H 2 O, citric acid, EDTA Na 2 , Ammonium ferric citrate green, Na 2 CO 3 and trace metal solutions (H 3 BO 3 , MnCl 2 .4H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, Na 2 MoO 4 .2H 2 O, CuSO 4 .5H 2 O, Co 3 ) 2 .6H 2 O) can be used.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 35℃, 바람직하게는 25℃ 내지 30℃로 유지할 수 있다. In addition, bubble formation can be suppressed by using a defoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester. A gas (eg, air) can be injected to maintain the exhalation condition. The temperature of the culture can usually be maintained at 20 ° C to 35 ° C, preferably at 25 ° C to 30 ° C.
아울러, 광합성을 수행하는 상기 미세조류의 특성상 배양시 빛을 제공함이 바람직한데, 제공되는 빛의 양과 제공시간은 당업자가 필요에 따라 적절하게 조절할 수 있으나, 약 50 내지 100μmole/㎡/s의 광도조건으로 빛을 제공할 수 있다.
The amount of light to be supplied and the duration of light to be provided can be appropriately adjusted according to the needs of a person skilled in the art, but it is preferable that the light intensity of about 50 to 100 μmole /
본 발명의 일 실시예에 의하면, 염류를 포함하지 않은 BG11 배지와 3%의 NaCl을 포함하는 BG11 배지에 클로렐라 소로키니아나 HS를 접종하고, 배양한 다음, 전자현미경 (TEM)을 이용해 세포내 변화를 확인한 결과, 클로렐라 소로키니아나 HS를 염류를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 세포내의 스타치와 지질체의 함량이 증가하여 전체적으로 세포의 크기가 증가하였다(도 1). 또한, 0, 1, 2, 3 또는 4%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에 포함된 지질의 함량을 측정한 결과, 염류가 포함되지 않은 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 10%이고, 1%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 15%이며, 2%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 25%이고, 3%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 34%이며, 4%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 32%임을 확인하였다(도 2). 아울러, 염류가 없는 배지에서 클로렐라 소로키니아나 HS를 배양하다가 상기 배양된 균주를 3 내지 20%(w/v) NaCl을 포함하는 배지에서 배양할 경우, 염류가 없는 배지에서 배양하는 동안에는 상기 균체내에 지질이 축적되지 않았으나, 염류를 포함하는 배지에서 배양하면 염류의 농도에 비례하여 균체내에 지질을 축적하는 균체의 수가 증가함을 확인하였다(도 4).According to one embodiment of the present invention, chlorella norovirus (HS) is inoculated in BG11 medium containing no salt and BG11 medium containing 3% NaCl, and then cultured, and then subjected to electron microscopy (TEM) It was found that when chlorella norovirus HS was cultured in a medium containing salts, the content of starch and lipid in the cells increased and the cell size as a whole increased (Fig. 1). In addition, lipid contents of chlorella norovirus or HS cultured in BG11 medium containing 0, 1, 2, 3 or 4% of salts were measured. As a result, the cells cultured in BG11 medium containing no salt The lipid content contained in the cells cultured in the BG11 medium containing about 1% of the salt was about 10%, and the lipid content in the cells cultured in the BG11 medium containing about 2% Lipid content is about 25%, and the lipid content in the cells cultured in the BG11 medium containing 3% salt is about 34%, and the lipid content in the cells cultured in the BG11 medium containing 4% Was about 32% (FIG. 2). In addition, when the cultured strain is cultured in a culture medium containing 3 to 20% (w / v) NaCl in the absence of a salt solution, chlorella norovirus or HS is cultured in a salt-free medium, Although lipid was not accumulated, it was confirmed that when cultured in a medium containing salts, the number of cells accumulating lipids in the cells increased in proportion to the concentration of salts (FIG. 4).
따라서, 염류를 포함하는 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS는 세포내 지질함량이 증가하고, 지질축적을 일으키는 균체의 수가 증가함을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that chlorella norovirus HS cultured in a medium containing salts increases the intracellular lipid content and increases the number of cells causing lipid accumulation.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조되어, 염류를 포함하지 않은 배지에서 배양된 균체에 비하여 증가된 함량의 지질을 포함하는 클로렐라 소로키니아나 HS를 제공한다.
