KR20150063027A - 신체 기관의 생리학적 상태를 모니터링하는 방법 - Google Patents

신체 기관의 생리학적 상태를 모니터링하는 방법 Download PDF

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페르-올로프 베리렌
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바이오크린 에이비
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Abstract

본 발명은 대상체의 눈에서 이식된 조직 내의 시간에 따른 형태학적 변화를 모니터링함으로써 대상체 내의 기관의 생리학적 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다.

Description

신체 기관의 생리학적 상태를 모니터링하는 방법{Methods for monitoring physiological status of a body organ}
상호 참조
본 출원은, 2012년 7월 27일자로 출원된, 미국 가특허출원 일련번호 제61/676578호의 우선권을 청구하며, 이들 전체는 본원에 참조로 원용된다.
배경
다수의 상이한 실험적 시도들은 베타 세포 질량의 정량화(quantification) 및 궁극적으로 섬(islet)의 개조(remodeling)를 나타내도록 한다. 시험관내 기술은 득점 계산 형태계측(point counting morphometry) 및 절개된 췌장 조직내 섬 치수의 직접적인 측정에 의한 췌장의 조직학적 단면의 분석을 포함한다. 생체 외 영상화 기술은 공초점 현미경검사법 또는 광학 간섭 현미경검사법에 의해 체외로 드러낸 췌장의 영상화를 포함한다. 최종적으로, 수개의 비-침습성(non-invasive) 생체 내 영상 기술은 전체 베타 세포 질량의 종방향 정량화, 즉, 자기 공명 영상화(MRI), 양전자 방사 단층 촬영(PET), 생물발광 영상화, 또는 조합된 멀티모달 영상화를 목표로 한다. 그러나, 이들 다양한 기술들은 시간에 따른 개인의 섬내 후속적인 형태학적 변화에 대한 가능성을 제공하지 않으므로, 이들 기술들은 섬 가소성(islet plasticity)에 대한 간접적인 증거만을 제공한다.
발명의 요지
본 발명은 대상체의 눈에서 이식된 조직내의 시간에 따른 형태학적 변화를 모니터링하는 단계(여기서, 상기 조직은 관심 기관(organ of interest)으로부터 기원하며, 여기서 대상체의 눈에서 이식된 조직내 시간에 따른 형태학적 변화는 대상체에서 관심 기관의 생리학적 상태를 나타낸다)를 포함하는, 대상체에서 기관의 생리학적 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 장애에 대한 치료 과정의 효능을 모니터링하는데 사용된다. 상기 구현예에서, 치료 과정은 대상체에게 치료제를 투여함을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 방법은 개인에서 치료제의 효능을 모니터링한다. 추가의 구현예에서, 치료 과정은 식이 및/또는 운동 요법을 포함할 수 있으며, 상기 방법은 개인에서 식이 및/또는 운동 요법의 효능을 모니터링한다.
다른 구현예에서, 이식된 조직은 대상체로부터 수득될 수 있다. 추가의 구현예에서, 관심 기관은 췌장, 폐, 심장, 뇌, 신장, 간, 소장, 대장, 결장, 위, 담낭, 식도, 요관, 요도, 난소, 자궁, 유방, 척추, 전립샘, 시상하부, 부신, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 송과샘, 비장, 가슴샘, 직장, 유선, 정낭, 사구체, 지방 조직, 종양, 및 고환으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 관심 기관은 땀샘, 침샘, 젖샘, 위, 간, 및 췌장을 포함하나, 이에 한정되지 않는 외분비선을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 관심 기관은 뇌하수체, 췌장, 난소, 고환, 갑상샘, 및 부신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현에에서, 관심 기관은 췌장이다. 이러한 구현예에서, 상기 조직은 분리된 췌장 랑게르한스 섬을 포함할 수 있다.
각종 구현예에서, 형태학적 변화는 조직 내의 세포 크기, 조직 내의 세포 용적, 조직 내의 세포 면적, 조직 내의 세포 형태, 조직 내의 세포 사멸, 조직 내의 세포 증식, 조직 내의 세포 질량, 조직 내의 혈액 관류, 조직 내의 세포의 광학적 반사도, 및 조직 내의 세포의 과립화로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 형태학적 변화는 현미경 관찰에 의해 모니터링될 수 있다. 추가의 구현예에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일 구현예에서, 비-인간 포유동물은 인간 질병의 동물 모델을 갖는다. 다른 구현예에서, 대상체는 인간이고, 여기서 인간은 관심 기관과 관련된 질병을 가진다. 각종 구현예에서, 상기 질병은 당뇨병을 포함할 수 있으며 관심 기관은 췌장일 수 있거나, 상기 질병은 암을 포함할 수 있으므로 상기 관심 기관은 종양을 포함한다. 추가의 구현에에서, 상기 방법은 치료제 또는 시험 화합물을 대상체에게 투여하는 것, 및 투여로부터 야기되는 형태학적 변화를 모니터링하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
인용된 모든 참조문헌은, 그들의 전체가 본원에 참조로서 원용된다. 본 출원에서, 달리 기술하지 않는 한, 이용된 기술은 Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Sambrook, 등., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, 등. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Technique , 2 nd Ed . (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), 및 the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX)와 같은 수개의 공지된 참조 문헌 중의 어느 것에서도 찾을 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 단수 형태 "하나"("a", "an") 및 ("the")는, 내용에서 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 "및"은 달리 표현하여 기술하지 않는 한 "또는"과 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 어떠한 측면의 모든 구현예도, 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, 함께 사용될 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 대상체의 눈에 이식된 조직에서 시간에 따른 형태학적 변화를 모니터링하는 것을 포함하는, 대상체에서 기관의 생리학적 상태를 모니터링하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 조직은 관심 기관으로부터 유래되고, 여기서 상기 대상체의 눈의 이식된 조직내 시간에 따른 형태학적 변화는 대상체의 목적한 기관의 생리학적 상태를 나타낸다.
다음의 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 전안방 내로 이식되어 수개월의 과정에 걸쳐 췌장 섬 집단에서 동일계 내에서 발생하는 형태학적 변화의 생체 내 지시인자로서 제공되는 약간의 "리포터 섬(reporter islet)"의 용도를 기반으로 하는 신규한 방법론을 입증하였다. 상기 개념은 약물 치료 후 후속적으로 정상화되는 비만-유도된 섬 성장 및 혈관화 양식의 종적 가시화 및 정량화에 의해 실시예에 예시하며, 구체적인 요구에 대한 적응에 있어서 이의 인슐린-분비 잠재능의 확장 또는 감소에 의한 개개인의 섬 개조에 대한 최초의 증거를 나타낸다. 따라서, "리포터 섬"은 췌장에서 섬 기능의 임의로 접근가능한 지시인자로서 제공되며, 섬 기능장애의 진단 및 섬 세포 질량 및 기능 상태의 조절 시 특수한 치료의 효과의 모니터링 둘 다를 위한 효과적인 판독으로 제공되는 개인화된 생체 내 생물학적 마커로서 사용될 수 있다.
상기 대상체는 목적한 특정 대상체, 바람직하게는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 영장류, 침팬지, 개코원숭이, 및 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물일 수 있다.
상기 방법이 췌장의 생리학적 상태를 평가하기 위한 리포터 섬의 용도로 예시되어 있지만, 당해 분야의 당업자는, 본원의 교시내용을 기반으로 하여, 상기 방법이 관심 기관으로부터 이식된 조직의 사용에 의해 광범위한 유형의 기관에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 어떠한 적합한 관심 기관의 생리학적 상태도 본 발명의 방법으로 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 관심 기관은 췌장, 폐, 심장, 뇌, 신장, 간, 소장, 대장, 결장, 위, 담낭, 식도, 요관, 요도, 난소, 자궁, 유방, 척추, 전립선, 시상하부, 부신, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 송과샘, 비장, 가슴샘, 직장, 땀샘, 침샘, 유선, 정낭, 사구체, 종양, 지방 조직, 및 고환으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
다른 구현예에서, 관심 기관은 외분비선을 포함한다. 상기 구현예에서, 외분비선의 비-제한된 예는 땀샘, 타액선, 유선, 위, 간, 및 췌장을 포함한다. 추가의 구현예에서, 관심 기관은 내분비선을 포함한다. 상기 구현예에서, 내분비선의 비-제한적 예는 뇌하수체, 췌장, 난소, 고환, 갑상선, 및 부신을 포함한다.
