KR20150058463A - 데스모글레인 2 (dsg2) 결합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

데스모글레인 2 (dsg2) 결합 단백질 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 아데노바이러스 조성물, 및 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는데 있어서 상기 조성물을 사용하기 위한 방법을 제공한다.

Description

데스모글레인 2 (DSG2) 결합 단백질 및 그의 용도{Desmoglein 2 (DSG2) Binding Proteins and Uses Therefor}
관련 출원에 대한 교차참조
본원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된 2012년 9월 25일자로 제출된 U.S. 임시특허출원 일련번호 61/705,523의 우선권을 주장한다.
정부 권리의 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 R01 CA080192 및 RO1 HLA078836 하에 U.S. 정부 지원으로 이루어졌다. U.S. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
인간 아데노바이러스 (Ads)는 현재 51개의 혈청형을 함유하는 6 종 (A 내지 F)으로 분류되었다. 대부분의 Ad 혈청형은 일차 부착 수용체로서 콕사키-아데노바이러스 수용체 (CAR)를 이용한다 (Bergelson et al., 1997). 그러나, 이것은 종 B Ad 혈청형에 대한 경우는 아니다. 최근에, 본 발명자들은 종 B Ads의 수용체 유용성을 토대로 신규 분류를 제안했다 (Tuve et al., 2006). 그룹 1 (Ad16, 21, 35, 50)은 수용체로서 거의 오로지 CD46만을 이용하고; 그룹 2 (Ad3, Ad7, 14)는 CD46이 아니고 임시적으로 수용체 X로 명명되었던 공통의, 미확인된 수용체(들)를 공유하고; 그룹 3 (Ad11)은 CD46과 우선적으로 상호작용할 뿐만 아니라 CD46이 차단된다면 수용체 X를 이용한다.
종 B Ads는 공통의 인간 병원체이다. 2005년 이래로, 대다수의 US 군사 훈련 시설에서 다양한 종 B 혈청형의 동시 출현이 관찰되었다. 이것은 혈청형 Ad3, Ad7, 및 Ad14를 포함했다 (Metzgar et al., 2007). 2007에, Ad14의 신규의, 고병원성 균주 및 아마도 더 악성인 균주, Ad14a가 미국 및 아시아의 몇몇 장소에서 발견되었다 (Louie et al., 2008; Tate et al., 2009). 본 발명자들은 Ad14a가 그의 수용체 유용성에 관해서 종 B 그룹 2 Ads에 속한다고 최근에 입증했다 (Wang et al., 2009). 총괄하여, 혈청형 (Ad3, Ad7, Ad14, Ad14a, 및 Ad11)을 이용하는 모든 수용체 X는 AdB-2/3으로 본원에서 언급된다.
AdB-2/3은 대부분의 고형 종양에 상당하는, 특히 상피 기원 종양에 관해서, 유전자 전달 벡터로서 큰 관련성을 갖는다 (Yamamoto and Curiel, 2010). 상피 세포는 몇 개의 세포간 접합 및 정점-기저 극성을 유지한다. 상피 세포의 주요 특징은 동소 상피암 및 암 세포주에서 보존된다 (Turley et al., 2008). CAR 및 CD46 둘 모두는 상피 암 세포의 단단한 부착 접합부에서 흔히 포획되며 이들 부착 수용체를 사용하는 Ads에 접근가능하지 않다 (Coyne and Bergelson, 2005; Strauss et al., 2009). 그에 반해서, AdB-2/3은 상피 암 세포를 효율적으로 감염시키고, 이것은 상피 세포로부터 간엽 세포로의 전이 (Epithelial-to-Mesenchymal Transition; EMT)를 연상시키는 유도 과정을 통해 부분적으로 달성된다 (Strauss et al., 2009). AdB-2/3의 또 하나의 독특한 특징은, Ad 섬유 및 펜톤 염기로 이루어진, 그의 복제 동안 서브바이러스 12면체 입자를 생산하는 그의 능력이다 (Norrby et al., 1967). 펜톤-12면체 (PtDd)는 전장 펜톤 염기 단백질로부터 조립될 수 없지만, 잔기 37 및 38 사이에 단백질분해에 의한 자발적인 N-말단 절단을 필요로 한다 (Fuschiotti et al., 2006). 이 절단된 부위는 Ad3, Ad7, Ad11, 및 Ad14에서 보존되지만 Ad2 및 Ad5에 존재하지 않는다. Ad3의 경우에 PtDd는 감염성 바이러스당 엄청난 과잉의 5.5 × 106 PtDd로 형성되고 (Fender et al., 2005), PtDd가 세포간 접합을 방해함으로써 Ad3 감염성을 증대시키고, 따라서 바이러스 확산에 유리하다고 제안되었다 (Walters et al., 2002).
발명의 요약
일 측면에서, 본 발명은 서열번호:1-11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 하나의 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드를 제공한다:
(a) 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, 또는 그의 작용성 등가물;
(b) 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인에 작동가능하게 연결되고 C-말단에 위치한 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 (knob) 도메인으로서, 상기 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 도메인은 임의 서열번호:1-11의 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 폴리펩타이드 노브 도메인;
(c) 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인에 작동가능하게 연결되고 N-말단에 위치한 1 이상의 비-AdB-2/3-유도된 이량체화 도메인.
일 구현예에서, AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드는 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 테일 도메인을 포함하지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 각 샤프트 도메인은 Ad3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad7 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad11 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad 14 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad14a 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, 그의 조합, 및 그의 작용성 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 구현예에서, 각 샤프트 도메인은 서열번호:12-18 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그의 조합을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 이량체화 도메인은 서열번호:24 및 서열번호: 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 추가의 구현예에서, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드는 서열번호:28-34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 하나의 구현예에서, AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드는 다량체화, 예컨대 이량체화된다. 추가 구현예에서, AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드는 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드에 접합된 1 이상의 화합물, 예컨대 치료제, 진단제, 및 조영제를 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 펩타이드 또는 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산, 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다:
(a) 본 발명의 임의의 구현예의 AdB-2/3 섬유 다량체 또는 구현예의 조합; 및
(b) 약제학적으로 허용가능한 담체.
또 추가의 측면에서, 본 발명은 상피 조직과 관련된 장애의 치료적 처리, 또는 진단을 증대시키고/시키거나, 를 진단하고/하거나 상피 조직을 이미지화하는 것을 필요로 하는 대상체에게 하기를 투여함을 포함하는, 방법을 제공한다:
(a) 상기 장애를 치료하기에 충분한 1 이상의 치료제, 상기 장애를 진단하기에 충분한 진단제, 및/또는 상피 조직을 이미지화하기에 충분한 조영제의 양; 및
(b) 상기 1 이상의 치료제, 진단제, 및/또는 조영제의 효능을 증대시키기에 충분한, 상당한 양의 본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 AdB-2/3 섬유 다량체 또는 약제학적 조성물의 양.
상피 조직과 연관된 예시적인 그와 같은 장애는 고형 종양, 과민성 장 증후군, 염증성 창자 장애, 크론병, 궤양성 대장염, 변비, 위식도 역류 질환, 바렛 식도, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 기관지염, 폐 폐공기증, 낭포성 섬유증, 사이질 폐질환, 폐렴, 일차 폐 고혈압, 폐 색전증, 폐 유육종증,결핵, 췌장염, 췌관 장애, 담관 폐색, 담낭염, 온담낭관돌증, 뇌 장애, 건선, 피부염, 사구체신염, 간염, 당뇨병, 갑상선 장애, 연조직염, 감염, 신우신염, 및 담석을 포함한다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 상피 조직과 관련된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 장애를 치료하기에 충분한, 상당한 양의 본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 AdB-2/3 섬유 다량체 또는 약제학적 조성물의 양을 투여함을 포함하는, 상기 치료 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 그와 같은 장애는 바이러스성 감염 또는 고형 종양일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 상피 조직에 화합물의 전달을 개선시키는 방법으로서, 상피 조직을
(a) 상피 조직에 전달되는 1 이상의 화합물; 및
(b) 상피 조직에 1 이상의 화합물의 전달을 증대시키기에 충분한, 본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 AdB-2/3 섬유 다량체 또는 약제학적 조성물의 양과 접촉시킴을 포함하는, 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 1 이상의 화합물은 진단제 또는 조영제일 수 있다.
또 추가의 측면에서, 본 발명은 데스모글레인 2 (DSG2)를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키는 방법으로서, DSG2를 발현시키는 조직을
(a) 조직에 전달되는 1 이상의 화합물; 및
(b) 1 이상의 화합물의 상기 조직으로의 전달을 증대시키기에 충분한, 본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 AdB-2/3 섬유 다량체 또는 약제학적 조성물의 양과 접촉시킴을 포함하는, 방법을 제공한다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 조직내에서 상피 세포로부터 간엽 세포로의 전이 (EMT)를 유도하기에 충분한, 본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 AdB-2/3 섬유 다량체 또는 약제학적 조성물의 양과 접촉시킴을 포함하는, 조직에서 EMT를 유도하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는 것, 상피 조직으로의 물질의 전달을 개선하는 것 중 1 이상을 위하거나, DSG2를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키고, 조직에서 EMT를 유도하고/하거나, AdB-2/3 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 식별하기 위한 방법으로서,
(a) DSG2에 대한 다량체 결합을 촉진시키기 위한 조건 하에서 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체를 DSG2에 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉하는 단계를 1 이상의 시험 화합물의 존재 하에 수행하는, 단계; 및
(b) DSG2에 대한 결합을 위하여 상기 AdB-2/3 섬유 다량체와 경쟁하는 양성 시험 화합물을 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하고,
상기 양성 시험 화합물은 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는 것, 상피 조직으로의 물질의 전달의 개선하는 것 중 1 이상을 위하거나, DSG2를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키고, 조직에서 EMT를 유도하고/하거나 AdB-2/3 감염을 치료하기 위한 후보 화합물인, 방법을 제공한다.
도 1. DSG2 에 대한 결합에 중요하게 관련된 것으로 밝혀진 잔기 . A) Ad3 및 Ad14p1 섬유 노브의 아미노산 서열을 보여준다. Ad3 노브 (PDB 수납 번호 1H7Z_A) 및 Ad14 노브 (PDB: 3F0Y_A)에 존재하는 베타 시트는 선으로 나타낸다. 검은 화살표는, 개별적으로 돌연변이될 때, DSG2에 대한 결합을 제거하거나 감소시키는 Ad3 섬유 노브 내의 잔기를 나타낸다. 모 균주 Ad14(deWit)와 비교할 때, Ad14p1은 삼각형으로 명시된 섬유 단백질 노브 (24)의 FG 루프 내의 2개의 아미노산 잔기의 결실을 가졌다. B) 이량체 Ad3 섬유 노브 돌연변이체의 도식적 구조. 섬유 노브 도메인 및 하나의 샤프트 모티프는 가요성 링커를 통해 동형이량체화된 K-코일 도메인 (41)에 융합되었다. 단백질은 자가-이량체화되고 His-Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제될 수 있다. C-F) 가용성 DSG2에 대한 이량체 Ad3 섬유 노브 돌연변이체의 결합 분석. C 및 D) 쿠마씨 염색. 10μg의 정제된 Ad3 섬유 노브 (끓이지 않음)를 레인마다 로딩했다. 삼량체 형태의 섬유 노브를 화살표로 나타낸다. 겔은 SDS 및 DTT를 함유하는 로딩 버퍼를 함유했으며, 이것은 이전에 보고된 바와 같이 삼량체 섬유 노브의 이량체의 분해를 야기했다 (41). E 및 F) : 프로브로서 가용성 재조합 DSG2, 그 다음 항-DSG2-mAb 및 항-마우스 IgG-HRP를 사용한 웨스턴 블롯. 비교를 위해, JO-1 (0.5μg/레인)을 보여준다. 웨스턴 블롯을 스캐닝하고 신호를 정량화했다.
도 2. Ad3 섬유 노브의 3D 모델. 구조는 PDB 수납 번호 1H7Z_A를 토대로 한다. 상부 패널: DSG2 결합과 관련된 4개의 중요한 영역. 중요 잔기는 삼량체 섬유 노브의 등위면에서 보여준다. 수용체와 마주 대하는 상부 (윗쪽)로부터의 도면. 하부 패널: 조합된 모든 중요 잔기. 우측: 약간의 측면 회전 후 홈의 확장.
도 3. 이량체화된 Ad3 노브 돌연변이체에 의한 Ad3 바이러스의 경쟁. A) 이량체 섬유 노브 돌연변이체의 존재 하에 3H-표지된 Ad3 바이러스의 상대적 부착. 1.8 x 105 HeLa 세포를 얼음 위에서 1 시간 동안 2.5 및 100μg/ml의 농도의 Ad3 노브 돌연변이체와 인큐베이션했다. 그 다음 400 pfu/세포의 3H-Ad3 바이러스를 얼음 위에서 또 1 시간 동안 부가했다. 미결합된 바이러스 입자를 세정하여 제거했다. PBS와 인큐베이션된 바이러스 입자의 부착을 100%로 간주했다. N=3. B) HeLa 세포에서 Ad3-GFP 바이러스 감염의 경쟁. 1.5 x 105 HeLa 세포를 24 웰 플레이트 내로 시딩했다. 세포를 실온에서 1 시간 동안 증가하는 농도에서 Ad3 노브 돌연변이체와 인큐베이션했다. 그 다음 100 pfu/세포의 Ad3-GFP 바이러스를 부가하고 GFP 발현을 유세포측정에 의해 18 시간 후 분석했다. 좌측 패널: GFP 양성 세포의 백분율. 우측 패널: 평균 형광 세기. N=3. 표준 편차는 10% 미만이었다. C) 다중 돌연변이를 갖는 이량체 섬유 노브 돌연변이체의 존재 하에 3H-표지된 Ad3 바이러스의 상대적 부착. 연구는 B)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 표준 편차는 10% 미만이었다. D) HeLa 세포에서 Ad3-GFP 바이러스 감염의 경쟁. 연구는 C)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 표준 편차는 10% 미만이었다.