As another embodiment for achieving the above-mentioned object, the present invention provides chlorella norovirus or HS produced by the above method and containing an increased amount of lipid in comparison with the cells cultured in a medium containing no salt.
상기 방법으로 제조된 클로렐라 소로키니아나 HS는 염류를 포함하지 않은 배지에서 배양된 균체에 비하여 약 3 내지 4배 향상된 함량의 지질을 포함한다. 이때, 상기 클로렐라 소로키니아나 HS에 포함된 지질은 팔미테이트(palmitate, C16:0), 팔미톨레이트(palmitoleate, C16:1), 스테아레이트(stearate, C18:0), 올레이트(oleate, C18:1), 리놀레이트(linoleate, C18:2), 리놀레네이트(linolenate, C18:3) 등을 포함한다. 특히, 팔미톨레이트(palmitoleate, C16:1)는 염류를 포함하지 않은 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에는 포함되지 않으므로, 본 발명의 방법으로 제조된 클로렐라 소로키니아나 HS를 종래의 방법으로 제조된 클로렐라 소로키니아나 HS와 구별할 수 있는 주요 마커로서 사용될 수 있다.
Chlorella norovirus HS prepared by the above method contains about 3 to 4 times more lipid content than the cells cultured in a medium containing no salt. At this time, the lipid contained in the chlorella norovirus HS is palmitate (C16: 0), palmitoleate (C16: 1), stearate (C18: 0), oleate : 1), linoleate (C18: 2), linolenate (C18: 3), and the like. Particularly, since palmitoleate (C16: 1) is not contained in chlorella norovirus cultured in a medium containing no salt, chlorella norovirus (HS) prepared by the method of the present invention is produced by a conventional method Can be used as a major marker that can distinguish it from the Chlorella norovirus HS.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 0, 1, 2, 3 또는 4%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에 포함된 지질의 조성을 분석한 결과, 팔미테이트(palmitate, C16:0), 팔미톨레이트(palmitoleate, C16:1), 스테아레이트(stearate, C18:0), 올레이트(oleate, C18:1), 리놀레이트(linoleate, C18:2), 리놀레네이트(linolenate, C18:3) 등을 포함함을 확인하였다. 특히, 팔미톨레이트는 염류를 포함하지 않은 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에는 포함되어 있지 않고, 염류를 포함하는 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에만 포함되어 있으며, 배지에 포함된 염류의 농도가 증가할수록 상기 지방산들 중에서 팔미톨레이트의 함량이 증가되는 경향을 나타냄을 확인하였다(도 3).
According to one embodiment of the present invention, the composition of lipids contained in Chlorella norovirus HS cultured in BG11 medium containing 0, 1, 2, 3 or 4% of salt was analyzed to find that palmitate, C16 : 0), palmitoleate (C16: 1), stearate (C18: 0), oleate (C18: 1), linoleate (C18: 2), linolenate , C18: 3), and the like. Particularly, palmitoleate is not contained in chlorella norovirus HS cultured in a medium containing no salt, but is contained only in chlorella norovirus or HS cultured in a medium containing salts, and the content of salts It was confirmed that the content of palmitoleate in the fatty acids tends to increase as the concentration increases (FIG. 3).
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS를 포함하는 바이오매스 및 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a biomass comprising chlorella sororinina HS having increased intracellular lipid content, and a method for producing biodiesel using the biomass.
본 발명의 용어 "바이오매스(biomass)"란, 광합성에 의하여 생성되는 다양한 조류(藻類) 및 식물 자원, 즉 나무, 풀, 농작물의 가지, 잎, 뿌리, 열매 등을 의미한다.The term "biomass " of the present invention means various algae and plant resources produced by photosynthesis, that is, trees, grasses, branches, leaves, roots, fruits and the like of crops.
본 발명에 있어서, 상기 바이오매스는 고농도의 염을 포함하는 배지에서 배양되어 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS 균체, 상기 균체를 포함하는 배양물, 배양분획물 등으로 해석될 수 있고, 상기 바이오매스는 바이오디젤의 제조원료로서 사용될 수 있다.