상기 이식된 조직은 개인 세포, 동일한 유형의 다수의 세포, 또는 다수의 상이한 세포 유형의, 예를 들면, 조직/조직 부위를 포함할 수 있다. 상기 이식된 조직은 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 이식된 조직은 눈에 이식되기 전에 대상체로부터 수득된다. 관심 기관으로부터 소량의 조직을 수득하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
대상체의 시력 또는 다른 눈 기능에 있어서 이식체의 어떠한 부정적인 영향을 최소화시키는 어떠한 적합한 양의 조직도 이식시킬 수 있다. 본원에 나타낸 데이타에 예시된 바와 같이, 10 내지 20개의 섬을 마우스 전안방에 이식하였다. 본원의 교시내용을 기반으로 하여, 당해 분야의 당업자는 주어진 대상체에 대해 이식될 적절한 양의 조직을 측정할 수 있다.
일 구현예에서, 이식된 조직 내의 형태학적 변화를 모니터링하는 것은 이식후 적절하게는 1개월 째에 시작하여 이식된 조직의 완전한 혈관화 및 감각형성을 허용한다. 다른 구현예에서, 이식된 조직의 형태학적 변화를 모니터링하는 것은 바람직하게는 이식 직 후 시작할 수 있으며; 상기 구현예는, 예를 들면, 이식된 조직의 완전한 혈관화가 주어진 연구의 경우 필요하지 않을 때(예를 들면, 시험 화합물을 보는 것이 혈관화 및/또는 감각형성에 영향을 미칠 때) 사용할 수 있다. 모든 구현예에서, 상기 모니터링은 주어진 연구에 대해 바람직하다면 수행할 수 있다. 목적하는 경우, 상기 이식된 조직은 치료의 완료 후 또는 어떠한 다른 이유로도 제거할 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 관심 기관은 종양이다. 상기 구현예에서, 상기 방법은 예를 들면, 항-종양 효능, 부작용 등에 대해 비-인간 포유동물 대상체에서 후보물 화합물 또는 다른 치료요법을 시험하기 위해 사용할 수 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 관심 기관은 췌장이다. 상기 구현예에서, 상기 조직은 분리된 췌장 랑게르한스섬을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 적합한 췌장 조직일 수 있다. 랑게르한스 섬은 알파-, 베타- 및 델타-세포를 포함하는 수개의 상이한 세포 유형으로 구성된다. 이들 세포 집단은 내분비 췌장을 나타내며 글루코즈 항상성을 위애 매우 중요하다. 상승된 혈당 수준에 대해 반응하여 베타-세포로부터 인슐린의 불충분한 방출은 당뇨병을 초래한다. 베타-세포로부터 글루코즈 유도된 인슐린 분비의 조절은 자가분비, 측분비, 호르몬 및 신경 인자에 의해 조절되는 복잡한 공정이다.
어떠한 형태학적 변화도 주어진 연구에 적합한 것으로 평가될 수 있으며, 관심 기관 및 이식된 조직의 유형에 적어도 부분적으로 의존한다. 비-제한적 구현예에서, 형태학적 변화는 조직 내의 세포 크기, 조직 내의 세포 용적, 조직 내의 세포 면적, 조직 내의 세포 유형, 조직 내의 세포 사멸, 조직 내의 세포 증식, 조직 내의 세포 질량, 조직 내의 혈액 관류, 조직 내의 세포의 광학 반사도, 및 조직 내의 세포의 과립화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 관심 기관이 췌장이고 이식된 조직이 분리된 랑게스한스 섬을 포함하는 구현예에서, 예시적인 형태학적 변화는 다음을 포함한다:
(a) 베타 세포 질량의 변화(췌장의 생리학적 상태를 반영함);
(b) 베타 세포 파괴(췌장 병리학을 반영할 수 있음);
(c) 베타 세포 과형성 및/또는 세포 비대(증가된 인슐린 함량을 반영함);
(d) 베타 세포 증식(췌장의 생리학적 상태를 반영함);
(e) 섬 치수(췌장의 생리학적 상태를 반영함);
(f) 섬 손상(췌장의 병리학을 반영할 수 있음);
(g) 섬내 혈관 직경(고혈당 조건하에서 미세혈관 혈액 관류를 증가시키도록 설계된 상보성 메카니즘을 반영할 수 있음);
(h) 섬 탈과립화(인슐린 분비 수준을 반영함); 및
(i) 섬 광학 반사율(인슐린 방출의 지표).
본 발명의 특정 구현예 또는 구현예들의 조합의 일 구현예에서, 상기 방법은 대상체에게 투여된 치료제 또는 시험 화합물의 관심 기관에서의 효과를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 하나의 비-제한적 예에서, 상기 방법은 대상체에서 질환에 대한 치료 과정의 효능을 평가함을 포함한다. 비-제한적인 일 구현예에서, 상기 대상체는 당뇨병(제1 또는 제2형 당뇨병)으로 고생하거나, 또는 상기 대상체는 당뇨병의 동물 모델이며 상기 방법은, 상기 대상체가 당뇨병을 치료중인 치료 과정의 효능을 모니터링하는데 사용된다. 일 구현예에서, 치료 과정은 치료제 또는 후보물 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 방법은 치료제의 효능, 치료제의 부작용, 용량 변화의 효과, 및/또는 개인에서 목적한 어떠한 다른 종점을 모니터링한다. 다른 구현예에서, 치료 과정은 식이 및/또는 운동 요법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 개인에서 식이 및/또는 운동 요법의 효능을 모니터링한다.
하기 예시된 바와 같이, 이식된 섬의 생체 내 영상화는 이식 후 제공된 시점에서 각종 섬 매개변수의 정밀한 정량화를 허용하는 3차원 형태학적 정보를 제공한다. 예를 들면, 시간에 따른 평균 섬 용적의 정량화는 이식 후 1개월째로부터 시작하여 ob/ob와 대조군 대상체 사이에서의 유의적인 차이를 나타내었으며, ob/ob 대상체에서 현저한 섬 성장을 나타낸다. 이러한 성장은 대상체 공여체 유전형과는 독립적임을 입증하는데, 즉, 유사한 성장이, 대조군 대상체 섬을 ob/ob 대상체 내로 이식하는 경우에 관찰되었으며, 이는, i) 수용체 대상체로부터 유래하는 시그날링 인자가 이식된 섬의 형태학적 변화를 나타내며, ii) 이식된 섬이 수용체(recipient)의 동일계 내 췌장섬의 형태학적 거동을 반영함을 입증한다. 하기 나타낸 연구는, 이러한 관측된 가소성이 췌장에 위치한 섬에서 동일계 내에서 발생하는 가소성을 반영하며, 상기 장애에 대한 치료에 의해 유발된 이들 형태학적 매개변수에서의 생체 내 변화가 또한 이식된 섬에서 발견되었음을 추가로 입증한다.
따라서, 상기 예는, "리포터 섬"이 대표적인 방식으로, 이들의 인슐린 분비 잠재능을 확장시키거나 감소시키는, 동일계 내 췌장 섬 집단의 개조를 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 기술은 각각의 섬의 연구와 섬 집단의 연구를 "결합(merge)"하도록 하며, 다수의 횡단면 실험을 종방향 연구로 교체하기 위한 잠재성을 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 다재다능한 도구로서 눈 내로 "리포터" 이식된 조직을 영상화하여 이식체, 및 따라서 관심 기관의 형태학적 변화를 초래하는 인자를 확인하는 것을 제안한다.