도 4. 가용성 CD46 에 대한 Ad3 섬유 노브 결합의 분석. 상이한 수의 샤프트 모티프 및 야생형 Ad3 섬유 노브 (레인 1: Ad3-S6/Kn, 레인 2: Ad3-S5/Kn, 레인 3: Ad3-S4/Kn, 레인 4: Ad3-S3/Kn, 레인 5: Ad3-S2/Kn, 레인 6: Ad3-S/Kn), JO-1 (레인 7) 및 CD46-결합 Ad35 섬유 노브 (레인 8)를 함유하는 Ad3 섬유 노브를 블롯팅하고 가용성 DSG2 (상부 패널) 또는 가용성 CD46 (하부 패널)과 혼성화했다. 결합을 항-DSG2 mAb 또는 항-CD46 mAb로 검출했다.
도 5. 상피 접합부를 개방시키는 능력과의 감소된 DSG2 결합의 상관관계. A) 상피 관통 전기적 저항성 (TEER)을 극성화된 결장암 T84 세포에서 측정했다. 세포를 TEER이 일정할 때까지, 즉 단단한 접합이 형성될 때까지 트랜스웰 챔버에서 배양했다. 그 다음 PBS 중의 총 5μg의 이량체 Ad3 섬유 노브를 정점 챔버에 1 시간 동안 부가했다. TEER을 명시된 시점에서 측정했다. N=6. 시점 1.5 및 4 시간의 경우 JO-1 대 D261N 및 N186D 사이의 차이가 유의미했다 (p<0.01). 화살표는 Ad3 섬유 노브의 부가 및 제거를 나타낸다. B) 이리노테칸 요법의 증대. 총 4x106 A549 세포를 CB17-SCID/베이지 마우스에 피하로 주입했다. 종양이 ~100 mm3의 용적에 도달되면 (이식 후 15 일), 마우스는 2mg/kg JO-1, E299V, N186D, 또는 PBS로 정맥내로 주입되었고, 그 다음 1 시간 후 이리노테칸 (37.5mg/kg)의 정맥내 주사로 주입되었다. 처리는 25 일에 반복되었다. N=5. "이리노테칸" 대 "E299V+이리노테칸" 또는 "이리노테칸" 대 "N186+이리노테칸" 사이의 차이는 유의미하지 않았다. "이리노테칸" 대 "JO-1+이리노테칸" 사이의 차이는 20 일부터 계속 유의미했다 (p<0.01).
도 6. DSG2 에 대한 결합을 증가시키는 아미노산 치환 A) Ad3 섬유 노브의 아미노산 서열을 보여준다. 베타 시트는 선으로 명시된다. 화살표는 DSG2에 대한 더 강한 결합을 명시하는, 돌연변이될 때 콜로니 블롯 검정에서 더 강한 신호를 산출했던 Ad3 섬유 노브 내의 잔기를 명시한다. B) 3개의 노브 단량체의 등위면. 좌측 패널: 평면도; 우측 패널: 측면도. V239 및 Y250은 상부에서 노출되지 않으며, 이는 DSG2에 대한 직접적인 결합에 관여하기 보다는 노브에서의 구조적 변화를 암시한다. C) DSG2에 대한 결합을 증대시키는 모든 돌연변이의 국소화. 잔기는 2개의 노브 단량체에서 심홍색(magenta)으로 보여준다. 하나의 단량체의 등위면은 회색 투명도로 보여준다.
도 7. DSG2 와 비- 이량체화된 Ad3 섬유 노브 상호작용의 SPR 분석. A) DSG2를 센서칩 위에 고정시키고, 배경을 대조 유동셀에서 자동으로 배제했다. Ad3 섬유 노브 (w/o 이량체화 도메인: "noDD")를 2.5 μg/ml에서 3 분 동안 주입하고 그 다음 2.5 분 해리 기간이 뒤따랐다. B) SPR 데이타의 요약. 2.5 내지 10 μg/ml 농도 범위의 노브를 주입하고, 동력학 및 친화도 파라미터를 BIAeval 소프트웨어를 사용하여 평가했다. 추출된 데이타를 표에서 요약한다. Wt= 돌연변이가 없는 Ad3 섬유 노브
도 8. Ad3 섬유 노브 돌연변이체 JO -2의 전자 현미경검사 및 3D 구조. A-C) SST로 JO-2의 음성 염색. 이량체 형태가 보여질 수 있지만 고급 구조가 또한 보이고, 대략 50nm의 이종성 복합체는 가는 화살표로 묘사되었고 더 작은 규칙적 "12면체-유사" 입자는 두꺼운 화살표로 묘사되었다. 클로즈업 도면은 B 및 C에서 주어진다. D-G) (K217E/F224S 돌연변이체)의 비-이량체화된 형태의 결정 구조. D) 단백질 결정. E) 야생형 Ad3 노브는 회색으로 착색되고 EF 루프 217-224는 별도로 착색된다. 이것은 돌연변이체에서 무질서하게 되는 루프이다. 돌연변이체 구조에서 이들 잔기에 대한 밀집은 없다. F) 돌연변이체는 카툰으로서 보여준다. G) 이들 2개의 구조의 중첩은 EG 루프가 K217E/F224S 돌연변이체에서 완전히 무질서하게 됨을 보여준다. 하부 패널은 한 단량체의 클로즈업 도면을 보여준다. K217 및 F224는 스틱으로 나타난다.
도 9. DSG2 에 대한 친화도가 증가된 이량체 Ad3 섬유 노브 돌연변이체의 분석. A) 이량체 친화도-증대된 돌연변이체 Y250F 및 JO-1 (이량체 wt Ad3 섬유 노브)를 갖는 HeLa 세포에서 Ad3-GFP 바이러스 감염의 경쟁. 실험 셋팅은 도 3c에 대해 기재된 바와 같다. 좌측 패널: GFP 양성 세포의 백분율. 우측 패널: 평균 형광 세기. N=3. 표준 편차는 10% 미만이었다. B) DSG2 결합이 증대되었지만 이량체화 도메인이 없는 Ad3 노브 돌연변이체에 의한 HeLa 세포에서 Ad3-GFP 바이러스 감염의 경쟁. 1.5 x 105 HeLa 세포를 24 웰 플레이트 내에 시딩했다. 세포를 실온에서 1 시간 동안 증가하는 농도에서 Ad3 노브 돌연변이체와 인큐베이션했다. 그 다음 100 pfu/세포의 Ad3GFP 바이러스를 부가하고 GFP 발현을 18 시간 후에 분석했다. C) 결장암 T84 세포에 대한 TEER. 실험 셋팅은 도 5a에 대해서와 동일했다. 4 시간에서의 TEER을 보여준다. N=3.
도 10. 친화도-증대된 JO -1 버전의 화학요법과의 조합. A) 이리노테칸 (I) 요법의 증대. 실험 셋팅은 도 5b에서와 동일했다. 그룹 "JO-1+I" 대 "JO-2+이리노테칸" 및 "JO-2+I" 대 "JO-4+I"에서의 차이는 20 일부터 계속 유의미했다. N=5. B) JO-4는 JO-1보다 저 용량에서 난소암 모델에서 PLD 요법을 증대시킨다. 유선 지방 패드 종양을 일차 난소암 ovc316 세포로부터 확보했다. 처리는 종양이 100mm3의 용적에 도달될 때 개시했다. 마우스는 2 mg/kg JO-1 또는 0.5mg/kg JO-4로 정맥 내로 주입되었고, 그 다음 1 시간 후 페길화된 리포좀 독소루비신 (PLD)(1 mg/kg)의 정맥내 주사가 뒤따랐다. 처리를 매주 반복했다. C) JO-4는 나쁜-예후 삼중 음성유방암 (TNBC)에서 요법을 증대시킨다. 총 4x106 TNBC MDA-MB-231 세포를 CB17 SCID-베이지 마우스의 유선 지방 패드 내로 주입했다. JO-4 (2mg/kg)를 세툭시맙 (C)(10mg/kg, i.p.) 및 nab-파클리탁셀 (nab-P)(5mg/kg, i.v)의 적용 1 시간 전에 정맥내로 주입했다. 매주 처리되었다. nab-P+C 대 JO-4+nab-P+C에 대한 25 일에서의 N=10 P<0.01.
도 11. JO -4의 약동학, 독성, 및 면역원성. A) JO-1 및 JO-4의 혈청 청소능. 피하 TC1-hDSG2 종양 (~600mm3)을 갖는 hDSG2 이식유전자 마우스는 JO-1 또는 JO-4 (2mg/kg)로 정맥내로 주입되었고 혈청 샘플을 ELISA로 분석했다. N=3. Y-축은 로그 눈금을 가짐을 주지한다. B) JO-1 또는 JO-4 주사 후 hDSG2/TC1-hDSG2 이식유전자 마우스에서 림프구 및 혈소판 수. N=3. C) TC1-hDSG2 종양을 갖는 면역적격 hDSG2 이식유전자 마우스에서의 요법 연구. 종양이 ~80mm3의 용적에 도달될 때, JO-1 또는 JO-4 (2mg/kg) 또는 PBS를 정맥내로 주입하고 그 다음 1 시간 후 PLD/독실 (i.v. 1.5mg/kg)이 뒤따랐다. 처리는 화살표로 명시된 바와 같이 반복했다. 그 다음 종양을 약 2 주 동안 재성장시켰다. 15 일부터 계속 혈청 항-JO-1/J)-4 항체를 ELISA로 검출가능했다. 2 이상의 처리 사이클을 28 일 및 35 일에 수행했다. JO-1 및 JO-4는 심지어 검출가능한 항체의 존재 하에서도 다중 처리 사이클 후에도 효과가 지속되었다. JO-1/PLD 대 JO-4/PLD 사이의 차이는 31 일부터 계속 유의미하다. N=10.
도 12. 섬유 노브 서열의 정렬. DSG2에 대한 Ad3 노브 결합을 제거하고/감소시키는 잔기를 명시한다.
도 13. 인간 및 과백신접종된 ( hypervaccinated ) 마우스로부터의 혈청은 JO-4의 활성을 억제하지 않는다. A) ELISA에 의한 JO-4와의 결합에 대한 인간 혈청의 분석. Ad3 섬유 노브에 대한 토끼 폴리클로날 항체가 포획에 사용되었고, 그 다음 재조합 JO-1 단백질, 인간 혈청 (희석 1:20 내지 1:1000), 및 항-인간 IgG-HRP를 사용했다. IgG에 대해 고갈되는 상업적 인간 Ab 혈청을 음성 대조군으로서 사용했다 (수평선). Ad3 바이러스와 함께 일상적으로 작업하는 과학자로부터의 혈청을 양성 대조군으로서 사용했다. P1 내지 P38은 태평양 난소암 연구 컨소시엄 (Pacific Ovarian Cancer Research Consortium)에서 수득된 난소암 환자에 대한 혈청 샘플이다.
발명의 상세한 설명
인용된 모든 참조문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원 내에서, 달리 언급되지 않으면, 이용된 기술은 수개의 공지된 참조문헌, 예컨대: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Technique , 2 nd Ed . (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), and the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX) 중 어느 것에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "1개", "이의", 및 "그의" ("a", "an" 및 "the")는 달리 문백에서 명확히 명시되지 않으면 복수의 지시대상을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "및"은 달리 명확히 언급되지 않으면 "또는"과 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 하기와 같이 축약된다: 알라닌 (Ala;　A), 아스파라긴 (Asn;　N), 아스파르트산 (Asp;　D), 아르기닌 (Arg;　R), 시스테인 (Cys;　C), 글루탐산 (Glu;　E), 글루타민 (Gln;　Q), 글리신 (Gly;　G), 히스티딘 (His;　H), 이소류신 (Ile;　I), 류신 (Leu;　L), 라이신 (Lys;　K), 메티오닌 (Met;　M), 페닐알라닌 (Phe;　F), 프롤린 (Pro;　P), 세린 (Ser;　S), 트레오닌 (Thr;　T), 트립토판 (Trp;　W), 티로신 (Tyr;　Y), 및 발린 (Val;　V).
본원에서 사용된 바와 같이, 약어 "Ad"는 아데노바이러스를 지칭하고 전형적으로 아데노바이러스의 혈청형을 명시하는 수가 뒤따른다. 예를 들면, "Ad3"은 아데노바이러스 혈청형　3을 지칭한다.
본 발명의 임의 측면의 모든 구현예는 달리 문맥에서 명확히 명시되지 않으면 조합하여 사용될 수 있다.
제 1 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공한다:
TLWTG(V/P)(N/K)P(--/T)(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/N)(N/P)D(C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G)(L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D)(N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL(F/Y)FD(S/A)(A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3 (S/Y)(G/K) Q(N/T)(M/--)(A/--)(T/--)(G/--)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 (--/L)(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/--) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN(Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T/L)WS(W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APE(G/V/--)(Q/--)T(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (서열번호: 1); 여기서
X2는 H, L, 또는 P이고;
X3은 K 또는 E이고;
X4는 T, F, S, 또는 L이고;
X5는 V, D이거나, 부재하고;
X6은 E, G이거나, 부재하고
X7은 Y 또는 F이고;
X8은 T, K, 또는 E이고;
X9는 N 또는 S이고;
여기서 하기 중 적어도 하나는 참이다:
X2는 P이거나;
X3은 E이거나;
X4는 S, 또는 L이거나;
X5는 D이거나;
X6은 G이거나;
X7은 F이거나;
X8은 E이거나;
X9는 S이다.