In the present invention, the biomass can be interpreted as chlorella norovirus or HS cells which are cultured in a culture medium containing a salt at a high concentration to increase the lipid content in the cells, cultures containing the cells, and culture fractions. The biomass can be used as a raw material for producing biodiesel.
한편, 본 발명의 바이오디젤의 제조방법은 (a) 상기 바이오매스로부터 지질성분을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 지질에 메탄올을 가하고 알칼리 촉매하에서 반응시켜서 바이오디젤인 FAME(fatty acid methyl)을 수득하는 단계를 포함한다. 이때, FAME의 수율을 증가시키기 위하여 반응부산물인 글리세롤을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Meanwhile, the method for producing biodiesel of the present invention comprises the steps of: (a) obtaining a lipid component from the biomass; And (b) adding methanol to the lipid obtained and reacting it under an alkali catalyst to obtain biodiesel FAME (fatty acid methyl). At this time, in order to increase the yield of FAME, a step of removing glycerol as a reaction by-product may be further included.
본 발명의 용어 "바이오디젤(bio-diesel)"이란, 넓게는 식물성 기름을 원료로 해서 만든 무공해 연료를 통틀어 의미하고, 좁게는 콩기름 등의 식물성 기름을 원료로 사용하여 제조된 지방산메틸에스테르(FAME)를 의미한다. 상기 바이오디젤은 다양한 방법으로 제조될 수 있는데, 대체로 중성지방에 알칼리 촉매와 함께 메탄올을 처리하여 제조된다.
The term "bio-diesel" in the present invention refers broadly to pollution-free fuels made from vegetable oil as a raw material, and narrowly refers to fatty acid methyl esters prepared by using vegetable oil such as soybean oil as a raw material ). The biodiesel can be prepared by various methods, usually prepared by treating methanol with an alkali catalyst to neutral fat.
본 발명의 바이오디젤의 제조방법에 있어서, 상기 바이오매스로부터 지질성분을 수득하기 위하여는 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오매스에 포함된 클로렐라 소로키니아나 HS를 건조시키고, 이를 물리적으로 파쇄하여 수득할 수도 있고, 상기 바이오매스에 유기용매를 가하여 클로렐라 소로키니아나 HS로부터 지질성분을 추출할 수도 있다. 이때, 상기 용매로는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 헥산, DMSO(dimethyl sulfoxide), DMC(dimethyl carnonate) 등을 사용할 수 있다.
In the method for producing biodiesel of the present invention, various known methods can be used for obtaining a lipid component from the biomass. For example, it may be obtained by drying and physically crushing chlorella norovirus or HS contained in the biomass. Alternatively, an organic solvent may be added to the biomass to extract a lipid component from chlorella norovirus or HS . At this time, non-polar solvent may be used as the solvent, and hexane, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl carnonate (DMC) and the like may be used.
본 발명의 방법을 이용하면, 종래의 미세조류에서 지질의 함량을 증가시키기 위해 수행된 공정을 수행하지 않고서도 세포내 지질함량이 증가된 미세조류를 제조할 수 있고, 상기 제조된 세포내 지질함량이 증가된 미세조류는 바이오 디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용할 수 있으므로, 바이오 디젤의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
By using the method of the present invention, it is possible to produce a microalga having an increased intracellular lipid content without performing a process performed to increase the lipid content in the conventional microalgae, and the produced intracellular lipid content This increased microalgae can be used as a biomass for the production of biodiesel, which can be widely used for the economical production of biodiesel.
도 1의 A는 염류를 포함하지 않은 BG11 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS의 세포내 TEM 사진이고, 도 1의 B는 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS의 세포내 TEM 사진이다.
도 2는 배지에 포함된 염류의 농도변화에 따른 클로렐라 소로키니아나 HS 유래 지질함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 염류를 포함하는 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS 세포내 지질의 조성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 염류를 포함하지 않는 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에 염류(3 내지 20%)를 공급하였을 때, 균체내에서 증가하는 지질의 수준을 나타내는 사진이다.FIG. 1 (A) is an intracellular TEM image of chlorella norovirus or HS cultured in BG11 medium containing no salt. FIG. 1 (B) shows the intracellular TEM of chlorella norovirus (HS) cultured in BG11 medium containing salts It is a photograph.