눈으로의 이식은 바람직하게는 전안방 내로의 이식을 포함한다. 상기 전안방은 눈의 전방 부위를 포함하며, 유리체, 및 또한 각막, 홍채, 모양체, 및 렌즈 전방의 구조를 포함한다. 조직의 전안방 내로의 이식은 어떠한 하나 이상의 이들 전안방 구획 내로의 세포의 위치를 포함할 수 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 조직 이식은 각막을 통한 주사를 통해 이식됨으로써 이식된 섬이 홍채 내로 이식되도록 하여, 각막을 통한 관찰 및 영상화를 허용한다. 홍채 상으로 이식된 전안방 내로 이식된 섬은 혈관화되어, 이들의 세포 조성을 보유하고, 자극에 대해 반응한다. 더욱이, 이들은 형태학적 변화의 생체 내 영상화를 허용하는 비-침습성 레이저 주사 현미경(non-invasive laser scanning microscopy: LSM)에 의해 모니터링될 수 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허공개출원 제20090060843호). 이식 부위로서 전안방을 사용하는 것은 이식된 조직 내 형태학적 변화의 지속적인 모니터링을 허용하며, 예를 들면, 내분비 세포 또는 혈관 세포의 호르몬 및 신경계로부터뿐만 아니라, 자가분비/측분비 시그날로부터의 조절성 도입의 효과를 설명하는데 사용될 수 있다.
이식된 조직에서의 형태학적 변화는 직접적인 가시화를 포함하나, 이에 한정되지 않고, 어떠한 적합한 기술에 의해서도 모니터링될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 형태학적 변화는 현미경에 의해 모니터링된다(참조: 예를 들면, 공개된 미국 특허공개출원 제20090060843호, 및 후속되는 실시예에 기재된 방법). 바람직한 일 구현예에서, 상기 형태학적 변화는 3차원의 형태학적 정보를 제공하는, 공초점 현미경 및/또는 2-광자 현미경에 의해 모니터링된다.
상기 방법은 대상체의 눈에서 이식된 조직의 시간에 따른 형태학적 변화를 모니터링하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 대상체는 목적한 치료제 또는 시험 화합물을 어떠한 적합한 투여 경로를 통해 투여받으며, 이식된 조직의 형태학적 변화는 1회 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상)의 후속적인 시점에서 측정된다. 형태학적 변화의 측정 사이의 어떠한 적합한 시간은, 수행되는 방법의 세부사항의 측면에서 적절한 것으로 고려되는 바와 같이, 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 이식된 조직에서 시간에 따른 형태학적 변화를 대상체로부터 수득된 생검(biopsies)에서 나타낸 바와 같이, 동일한 시간들에 따라 발생하는 동일계 내 변화에 있어서의 변화를 비교하는 것을 추가로 포함한다. 동일계 내 변화는 후술되는 실시예에 기술된 바와 같이 조직 단면의 조직화학적 분석을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 어떠한 적합한 기술에 의해서도 평가할 수 있다.
도 1. ob/ob 마우스 췌장에서 높은 인슐린 요구에 적응하기 위한 증가된 섬 크기. (A) 강력한 비만 표현형을 나타내는, 대조군 한배새끼(우측)와 비교하여 ob/ob 마우스(좌측)의 대표적인 형태학적 외형; (B) 연령이 상이한 ob/ob 및 대조군 마우스의 절식된 체중은 ob/ob 마우스에서 체중의 급속한 증가를 나타낸다; (C) ob/ob 및 대조군 마우스에서 절식된 혈당 및 혈장 인슐린 수준; (D) ob/ob의 5μm-두께의 단면의 영상 몽타주 및 (E) 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된, 대조군 한배새끼 췌장. 담회색의 섬 단면의 염색에 주목한다; (D, E)내 삽화는 전형적인 섬 치수 및 형태학의 확대도를 나타낸다. 마우스는 (A) 4개월 령, (C) 3개월 령, 및 (D, E) 8개월령이다. (B, C): 혼합된 수컷 및 암컷에 대한 값(ob/ob 및 대조로 이루어지는 군 한배새끼 각각에 대해 n = 5마리의 수컷 + 4마리의 암컷, 및 5마리의 수컷 + 5마리의 수컷). 규모 = 1 mm, 삽화 치수는 1 mm × 1 mm를 나타낸다. 값들은 평균 ±s.e.m.이다; **p<0.01; ***p<0.001.
도 2. 섬 성장의 생체 내 종방향 영상화. (A) 4주령 마우스로부터의 섬을 4주령의 대조군(상부 레인) 및 ob/ob(하부 레인) 마우스의 전안방(anterior chamber of the eye) 내로 이식하였다. 상이한 시점에서 이식된 눈의 사진은, 개개의 섬이 확인되고 종방향으로 이어질 수 있음을 나타낼 수 있다(참조: 황색 사선 환); (B) 섬 이식체의 확대된 사진(A에서 적색 틀로 표시)은 ob/ob 수령체의 홍채 위에 이식된 섬에서 명백하게 가시적인 크고 길고 복잡한 혈관을 나타낸다; (C) 공 촛점 현미경 관찰에 의한 이식 1개월 후 단일 섬의 생체 내 영상은 대조군 마우스 대 ob/ob 마우스의 섬 이식체 사이의 형태학적 차이를 나타낸다. 혈관화는 FITC-표지된 덱스트란의 정맥내 주사 전에 영상화된다. 후방산란(backscatter) 강도 및 혈관 직경의 차이에 주목한다; (D) 공초점 현미경 검사법에 의한 이식 후 상이한 시점에서 섬 이식체의 생체 내 영상화; (E) 대조군(사선)과 비교한 것으로서, 후방산란 영상의 분석에 의한 섬 용적의 정량화는 ob/ob(실선)에서 유의적으로 증가된 성장을 나타낸다. 회색 선은 단일 마우스에서 평균 섬 용적을 나타내고, 흑색 선은 유전자형 당 수득된 평균 값(n=3)을 나타낸다; (F) 면역조직화학 분석은 인슐린 및 Ki67 염색에 의해 관찰되는 것으로서, ob/ob 이식된 눈 및 췌장 둘 다에서 베타 세포의 강력한 증식을 나타낸다; (G) 평균 베타 세포 면적을 인슐린 및 DAPI 염색으로부터 정량화하였으며, 이는 ob/ob 마우스로부터의 베타 세포(실선)가 이들의 대조군 한배새끼(사선)로부터의 것보다 유의적으로 더 커졌음을 입증한다. 이러한 비대는, 섬이 췌장 또는 이식된 눈에서 동일계내에 위치하는지에 상관없이 유사하며 비의존적이었다(유의적인 차이는 없음). 모든 영상은 대표적인 것이다. 공초점 영상은 광학 z-스택(optical z-stack)의 최대 강도 투사(maximum intensity projection: MIP)로서 나타낸다. 면역조직화학 실험은 4개월 령 마우스(군당 n ≥ 3마리)를 사용하여 수행하였다. 크기 바아(bars) = 100μm. 오차 바아는 s.e.m.을 나타낸다; *p<0.05; **p<0.01.
도 3. ob/ob 마우스에서 렙틴 처리의 생리학적 효과. (A) ob/ob 마우스에게 3 및 4개월 령 사이에 렙틴을 매일 복강내 주사하였다. 체중, 혈당 및 혈장 인슐린 수준을 처리 전, 동안 및 후에 모니터링하였다(치료의 개시 및 종료는 수직 사선으로 나타낸다); (B) 복강내 글루코즈 내성 시험은 4개월 령에서 대조군 한배새끼(상단 흔적)와 비교하여 ob/ob 마우스에서 손상된 글루코즈 취급을 나타내며, 이는 렙틴 처리로 표준화되지만 거짓 처리(sham treatment)(중간 흔적)에 의해서는 표준화되지 않는다. 하부 막대 그래프는 상기 흔적으로부터의 곡선하 영역(AUC) 값을 나타내며, 글루코즈 취급시 렙틴의 유리한 효과를 입증한다. 값은 평균 ± s.e.m.이다; ** p<0.01; *** p<0.001.