본 발명의 이러한 측면에 따르는 단리된 폴리펩타이드는, 예를 들면, 이전에 공지된 DSG2 결합 폴리펩타이드와 비교하여 데스모글레인 2 (DSG2)에 대해 유의미하게 증대된 친화도를 제공하는 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있는 돌연변이체 AdB-2/3 노브 도메인을 포함한다. 하기 실시예에서 보여주는 바와 같이, 본 발명의 제 1 측면의 돌연변이체 노브 도메인을 포함한 본 발명의 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드는 일련의 암 모델에서 개선된 효능으로 예시된 바와 같이, 상피-연관된 장애를 치료하기 위한 이전에 공지된 DSG2 결합 폴리펩타이드보다 치료적으로 더 강한 것으로 추가로 보여준다. 본 발명의 단리된 펩타이드가, 예를 들면, AdB-2/3 바이러스에 대한 항원으로서 또한 사용될 수 있다.
소괄호 내에 보여주는 잔기는 단일 잔기에서의 옵션을 반영하고; 대시 (--)는 잔기가 부재할 수 있다는 것을 명시한다.
일 구현예에서, 본 발명의 제 1 측면의 단리된 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
TLWTG(V/P)(N/K)P(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/N)(N/P)D(C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G)(L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D)(N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL(F/Y)FD(S/A)(A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3 (S/Y)(G/K)Q(N/T)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 (--/L)(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/--) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN(Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T/L)WS(W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APET(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (서열번호: 2).
또 하나의 구현예에서, 본 발명의 제 1 측면의 단리된 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
TLWTG(V/P)(N/K)P(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/N)(N/P)D(C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G)(L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D)(N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL(F/Y)FD(S/A)(A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3 (S/Y)(G/K)Q(N/T)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 L(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN(Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T/L)WS(W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APET(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (서열번호: 3).
추가 구현예에서, 본 발명의 제 1 측면의 단리된 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
TLWTGPKPEA NCIIEYGKQN PDSKLTLILV KNGG(I/L)VNGYV TLMGASDYVN TLFKNKNVSI NVELYFDATG HILPDSSSLK TDLE X2 X3 YKQT AD X4 SARGFMP
STTAYPF X5 LP NAGTHN X6 N X7 I FGQCYY X8 ASD GALFPLEVTV MLNKRLPDSR
TSYVMTFLWS L X9 AGLAPETT QATLITSPFT FSYIREDD (서열번호: 4).
이들 모든 구현예에서, 하기 중 적어도 하나는 참이다:
X2는 P이거나;
X3은 E이거나;
X4는 S, 또는 L이거나;
X5는 D이거나;
X6은 G이거나;
X7은 F이거나;
X8은 E이거나;
X9는 S이다.
다양한 구현예에서, 이들 서술 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 모두는 참이다. 하나의 예시적인 구현예에서, 적어도 X7은 F이다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 X3은 E이고 X4는 S이다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 X9는 S이다. 추가 구현예에서, 적어도 X5는 D이다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 X4는 L이다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 X2는 P이고 X8은 E이다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 X6은 G이고 X8은 E이다.
다양한 추가 구현예에서, 단리된 폴리펩타이드는 하기 펩타이드 중 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
(a)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 5);
(b)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELEYKQTADSSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 6);
(c)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLSAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 7);
(d)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFDLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 8);
(e)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLEPKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 9);
(f)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADLSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 10); 및
(g)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 11).
제 2 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드를 제공한다:
(a) 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, 또는 그의 작용성 등가물;
(b) 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인에 작동가능하게 연결되고 C-말단에 위치한, AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 도메인으로서, 상기 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 도메인은 본 발명의 제 1 측면의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 노브 도메인;
(c) 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인에 작동가능하게 연결되고 N-말단에 위치한 1 이상의 비-AdB-2/3-유도된 이량체화 도메인.
본원에서 사용된 바와 같이, "AdB-2/3"은 바이러스 결합을 위해 상피 세포 수용체로서 DSG2를 사용한 임의 아데노바이러스 혈청형이다. 현재까지, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, 및 Ad14a 혈청형이 확인되었다. 다른 Ad 혈청형이 확인됨으로써, 당해 분야의 숙련가는 본원에서 개시된 바와 같이 DSG2 결합 검정을 토대로 하여 AbD-2/3 패밀리에 속하는 것들을 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들면, 고정된 재조합 DSG2를 함유한 센서를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 연구는, DSG2 경쟁 연구와 결합되어, 신규 Ad 혈청형이 DSG2와 결합하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 추가의 예시적인 연구, 예컨대 기능의 손실 및 획득 분석이 WO 2011/156761에 상세히 기재된다.
아데노바이러스 비리온은 캡시드의 각각의 12 정점의 기저에 위치한 섬유에 의해 특징지워진 정이십면체이다. 비리온 상의 섬유는 3개의　개별적인 섬유 폴리펩타이드로 이루어진 동형삼량체 구조이다. 각각의 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드는 캡시드의 펜톤 염기 단백질과 상호작용하고 세포 핵에 단백질의 수송에 필요한 신호를 함유하는 N-말단 테일; 수많은 15-잔기 반복 단위를 함유하는 샤프트; 및 수용체 결합을 위한 결정요인을 함유하는 C-말단 노브 도메인으로 이루어진 비대칭 구조이다 (J.S.　Hong and J.A.　Engler, Journal of Virology　70:7071-7078 (1996)). 모든 아데노바이러스는 섬유의 말단 상의 노브 구조를 통해 그의 수용체에 부착된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 AdB-2/3 "섬유 폴리펩타이드"는 N-말단 테일 도메인, 샤프트 도메인, 및 C-말단 노브 도메인을 포함하는 전장 섬유 폴리펩타이드를 지칭한다. 섬유 폴리펩타이드는 캡시드의 각각의 12 정점의 기저에서 아데노바이러스 비리온의 외부에 위치한 "섬유"로서 지칭되는 동형삼량체로 자발적으로 조립된다.
바람직한 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 Ad 섬유 폴리펩타이드로부터의 테일 도메인을 포함하지 않는다. 하기 상세히 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 중요 잔기를 확인했으며, 이의 돌연변이는 DSG2에 대해 유의미하게 증대된 친화도, 및 유의미하게 증대된 치료적 효력을 나타내는 섬유 폴리펩타이드를 야기한다. 따라서 본 발명의 이러한 측면의 폴리펩타이드는, 예를 들면, 상술한 본 발명의 다양한 방법에 사용하기 위한 AdB-2/3 섬유 다량체를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 이 측면에서, 재조합 폴리펩타이드는 임의 AdB-2/3 바이러스로부터의 샤프트 도메인, 또는 DSG2에 대한 결합 친화도를 유지하거나 개선시키는 그와 같은 샤프트 도메인에 대한 임의 돌연변이체 (치환, 부가, 결실, 키메라, 등)를 포함할 수 있으며, 이량체화 도메인(작용성 등가물)을 통해 다량체 (예컨대 이량체)를 형성할 수 있다. 예를 들면, 고정된 재조합 DSG2를 함유한 센서를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 연구는, DSG2 경쟁 연구와 결합되어, 평가될 재조합 폴리펩타이드가 DSG2와 결합하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
본원 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 그의 폭넓은 의미에서 서브유닛 아미노산의 서열을 지칭하는데 사용된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 L-아미노산, (생체내에서 L-아미노산-특이적 프로테아제에 대해 내성인) D-아미노산, 또는 D- 및 L-아미노산의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있거나 재조합으로 발현될 수 있다. 폴리펩타이드는, 예컨대 페길화 (PEGylation), 헤실레이션 (HESylation), 파실레이션 (PASylation), 당화에 의해 생체내에서 반감기 증가를 촉진시키기 위해 다른 화합물에 연결될 수 있거나, Fc-융합 또는 탈면역화된 변이체로서 생산될 수 있다. 그와 같은 연결은 당해 분야의 숙련가에게 이해되는 바와 같이 공유 또는 비-공유일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 원소들의 배열을 지칭하며, 여기서 도메인은 이들이 그의 의도된 목적을 위해 유닛으로 기능하도록 구성된다. 상기 용어는, 스페이서/링커 서열이 도메인들 사이에 존재할 수 있기 때문에, 도메인들이 폴리펩타이드 상에서 바로 접하여 인접하는 것을 요구하지 않으며, 이의 길이는 상당히 가변적이다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드들의 임의 2 개의 도메인들 사이의 스페이서 길이는 약 0 아미노산 내지 약 20 아미노산일 수 있다. 다양한 다른 비제한적인 구현예에서, 스페이서 길이는 길이가 0-20, 0-19, 0-18, 0-17, 0-16, 0-15, 0-14, 0-13, 0-12, 0-11, 0-10, 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 0-2, 0-1, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-20, 8-19, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12, 10-11, 11-20, 11-19, 11-18, 11-17, 11-16, 11-15, 11-14, 11-13, 11-12, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, 12-13, 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 13-14, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 14-15, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 15-16, 16-20, 16-19, 16-18, 16-17, 17-20, 17-19, 17-18, 18-20, 18-19, 19-20, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0 아미노산일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 폴리펩타이드"는 비-자연 발생 단백질 생성물을 의미하고, 여기서 재조합 폴리펩타이드의 도메인은 1 이상의 다른 단백질 또는 인공적으로 유도된 서열, 예컨대 본 발명의 돌연변이체 노브 도메인 폴리펩타이드로부터 유도된다. 예를 들면, 각각의 샤프트 도메인은 상이한 자연 발생 단백질로부터 유도될 수 있다. 재조합 폴리펩타이드는, 비제한적으로, 표준 DNA 조작 기술 및 재조합 폴리펩타이드의 서브유닛 부분을 통한 화학적 어셈블리를 포함하는 다양한 기전에 의해 구성될 수 있다. 화학적 어셈블리는 분자 유전적 형태로서의 등가 형태를 야기하거나 등가 기능을 갖는 대안적인 연합을 야기할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 표준 재조합 DNA 기법에 의해 생산된다. 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 그와 같은 재조합 생산 및 단리를 위한 기술은 본원의 교시를 토대로 하여 당해 분야의 숙련가의 수준 내에서 충분하다.
일 구현예에서, 각각의 샤프트 도메인은 Ad3 샤프트 도메인, Ad7 샤프트 도메인, Ad11 샤프트 도메인, Ad 14 샤프트 도메인, Ad14a 샤프트 도메인, 그의 조합, 및 그의 작용성 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 샤프트 도메인은 섬유 노브 이량체화를 위해 필요하며, 이것은 DSG2에 대한 결합 및 이에 따른 세포간 접합의 일시적 개방을 위해 필요하다. 따라서, 이들 Ad 바이러스 혈청형의 샤프트 도메인의 작용성 등가물은 하기 제공된 실시예를 토대로 하여 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들면, 고정된 재조합 DSG2를 함유한 센서를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 연구는, DSG2 경쟁 연구와 결합하여, 평가될 재조합 폴리펩타이드가 DSG2와 결합하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 추가의 예시적인 연구, 예컨대 기능의 손실 및 획득 분석이 실시예 1에 상세히 기재된다.
재조합 폴리펩타이드는 1 내지 22 개의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서에서, 폴리펩타이드는 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-22, 2-21, 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-22, 3-21, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-22, 4-21, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-22, 5-21, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-22, 6-21, 6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-22, 7-21, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-22, 8-21, 8-20, 8-19, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-22, 9-21, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-22, 10-21, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12, 10-11, 11-22, 11-21, 11-20, 11-19, 11-18, 11-17, 11-16, 11-15, 11-14, 11-13, 11-12, 12-22, 12-21, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, 12-13, 13-22, 13-21, 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 13-14, 14-22, 14-21, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 14-15, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 15-16, 16-22, 16-21, 16-20, 16-19, 16-18, 16-17, 17-22, 17-21, 17-20, 17-19, 17-18, 18-22, 18-21, 18-20, 18-19, 19-22, 19-21, 19-20, 20-22, 20-21, 21-22, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 AdB-2/3 섬유 단백질 샤프트 도메인을 포함한다. 1 초과의 AdB-2/3 섬유 단백질 샤프트 도메인이 존재하는 경우, 각각의 샤프트 도메인은 동일할 수 있거나, 샤프트 도메인의 1 이상의 카피는 단일 재조합 폴리펩타이드에서 상이할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드는 단일 샤프트 도메인을 갖는다.
또 하나의 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드에서 1 이상의 (또는 모든) 샤프트 도메인은 서열번호 12에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
GVL(T/S)LKC(L/V)(T/N)PLTT(T/A)(G/S)GSLQLKVG(G/S)GLTVD(D/T)T(D/N)G(T/F/S)L(Q/K/E)ENI(G/S/K)(A/V)(T/N)TPL(V/T)K(T/S)(G/N)HSI(G/N)L(S/P)(L/I)G(A/P/N)GL(G/Q)(T/I)(D/E)(E/Q)NKLC(T/S/A)KLG(E/Q/N)GLTF(N/D)S(N/S)N(I/S)(C/I)(I/A)(D/N/L)(D/K)N(I/--)NTL. 본원에서 보여주는 이 서열 및 다른 가변 서열에서, 가변 잔기는 소괄호 내에 나타내고, "_"는 잔기가 부재할 수 있음을 명시한다.