Fig. 2 is a graph showing changes in lipid content derived from chlorella norovirus and HS according to changes in the concentration of salts contained in the medium. Fig.
Figure 3 is a graph showing the composition of lipids in chlorella norovirus or HS cells cultured in medium containing various concentrations of salts.
FIG. 4 is a photograph showing the level of lipid increased in the cells when salts (3 to 20%) were supplied to chlorella norovirus HS cultured in a medium containing no salt.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
1: 클로렐라 1: Chlorella
소로키니아나Sorokiniana
HSHS
에 미치는 염류의 효과Effect of salts on
본 발명자들은 축산폐수에서 분리동정된 클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP)를 배양할 때, 배지내의 염류의 농도가 증가하면 균체의 수는 감소하지만, 균체 자체의 부피가 증가하여 건조중량을 증가시키는 특성을 나타냄을 확인하고, 이를 특허출원하였다(대한민국 특허출원 제2012-0073061호, 2012년 7월 4일).
The present inventors to culture the Isolation and Identification of Chlorella Thoreau Kearney Ana HS (Chlorella sorokiniana HS) (KCTC 12171BP) from livestock waste water, when the salt concentration of in the medium increased the number of cells is reduced, however, increase the volume of the cells themselves (Korean Patent Application No. 2012-0073061, July 4, 2012). In addition, the present invention has been made in view of the above-mentioned problems.
한편, 고농도의 염류를 포함하는 배양액에서 성장한 클로렐라 소로키니아나 HS의 세포내 변화를 확인하기 위해, 염류를 포함하지 않은 BG11 배지와 3%의 염류(NaCl)를 포함하는 BG11 배지에 상기 클로렐라 소로키니아나 HS를 접종하고, 배양한 다음, 전자현미경 (TEM)을 이용해 세포내 변화를 확인하였다(도 1). 이때, 상기 BG11 배지는 하기 표 1에 개시된 Stock No.1 내지 Stock No.9를 혼합하여 제조하였는데, 구체적으로, 배지 1ℓ당, Stock No.1 100㎖, Stock No.2 10㎖, Stock No.3 10㎖, Stock No.4 10㎖, Stock No.5 10㎖, Stock No.7 10㎖, Stock No.8 10㎖, Stock No.9 10㎖ 및 여분의 증류수를 포함하도록 혼합하고, 멸균한 후, 최종적으로 Stock No.6 1㎖을 가하여 제작하였다.
On the other hand, in order to confirm intracellular changes of chlorella norovirus or HS grown in a culture medium containing a high concentration of salts, BG11 medium containing no salt and BG11 medium containing 3% salt (NaCl) Ana HS was inoculated and cultured, and then an intracellular change was confirmed using an electron microscope (TEM) (Fig. 1). At this time, the BG11 medium was prepared by mixing Stock No. 1 to Stock No. 9 shown in the following Table 1, specifically 100 ml of Stock No. 1, 10 ml of Stock No. 2, and Stock No. 10 per liter of medium. 3, 10 ml of Stock No. 4, 10 ml of Stock No. 5, 10 ml of Stock No. 7, 10 ml of Stock No. 8, 10 ml of Stock No. 9 and extra distilled water, , And finally, 1 ml of Stock No. 6 was added.