도 4. 렙틴 처리는 ob/ob 섬의 조절장애를 역전시킨다. (A) 3 및 4개월 령 사이의 렙틴 처리(상단) 또는 가짜 처리(하단)된 ob/ob 마우스에서 섬 이식체의 종방향 생체 내 영상화. 맥관구조(vasculature)는 덱스트란-FITC의 꼬리 정맥 주사로 가시화시켰다; (B) 섬 용적 분석은 가짜 치료(백색 바아)와 비교한 것으로서 렙틴 처리(회색 바아) 동안 섬 성장의 역전을 나타낸다; 렙틴 또는 가짜 처리의 말기 후 섬 성장의 차이는 없었다. (C) 렙틴 처리의 말기에 ob/ob 마우스의 이식된 눈 및 췌장 시료에서 면역조직화학은 인슐린 및 Ki67에 대한 면역염색에 의한 약화된 베타-세포 증식을 입증하였다(비교용 도 2F 참조). 공초점 영상은, 대표적인 것이 MIPs로서 나타낸다. 크기 바아 = 100μm. 값은 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다; *** p<0.001.
도 5. 섬내 혈관화에 있어서 렙틴 처리의 효과. 섬을 4주령의 ob/ob 마우스의 전안방 내로 이식하였다. 3개월 령의 마우스에게 렙틴을 매일 복강내 주사하였다. (A) 렙틴 투여는 처리 개시 전, 및 처리 1주일 후 동일한 섬의 생체 내 영상화에 의해 관찰된 것으로서, 혈관 직경에 대한 급속한 효과를 가졌다(맥관구조는 덱스트란-FITC의 꼬리-정맥 주사로 가시화되었다). 상기 동일한 혈관 분절은 상이한 시점 및 측정된 직경에서 확인할 수 있었다(참조: 적색 선). 본 발명자는 렙틴 투여 후 혈관형성을 관찰할 수 있었음에 주목한다(화살표); (B) 개인 혈관 직경의 종방향 분석은 렙틴 처리 전, 동안 및 후의 혈관 형태학적 변화를 나타낸다(상부 흔적, ob/ob 마우스의 섬 이식체로부터 20개의 혈관 분절을 시간에 따라 나타내며, 하부의 막대 그래프(bar graph)는 상응하는 평균 매달 직경 증가를 나타낸다). 공초점 영상은, 대표적인 것이며 MIPs로 나타낸다. 크기 바아 = 100μm. 값은 평균 ± s.e.m.이다; *** p<0.001; ****p<0.0001.
실시예 : 리포터 섬은 동일계 내 췌장 섬의 적합한 가소성을 나타낸다.
요약
랑게르한스 섬은 내분비 췌장을 구성하며 혈당 항상성을 유지하는데 관여한다. 이들은 외분비 췌장 속에 깊숙히 박혀있으므로 기능 연구를 위한 이들의 접근성은 제한되어 있다. 기능 및 생존의 조절을 이해하고 당뇨병에 대한 개개 치료 전략의 임상 결과를 평가하기 위하여, 내분비 췌장을 지속적으로 보고하는 모니터링 시스템이 요구되고 있다. 본 발명자들은 동일계내 췌장 섬의 특성을 성공적으로 보고하는 자연적인 바디 윈도우(body window)의 용도를 기술한다. 원리의 증명으로서 "리포터 섬"을 렙틴이 결여된 마우스의 전안방 내로 이식시켰다. 상기 "리포터 섬"은 렙틴 치료에 의해 역전된 비만-유도된 성장 및 혈관화 패턴을 나타내었다. 따라서, "리포터 섬"은 췌장에서 섬 기능의 광학적으로 접근가능한 지시인자로서 작용하며, 생체 내에서 섬 가소성을 조절하는 특이적인 치료 요법의 효능을 반영한다.
서론
혈당 농도에 있어서 정상적인 변동은 내분비 췌장 내, 랑게르한스 섬의 각종 세포들로부터의 호르몬의 조직화된 방출을 개시한다. 베타 세포는 글루코즈 흡수를 조절하는 필수 호르몬인 인슐린을 생산하여 분비한다. 기능적 베타 세포 질량의 감소는 유행성 확산성을 갖는 파괴 질병인, 손상된 글루코즈 항상성 및 당뇨병을 초래한다. 따라서, 베타 세포 질량의 적절한 조절은 정상 혈당 농도의 유지를 항상 보증하는 각종 기능적 요구에 맞추기 위해 가장 중요하다(1). 건강 및 질병에서 랑게르한스의 섬의 기능적 연구를 위한 주요 과제는, 이들이 내분비 췌장 속에 깊숙히 박혀있으므로 제한된 접근성을 갖는다는 사실이다. 따라서, 기능 및 생존의 조절을 이해하고 당뇨병에 대한 개개 치료 전략의 임상 결과를 평가하기 위하여, 살아있는 유기체내에서 내분비 췌장의 상태를 지속적으로 보고하는 모니터링 시스템이 궁극적으로 요구되고 있다.
본 발명자들은 단일 세포 해상도(2,3)에서 비-침습성의, 종방향, 생체 내 영상화를 위한 기술적 플랫폼을 개발하였다. 이러한 생체 내 영상화 기술을 현재의 연구에 적용함으로써, 본 발명자들은, 전안방 내로 이식된 섬이 내인성 내분비 췌장의 기능적 상태를 보고할 수 있고 더욱이 랑게르한스 섬 내 생리학적 공정을 사용한 중재가 실제로 눈 내에서 모니터링될 수 있다는 본 발명자들의 가설을 시험하기를 원하였다. 이러한 목적으로, 본 발명자들은 모델 시스템으로서 비만 돌연변이체 마우스(ob/ob)의 장점을 취하였다. 상기 마우스는 1950년에 처음 기술되었으며(4), 이는 이의 생애 동안 인상적인 섬 가소성을 나타내며 비만 및 인슐린 내성에 대한 모델로서 집중적으로 연구되었다. 영아때, 이들 마우스는 과인슐린증(hyperinsulinemic), 고혈당증이며 평균 체중보다 더 무겁게 나타난다(5). 강한 식욕과 결합된 명백한 비만 외에, 이들 마우스는 감소된 대사율, 손상된 열발생, 손상된 면역성 및 불임과 같은, 다수의 손상된 기능을 나타낸다(6). 1994년에, 프리드만(Friedman) 및 공동연구자들은 지방 조직에서 주로 생산된, 호르몬 렙틴을 암호화하는 ob 유전자를 확인하였다(7). 상기 유전자는 ob/ob 마우스에서 돌연변이되며, 그 결과 상기 마우스는 어떠한 기능적 렙틴을 발현할 수 없다. 정상 조건하에서, 렙틴은 많은 상이한 생리학적 역활을 가지지만 이의 가장 현저한 기능들 중 하나는 식욕을 조절하는 것이다. 영양소에 대한 반응시, 렙틴은 지방 조직으로부터 방출되어 시상하부에서 렙틴 수용체를 활성화시킴으로써 식욕을 억제하고 결과적으로 식품 섭취를 감소시켰다. 또한, 렙틴 수용체는 베타 세포에서 발현되며, 식품 섭취 후 인슐린 발현 및 방출을 억제하는 지방-인슐린 피드백 루프(adipo-insular feedback loop)에 관여한다(8,9). 따라서, ob/ob 마우스에서 렙틴의 결여는 체중의 급속한 증가 및, 베타 세포 과형성 시 인슐린에 대한 증가된 요구도를 보상하기 위한 노력을 초래한다(10). 그 결과, ob/ob마우스의 섬 세포 집단은 변경되며, 다른 내분비 세포와 비교하여 베타 세포의 퍼센트는 특히 높아서 전체 섬 세포의 90% 이상을 차지한다(11). ob/ob 마우스에서, 렙틴-주도의(leptiin-driven) 피드백 루프 둘 다의 부재는 베타 세포로부터 관찰된 강한 인슐린 방출을 설명하며, 명백한 탈과립화(10) 및 인슐린 내성의 발달의 결과를 나타낸다.