또 하나의 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드에서 1 이상의 (또는 모든) 샤프트 도메인은 서열번호 13에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
GVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLT(V/I)DDTDG(T/F)L(Q/K)ENI(G/S)ATTPLVKTGHSIGL(S/P)LG(A/P)GLGT(D/N)ENKLC(T/A)KLG(E/Q)GLTFNSNNICI(D/N)DNINTL
또 추가의 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드에서 1 이상 (또는 모든) 샤프트 도메인은 서열번호:14 (Ad3), 서열번호: 15 (Ad7), 서열번호: 16 (Ad11), 서열번호: 17 (Ad14), 및 서열번호:18 (Ad14a)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 도메인은 본 발명의 제 1 측면의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합을 포함하거나 이로 이루어지고 (즉: 서열번호: 1-11 중의 어느 것); 이들 폴리펩타이드 도메인은 본 발명의 제 1 측면에 상세히 기재된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "이량체화 도메인"은 그것을 함유하는 재조합 폴리펩타이드에서 이량체화를 촉진시키는 펩타이드 서열이다. 임의의 적합한 비-AdB-2/3-유도된 이량체화 도메인은, 그것이 재조합 폴리펩타이드의 이량체화를 가능하게 하고 이에 따라 DSG2에 대한 결합을 가능하게 하는 한, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드에서 사용될 수 있다. 이량체화 도메인은, 그것이 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드에서 자연 발생 도메인이 아니라는 점에서, 비-AdB-2/3-유도된 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 공지되고 본 발명에 사용하기에 적합한 수많은 이량체화 도메인의 비-제한적인 예는, 비제한적으로 적어도 하나의 나선을 함유하는 펩타이드 나선, 또는 나선, 코일 및 또 하나의 나선, 등에 의해 형성된 구조, 이중나선 구조, 예를 들면, 다수의 세포 표면 신호전달 수용체 내의 이량체화 도메인, 항체의 Fc 영역 또는 힌지 영역, 류신 지퍼, STAT 단백질 N 말단 도메인, FK506 결합 단백질, LexA 단백질 C-말단 도메인, 핵 수용체, FkpA N-말단 도메인, 에이. 멕시마 (A. maxima)로부터의 오렌지 카로테노이드 단백질, 인플루엔자로부터의 M1 매트릭스 단백질, 인플루엔자 바이러스로부터의 뉴라미니다제, 대장균 푸쿨로오스 알돌라아제; 등을 포함한다 (참고, 예를 들면, O'Shea, Science. 254: 539 (1991), Barahmand-Pour et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121-128 (1996); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998); Ho et al., Nature. 382: 822-826 (1996); 및 Pomeranz et al., Biochem. 37: 965 (1998)). 추가의 예들은 소 파필로마바이러스 E2 단백질에서 잔기 325 내지 410, (Dostatni, N., et al., EMBO J 7 (1988) 3807-3816; Haugen, T., et al. EMBO J 7 (1988) 4245-4253; McBride, A., et al., EMBO J 7 (1988) 533-539; McBride, A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 86 (1989) 510-514), 타입 I 탈이온효소 (D1) : DFLVIYIEEAHASDGW (서열번호: 19) 또는 ADFL--YI-EAH―DGW (서열번호: 20); HIV-1 캡시드 단백질: QGPKEPFRDYVDRFYKTLRA (서열번호: 21); 효모 GCN4의 류신 지퍼 이량체화 모티프: HMKQL D VEEL S NYHL N VARL K VGER (서열번호: 22); 에스케리치아 콜리 전사 항종결자 단백질에서 류신 지퍼; 및 BglG: GVTQLMREMLQLIKFQFSLNYQEESLSYQRLVT (서열번호: 23)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이량체화 도메인은 EVSALEK (서열번호:24) 및/또는 KVSALKE (서열번호: 25)의 1 이상의 카피를 포함한다.
본 발명의 재조합 폴리펩타이드에서 이량체화 도메인, 및 그의 돌연변이체로서 제공될 수 있는 적절한 펩타이드 서열을 확인하는 것은 충분히 당해 분야의 기술 수준 내에 있다. 예를 들면, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드의 이량체화는 수크로오스 구배에 의한 침강, 트립신 단백질분해에 대한 저항성, 및 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동 이동도를 포함하는 기준에 의해 평가될 수 있다 (Hong and Engler, Journal of Virology　70:7071-7078 (1996)).
재조합 폴리펩타이드는 1 이상의 비-AdB-2/3-유도된 이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 비-AdB-2/3-유도된 이량체화 도메인을 포함한다. 다중 도메인이 폴리펩타이드에 존재하는 경우, 각각의 이량체화 도메인이 동일한 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서 스페이서 펩타이드는 이량체화 도메인 및 1 이상의 샤프트 도메인 사이에 위치한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 구조적 가요성을 갖는 펩타이드이다. 구조적 가요성을 갖는 사실상 임의의 펩타이드가 사용될 수 있다. 예로서, 가요성 펩타이드는 아미노산 잔기의 반복, 예컨대 Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호: 26), 또는 아미노산 잔기의 임의의 다른 적합한 반복을 포함할 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 항체의 힌지 영역이 사용될 수 있다. 스페이서는 재조합 폴리펩타이드의 이량체화하고 DSG2에 대한 재조합 폴리펩타이드의 결합을 유지하는 능력을 유지하는 임의의 적합한 길이일 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 재조합 AdB-2/3 폴리펩타이드는 각각이 Ad3 샤프트 도메인 (서열번호:14)을 포함하거나 이로 이루어진 1 이상의 샤프트 도메인을 포함한다.
이러한 바람직한 구현예는 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 임의의 적합한 이량체화 도메인이 사용될 수 있고, 임의의 적합한 노브 도메인은 비제한적으로 EVSALEK (서열번호:24) 및/또는 KVSALKE (서열번호: 25)의 1 이상의 카피를 포함하여, 사용될 수 있다. 유사하게 임의의 적합한 스페이서 펩타이드가 이량체화 도메인 및 샤프트 도메인 사이에 그리고/또는 샤프트 도메인 및 노브 도메인 사이에 사용될 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 재조합 AdB-2/3 폴리펩타이드는 JO-1 (서열번호 :27), 또는 그의 다량체 (예컨대 이량체)를 포함하거나 이로 이루어진다.
재조합 폴리펩타이드는 추가의 도메인, 예컨대 폴리펩타이드의 단리를 위한 도메인 및/또는 검출 도메인을 포함할 수 있다. 단리 도메인은, 예를 들면, 재조합 폴리펩타이드 생산 후에 폴리펩타이드의 정제/단리를 용이하게 하기 위해 부가될 수 있다. 임의의 적합한 단리 도메인은 비제한적으로 HIS, CBP, CYD (공유결합이지만 분리할 수 있는 NorpD 펩타이드), Strep II, FLAG, HPC (단백질 C의 중쇄) 펩타이드 태그, GST 및 MBP 친화성 태그를 포함하여, 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "검출 도메인"은 검출될 수 있는 1 이상의 아미노산 서열을 의미한다. 임의의 적합한 검출 도메인은, 형광으로 또는 발광으로 표지된, 비제한적으로, 염료, 효소 보조인자 및 조작된 결합 분자를 포함하는, 본질적으로 형광인 단백질 (예를 들면 비생물발광 산호충강 종으로부터의 녹색 형광 단백질 및 형광 단백질), 보조인자-요구 형광 또는 발광 단백질 (예를 들면 피코빌리단백질 또는 루시퍼라아제), 및 특이적 항체 또는 다른 특이적 천연 또는 비천연 결합 프로브에 의해 인식가능한 에피토프를 포함하여, 이로 한정하지 않지만, 사용될 수 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드는 하기 서열 중의 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
(a)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 28);
(b)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELEYKQTADSSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 29);
(c)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLSAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 30);
(d)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFDLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 31);
(e)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLEPKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 32);
(f)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADLSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 33); 및
(g)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 34).
또 하나의 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 다량체 형태, 예컨대 이량체, 삼량체, 등으로 존재한다. 바람직한 구현예에서, 다량체는 각각의 동형삼량체에서 이량체화 도메인을 통한 이량체화에 의해 형성된 이량체를 포함한다 (즉: 폴리펩타이드는 노브 도메인의 삼량체화를 통한 동형삼량체이다). 다량체 형태 (예컨대 이량체)에서, 재조합 폴리펩타이드는 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함하고, 상술한 본 발명의 다양한 방법에 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 그와 같은 다량체는 본 발명의 동일한 재조합 폴리펩타이드의 다량체를 포함할 수 있거나, 본 발명의 상이한 재조합 폴리펩타이드의 다량체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이량체화 도메인은 다량체의 각 재조합 폴리펩타이드 형성 부위에서 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 이량체화 도메인은 다량체의 각 재조합 폴리펩타이드 형성 부위에서 상이하다. 또 하나의 구현예에서, 샤프트 및/또는 노브 도메인은 다량체의 각 재조합 폴리펩타이드 형성 부위에서 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 샤프트 및/또는 노브 도메인은 다량체의 각 재조합 폴리펩타이드 형성 부위에서 상이하다.
AdB-2/3 섬유 다중화는 당해 분야의 전문가에게 잘 알려진 방법에 따라서 결정될 수 있다. 예를 들면, 재조합 AdB-2/3 섬유 구성체의 다중화는 수크로오스 구배에 의한 침강, 트립신 단백질분해에 대한 저항성, 및 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동 이동도를 포함하는 기준에 의해 평가될 수 있다 (Hong and Engler, Journal of Virology 　70:7071-7078 (1996)). 전기영동 이동도에 관하여, 섬유 다량체는 매우 안정한 복합체이고, 샘플을 SDS-PAGE 전에 끓이지 않을 때 다량체의 것과 일치된 분자량에서 움직일 것이다. 그러나, 끓이면, 다량체 구조는 파열되고 차후에 단백질은 단백질 단량체와 일치된 크기로 움직인다.
재조합 폴리펩타이드, 또는 그의 다량체 버전은 용액으로 보관되거나 냉동될 수 있다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드는 상피 조직과 관련된 장애를 위한 1 이상의 치료제와 조합된다 (예컨대 치료제에 접합된다). 그와 같은 결합체는, 예를 들면, 본 발명의 치료 방법에 사용될 수 있다. 예컨대 공유 결합 또는 화학적 가교결합에 의한 본 발명의 폴리펩타이드의 관심 치료제로의 접합 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 임의의 적합한 치료제는 본 발명의 이러한 구현예에 따라서, 비제한적으로, 종양 기질 분해 화합물 (예컨대 릴락신), 알킬화제, 신생혈관형성 억제제, 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 오로라 키나아제 억제제, 세포자멸사 프로모터 (예를 들면, Bcl-xL, Bcl-w 및 Bfl-1) 억제제, 사멸 수용체 경로의 활성제, Bcr-Abl 키나아제 억제제, BiTE (이중특이적 T 세포 연관체) 항체, 생물학적 반응 조절물질, 사이클린-의존적 키나아제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, 성장 인자 억제제, 열충격 단백질 (HSP)-90 억제제, 탈메틸화제, 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 억제제, 호르몬 치료, 면역제제, 세포자멸사 단백질 억제제 (IAPs) 삽입 항생제, 키나아제 억제제, 포유동물 표적의 라파마이신 억제제, 마이크로RNA의 미토겐-활성화된 세포외 신호-조절된 키나아제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드 항-염증성 약물 (NSAIDs), 폴리 ADP (아데노신 디인산염)-리보오스 중합효소 (PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나아제 (Plk) 억제제, 프로테아솜 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물성 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산 (siRNAs), 토포이소머라제 억제제 등을 포함하여, 결합체(conjugate)를 형성하는데 사용될 수 있다.