도 1의 A에서 보듯이, 염류를 포함하지 않은 BG11 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS는 약 2㎛의 크기를 갖고, 세포내에는 틸라코이드, 클로로플라스트, 파이레노이드, 스타치(S) 및 지질체(L)가 포함되어 있음을 알 수 있었다. 이에 반하여, 도 1의 B에서 보듯이, 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS는 약 6㎛의 크기를 갖고, 세포내에는 틸라코이드, 클로로플라스트, 파이레노이드, 다수의 스타치(S) 및 다수의 지질체(L)가 포함되어 있음을 알 수 있었다. 이로부터, 클로렐라 소로키니아나 HS를 염류를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 세포내의 스타치와 지질체의 함량이 증가하여 전체적으로 세포의 크기가 증가함을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 1 (A), chlorella norovirus (HS) cultured in BG11 medium containing no salt has a size of about 2 탆, and thylakoid, chloroplast, pyrenoid, stachy (S) And the lipid body (L). On the contrary, as shown in Fig. 1B, chlorella norovirus HS or HS cultured in BG11 medium containing salts has a size of about 6 mu m, and the cells contain thylakoids, chloroplasts, pyrenoids, (S) and a plurality of lipid bodies (L). From these results, it can be seen that when chlorella norovirus HS is cultured in a medium containing salts, the content of starch and lipid in cell increases and the cell size as a whole increases.
실시예Example
2: 염류에 의한 클로렐라 2: chlorella by salt
소로키니아나Sorokiniana
HSHS
세포내Intracellular
지질함량의 변화 Changes in lipid content
상기 실시예 1의 결과로부터, 클로렐라 소로키니아나 HS를 염류를 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 세포내의 스타치와 지질의 함량이 증가하여 전체적으로 세포의 크기가 증가함을 확인하였으므로, 상기 증가된 세포내 지질의 함량을 변화를 측정하였다.From the results of Example 1, it was confirmed that when chlorella norovirus or HS was cultured in a medium containing salts, the content of starch and lipid in cells increased and the size of cells increased as a whole, Changes in lipid content were measured.
구체적으로, 0, 1, 2, 3 또는 4%의 염류(NaCl)를 포함하는 BG11 배지에 클로렐라 소로키니아나 HS를 접종하여 배양하고, 배양이 종료된 후, 각각의 배양액으로부터 배양균체를 수득하였다. 상기 수득한 각 배양균체에 클로로포름과 메탄올이 2:1(v/v)로 포함된 혼합용매를 가하고 교반한 다음, 다시 증류수를 첨가하여 최종적으로는 클로로포름, 메탄올 및 증류수의 비율이 1:1:0.9(v/v/v)이 되도록 하였다. 이어, 교반을 중지하고, 클로로포름 층을 분획하였으며, 상기 분획된 클로로포름에 용해된 각 배양균체로부터 유래된 지질의 함량을 공지된 방법(Bioresource Technology 101: S75-S77)으로 측정하였다(도 2). 도 2에서 보듯이, 염류가 포함되지 않은 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 10%이고, 1%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 15%이며, 2%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 25%이고, 3%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 34%이며, 4%의 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양된 균체에 포함된 지질함량은 약 32%임을 확인하였다. 이로부터, 3%의 염류를 포함하는 배지에서 배양된 균체가 가장 높은 세포내 지질함량을 나타내고, 염류를 포함하지 않는 배지에서 배양된 균체에 비하여 세포내 지질함량이 약 3.4배 증가하며, 그 이상의 염류를 포함하는 배지에서 배양된 균체는 세포내 지질함량이 다소 감소하는 경향을 나타냄을 알 수 있었다.
Specifically, chlorella norovirus or HS was inoculated in BG11 medium containing 0, 1, 2, 3 or 4% of salt (NaCl), and after cultivation was completed, cultured cells were obtained from each culture . A mixed solvent containing chloroform and methanol in a ratio of 2: 1 (v / v) was added to each of the cultured microbial cells obtained above, and the mixture was stirred. Finally, distilled water was added to the culture. Finally, the ratio of chloroform, methanol and distilled water was 1: 0.9 (v / v / v). Then, the stirring was stopped, and the chloroform layer was fractionated. The content of lipid derived from each cultured cells dissolved in the fractionated chloroform was measured by a known method (Bioresource Technology 101: S75-S77) (FIG. 2). As shown in FIG. 2, the lipid content of the cells cultured in the BG11 medium containing no salt was about 10%, the lipid content in the cells cultured in the BG11 medium containing 1% salt was about 15% , And the lipid content of the cells cultured in the BG11 medium containing 2% of salt is about 25%, the lipid content in the cells cultured in the BG11 medium containing 3% of salt is about 34% The lipid content of the cells cultured in the BG11 medium containing 4% of the salt was found to be about 32%. From this, it can be seen that the cells cultured in the medium containing 3% of the salt exhibit the highest intracellular lipid content, the intracellular lipid content is increased about 3.4 times as compared with the cells cultured in the medium containing no salt, Cells cultured in the medium containing the salts showed a tendency to decrease the lipid content in the cells.