모델 시스템으로서 ob/ob 마우스를 적용함으로써, 본 발명자들은 전안방에서광학적으로 접근가능한 "리포터 섬"의 다재다능하고 흥미있는 용도를 입증할 수 있었다. 이들 리포터 섬은 내분비 췌장에서 동일계 내에서 베타 세포 가소성을 성공적으로 모니터링하며, 또한 후속적으로 특이적인 치료 요법이 가능하도록 한다.
결과
ob / ob 마우스는 비정상적인 생리학적 특성을 나타낸다.
ob/ob 마우스는, 4주령에서 이미 이의 대조군 한배새끼와는 형태학적으로 차별화될 수 있으며, 이의 증가된 체중은 나이가 들어감에 따라 크게 인식가능하게 된다(도 1A, B). 생리학적 연구는 대조군 한배새끼와 비교한 것으로서 증가된 절식 혈당 및 인슐린 수준을 나타내었다(도 1C). 이는 앞서의 보고와 일치하며(5) 과도한 식품 섭취 및 인슐린 내성의 지표이다. ob/ob 마우스 및 대조군 마우스 췌장의 파라핀-포매된(paraffin-embedded) 단면을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 섬 형태학에서의 차이를 관찰하였다. 섬 치수는 증가된 식품 섭취를 보상하기 위한 노력으로 큰 잠재적인 인슐린 분비능을 제공하기 위해 ob/ob 마우스에서 증가되었다(도 1D, E). 췌장 단면을 관찰하는 것은 특정 시점에서 섬의 형태학적 상태에 관한 정보를 제공하지만, 역학적 변화는 인식될 수 없다.
안구내(intraocular) 섬 이식체는 동일계 내 내인성 섬의 적절한 형태학적 가소성을 반영한다.
따라서, 시간에 따른 이들 섬의 형태학적 가소성을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 소수의 "리포터 섬"을, 종방향의 생체 내 영상화를 위해 광학적으로 접근가능한, 마우스의 전안방 내로 이식하였다. 췌장 섬을 4주령의 공여체 마우스로부터 분리하고 연령이 일치하는 수용체의 전안방 내로 이식하였다. 이러한 생체 내 환경은 이식된 섬과 연결될 신경 네트워크뿐만 아니라 모세관도 풍부하게 함유하므로 세포간 측분비 뿐만 아니라 내분비 및 신경 주입도 가능하도록 한다(2, 12). 이식된 섬은 홍채에 신속하에 주입되었으며 개개 섬 이식체는 이식 후 상이한 시점에서 반복적으로 확인될 수 있었다(도 2A). 증가된 성장 외에, 이들 섬들은 시험관내 절개된 췌장 조직으로부터 이미 문서화(13, 14)된 바와 같이, ob/ob 수용체에서 증가된 섬내 혈관 직경을 나타내었다(도 2B). 섬내 혈관 직경에 있어서의 증가는 고혈당증 상태 하에서 혈액 관류를 증가시키도록 설계된 상보성 메카니즘에 관여할 수 있다(15). 이는 또한 내분비 시그날링을 최적화시켜, 각각의 베타 세포가 이러한 강력한 증식 조건하에서 혈액 유동과 직접 교류(communication)하도록 보증하는 하나의 시도일 수 있다. 개개의 섬들은 공초점 현미경에 의해 동계 이식된 마우스에서 상이한 시점에 생체 내 영상화되었으며, ob/ob 섬 이식체에서 거대하고 길고 복잡한 혈관은 형광 영상화에 의해 확인되었다(도 2C). 후방산란 영상화는, ob/ob 마우스 섬에서 외견상 탈과립화되고 불균일한 패턴뿐만 아니라 섬 형태학을 나타내었다. 광의 희소한 반사는 신속한 인슐린 분비를 나타내며, 이는 렙틴-결핍성 조건하에서 지방-인슐린 피드백 루프의 파괴로 설명될 수 있다(9). 파라핀-포매된 단면에서 면역조직화학에 의한 동일계내 섬의 분석은, 췌장의 섬이 ob/ob 마우스와 대조군 마우스 사이의 유사하게 구별가능한 특성을 따라가는 것을 나타내었는데, 즉, CD31 염색은 ob/ob 섬에서 거대 혈관을 나타내었으며 인슐린 염색은 일정하지 않았다.
공초점 현미경에 의한 이식된 섬의 생체 내 영상화는 이식 후 임의의 제공된 시점에서 섬 용적의 정밀한 정량화를 최초로 허용하는 3차원의 형태학적 정보를 제공한다. 시간에 따른 평균 섬 용적의 정량화는 이식 후 1개월째로부터 출발하여 ob/ob 마우스와 대조군 마우스 사이에 유의적인 차이를 나타내었으며, ob/ob 마우스에서 현저한 섬 성장을 나타내었다(도 2D, E). 흥미롭게도, 이러한 성장은 마우스 공여체 유전형과는 독립적인 것으로 입증되었는데, 즉, 본 발명자들은, 대조군 마우스 섬을 ob/ob 마우스 내로 이식한 경우, 유사한 성장을 관찰하였으며, 이러한 특수한 경우에 i) 수용체 마우스로부터 유래되는 시그날링 인자는 이식된 섬의 형태학적 변화를 나타내며, ii) 이식된 섬은 수용체의 동일계 내 췌장 섬에서의 형태학적 거동을 반영함을 입증한다.
안구의 전방에서 이러한 관찰된 가소성이 실제로 췌장 내에 위치한 섬에서 동일계 내에서 발생하는 가소성을 반영하는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 면역조직화학에 의해 섬 이식체 및 내인성 췌장 섬의 파라핀-포매된 단면을 비교하였다. 본 발명자들은 인슐린 및 Ki67에 대한 염색에 의해 ob/ob 마우스 섬에서 베타-세포의 강력한 증식을 관찰하였다(도 2F). 이러한 증식률은, 동일계내 췌장 섬으로부터 또는 전안방 내에 이식된 섬으로부터 측정된 것인지에 대하여 유의적으로 상이하지 않았다(각각 평균 ± s.e.m. = 0.82 ± 0.10 %, n = 5, 및 0.95 ± 0.15 %, n = 4마리의 마우스). 베타 세포에서의 형태학적 변화는 또한 면역조직화학으로 평가하였으며 췌장 및 섬 이식체 내에 위치한 동일계 내 섬 둘 모두에서, 대조군 마우스와 비교하여 ob/ob 마우스에서 세포 면적에서 대략 1.35배의 증가를 나타내었다(도 2G). 렙틴 시그날링의 결여는 이러한 용적 확장에 대하여 유사한 기여인자이다. 실제로, 췌장-특이적인 렙틴 수용체 KO 마우스를 사용하여, 섬에서 렙틴 작용의 파괴가 향상된 PI3K/AKT 시그날링을 초래하며, 이는 베타 세포 크기 및 섬 질량의 증가와 관련됨이 밝혀졌다(16). 이러한 상보성 섬 성장은 시험관 내에서 입증되었지만, 본 발명자들은 본 발명에 이르러 단일의 "리포터 섬"의 분석에 의해 살아있는 ob/ob 마우스에서 상기 패턴을 종방향으로 입증할 수 있었다. 중요하게도, 본 발명자들의 데이타는, 평균 섬 용적이 분리된 섬을 기반으로 한 연구(17)로부터 또는 전체 췌장으로 확장되는 조직학적 단면의 영상화(18)로부터, 2개월 령의 대조군 마우스와 ob/ob 마우스 사이에 4배의 차이를 나타낸 선행 연구와 양립된다.