이들 다양한 클래스 내에 속하는 예시적인 치료제는 비제한적으로 하기를 포함한다: 도세탁셀, 독소루비신, 이리노테칸, 파클리탁셀 (Taxol®), 파클리탁셀 알부민 결합된 입자 (Abraxane®), 독소루비신 HCL 리포좀 (Doxil®), BiTE 항체 예컨대 아데카투무맙 (Micromet MT201), 블리나투모맙 (Micromet MT103) 등, siRNA-기반 치료제, 알트레타민을 포함하는 알킬화제, AMD-473, AP-5280, 아파지쿠온, 벤다무스틴, 브로스탈리신, 부설판, 카보쿠온, 카르무스틴 (BCNU), 클로르암부실, CLORETAZINE® (라로무스틴, VNP 40101M), 사이클로포스파마이드, 다카르바진, 데시타빈, 5'-아자시티딘, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파마이드, 이포스파마이드, KW-2170, 로무스틴 (CCNU), 마포스파마이드, 멜팔란, 미토브로니톨, 미토락톨, 니무스틴, 질소 머스타드 N-옥사이드, 라니무스틴, 테모졸로마이드, 티오테파, TREANDA® (벤다무스틴), 트레오설판, 로포스파미드 등; 내피-특이적 수용체 티로신 키나제 (Tie-2) 억제제, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제, 인슐린 성장 인자-2 수용체 (IGFR-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 (MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9) 억제제, 혈소판-유도된 성장 인자 수용체 (PDGFR) 억제제, 트롬보스폰딘 유사체, 혈관 내피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 (VEGFR) 억제제 등을 포함하는 신생혈관형성 억제제; ALIMTA® (페메트렉세드 디나트륨, LY231514, MTA), 5-아자시티딘, XELODA® (카페시타빈), 카모푸르, LEUSTAT® (클라드리빈), 클로파라빈, 사이타라빈, 사이타라빈 옥인산염, 시토신 아라바이노사이드, 데시타빈, 데페록사민, 독시플루리딘, 에플로르니틴, EICAR (5-에티닐-1-.베타.-D-리보푸라노실이미다졸-4-카복사마이드), 에노시타빈, 에트닐시티딘, 플루다라빈, 단독으로 또는 류코보린과 조합된 5-플루오로우라실, GEMZAR® (젬시타빈), 하이드록시우레아, ALKERAN® (멜팔란), 머캅토퓨린, 6-머캅토퓨린 리보사이드, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 유사체 (예컨대 트리메트렉세이트 및 프랄라트락세이트), 마이코페놀산, 넬라라빈, 놀라트렉세드, 옥인산염, 펠리트렉솔, 펜토스타틴, 랄티트렉세드, 리바비린, 트리아핀, 트리메트렉세이트, S-1, 티아조퓨린, 테가푸르, TS-1, 비다라빈, 등을 포함하는 항대사물질; AT-101 ((-) 고시폴), GENASENSE® (G3139 또는 오블리메르센 (Bcl-2-표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드)), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4'-클로로(1,1'-바이페닐)-2-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4--(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-니트로벤젠설폰아미드)(ABT-737), N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸-)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드 (ABT-263), GX-070 (오바토클락스) 등을 포함하는 Bcl-2 단백질 억제제; DASATINIB® (BMS-354825), GLEEVEC® (이마티닙) 등을 포함하는 Bcr-Abl 키나아제 억제제; AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, 플라보피리돌, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, 셀리시클립 (CYC-202, R-로스코비틴), ZK-304709 등을 포함하는 CDK 억제제; ABX-EGF, 항-EGFR 면역리포좀, EGF-백신, EMD-7200, ERBITUX® (세툭시맙), HR3, IgA 항체, IRESSA® (게피티닙), TARCEVA® (에를로티닙 또는 OSI-774), TP-38, EGFR 융합 단백질, TYKERB® (라파티닙) 등을 포함하는 EGFR 억제제; CP-724-714, CI-1033 (카네르티닙), HERCEPTIN® (트라스투주맙), TYKERB® (라파티닙), OMNITARG® (2C4, 페투주맙), TAK-165, GW-572016 (이오나파르닙), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (HER2 백신), APC-8024 (HER-2 백신), 항-HER/2neu 이중특이적 항체, B7.her2IgG3, AS HER2 삼작용성 이중특이적 항체, mAb AR-209, mAb 2B-1 등을 포함하는 ErbB2 수용체 억제제; 로미뎁신, LAQ-824, MS-275, 트라폭신, 수베로일아닐라이드 하이드록삼산 (SAHA), TSA, 발프로산 등을 포함하는 히스톤 탈아세틸화효소 억제제; 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, 젤다나마이신, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® (HSP-90에 대한 인간 재조합 항체), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, 라디시콜, SNX-2112, STA-9090 VER49009 등을 포함하는 HSP-90 억제제; TRAIL을 포함하는 사멸 수용체 경로의 활성제, TRAIL 또는 사멸 수용체 (예를 들면, DR4 및 DR5)를 표적하는 항체 또는 다른 제제 예컨대 아포맙, 코나투무맙, ETR2-ST01, GDC0145, (렉사투무맙), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 및 트라스투주맙; 시스플라틴, ELOXATIN® (옥살리플라틴) 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, PARAPLATIN® (카보플라틴), 사트라플라틴, 피코플라틴 등을 포함하는 백금 화학치료제; AVASTIN® (베바시주맙), ABT-869, AEE-788, 악시티닙 (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, 마쿠젠 (페갑타밉), NEXAVAR® (소라페닙, BAY43-9006), 파조파닙 (GW-786034), 바탈라닙 (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (선니티닙, SU-11248), VEGF 트랩, ZACTIMAThi (반데타닙, ZD-6474) 등을 포함하는 VEGFR 억제제; 수지상 세포 치료 (시푸류셀-T, Provenge®); 아클라루비신, 9-아미노캄프토테신, 아모나파이드, 암사크린, 베카테카린, 벨로테칸, BN-80915, CAMPTOSAR® (이리노테칸 하이드로클로라이드), 캄프토테신, 덱스라족신, 디플로모테칸, 에도테카린, ELLENCE® 또는 PHARMORUBICIN® (에피루비신), 에토포사이드, 엑사테칸, 아브락산, 이레노테칸,10-하이드록시캄프토테신, 지마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 오라테신, 피라르부신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, SN-38, 타플루포사이드, 토포테칸 등을 포함하는 토포이소머라제 억제제; AVASTIN® (베바시주맙), CD40-특이적 항체, chTNT-1/B, 데노수맙, ERBITUX® (세툭시맙), HUMAX-CD4® (자놀리무맙), IGF I R-특이적 항체, 린투주맙, PANOREX® (에드레콜로맙), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (리툭시맙), 티실리무맙, 트라스투지맙 등을 포함하는 항체; ARIMIDEX® (아나스트로졸), AROMASIN® (엑세메스탄), 아르족시펜, CASODEX® (바이칼루타마이드), CETROTIDE® (세트로렐릭스), 데가렐릭스, 데슬로렐린, DESOPAN® (트릴로스탄), 덱사메타존, DROGENIL® (플루타미드), EVISTA® (랄록시펜), AFEMA® (파드로졸), FARESTON® (토레미펜), FASLODEX® (풀베스트란트), FEMARA® (레트로졸), 포르메스탄, 글루코코르티코이드, HECTOROL® (독세르칼시페롤), RENAGEL® (세벨라메르 카보네이트), 라소폭시펜, 류프롤라이드 아세테이트, MEGACE® (메게스테롤), MIFEPREX® (미페프리스톤), NILANDRON® (닐루타마이드), NOLVADEX® (타목시펜 시트레이트), PLENAXIS® (아바렐릭스), 프레드니손, PROPECIA® (피나스테라이드), 릴로스탄, SUPREFACT® (부세렐린), TRELSTAR® (황체형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH)), VANTAS® (히스트렐린 임플란트), VETORYL® (트릴로스탄 또는 모드라스탄), ZOLADEX® (포스렐린, 고세렐린) 등을 포함하는 호르몬 요법; 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a, ACTIMMUNE® (인터페론 감마-1b) 또는 인터페론 감마-n1, 그의 조합 등을 포함하는 면역제제. 다른 제제는 ALFAFERONE® (IFN-알파), BAM-002 (산화된 글루타티온), BEROMUN® (타소네르민), BEXXAR® (토시투모맙), CAMPATH® (알렘투주맙), CTLA4 (세포독성 림프구 항원 4), 데카바진, 데닐류킨, 에프라투주맙, GRANOCYTE® (레노그라스팀), 렌티난, 백혈구 알파 인터페론, 이미퀴모드, MDX-010 (항-CTLA-4), 흑색종 백신, 미투모맙, 몰그라모스팀, MYLOTARG.TM. (젬투주맙 오조가마이신), NEUPOGEN® (필그라스팀), OncoVAC-CL, OVAREX® (오레고보맙), 펨투모맙 (Y-muHMFG1), PROVENGE® (시푸류셀-T), 사르가라모스팀, 시조필란, 테셀류킨, THERACYS® (바실러스 칼메트-구에린), 우베니멕스, VIRULIZIN® (면역치료제, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (특이적 마루야마 물질 (SSM)), WF-10 (테트라클로로데카옥사이드 (TCDO)), PROLEUKIN® (알데스류킨), ZADAXIN® (티말파신), ZENAPAX® (다클리주맙), ZEVALIN®. (90Y-이브리투모맙 티욱세탄) 등; 오파투무맙; 크레스틴, 렌티난, 시조푸란, 피시바닐 PF-3512676 (CpG-8954), 우베니멕스 등을 포함하는 생물학적 반응 조절물질 약제; 사이타라빈 (ara C 또는 아라바이노사이드 C), 시토신 아라바이노사이드, 독시플루리딘, FLUDARA® (플루다라빈), 5-FU (5-플루오로우라실), 플록수리딘, GEMZAR® (젬시타빈), TOMUDEX® (라티트렉세드), TROXATYL® (트리아세틸우리딘 트록사시타빈) 등을 포함하는 피리미딘 유사체; LANVIS® (티오구아닌) 및 PURI-NETHOL® (머캅토퓨린)을 포함하는 퓨린 유사체; 바타불린, 에포틸론 D (KOS-862), N-(2-((4-하이드록시페닐)아미노)피리딘-3-일)-4-메톡시벤젠설폰아미드, 익사베필론 (BMS 247550), 파클리탁셀, TAXOTERE® (도세탁셀), PNU100940 (109881), 파투필론, XRP-9881 (라로탁셀), 빈플루닌, ZK-EPO (합성 에포틸론) 등을 포함하는 항유사분열제; 및 다른 화학치료제 예컨대 ABRAXANE® (ABI-007), ABT-100 (파르네실 전달효소 억제제), ADVEXIN® (Ad5CMV-p53 백신), ALTOCOR® 또는 MEVACOR® (로바스타틴), AMPLIGE® (폴리 I:폴리 C12U, 합성 RNA), APTOSYN® (엑시술린드), AREDIA® (파미드론산), 아르글라빈, L-아스파라기나제, 아타메스탄 (1-메틸-3,17-디온-안드로스타-1,4-디엔), AVAGE® (타자로텐), AVE-8062 (콤브레아스타틴 유도체) BEC2 (미투모맙), 카켁틴 또는 카켁신 (종양 괴사 인자), 칸박신 (백신), CEAVAC® (암 백신), CELEUK® (셀모류킨), CEPLENE® (히스타민 디하이드로클로라이드), CERVARIX® (인간 파필로마바이러스 백신), CHOP® (C: CYTOXAN® (사이클로포스파마이드); H: ADRIAMYCIN® (하이드록시독소루비신); O: 빈크리스틴 (ONCOVIN®); P: 프레드니손), CYPAT® (사이프로테론 아세테이트), 콤브레스타틴 A4P, DAB(389)EGF (His-Ala 링커를 통해 인간 표피 성장 인자에 융합된 디프테리아 독소의 촉매적 및 전좌 도메인) 또는 TransMID-107R® (디프테리아 독소), 다카르바진, 닥티노마이신, 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산 (DMXAA), 에닐루라실, EVIZON.TM. (스쿠알라민 락테이트), DIMERICINE® (T4N5 리포좀 로션), 디스코데르몰라이드, DX-8951f (엑사테칸 메실레이트), 엔자스타우린, EPO906 (에피틸론 B), GARDASIL® (4가 인간 파필로마바이러스 (유형 6, 11, 16, 18) 재조합 백신), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (강글리오사이드 결합체 백신), GVAX® (전립선 암 백신), 할로푸기논, 히스테렐린, 하이드록시카바마이드, 이반드론산, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (신트레데킨 베수도톡스), IL-13-슈도모나스 외독소, 인터페론-알파, 인터페론-감마, JUNOVAN® 또는 MEPACT® (미파무르타이드), 로나파르닙, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 밀테포신 (헥사데실포스포콜린), NEOVASTAT® (AE-941), NEUTREXIN® (트리메트렉세이트 글루쿠로네이트), NIPENT® (펜토스타틴), ONCONASE® (리보뉴클레아제 효소), ONCOPHAGE® (흑색종 백신 치료), ONCOVAX® (IL-2 백신), ORATHECIN® (루비테칸), OSIDEM® (항체-기반 세포 약물), OVAREX®MAb (쥣과 모노클로날 항체), 파클리탁셀, PANDIMEX® (20(S)프로토파낙사디올 (aPPD) 및 20(S)프로토파낙사트리올 (aPPT)을 포함하는 인삼으로부터의 아글리콘 사포닌), 파니투무맙, PANVAC®-VF (시험용 암 백신), 페가스파르가스, PEG 인터페론 A, 페녹소디올, 프로카바진, 레비마스타트, REMOVAB® (카투막소맙), REVLIMID® (레날리도마이드), RSR13 (에파프록시랄), SOMATULINE® LA (란레오타이드), SORIATANE® (아시트레틴), 스타우로스포린 (스트렙토마이세스 스타우로스포레스), 탈라보스타트 (PT100), TARGRETIN® (벡사로텐), TAXOPREXIN® (DHA-파클리탁셀), TELCYTA® (칸포스파마이드, TLK286), 테밀리펜, TEMODAR® (테모졸로마이드), 테스밀리펜, 탈리도마이드, THERATOPE® (STn-KLH), 티미타크 (2-아미노-3,4-디하이드로-6-메틸-4-옥소-5-(4-피리딜티오)퀴나졸린 디하이드로클로라이드), TNFERADE® (아데노벡터: 종양 괴사 인자-알파에 대한 유전자를 함유하는 DNA 담체), TRACLEER® 또는 ZAVESCA® (보센탄), 트레티노인 (레틴-A), 테트란드린, TRISENOX®. (삼산화 비소), VIRULIZIN®, 우크라인 (애기똥풀 (greater celandine) 식물로부터의 알칼로이드 유도체), 비탁신 (항-alphavbeta3 항체), XCYTRIN® (모텍사핀 가돌리늄), XINLAY® (아트라센탄), XYOTAX® (파클리탁셀 폴리글루멕스), YONDELIS® (트라벡테딘), ZD-6126, ZINECARD® (덱스라족산), ZOMETA® (졸렌드론산), 크리조티닙, 조루비신 등을 포함한다.
또 하나의 바람직한 구현예에서, 치료제는 데스모글레인-2와 결합하는 화합물을 포함하고; 바람직하게는 DSG2와 결합하고 단단한 접합을 개방하는 화합물이다.
다른 구현예에서, 치료제는 방사성 입자/방사선 요법을 포함한다. 임의의 적합한 방사성 요법 또는 입자는 비제한적으로 코발트-60, 요오드-131, 이리듐-192, 스트론튬-89, 사마륨 153, 레늄-186 및 납-212를 포함하여, 주치의에 의해 적절한 것으로 간주될 때 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 치료제는 항종양 치료제이며, 본원에 기재된 바와 같이 화학치료제 또는 항종양 모노클로날 항체를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 항종양 치료제는 트라스투주맙, 세투믹시맙, 페투주맙, 아포맙, 코나투무맙, 렉사투무맙, 베바시주맙, 베바시주맙, 데노수맙, 자놀리무맙, 린투주맙, 에드레콜로맙, 리툭시맙, 티실리무맙, 토시투모맙, 알렘투주맙, 에프라투주맙, 미투모맙, 젬투주맙 오조가마이신, 오레고보맙, 펨투모맙 다클리주맙, 파니투무맙, 카투막소맙, 오파투무맙, 및 이브리투모맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 포함한다. 유용한 항종양 mAb의 비-제한적인 예 및 그의 특정 용도는 표 1에 열거되며, 본원에 참고로 포함된, 문헌[참고: Campoli,　M., et　al., Principles & Practice of Oncology　23(1&2):1-19 (2009)]에 추가로 기재된 바와 같다.