실시예Example
3: 클로렐라 3: Chlorella
소로키니아나Sorokiniana
HSHS
세포내Intracellular
지질의 조성 분석 Analysis of lipid composition
상기 실시예 2에서 수득한 각 배양균체 유래 지질의 조성을 GC 분석을 통해 확인하였다.The composition of each cultured cell-derived lipid obtained in Example 2 was confirmed by GC analysis.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 수득한 배양균체 50 mg에 1㎖의 KOH-CH3OH를 가하여 75℃에서 10분동안 반응시키고, 이에 5% HCl과 메탄올을 추가한 다음 다시 75℃에서 10분동안 반응시켰다. 이어, 상기 반응물에 헥산과 (CH3)3COCH3을 가하여 반응시키고, 증류수를 가한 후 격렬히 혼합하였으며, 상기 혼합물을 상온에서 방치하고 분별추출하여, 지질성분이 포함된 유기용매층을 수득하였다. 상기 수득한 유기용매층을 감압농축 및 동결건조시켜서 지질성분을 수득하고, 상기 수득한 지질성분을 이용하여 다음과 같은 조건으로 GC 분석을 수행하였다: GC 분석장치로는 Gas chromatograph (Shimadzu GC-2010, Japan)를 이용하고, GC 컬럼으로는 DB-WAX (30 m, 0.25 mm)를 사용하였으며, 캐리어 가스(carrier gas)로는 헬륨(30 ㎖/min)을 사용하고, 주입량(injection volumne)은 1㎕이며, 분리비(split ratio)는 20:1이고, 오븐조건(Oven condition)은 170℃에서 1분, 250℃까지 1분당 5℃로 승온시켰으며, 250℃에서 12분 동안 유지하였다(도 3). 도 3에서 보듯이, 클로렐라 소로키니아나 HS 세포내 지질은 주요 지방산으로서 팔미테이트(palmitate, C16:0), 팔미톨레이트(palmitoleate, C16:1), 스테아레이트(stearate, C18:0), 올레이트(oleate, C18:1), 리놀레이트(linoleate, C18:2), 리놀레네이트(linolenate, C18:3) 등을 포함한다. 특히, 팔미톨레이트는 염류를 포함하지 않은 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에는 포함되어 있지 않고, 염류를 포함하는 배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에만 포함되어 있으며, 배지에 포함된 염류의 농도가 증가할 수록 상기 지방산 중에서 함량이 증가되는 경향을 나타냄을 확인하였다.
Specifically, 1 ml of KOH-CH 3 OH was added to 50 mg of the cultured cells obtained in Example 2, and the mixture was reacted at 75 ° C for 10 minutes. Then, 5% HCl and methanol were added thereto, Lt; / RTI > Subsequently, hexane and (CH 3 ) 3 COCH 3 were added to the reaction mixture, followed by reaction with distilled water. The mixture was stirred vigorously. The mixture was allowed to stand at room temperature and fractionated to obtain an organic solvent layer containing lipid components. The obtained organic solvent layer was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain a lipid component. The obtained lipid component was subjected to GC analysis under the following conditions: A gas chromatograph (Shimadzu GC-2010 DB-WAX (30 m, 0.25 mm) was used as the GC column, helium (30 ml / min) was used as the carrier gas, and the injection volume was 1 And the split ratio was 20: 1. The oven condition was raised to 170 deg. C for 1 minute and 250 deg. C for 1 minute, and maintained at 250 deg. C for 12 minutes ). As shown in FIG. 3, the lipids in the cells of Chlorella norovirus HS cells contain palmitate (C16: 0), palmitoleate (C16: 1), stearate (C18: Oleate (C18: 1), linoleate (C18: 2), linolenate (C18: 3) and the like. Particularly, palmitoleate is not contained in chlorella norovirus HS cultured in a medium containing no salt, but is contained only in chlorella norovirus or HS cultured in a medium containing salts, and the content of salts It was confirmed that as the concentration increased, the content tended to increase in the fatty acid.