렙틴 치료는 ob / ob 마우스에서 체중을 감소시키고 혈당 항상성을 교정한다.
식품 과다 소비 및 인슐린 내성에 대한 반응에 있어서 개개인이 섬의 거동이 입증되면서, 본 발명자들은, 이러한 성장이 ob/ob 마우스를 렙틴으로 치료함에 의해 억제되거나 심지어 회복될 수 있는지에 의문을 가졌다. 마우스에게 3 및 4개월 령 사이에 매일 복강내 주사하였다. 이러한 치료의 생리학적 효과를 상이한 매개변수를 사용하여 정규적으로 모니터링하였다. 이들의 가시적으로 감소된 식욕과 유사하게 본 발명자들은 치료 동안 체중, 혈당 및 인슐린 농도에 있어서의 감소를 측정하였다(도 3A). 그러나, 렙틴의 이러한 유리한 효과는, 치료 기간의 종결 후 급속하게 증가하여 약 1개월 후 연령이 일치하는 치료되지 않은 ob/ob 마우스와 유사한 질량에 도달하였으므로 영구적이지 않았다(비교를 위해 도 1B 참조). 상기 치료는 또한 인슐린 민감성에 있어서 유리한 영향을 가졌다. 치료 기간의 말기에, ob/ob 마우스에서 복강내 글루코즈 내성 시험은 연령이 일치하는 대조군 마우스로부터 수득한 것들과 유사한 글루코즈 변동폭(glucose excursion)을 입증하였다(도 3B).
종방향 생체 내 영상은 렙틴에 의한 ob / ob 마우스 섬의 역전된 조절장애를 나타낸다.
렙틴 치료는 또한 섬 성장에 있어서의 영향을 발휘한다. 가짜 처리된(sham-treated) 마우스는 섬 이식체의 지속적인 적합한 성장을 나타낸 반면, 상기 성장은 앞서의 보고와 일치하게(19, 20), 렙틴-치료 하에 폐지되거나 부분적으로 역전되었다(도 4A, B). 치료의 말기에, 베타 세포의 증식은 이식된 섬 및 렙틴으로 치료된 ob/ob 마우스로부터의 동일계내 췌장 섬 둘 다에서 사실상 폐지되었다(도 4C). 렙틴 치료 후 평균 베타 세포 크기는 회복되었으며, 섬이 이식되거나 췌장 속에 내인성으로 존재하는지에 상관없이 연령이 일치한 처리되지 않은 대조군 마우스와 비교하여 유의적인 차이를 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 섬 크기에 있어서의 감소는 앞서 보고된 바와 같이(21), 개개의 베타 세포 크기에서 이러한 감소에 의해서 및 섬내 맥관구조에 있어서의 형태학적 변화에 의해 부분적으로 설명될 수 있었다(도 5). 본 발명자들은 저하된 혈당 수준과 유사한 섬 이식체내 혈관 직경에 있어서의 감소를 측정하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 렙틴 치료 후 초기 단계에서, 혈관 관류를 향상시키고 혈관형성 인자 FGF-2 및 VEGF를 사용한 상승적 자극을 통해 렙틴에 의해 긍정적으로 영향받는 것으로 공지된 생물학적 현상인, 섬 이식체 내의 혈관형성을 관찰할 수 있었다(22).
회복된 렙틴-주도의 지방-인슐린 피드백 루프 및 혈당 수준의 감소로 인하여, 본 발명자들은 렙틴 치료된 ob/ob 마우스로부터의 섬에서 인지된 인슐린에 대한 증가된 면역 염색에 따라서(19), 이들의 보다 강력한 반사 광학적 특성에 의해 이식된 섬에서 수득되는 생체 내 섬 세포의 재과립화를 관찰할 수 있었다(도 4A). ob/ob 마우스에서 렙틴 치료 후 생체 내 인슐린 방출의 표준화는 식품 섭취(20)에 의존적이고 독립적인 둘 모두의 메카니즘의 결과인 것으로 밝혀졌다.
논의
동일계 내 내분비 췌장의 상태를 보고하는 "리포터 섬"에 대한 본 발명자들의 신규한 개념을 시험하기 위하여, 본 발명자들은, 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에서 내분비 췌장의 유의적인 리모델링 능력이 존재한다는 사실을 이용하였다. 따라서, ob/ob 마우스 모델로부터의 "리포터 섬"을 내분비 췌장내에서 성장하는 것을 나타내는, 섬 세포 질량 조절을 조사하기 위해 유사한 유형의 마우스의 전안방에 이식하였다. 상기 "리포터 섬"은 췌장에서 동일계 내에서 관찰된 것과 동일한 비만-유도된 성장 및 혈관화 패턴을 나타내었다. 이들 비만-유도된 성장 및 혈관화 패턴은 전안방 및 동일계 내 췌장 둘 모두에서 렙틴 치료에 의해 회복되었으며, 이의 인슐린 분비 효능의 확장 또는 감소에 의한 매우 효과적인 섬 리모델링에 대한 증거를 나타낸다. 이러한 리모델링 능력은 횡단면 연구에 의해 또는 시험관내 비교적 낮은 해상도에서 췌장 섬 집단의 분석에 의해 단지 간접적으로 제안되어 왔다. 따라서, "리포터 섬"은 생체 내 내분비 췌장의 적합한 가소성을 조절하는 분자 메카니즘을 성공적으로 나타낼 수 있다.
다수의 상이한 실험적 시도는 베타 세포 질량의 정량화 및 궁극적으로 섬의 리모델링을 나타내도록 고려한다. 시험관내 기술은 점 계수 형태계측(point counting morphometry)(18) 및 절개된 췌장 조직내 섬 치수의 직접적인 측정(23, 24)에 의한 췌장의 조직학적 단면의 분석을 포함한다. 생체 외(ex vivo) 영상화 기술은 공초점 현미경(25) 또는 광간섭 현미경(26)에 의한 구체화된 췌장의 영상화를 포함한다. 최종적으로, 수개의 비침습성의 생체 내 영상화 기술, 즉, 자기 공명 영상화(MRI(27)), 양전자 방사 단층 촬영(PET (28)), 생물발광 영상화(29), 또는 조합된 멀티모달 영상화(combined multimodal imaging(30))는 전체 베타 세포 질량의 종방향 정량화를 목표로 한다. 이들 기술들 중 어느 것도 시간에 따라 개개 섬에 있어서 형태학적 변화를 따라갈 가능성을 제공하지 않는다.
본 발명자들은 본 발명에 이르러, 소수의 "리포터 섬"이 대표적인 방식으로, 이들의 인슐린-분비 잠재능을 확대하거나 감소시키는, 동일계 내 췌장 섬 집단의 리모델링을 나타낼 수 있음을 입증한다. 따라서, 상기 기술은 개인의 섬의 연구를 섬 집단의 연구와 함께 "융합"하도록 하며, 다수의 횡단면 실험을 종방향 연구로 대체하기 위한 잠재능을 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 분자 메카니즘을 명확하게 하고 베타 세포 기능 및 생존의 조절시 약리학적 화합물을 확인하기 위한 다목적 도구로서 전안방 내로 이식된 "리포터 섬"의 생체 내 영상화를 제안한다. 중요하게도, 인간에서 섬 기능장애를 진단하고 구체적인 개별적으로 기반한 치료 요법의 효과를 모니터링하기 위한, "리포터 섬"의 동종 용도가 신규한 개인화된 의약 시도로서 예상될 수 있다. "리포터 섬"의 본 발명자들의 개념은 기능 및 증식에 대한 다수의 높은 일시적인 세포의 바이오마커(biomarker)의 실행에 의해 추가로 개발될 수 있으며 또한 세포 및 기관 수준에서 분자 상호작용 및 적합한 메카니즘을 상세히 확인하고 이해하며, 생리학 및 병리학 둘 다에 대한 영향을 가질 열망으로, 또한 다른 기관에 확장시킬 수 있다.