표　1: 암 치료를 위한 종양-항원 특이적 mAbs
항체 아이소타입 표적 질환 징후
SGN-75 인간화된 IgG1 CD70 신장 세포 암, CD70 + 혈액 악성종양을 포함하는 고형 종양
트라스투주맙 인간화된 IgG1 HER2/neu HER2/neu(+) 유방암*
세툭시맙 키메라 IgG1 EGFR EGFR(+) 결장암*
파니투무맙 완전 인간 IgG2 EGFR EGFR(+) 결장암*
마투주맙 인간화된 IgG1 EGFR 비-편평상피 비-소세포 폐암 (NSCLC),
두경부 편평상피 세포 암종 (HNSCC), 유방 및 췌장암, 결장암 (CC)
페르트주맙 인간화된 IgG1 EGFR NSCLC, HNSCC, CC, 유방 및 난소암
이필리무맙 (MDX-010) 인간화된 IgG1 CTLA-4 NSCLC, RCC, 전이성 흑색종
트레멜리무맙 (CP-675, 206) 인간화된 IgG1 CTLA-4 NSCLC, RCC, 전이성 흑색종
시브로투주맙 인간화된 IgG1 FAP** NSCLC, CC
DR-4-특이적 마파투무맙 (TRM-1, HGS-ETR1) 인간화된 IgG1 TRAIL NSCLC, CC, 난소암, 다발성 골수종,
DR-5- 특이적 렉사투무맙 (HGS-ETR2, TRA-8) 인간화된 IgG1 TRAIL 고형 종양
칸투주맙 메르탄신 인간화된 IgG1-메이탄시노이드 CanAg*** CC, 췌장암
베바시주맙
(아바스타틴) 		인간화된 IgG1 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결장암*, 비-편평상피 비-소세포 폐암 (NSCLC) *, 전이성 유방암*
또 하나의 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드는 1 이상의 진단제 또는 조영제와 조합된다 (예컨대 접합된다). 본 발명의 재조합 폴리펩타이드, 및 그의 다량체는, 관심 표적에 대한 접근이 제한될 수 있는 세포간 접합부를 포함하는 상피 조직에 임의 진단제, 조영제, 또는 다른 화합물의 전달을 위해 광범위하게 적용된다. 다양한 비제한적인 구현예에서, 조영제는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 산출할 수 있는 임의 화합물을 포함할 수 있다. 다수의 그와 같은 조영제는 당해 분야의 숙련가에게 공지된다. 개시된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 조영제의 예는 방사성 동위원소, 형광 분자, 자기성 입자 (나노입자 포함), 금속 입자 (나노입자 포함), 인광 분자, 효소, 항체, 리간드, 및 그의 조합이며, 한편 진단제는 그와 같은 조영제와 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다. 조영제의 의해 발생된 신호를 검출하고 측정하는 방법이 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된다. 예를 들면, 방사성 동위원소는 섬광 계수 또는 직접적인 가시화로 검출될 수 있으며; 형광 분자는 형광 분광측정기로 검출될 수 있으며; 인광 분자는 분광측정기로 검출되거나 카메라를 사용하여 직접적으로 가시화될 수 있으며; 효소는 효소에 의해 촉매된 반응의 생성물의 검출 또는 가시화에 의해 검출될 수 있으며; 항체는 항체에 커플링된 2차 검출 표지를 검출함으로써 검출될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 조영제 및/또는 진단제는 직접적인 종양 결합에 의하던지 조영제 또는 진단제의 종양과 결합할 수 있는 화합물과의 커플링에 의해서든 종양을 검출하는데 사용될 수 있는 것이다.
다양한 구현예에서, 조영제는 형광 조영제일 수 있으며, 한편 진단제는 형광 조영제와 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다. 형광 조영제는 검출가능한 형광 신호를 갖는 임의의 화학적 물질(moiety)이다. 이 조영제는 단독으로 사용되거나 다른 조영제와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 적합한 형광제의 예는, 비제한적으로, 플루오레신 (FITC), 5-카복시플루오레신-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 5,6-카복시메틸 플루오레신, 니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일 (NBD), 플루오레스카민, OPA, NDA, 인도시아닌 그린 염료, 시아닌 염료 (예를 들면, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7), 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디설폰산, 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐리나프탈이미드-3,5 디설포네이트, N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, BODIPY, 브릴리언트 옐로우, 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린 (쿠마란 151), 시아노사인, 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5''-디브로모파이로갈롤-설포나프탈레인 (브로모파이로갈롤 레드), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4,4'-디이소티오시아네이토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, 단실클로라이드), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (DABCYL), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트 (DABITC), 에오신, 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신 B, 에리트로신, 이소티오시아네이트, 에티듐 브로마이드, 에티듐, 5-카복시플루오레신 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레신 (DTAF), 2',7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레신 (JOE), 플루오레신 이소티오시아네이트, IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸엄벨리페론, 오르토 크레졸프탈레인, 니트로티로신, 파라로사닐린, 페놀 레드, B-파이코에리트린, o-프탈디알데하이드, 피렌, 피렌 부티레이트, 석신이미딜 1-피렌 부티레이트, 리액티브 레드 4 (사이바크론[R] 브릴리언트 레드 3B-A), 6-카복시-X-로다민 (ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리스사민 로다민 B 설포닐 클로라이드 로다민 (Rhod), 5,6-테트라메틸 로다민, 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체 (텍사스 레드), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 쿠마린-6, 등, 및 그의 조합을 포함한다. 이들 형광 이미지화 물질(moeity)은 회사(Molecular Probes, Eugene, Oreg. and Research Organics, Cleveland, Ohio)를 포함하는 다양한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있거나 당해 분야의 숙련가에 의해 합성될 수 있다.
또 하나의 예에서, 조영제는 자기 공명 영상 (MRI) 시약을 포함할 수 있으며, 한편 진단제는 MRI 시약에 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다. MRI 시약은 검출가능한 자기성 공명 신호를 갖거나 또 하나의 시약의 자기성 공명 신호에 영향을 줄 수 있는 (예를 들면, 상기 신호를 증가시키거나 이동시킬 수 있는) 임의의 화학적 물질이다. 이러한 유형의 조영제는 단독으로 사용될 수 있거나 다른 조영제와 조합하여 사용될 수 있다. 또 하나의 예에서, 가돌리늄-기반 MRI 시약은 조영제로서 제공될 수 있다. 개시된 조영제 내로 혼입될 수 있는 적합한 MRI 시약의 예는 파라-아미노-벤질 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (p-NH2-Bz-DTPA, 화합물 7), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)의 결합가능한 형태이며, 이것은 가돌리늄과 강하게 결합되는 것으로 알려져 있고 자기성 공명 조영제로서의 임상 용도를 위해 승인되었다. 본원에서 개시된 바와 같이 큰 거대분자 예컨대 덴드리머 기질에 MRI 시약의 혼입은 신호를 증가시킬 수 있는, 큰 T1 이완 (고 명암 대비) 및 단일 분자상에서 시약의 다중 카피를 가능하게 할 수 있다. MRI 조영제 및, 예를 들면, 형광 조영제를 조합함으로써, 수득된 시약은 검출되고, 이미지화되고, MRI를 통해 실시간으로 추적될 수 있다. 다른 조영제는 18F, 또는 64Cu 또는 68Ga에 대한 킬레이터를 혼입함으로써 제조될 수 있는 PET 시약을 포함한다. 또한, 방사선핵종의 부가는 SPECT 이미지화 또는 방사선 용량의 전달을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있으며, 한편 진단제는 PET 시약에 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 진단제는 비제한적으로 위치 방출 단층촬영 (PET) 시약, 컴퓨터화된 단층촬영 (CT) 시약, 자기 공명 영상 (MRI) 시약, 핵자기 조영제 (NMI), 형광투시제 및 초음파 조영제를 포함하는, 진단 조영제이다. 그와 같은 진단제는 123I, 125I, 131I 등을 포함하는 요오드 (I), 바륨 (Ba), 가돌리늄 (Gd), 99Tc를 포함하는 테크네튬 (Tc), 31P를 포함하는 인 (P), 철 (Fe), 망간 (Mn), 탈륨 (Tl), 51Cr을 포함하는 크로뮴 (Cr), 14C를 포함하는 탄소 (C) 등과 같은 원소의 방사선동위원소, 형광으로 표지된 화합물, 또는 그의 복합체, 킬레이트, 부가물 및 결합체를 포함한다. 임의의 적합한 PET 시약은 비제한적으로 탄소-11, 질소-13, 산소-15, 불소-18,11C-메토미데이트, 및 비제한적으로 플루데옥시글루코오스 (불소-18로 표지된 글루코오스 유사체)를 포함하는 그의 글루코오스 유사체를 포함하여, 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 진단제는 세포에서 발현될 때 쉽게 검출가능한 단백질 (비제한적으로, 베타-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질, 루시퍼라아제, 등을 포함) 및 표지된 핵산 프로브 (예를 들면, 방사선표지된 프로브 또는 형광으로 표지된 프로브)를 인코딩하는 마커 유전자이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 AdB-2/3 다량체에 진단제 또는 조영제의 공유 콘주게이션(cohjugation)은 다양한 콘주게이션 공정에 따라서 달성된다. 다른 구현예에서, 진단제는 제공된 AdB-2/3 다량체와 비-공유적으로 관련된다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 본 발명의 임의의 구현예를 제공한다. 핵산은 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있으며, 본원의 교시를 토대로 하여, 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 제조되고 단리될 수 있다. 핵산은, 비제한적으로 폴리A 서열, 변형된 코작 서열, 및 에피토프 태그, 내보내기 신호, 및 분비성 신호, 핵 위치 신호, 및 원형질막 위치 신호를 인코딩하는 서열을 포함하는, 인코딩된 단백질의 발현 및/또는 정제를 촉진시키기에 유용한 추가의 도메인을 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 임의 측면의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. "재조합 발현 벡터"는 유전자 생성물의 발현을 수행할 수 있는 임의 프로모터에 핵산 코딩 영역 또는 유전자를 작동가능하게 연결한 벡터를 포함한다. 포유동물 시스템에서 개시된 핵산의 발현을 유도하는데 사용된 프로모터 서열은 (비제한적으로, CMV, SV40, RSV, 액틴, EF를 포함하는 임의의 다양한 프로모터에 의해 추진된) 구조 프로모터 서열 또는 (비제한적으로, 테트라사이클린, 엑디손, 스테로이드-반응성을 포함하는 다수의 유도 프로모터 중 어느 것에 의해 추진된) 유도 프로모터 서열일 수 있다. 형질감염 원핵 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터의 구성이 또한 당해기술에서 잘 알려져 있으며, 따라서 표준 기술을 통해 달성될 수 있다 (참고, 예를 들면, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), and the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX). 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA로의 통합에 의해 숙주 유기체에서 복제될 수 있어야 하며, 비제한적으로 선택 마커 예컨대 항생제-저항성 유전자를 포함하는, 주어진 용도에 적절한 것으로 간주되는 임의의 다른 구성성분을 포함할 수 있다.
또 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 재조합 발현 벡터, 및 그의 자손을 포함하는 숙주세포를 제공하며, 여기서 숙주세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 세포는 일시적으로 또는 안정되게 형질감염될 수 있다. 발현 벡터의 원핵 및 진핵 세포 내로의 그와 같은 형질감염은, 비제한적으로 표준 박테리아 전환, 인산칼슘 공동침전, 전기천공, 또는 리포좀 매개된-, DEAE 덱스트란 매개된-, 다중양이온성 매개된-, 또는 바이러스 매개된 형질감염을 포함하는, 당해 분야에 공지된 임의 기술을 통해 달성될 수 있다. (참고, 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2 nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY). 다량의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 발현 벡터로 형질감염된 배양 세포를 이용하는 기술이 당해기술에 익히 공지되어 있다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 다음을 를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다:
(a) 본 발명의 AdB-2/3 섬유 다량체; 및
(b) 약제학적으로 허용가능한 담체.
AdB-2/3 섬유 다량체는 본 발명의 제 1 측면의 임의의 구현예의 돌연변이체 노브 도메인 폴리펩타이드 (즉: 서열번호:1-11)를 혼입하는 본 발명의 임의 측면, 구현예 또는 구현예의 조합에 따라서 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다량체일 수 있다.