실시예Example
4: 염류첨가를 통한 클로렐라 4: Chlorella through addition of salt
소로키니아나Sorokiniana
HSHS
세포내Intracellular
지질 축적 Lipid accumulation
상기 실시예 2 및 3의 결과로부터, 클로렐라 소로키니아나 HS 균주를 염류를 포함하는 배지에서 배양할 경우, 균체내 지질의 함량이 증가함을 확인하였으므로, 상기 균주를 염류가 없는 배지에서 배양하고, 염류를 추가하여 상기 균주에 염류쇼크를 가할 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있는지 확인하고자 하였다.From the results of Examples 2 and 3, it was confirmed that when the chlorella norovirus HS strain was cultured in a medium containing salts, the content of lipids in the cells was increased. Therefore, the strain was cultured in a salt-free medium, Salt was added so as to obtain the same result when a salt shock was applied to the strain.
구체적으로, 염류를 포함하지 않는 BG11배지에서 클로렐라 소로키니아 HS 균주를 배양하고, 이로부터 균체를 수득한 다음, 상기 수득한 균체를 0, 3, 5, 7, 10, 15 또는 20%(w/v) NaCl을 각각 포함하는 BG11 배지에 분주하여 접종하였으며, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 각 배양물로부터 균체를 수득하고, 균체내 지질에 의해 반응하는 Nile red 염색을 수행하였으며, 그 결과를 형광현미경으로 관찰하였다(도 4). 도 4에서 보듯이, 0%(w/v) NaCl을 포함하는 BG11 배지에서 배양한 배양물에 포함된 Nile red 염색반응을 나타내는 균체의 수(대조군)에 비하여 염류를 포함하는 BG11 배지에서 배양한 배양물은 Nile red 염색반응을 나타내는 균체의 수가 증가하였고, 배지내 염류의 농도가 증가할 수록 상기 염색반응을 나타내는 균체의 수가 증가함을 확인하였으며, 10, 15 또는 20%(w/v) NaCl을 각각 포함하는 BG11 배지에서 배양한 배양물은 대부분의 균체가 Nile red 염색반응을 나타냄을 확인하였다. Specifically, a strain of Chlorella norovirus HS was cultured in a BG11 medium containing no salt, and the resulting cells were cultured in the presence of 0, 3, 5, 7, 10, 15 or 20% (w / v) NaCl, and further incubated for 24 hours. After completion of the culturing, cells were obtained from each of the cultures, and Nile red staining was performed by reacting with the lipids in the cells. The result was observed with a fluorescence microscope (FIG. 4). As shown in Fig. 4, the number of cells showing the Nile red staining reaction contained in the culture cultured in BG11 medium containing 0% (w / v) NaCl (control) was cultured in BG11 medium containing salts The number of cells expressing the Nile red staining reaction was increased, and the number of cells showing the above staining reaction was increased as the concentration of the salt in the medium was increased. When 10, 15 or 20% (w / v) NaCl In the BG11 culture medium, it was confirmed that most of the cells showed Nile red staining reaction.
따라서, 클로렐라 소로키니아나 HS를 염류를 포함하는 배지에서 배양할 경우 뿐만 아니라, 염류가 없는 배지에서 배양하고, 염류를 추가하여 상기 균주에 염류쇼크를 가할 경우에도 균체내 지질의 함량을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, when chlorella norovirus HS is cultured in a culture medium containing salts as well as cultured in a salt-free medium, salt shock is added to the strain to increase the content of lipids in the cells .
Claims (14)
Chlorella Thoreau Kearney Ana HS (Chlorella A method for producing chlorella sorokiniana HS having an increased lipid content, comprising the step of adding 1 to 20% (w / v) of a salt when culturing a sorokiniana HS (KCTC 12171BP).