방법 요약
유전자이식 마우스 모델
본 발명자들의 실험에 사용된 ob/ob 마우스는 스웨덴의 우메아(Umea)로부터 유래되며 카롤린스카 병원(Karolinska Hospital)에서 본 발명자의 동물 거점 시설에서 교배시켰다. 모든 실험은 연구 시 동물의 관리 및 사용에 대한 카롤린스카 연구소 지침에 따라서 수행되었으며, 카롤린스카 연구소에서 지방 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
췌장 섬의 전안방 내로의 이식
섬을 암컷 공여체 마우스로부터 분리하여 수컷 수용체의 전안방 내로 이식하였다. 본 발명자들은 이소플루란(제조원: 박스터)을 사용하여 마우스를 마취시켰으며, 대략 10 내지 20개의 섬을 마우스의 전안방 내로 이식하였다. 이식에 사용된 섬은 마우스 유전형과는 독립적인, 각각의 실험을 위한 유사한 크기로 선택하였다. 상기 마우스에게 수술 후 마취를 위해 템게식(Temgesic, 제조원: 쉐링플로우)으로 피하 주사하였다.
안구내 섬 이식체의 생체 내 영상화
마우스에서 섬 이식체는 이식 후 구체적인 시점에서 생체 내에서 영상화하였다. 본 발명자들은 장거리 수-침지(water-dipping) 대물렌즈(Leica HXC-APO 10X/0.30NA), 및 이식된 섬을 함유하는 마우스 눈이 대물렌즈를 향해 위치하도록 하는 주문 제작한 정위 방식 헤드 홀더(custom-built stereotaxic head holder)가 장착된 TCS-SP2-AOBS(제조원: Leica)를 기반으로 하는 직립 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하였다. 비스코티어스(Viscotears)(제조원: 노바티스)를 눈과 대물렌즈 사이에 침지 액으로서 사용하고, 이소플루란을 사용하여 생체 내 영상화 동안에 마우스를 마취하였다. 섬 형태학의 영상화는 633 nm에서 레이저 조명으로 수행하였으며, 동일한 파장에서 후방산란된 광을 수집하였다.
렙틴 치료
렙틴 치료는 1.5 ㎍/g 체중의 재조합체 인간 렙틴(제조원: 아밀린 파바슈티컬즈)으로 수행하였으며, 가짜 치료는 렙틴 대신에 물을 복강내 주사하여 수행하였다.
참조 문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004

물질 및 방법
마우스 모델
본 발명자들의 실험에 사용된 ob/ob 마우스는 스웨덴의 우메아로부터 유래되며 카롤린스카 병원에서 본 발명자들의 동물 거점 시설에서 교배시켰다. 대조군의 마른 한배새끼로부터의 구별은 표현형 및 유전형 분석으로 달성하였다(31). 모든 실험은 연구 시 동물의 관리 및 사용에 대한 카롤린스카 연구소의 지침에 따라서 수행되었으며 카롤린스카 연구소에서 지방 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
생리학적 측정 및 렙틴 치료
체중 및 혈당 수준을 최소 7마리의 마우스에서 측정하였다. 글루코즈 농도는 Accu-ChekTM 아비바 모니터링 시스템(제조원: 로슈)을 사용하여 수득하였다. 글루코즈 내성 시험을 16시간 동안 절식된 마우스(n≥5)에서 체중 그램 당 2 mg의 글루코즈의 복강내 주사로 수행하였다. 조건 당 최소 3마리의 마우스로부터의 혈장 인슐린 농도를 마우스 인슐린 ELISA 플레이트(제조원: 메르코디아(Mercodia))를 사용하여 측정하였다. 렙틴 치료는 1.5 ㎍/g 체중의 재조합체 인간 렙틴(제조원: 아밀린 파바슈티컬즈)의 매일 복강내 주사로 수행하였으며, 가짜 치료는 렙틴 대신에 물의 복강내 주사로 수행하였다.
전안방 내로의 췌장 섬의 이식
섬을 암컷 공여체 마우스로부터 분리하여 수컷 수용체의 전안방 내로 앞서 기술된 기술(2)을 사용하여 이식하였다. 본 발명자들을 마우스를 이소플루란(제조원: 박스터)을 사용하여 마취시키고, 대략 10 내지 20개의 섬을 마우스의 전안방 내로 이식하였다. 이식에 사용된 섬들은 마우스 유전형과는 독립적으로, 각각의 실험에 대해 유사한 크기가 되도록 선택하였다. 마우스에게 수술후 무통증을 위해 템게식TM(TemgesicTM)(제조원: 쉐링플로우)을 사용하여 피하 주사하였다.
안구내 섬 이식체의 생체 내 영상화
마우스의 섬 이식체를 앞서 기술한 바와 같이(2) 이식 후 특정한 시점에서 영상화하였다. 본 발명자들은 장거리 수-침지 대물렌즈(Leica HXC-APO 10X/0.30NA), 및 이식된 섬을 함유하는 마우스 눈이 대물렌즈를 향해 위치하도록 하는 주문 제작한 정위 방식 헤드 홀더가 장착된 TCS-SP2-AOBS(제조원: Leica)를 기반으로 하는 직립 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하였다. 비스코티어스TM(제조원: 노바티스)를 눈과 대물렌즈 사이에 침지 액으로서 사용하고, 이소플루란을 사용하여 생체 내 영상화 동안에 마우스를 마취하였다. 섬 형태학의 영상화는 633 nm에서 레이저 조명으로 수행하였으며, 동일한 파장에서 후방산란된 광을 수집하였다. 혈관의 가시화를 위해, 본 발명자들은 2.5 mg/ml의 500 kDa FITC-표지된 덱스트란(제조원: 인비트로겐)을 함유하는 용액 100μl를 꼬리 정맥 내로 주사하고, 496 nm 여기 파장을 사용하여 형광성을 영상화하였다. 스캐닝 속도 및 레이저 강도를 조절하여 마우스 눈 또는 섬 이식체에 대한 어떠한 세포 손상도 피하였다.
조직 단면 및 면역조직화학
절개된 조직을 PBS로 약하게 세정하고, 실온에서 48시간 동안 포르말린을 사용하여 고정시키고, 탈수시키며 파라핀 속에 포매(embedding)하였다. 프리코트된(precoated) 현미경 슬라이드 위에 올려놓은 5 마이크론 두께의 단면을 크실렌으로 탈랍(dewaxing)시키고, 가공 전에 서서히 다시 수화시켰다. 인슐린을 닭 항-인슐린(1:200 희석, 제조원: 아브캄(Abcam))을 사용하여 염색 한 후 염소 항-닭 알렉사TM(AlexaTM) 488(1:1000 희석, 제조원: 인비트로겐) 항체로 염색하며; 혈관을 랫트 항-마우스 CD31(1:50 희석, 제조원: BD 파밍겐(BD Pharmingen))을 사용하여 염색한 후, 바이오티닐화된 염소 항-랫트(5㎍/ml, 제조원: 벡터랩(Vector Labs))의 배양(incubation) 및 HRP-스트렙타비딘/AlexaTM 647-티라미드(제조원: 인비트로겐)로 증폭시키고; 증식을 마우스 항-인간 Ki67(1:50 희석, 제조원: Novocastra)으로 M.O.M. 바이오티닐화된 항-마우스 IgG(제조원: Vector Labs)와 함께 사용하여 평가하고, HRP-스트렙타비딘/알렉사 647-티라미드를 사용하여 증폭시켰다. 핵을 염색하고 슬라이드를 프로롱TM 골드 안티페이드 시약(ProLongTM Gold Antifade Reagent)과 DAPI(제조원: 인비트로겐)를 사용하여 설치한 커버 글래스로 보존하였다. 슬라이드를 BD Pathway 855 시스템(제조원: BD Biosciences)을 사용하여 영상화하였다. 인슐린, CD31, Ki67 및 DAPI 염색을 20X/0.75NA UApo/340 Olympus 대물렌즈를 사용하여 영상화하고, 헤마톡실린/에오신으로 염색된 췌장 단면의 개관을 4X/0.16NA UPlan SApo Olympus 대물렌즈를 사용하여 몽타주 포획 양식으로 수득하였다.