약제학적 조성물은, 비제한적으로 상기 개시된 것들을 포함하는, 상피 조직과 관련된 장애를 치료하기 위한 1 이상의 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 치료제는 항종양 치료제이고 본원에 기재된 바와 같이 화학치료제 또는 항종양 모노클로날 항체를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 항종양 치료제는 트라스투주맙, 세투믹시맙, 페투주맙, 아포맙, 코나투무맙, 렉사투무맙, 베바시주맙, 베바시주맙, 데노수맙, 자놀리무맙, 린투주맙, 에드레콜로맙, 리툭시맙, 티실리무맙, 토시투모맙, 알렘투주맙, 에프라투주맙, 미투모맙, 젬투주맙 오조가마이신, 오레고보맙, 펨투모맙 다클리주맙, 파니투무맙, 카투막소맙, 오파투무맙, 및 이브리투모맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 포함한다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 비독성, 생체적합성이고, 다량체 (및 그것과 함께 조합된 임의의 다른 치료제)의 생물학적 활성에 해롭게 영향을 미치지 않도록 선택된다. 펩타이드에 대한 예시적인 약제학적으로 허용가능한 담체는 Yamada의 미국 특허 번호　5,211,657에 기재된다. 조성물은, 경구, 비경구, 또는 수술 투여를 가능하게 하는, 고체, 반-고체, 겔, 액체 또는 가스성 형태 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 흡입제, 및 주사액으로 제제 내로 제형화될 수 있다. 주사제를 통한 비경구 전달, 주입, 또는 세척(irrigation) 및 국소 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리적 인산염-완충된 염수, 정상 또는 유산화된 링거액, 덱스트로오스 용액, 행크 용액, 또는 프로판디올을 포함한다. 또한, 멸균한, 고정오일이 용매 또는 분산매로서 이용될 수 있다. 이러한 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 생체적합성 오일이 이용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산이 주사제의 제조시 사용된다. 담체 및 제제는 액체, 서스펜션, 중합성 또는 비-중합성 겔, 페이스트 또는 고약으로서 혼합될 수 있다. 담체는 또한 제제(들)의 전달을 지속 (즉, 연장, 지연 또는 조절)하거나 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약동학을 증대시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수 있다. 그와 같은 전달 비히클은, 비-제한적인 예로서, 단백질, 리포좀, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리머 또는 공중합체 하이드로겔, 및 폴리머 교질입자로 이루어진 마이크로입자, 마이크로구형체, 나노구형체, 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 적합한 하이드로겔 및 교질입자 전달 시스템은 국제공개번호　WO　2004/009664　A2에 개시된 PEO:PHB:PEO 공중합체 및 공중합체/사이클로덱스트린 복합체, 및 U.S. 공보 번호　2002/0019369　A1에 개시된 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린 복합체를 포함한다. 그와 같은 하이드로겔은 의도된 작용 부위에 국소로 주입될 수 있거나 지속 방출 데포 (depot)를 형성하기 위해 피하로 또는 근육내로 주입될 수 있다.
척추강내 (IT) 또는 뇌심실내 (ICV) 전달을 위해, 적절하게 멸균한 전달 시스템 (예를 들면, 액체; 겔, 서스펜션, 등)이 상기 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 비-펩타이드성 약물의 경구 투여를 위해, 상기 조성물은 불활성 충전제 또는 희석제 예컨대 수크로오스, 옥수수전분, 또는 셀룰로오스에서 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생체적합성 부형제, 예컨대 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 희석제, 버퍼, 침투 개선제, 유화제, 결합제, 증점제, 풍미제 (경구 투여용)를 포함할 수 있다. 예시적인 제형은 멸균한 액체 예컨대 물, 오일, 염수, 글리세롤, 또는 에탄올일 수 있는 약제학적 담체와 함께 생리적으로 허용가능한 희석제에서 다량체의 용액 또는 서스펜션의 주사가능한 용량으로서 비경구로 투여될 수 있다. 추가로, 보조 물질 예컨대 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등이 변형된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물의 추가의 구성성분은 석유 (예컨대 동물, 식물성, 또는 합성 기원의 석유), 예를 들면, 대두 오일 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 글리콜 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 주사가능 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다.
약제학적 조성물은 또한 다량체 및 (존재하면) 다른 치료제의 지속된 또는 맥동 방출을 가능하게 하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드 이외에 (a) 동결건조보호제; (b) 계면활성제; (c) 증량제; (d) 긴장성 조정제; (e) 안정제; (f) 보존제 및/또는 (g) 버퍼를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물에서 버퍼는 트리스 버퍼, 히스티딘 버퍼, 인산염 버퍼, 시트레이트 버퍼 또는 아세테이트 버퍼이다. 약제학적 조성물은 또한 동결건조보호제, 예를 들면 수크로오스, 소르비톨 또는 트레할로오스를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 보존제 예를 들면 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 페닐수은함유 니트레이트, 티메로산, 벤조산, 및 이들의 다양한 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 유사 글리신과 같은 증량제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 계면활성제 예를 들면, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트- 60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올리에이트, 또는 그의 조합을 포함한다. 약제학적 조성물은 또한 긴장성 조정제, 예를 들면, 인간 혈액과 실질적으로 등장성 또는 등삼투성인 제형을 제공하는 화합물을 포함할 수 있다. 예시적인 긴장성 조정제는 수크로오스, 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 덱스트로오스, 이노시톨, 염화나트륨, 아르기닌 및 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 안정제, 예를 들면, 관심 단백질과 조합될 때, 동결건조된 또는 액체 형태에서 관심 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 실질적으로 방지하거나 감소시키는 분자를 추가로 포함한다. 예시적인 안정제는 수크로오스, 소르비톨, 글리신, 이노시톨, 염화나트륨, 메티오닌, 아르기닌, 및 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함한다.
약제학적 조성물은 임의의 적합한 방식으로 포장될 수 있다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 AdB-2/3 섬유 다량체의 용기 (예컨대 바이알)를 함유하는 키트로서 포장된다. 바람직한 구현예에서, 키트는 동일한 또는 별도의 용기 (예컨대 바이알)에 AdB-2/3 섬유 다량체와 함께 대상체에게 투여되는 치료제, 진단제, 또는 조영제를 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 1 이상의 재조합 폴리펩타이드/ AdB-2/3 섬유 다량체, 단리된 핵산, 재조합 발현 벡터, 및/또는 숙주세포; 및 (b) 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는데 있어서 그의/그들의 사용을 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 상피 조직과 관련된 장애의 치료적 처리, 또는 진단을 증대시키고/시키거나 상피 조직을 이미지화하는 방법으로서, 이들을 필요로 하는 대상체에게 하기를 투여함을 포함하는, 방법을 제공한다:
(a) 상기 장애를 치료하기에 충분한 1 이상의 치료제, 상기 장애를 진단하기에 충분한 진단제, 및/또는 상기 상피 조직을 이미지화하기에 충분한 조영제의 양; 및
(b) 1 이상의 치료제, 진단제, 및/또는 조영제의 효능을 증대시키기에 충분한, 본 발명의 AdB-2/3 섬유 다량체, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 양.
본 발명의 이러한 측면의 방법은 치료제, 진단제, 및/또는 조영제의 표적에 대한 접근 및 상피 조직으로의 전파를 개선시킴으로써 상피 조직과 관련된 장애의 치료적 처리, 진단, 또는 이미지화를 증대시키는데 사용될 수 있다. 임의의 기전에 구속되지는 않지만, 본 발명자들은 이것이 상보적 기전: 표적 수용체의 기저측으로부터 정점 세포 표면으로의 이동, 이에 따른 수용체(예컨대 모노클로날 항체)를 표적화하는 치료제, 진단제, 및/또는 조영제에 의해 상피 조직 표적에 대해 더 나은 접근을 가능하게 하고, 세포간 접합의 분열을 통해 치료제의 더 나은 침투를 가능하게 하는 상보적 기전을 통해 일어난다고 믿는다. DSG2는 AdB-2/3에 대해 일차 고 친화성 수용체이다. DSG2는 카드헤린 단백질 패밀리에 속하는 칼슘-결합 막통과 당단백질이다. 상피 세포에서, DSG2는 세포-세포 부착 구조의 성분이다. DSG2의 세포질 테일은 세포 부착 및 세포간 접합/ 세포 형태학의 조절물질과 직접 접촉하는 일련의 단백질과 상호작용한다. DSG2가 위암, 편평상피 세포 암종, 흑색종, 전이성 전립선암, 및 방광암을 포함하는 일련의 상피 악성종양에서 과발현됨을 보여주었다.
특정 작용 기전에 구속되지 않지만, 발명자들은 DSG2에 결합하는 AdB-2/3 섬유 다량체가 세포간 접합부의 일시적 DSG2-매개된 개방을 유발시키도록 제공하며, 이것은 상피 세포에서 표적에 결합하거나 그렇지 않으면 세포간 접합부에 적어도 어느 정도까지 포획될 것으로 짐작되는 치료제, 진단제, 조영제, 또는 임의의 다른 관심 화합물의 접근을 개선시킬 것이라고 믿는다. 그와 같은 활성의 상세한 예가 본원에 제공된다. 따라서 본 발명의 방법은 세포간 접합부의 일시적 DSG2-매개된 개방을 유발시키기 위해 본 발명의 임의 AdB-2/3 섬유 다량체를 사용하여 수행될 수 있다. 이들 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 1 이상의 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함하는 예시적인 다량체는, 비제한적으로, AdB-2/3 비리온, AdB-2/3 캡시드, AdB-2/3 12면체 입자 (PtDd) (AdB-2/3의 복제 동안 AdB-2/3에 의해 생산된 서브바이러스 12면체 입자), 및 재조합 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함한다.
본 발명의 방법은, DSG2가 상피 세포에서 널리 발현되기 때문에, 관심 표적에 대한 접근이 제한될 수 있는 세포간 접합부를 포함하는 상피 조직에 임의의 치료제, 진단제, 조영제 또는 다른 화합물의 전달을 위해 광범위하게 적용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "상피 조직과 관련된 장애"는 상피 세포/상피 조직에 투여하거나/조직을 통해 투여된 치료제, 진단제, 또는 조영제가 치료, 진단, 및/또는 이미지화 효능을 개선시키든지 아니든지 환자에게 임상 이득을 제공하는 임의 장애이다. 그와 같은 장애는, 비제한적으로, 고형 종양 (즉: 상피 세포 접합부로의 임의 종양), 위장관 장애 (비제한적으로 과민성 장 증후군, 염증성 창자 장애, 크론병, 궤양성 대장염, 변비, 위식도 역류 질환, 바렛 식도, 등을 포함), 피부 질환 (비제한적으로 건선 및 피부염 포함), 폐 장애 (비제한적으로 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 기관지염, 폐 폐공기증, 낭포성 섬유증, 사이질 폐질환, 폐렴, 췌관 장애, 뇌 장애 (즉: 혈액-뇌 장벽을 통해 약물의 개선된 수송으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의 뇌 장애), 일차 폐 고혈압, 폐 색전증, 폐 유육종증, 결핵, 등), 신장 장애(비제한적으로 사구체신염 포함), 간 질환 (비제한적으로 간염 포함), 내분비 장애 (비제한적으로 당뇨병 및 갑상선 장애 포함), 췌관 장애 (비제한적으로 췌장염 포함), 및 담관 장애 (비제한적으로 담관 폐색, 담낭염, 온담낭관돌증, 담석, 등을 포함) 및 상피 조직의 감염 (비제한적으로 연조직염, 폐렴, 간염, 및 신우신염 포함)을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상피 조직과 관련된 장애는, 비제한적으로 유방 종양, 폐 종양, 결장 종양, 직장 종양, 피부 종양, 내분비 종양, 위 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 자궁경부 종양, 신장 종양, 흑색종, 췌장 종양, 간 종양, 뇌종양, 두경부 종양, 비인두 종양, 위 종양, 편평상피 세포 암종, 선암종, 방광 종양, 및 식도 종양을 포함하는 고형 종양을 포함한다. 당해 분야의 숙련가에게 이해되는 바와 같이, 그와 같은 종양은 원발성 종양, 국소로 침입하는 종양, 뿐만 아니라 전이된 종양을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "증대된 효능"은 치료제, 진단제, 및/또는 조영제를 단독으로 사용하여 보여지게 될 효능에 비하여 치료, 진단, 및/또는 이미지화 효능에서 임의의 증가를 의미한다. 예를 들면, 치료적 효능의 측정은 치료될 장애에 따라서 가변적일 수 있지만, 주치의에 의해 쉽게 확인된다. 예를 들면, 효능의 그와 같은 증가는, 비제한적으로, 치료제 단독으로 치료하는 것과 비교하여 하기 중 1 이상의 증가를 포함한다: (a) 장애의 중증도의 감소; (b) 치료될 장애(들)의 특징적 증상의 발달의 제한 또는 예방; (c) 치료될 장애(들)의 특징적 증상의 악화의 억제; (d) 이전에 장애(들)를 가졌던 환자에서 장애(들)의 재발의 제한 또는 예방; 및 (e) 이전에 장애(들)에 대한 증상이 있었던 환자에서 증상의 재발의 제한 또는 예방. 하나의 비-제한적인 예에서, 고형 종양의 치료는 종양의 개선된 접근 및 사멸을 가능하게 하기 위해 상피 세포의 기저측면으로부터 종양 수용체의 출현을 유도하는 능력을 제공한다.
암의 경우, 종양 반응을 규정하기 위한 표준 및 반응을 측정하는 표준 방법이 있다. 이들은, 종양 크기의 변화 또는 질환의 혈청 마커를 모니터링하여 결정되는, 종양 반응을 포함한다. 부분 반응은 종양의 50% 초과 감소인 반면에, 완전한 반응은 종양의 완전한 소멸로서 규정된다. 종양을 측정하는데 사용된 방법은 의사에게 잘 알려져 있으며 물리적 시험, 방사선학적 시험 예컨대 CT 스캔, MRI, PET 스캔, X-선 뿐만 아니라 혈청 마커 예컨대 전립선암을 모니터하는데 사용되는 전립선 특이적 항원을 포함한다. 암 치료의 치료적 효능의 다른 측정은 진행, 무진행 생존 및 전체 생존까지의 시간의 측정을 포함한다.
개선된 진단 효능은, 비제한적으로, 진단 시험의 특이성 및/또는 민감도의 증가를 포함하는, 진단제 단독의 투여와 비교하여 효능의 임의의 개선을 포함한다. 개선된 이미지화 효능은, 비제한적으로 특이성, 민감도, 재현성, 콘트라스트 증대, 질환의 더 작은 부위의 검출, 질환의 더 정확한 묘사, 예컨대 종양, 종기 등과 같은 질환의 크기 및 형상을 포함하는, 조영제 단독의 투여와 비교하여된 효능의 임의의 개선을 포함한다.
다양한 구현예에서, 효능의 증가는 환자 모집단 전체에 걸쳐 치료제, 진단제, 및/또는 조영제 단독으로의 효능과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 더 큰 이점이다.