클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP)를 처음부터 1 내지 20%(w/v)의 염류를 포함하는 배지에 접종하고 배양하여 수행되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Chlorella Thoreau Kearney Ana HS (Chlorella sorokiniana HS (KCTC 12171BP) is initially inoculated and cultured in a medium containing 1 to 20% (w / v) of salt.
클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP)를 염류를 포함하지 않는 배지에 접종하고 배양한 다음, 상기 배지에 1 내지 20%(w/v)의 염류를 가하고 추가로 배양하여 수행되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Chlorella Thoreau Kearney Ana HS (Chlorella sorokiniana HS) (KCTC 12171BP) is inoculated and cultured in a medium containing no salt, and then 1 to 20% (w / v) of salt is added to the medium and further cultured.
상기 염류는 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘(MgCl2), 황산마그네슘(MgSO4), 황산칼슘(CaSO4), 황산칼륨(K2SO4), 탄산칼슘(CaCO3), 브로민화마그네슘(MgBr2) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
The salts include sodium chloride (NaCl), magnesium chloride (MgCl 2 ), magnesium sulfate (MgSO 4 ), calcium sulfate (CaSO 4 ), potassium sulfate (K 2 SO 4 ), calcium carbonate (CaCO 3 ), magnesium bromide 2 ), and combinations thereof.
A chlorella norovirus or HS strain produced by the method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the content of lipids is increased compared to the cells cultured without addition of salts.
상기 클로렐라 소로키니아나 HS 균주는 염류를 포함하지 않은 배지에서 배양된 균체에 비하여 약 2 내지 4배의 증가한 함량의 지질을 포함하는 것인 균주.
6. The method of claim 5,
Wherein the chlorella norovirus or HS strain comprises an increased amount of lipid in an amount of about 2 to 4 times that of the cells cultured in a medium containing no salt.
상기 지질은 팔미테이트(palmitate, C16:0), 팔미톨레이트(palmitoleate, C16:1), 스테아레이트(stearate, C18:0), 올레이트(oleate, C18:1), 리놀레이트(linoleate, C18:2), 리놀레네이트(linolenate, C18:3) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 균주.
6. The method of claim 5,
The lipid may be selected from the group consisting of palmitate (C16: 0), palmitoleate (C16: 1), stearate (C18: 0), oleate (C18: 1), linoleate : 2), linolenate (C18: 3), and combinations thereof.
상기 지질은 팔미톨레이트(palmitoleate, C16:1)인 것인 균주.
6. The method of claim 5,
Wherein said lipid is palmitoleate (C16: 1).
A biomass comprising the chlorella norovirus or HS strain of claim 5.
(b) 상기 수득한 지질에 메탄올을 가하고 알칼리 촉매하에서 반응시켜서 바이오디젤인 FAME(fatty acid methyl)을 수득하는 단계를 포함하는, 바이오디젤의 제조방법.
(a) obtaining a lipid component from the biomass of claim 9; And
(b) adding methanol to the obtained lipid and reacting it under an alkali catalyst to obtain biodiesel FAME (fatty acid methyl).
(a) 단계에서, 상기 바이오매스에 포함된 클로렐라 소로키니아나 HS를 건조시키고, 이를 물리적으로 파쇄하여 지질을 수득하는 것인 방법.
11. The method of claim 10,
in step (a), the chlorella norovirus or HS contained in the biomass is dried and physically disrupted to obtain lipids.
(a) 단계에서, 상기 바이오매스에 유기용매를 가하여 클로렐라 소로키니아나 HS로부터 지질성분을 추출하여 수득하는 것인 방법.
11. The method of claim 10,
wherein in step (a), an organic solvent is added to the biomass to extract a lipid component from chlorella norovirus or HS.
상기 유기용매는 헥산, DMSO(dimethyl sulfoxide), DMC(dimethyl carnonate) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매인 것인 방법.
13. The method of claim 12,
Wherein the organic solvent is an organic solvent selected from the group consisting of hexane, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl carnonate (DMC), and combinations thereof.
(b) 단계에서, 상기 FAME의 수율을 증가시키기 위하여 반응부산물인 글리세롤을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
11. The method of claim 10,
(b) further comprises removing glycerol, a reaction by-product, to increase the yield of the FAME.
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