영상 프로세싱 및 분석
AutoQuant X2(제조원: Media Cybernetics)를 영상 분석 전에 모든 생체 내 공초점 영상의 블라인드 디콘볼루션(blind deconvolution)에 사용하였다. 섬 용적을 MatlabTM 및 Image Processing Toolbox(제조원: Mathworks)을 사용하여 후방산란 시그날 채널을 기반으로 하여 분석하였다. 상기 섬 "적도 용적", 즉, 섬의 상단으로부터 계산된 적도까지의 용적을 사용하여 용적을 나타내고 섬 성장을 계산하였다. 본 발명자들은 동물당 최소 3개의 섬 이식체를 분석하여 분류(category) 당 최소 3마리의 마우스를 사용하여, 섬 성장을 측정하였다. 개개의 혈관 분절을 상이한 영상화 시점에서 확인하고 이들의 직경을 VolocityTM (제조원: Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다. 본 발명자들은 조직학적 단면의 자동화된 분석을 위해 VolocityTM에서 영상 분석 프로토콜을 확립하였다. 평균 베타 세포 단면적은 인슐린-염색된 면적을 상기 면적 속에 포함된 DAPI-염색된 핵의 총 수로 나누어 수득하였다(조직 당 최소 1000개의 세포). 베타 세포 증식율은 Ki67-양성 핵을 계수하고, 인슐린-양성 세포내 DAPI-염색된 핵의 총 수(이식된 눈 또는 췌장 당 최소 10000개 세포)로 나누어 수득하였다. VolocityTM을 영상 디스플레이(image display)를 위해서 사용하였고 포토샵 CS5(제조원: Adobe)를 영상 조립(image assembly)을 위해 사용하였다.
통계적 분석
모든 결과들은 평균 ± SEM으로 나타낸다. 스튜던츠 t 시험(Stuent's t test)은 통계적 유의성을 측정하기 위해 사용하였으며, P 값 < 0.05는 유의적인 것으로 고려하였다.

Claims (23)

  1. 대상체의 눈에 이식된 조직 내의 시간에 따른 형태학적 변화를 모티터링하는 것을 포함하고, 여기서 상기 조직은 관심 기관으로부터 유래하고, 여기서 상기 대상체의 눈에 이식된 조직 내의 시간에 따른 형태학적 변화는 상기 대상체의 관심 기관의 생리학적 상태를 나타내는, 대상체에서 기관의 생리학적 상태를 모니터링하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체에서 장애에 대한 치료 과정의 효능을 모니터링하기 위해 사용되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 치료 과정이 상기 대상체에게 치료제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 방법은 대상체에서 상기 치료제의 효능을 모니터링하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 치료 과정은 식이 및/또는 운동 요법을 포함하고, 여기서 상기 방법은 상기 대상체에서 상기 식이 및/또는 운동 요법의 효능을 모니터링하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식된 조직은 상기 대상체로부터 수득된 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 기관이 췌장, 폐, 심장, 뇌, 신장, 간, 소장, 대장, 결장, 위, 담낭, 식도, 요관, 요도, 난소, 자궁, 유방, 척추, 전립샘, 시상하부, 부신, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 송과샘, 비장, 가슴샘, 직장, 유선, 정낭, 사구체, 지방 조직, 종양, 및 고환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 기관이 외분비선을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 외분비선이 땀샘, 침샘, 젖샘, 위, 간, 및 췌장으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 기관이 내분비선을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 내분비선이 뇌하수체, 췌장, 난소, 고환, 갑상샘, 및 부신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 기관이 상기 췌장인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조직은 분리된 췌장 랑게르한스 섬을 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형태학적 변화가 상기 조직 내의 세포 크기, 상기 조직 내의 세포 용적, 상기 조직 내의 세포 면적, 상기 조직 내의 세포 형태, 상기 조직 내의 세포 사멸, 상기 조직 내의 세포 증식, 상기 조직 내의 세포 질량, 상기 조직 내의 혈액 관류, 상기 조직 내의 세포의 광학적 반사율, 및 상기 조직 내의 세포의 과립화로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 비-인간 포유동물인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비-인간 포유동물은 인간 질병의 동물 모델을 갖는 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 영장류이고, 여기서 상기 영장류는 상기 관심 기관에 관련된 질병을 가진 방법.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간이고, 상기 인간은 상기 관심 기관에 관련된 질병을 가진 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 인간은 당뇨병을 가지고 있고, 상기 관심 기관은 췌장인 방법.
  19. 제1항 내지 제5항 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 기관은 종양인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 치료제 또는 시험 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 것, 및 상기 투여로부터 야기되는 형태학적 변화를 모니터링하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 이식된 조직 내의 형태학적 변화는 투여 후 2회 이상의 시점에서 측정되는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형태학적 변화가 현미경에 의해 모니터링되는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직은 상기 대상체의 전안방(anterior chamber of the eye) 내로 이식되는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9462973B2 (en) 2012-07-27 2016-10-11 Biocrine Ab Methods for monitoring physiological status of a body organ
EP3117211A4 (en) * 2014-03-13 2017-10-11 Pharmacophotonics, Inc. D/B/A Fast Biomedical Improved measurement of body fluid volumes
EP3823648B1 (en) 2018-07-19 2023-06-07 BioCrine AB Methods for treating diabetes
CN110780247B (zh) * 2019-11-12 2021-02-12 无锡鸣石峻致医疗科技有限公司 一种基于磁共振原理的器官脂肪无创定量检测方法
CN114748042A (zh) * 2022-05-09 2022-07-15 江苏百宁盈创医疗科技有限公司 一种基于l型光路的甲状旁腺探测装置

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4289869B2 (ja) * 2002-11-06 2009-07-01 シスメックス株式会社 糖尿病診断支援システム
EP1623228B1 (en) 2003-04-29 2012-12-05 BioCrine AB Apociii and the treatment and diagnosis of diabetes
US20090060843A1 (en) 2007-08-31 2009-03-05 Biocrine Ab Non-Invasive In Vivo Imaging and Methods for Treating Type I Diabetes
CN101868201B (zh) * 2007-09-24 2014-04-16 伊万提斯公司 眼部植入物
WO2012051118A1 (en) 2010-10-12 2012-04-19 University Of Miami Islet storing intraocular implant, method of using the same and kit including the same
US9462973B2 (en) 2012-07-27 2016-10-11 Biocrine Ab Methods for monitoring physiological status of a body organ

Also Published As

Publication number Publication date
US9462973B2 (en) 2016-10-11
US20170276667A1 (en) 2017-09-28
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WO2014016400A1 (en) 2014-01-30
US20170016883A1 (en) 2017-01-19
EP2877084A1 (en) 2015-06-03
US9702867B2 (en) 2017-07-11
EP2877084C0 (en) 2023-06-07
HK1207957A1 (en) 2016-02-19
JP6234453B2 (ja) 2017-11-22
US20190317076A1 (en) 2019-10-17
JP2017201320A (ja) 2017-11-09
CN104703531A (zh) 2015-06-10
US20230079688A1 (en) 2023-03-16
US10228364B2 (en) 2019-03-12
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