임의의 적당한 대상체, 바람직하게는 인간 대상체는 본 발명의 방법을 사용하여 처리될 수 있다.
상피 조직을 표적할 수 있고 상피 조직으로의 이의 전달이 세포간 접합부의 일시적 개방에 의해 개선될 수 있는 임의의 치료제, 진단제, 조영제, 또는 다른 화합물이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 치료제는 항체, 면역결합체, 나노입자, 핵산 치료제, 및 그의 조합, 화학치료제, 백신, 방사성 입자/방사선 요법 ("방사선"), 입양 T-세포 치료 및 수지상 세포 치료 (예: 투여된 T-세포의 종양내 침투)를 포함하는 세포성 면역요법, 흡입 치료제, 유전자 치료 작제물 (비제한적으로 유전자 치료 벡터로서의 AdB-2/3 바이러스, 및 Ad5-기반 유전자 치료 벡터와의 공-투여 포함), 다른 핵산 치료제, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 치료제는 알킬화제, 신생혈관형성 억제제, 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 오로라 키나아제 억제제, 세포자멸사 프로모터 (예를 들면, Bcl-xL, Bcl-w 및 Bfl-1) 억제제, 사멸 수용체 경로의 활성제, Bcr-Abl 키나아제 억제제, BiTE (이중특이적 T 세포 연관체) 항체, 생물학적 반응 조절물질, 사이클린-의존적 키나아제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, 성장 인자 억제제, 열충격 단백질 (HSP)-90 억제제, 탈메틸화제, 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 억제제, 호르몬 치료, 면역제제, 세포자멸사 단백질 억제제 (IAPs) 삽입작용 항생제, 키나아제 억제제, 포유동물 표적의 라파마이신 억제제, 마이크로RNA의 미토겐-활성화된 세포외 신호-조절된 키나아제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드 항-염증성 약물 (NSAIDs), 폴리 ADP (아데노신 디인산염)-리보오스 중합효소 (PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나아제 (Plk) 억제제, 프로테아솜 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물성 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산 (siRNAs), 토포이소머라제 억제제 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이들 다양한 클래스 내에 속하는 예시적인 치료제는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 도세탁셀, 독소루비신, 이리노테칸, 파클리탁셀 (Taxol®), 파클리탁셀 알부민 결합된 입자 (ABRAXANE®), 독소루비신 HCL 리포좀 (Doxil®), BiTE 항체 예컨대 아데카투무맙 (Micromet MT201), 블리나투모맙 (Micromet MT103) 등, siRNA-기반 치료제, 알트레타민, AMD-473, AP-5280, 아파지쿠온, 벤다무스틴, 브로스탈리신, 부설판, 카보쿠온, 카르무스틴 (BCNU), 클로르암부실, CLORETAZINE® (라로무스틴, VNP 40101M), 사이클로포스파마이드, 다카르바진, 데시타빈, 5'-아자시티딘, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파마이드, 이포스파마이드, KW-2170, 로무스틴 (CCNU), 마포스파마이드, 멜팔란, 미토브로니톨, 미토락톨, 니무스틴, 질소 머스타드 N-옥사이드, 라니무스틴, 테모졸로마이드, 티오테파, TREANDA® (벤다무스틴), 트레오설판, 로포스파미드 등을 포함하는 알킬화제; 내피-특이적 수용체 티로신 키나제 (Tie-2) 억제제, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제, 인슐린 성장 인자-2 수용체 (IGFR-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 (MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9) 억제제, 혈소판-유도된 성장 인자 수용체 (PDGFR) 억제제, 트롬보스폰딘 유사체, 혈관 내피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 (VEGFR) 억제제 등을 포함하는 신생혈관형성 억제제; ALIMTA® (페메트렉세드 디나트륨, LY231514, MTA), 5-아자시티딘, XELODA® (카페시타빈), 카모푸르, LEUSTAT® (클라드리빈), 클로파라빈, 사이타라빈, 사이타라빈 옥인산염, 시토신 아라바이노사이드, 데시타빈, 데페록사민, 독시플루리딘, 에플로르니틴, EICAR (5-에티닐-1-.베타.-D-리보푸라노실이미다졸-4-카복사마이드), 에노시타빈, 에트닐시티딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 단독 또는 류코보린과 조합된 5-플루오로우라실, GEMZAR® (젬시타빈), 하이드록시우레아, ALKERAN® (멜팔란), 머캅토퓨린, 6-머캅토퓨린 리보사이드, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 유사체 (예컨대 트리메트렉세이트 및 프랄라트락세이트), 마이코페놀산, 넬라라빈, 놀라트렉세드, 옥인산염, 펠리트렉솔, 펜토스타틴, 랄티트렉세드, 리바비린, 트리아핀, 트리메트렉세이트, S-1, 티아조퓨린, 테가푸르, TS-1, 비다라빈, 등을 포함하는 항대사물질; AT-101 ((-) 고시폴), GENASENSE® (G3139 또는 오블리메르센 (Bcl-2-표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드)), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4'-클로로(1,1'-바이페닐)-2-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4--(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-니트로벤젠설폰아미드)(ABT-737), N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸-)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드 (ABT-263), GX-070 (오바토클락스) 등을 포함하는 Bcl-2 단백질 억제제; DASATINIB® (BMS-354825), GLEEVEC® (이마티닙) 등을 포함하는 Bcr-Abl 키나아제 억제제; AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, 플라보피리돌, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, 셀리시클립 (CYC-202, R-로스코비틴), ZK-304709 등을 포함하는 CDK 억제제; ABX-EGF, 항-EGFR 면역리포좀, EGF-백신, EMD-7200, ERBITUX® (세툭시맙), HR3, IgA 항체, IRESSA® (게피티닙), TARCEVA® (에를로티닙 또는 OSI-774), TP-38, EGFR 융합 단백질, TYKERB® (라파티닙) 등을 포함하는 EGFR 억제제; CP-724-714, CI-1033 (카네르티닙), HERCEPTIN® (트라스투주맙), TYKERB® (라파티닙), OMNITARG® (2C4, 페투주맙), TAK-165, GW-572016 (이오나파르닙), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (HER2 백신), APC-8024 (HER-2 백신), 항-HER/2neu 이중특이적 항체, B7.her2IgG3, AS HER2 삼작용성 이중특이적 항체, mAb AR-209, mAb 2B-1 등을 포함하는 ErbB2 수용체 억제제; 로미뎁신, LAQ-824, MS-275, 트라폭신, 수베로일아닐라이드 하이드록삼산 (SAHA), TSA, 발프로산 등을 포함하는 히스톤 탈아세틸화효소 억제제; 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, 젤다나마이신, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® (HSP-90에 대한 인간 재조합 항체), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, 라디시콜, SNX-2112, STA-9090 VER49009 등을 포함하는 HSP-90 억제제; TRAIL, TRAIL 또는 사멸 수용체 (예를 들면, DR4 및 DR5)를 표적화하는 항체 또는 다른 제제 예컨대 아포맙, 코나투무맙, ETR2-ST01, GDC0145, (렉사투무맙), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 및 트라스투주맙을 포함하는 사멸 수용체 경로의 활성제; 시스플라틴, ELOXATIN® (옥살리플라틴) 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, PARAPLATIN® (카보플라틴), 사트라플라틴, 피코플라틴 등을 포함하는 백금 화학치료제; AVASTIN® (베바시주맙), ABT-869, AEE-788, 악시티닙 (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, 마쿠젠 (페갑타밉), NEXAVAR® (소라페닙, BAY43-9006), 파조파닙 (GW-786034), 바탈라닙 (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (선니티닙, SU-11248), VEGF 트랩, ZACTIMAThi (반데타닙, ZD-6474) 등을 포함하는 VEGFR 억제제; 수지상 세포 치료 (시푸류셀-T, Provenge®); 아클라루비신, 9-아미노캄프토테신, 아모나파이드, 암사크린, 베카테카린, 벨로테칸, BN-80915, CAMPTOSAR® (이리노테칸 하이드로클로라이드), 캄프토테신, 덱스라족신, 디플로모테칸, 에도테카린, ELLENCE® 또는 PHARMORUBICIN® (에피루비신), 에토포사이드, 엑사테칸, 아브락산, 이레노테칸,10-하이드록시캄프토테신, 지마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 오라테신, 피라르부신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, SN-38, 타플루포사이드, 토포테칸 등을 포함하는 토포이소머라제 억제제; AVASTIN® (베바시주맙), CD40-특이적 항체, chTNT-1/B, 데노수맙, ERBITUX® (세툭시맙), HUMAX-CD4® (자놀리무맙), IGF I R-특이적 항체, 린투주맙, PANOREX® (에드레콜로맙), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (리툭시맙), 티실리무맙, 트라스투지맙 등을 포함하는 항체; ARIMIDEX® (아나스트로졸), AROMASIN® (엑세메스탄), 아르족시펜, CASODEX® (바이칼루타마이드), CETROTIDE® (세트로렐릭스), 데가렐릭스, 데슬로렐린, DESOPAN® (트릴로스탄), 덱사메타존, DROGENIL® (플루타미드), EVISTA® (랄록시펜), AFEMA® (파드로졸), FARESTON® (토레미펜), FASLODEX® (풀베스트란트), FEMARA® (레트로졸), 포르메스탄, 글루코코르티코이드, HECTOROL® (독세르칼시페롤), RENAGEL® (세벨라메르 카보네이트), 라소폭시펜, 류프롤라이드 아세테이트, MEGACE® (메게스테롤), MIFEPREX® (미페프리스톤), NILANDRON® (닐루타마이드), NOLVADEX® (타목시펜 시트레이트), PLENAXIS® (아바렐릭스), 프레드니손, PROPECIA® (피나스테라이드), 릴로스탄, SUPREFACT® (부세렐린), TRELSTAR® (황체형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH)), VANTAS® (히스트렐린 임플란트), VETORYL® (트릴로스탄 또는 모드라스탄), ZOLADEX® (포스렐린, 고세렐린) 등을 포함하는 호르몬 요법; 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a, ACTIMMUNE® (인터페론 감마-1b) 또는 인터페론 감마-n1, 그의 조합 등을 포함하는 면역제제. 다른 제제는 ALFAFERONE® (IFN-알파), BAM-002 (산화된 글루타티온), BEROMUN® (타소네르민), BEXXAR® (토시투모맙), CAMPATH® (알렘투주맙), CTLA4 (세포독성 림프구 항원 4), 데카바진, 데닐류킨, 에프라투주맙, GRANOCYTE® (레노그라스팀), 렌티난, 백혈구 알파 인터페론, 이미퀴모드, MDX-010 (항-CTLA-4), 흑색종 백신, 미투모맙, 몰그라모스팀, MYLOTARG.TM. (젬투주맙 오조가마이신), NEUPOGEN® (필그라스팀), OncoVAC-CL, OVAREX® (오레고보맙), 펨투모맙 (Y-muHMFG1), PROVENGE® (시푸류셀-T), 사르가라모스팀, 시조필란, 테셀류킨, THERACYS® (바실러스 칼메트-구에린), 우베니멕스, VIRULIZIN® (면역치료제, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (특이적 마루야마 물질 (SSM)), WF-10 (테트라클로로데카옥사이드 (TCDO)), PROLEUKIN® (알데스류킨), ZADAXIN® (티말파신), ZENAPAX® (다클리주맙), ZEVALIN® (90Y-이브리투모맙 티욱세탄) 등; 오파투무맙; 크레스틴, 렌티난, 시조푸란, 피시바닐 PF-3512676 (CpG-8954), 우베니멕스 등을 포함하는 생물학적 반응 조절물질 약물; 사이타라빈 (ara C 또는 아라바이노사이드 C), 시토신 아라바이노사이드, 독시플루리딘, FLUDARA® (플루다라빈), 5-FU (5-플루오로우라실), 플록수리딘, GEMZAR® (젬시타빈), TOMUDEX® (라티트렉세드), TROXATYL® (트리아세틸우리딘 트록사시타빈) 등을 포함하는 피리미딘 유사체; LANVIS® (티오구아닌) 및 PURI-NETHOL® (머캅토퓨린)을 포함하는 퓨린 유사체; 바타불린, 에포틸론 D (KOS-862), N-(2-((4-하이드록시페닐)아미노)피리딘-3-일)-4-메톡시벤젠설폰아미드, 익사베필론 (BMS 247550), 파클리탁셀, TAXOTERE® (도세탁셀), PNU100940 (109881), 파투필론, XRP-9881 (라로탁셀), 빈플루닌, ZK-EPO (합성 에포틸론) 등을 포함하는 항유사분열제; 및 다른 화학치료제 예컨대 ABRAXANE® (ABI-007), ABT-100 (파르네실 전달효소 억제제), ADVEXIN® (Ad5CMV-p53 백신), ALTOCOR® 또는 MEVACOR® (로바스타틴), AMPLIGE®. (폴리 I:폴리 C12U, 합성 RNA), APTOSYN® (엑시술린드), AREDIA® (파미드론산), 아르글라빈, L-아스파라기나제, 아타메스탄 (1-메틸-3,17-디온-안드로스타-1,4-디엔), AVAGE® (타자로텐), AVE-8062 (콤브레아스타틴 유도체) BEC2 (미투모맙), 카켁틴 또는 카켁신 (종양 괴사 인자), 칸박신 (백신), CEAVAC® (암 백신), CELEUK® (셀모류킨), CEPLENE® (히스타민 디하이드로클로라이드), CERVARIX® (인간 파필로마바이러스 백신), CHOP® (C: CYTOXAN® (사이클로포스파마이드); H: ADRIAMYCIN® (하이드록시독소루비신); O: 빈크리스틴 (ONCOVIN®); P: 프레드니손), CYPAT® (사이프로테론 아세테이트), 콤브레스타틴 A4P, DAB(389)EGF (His-Ala 링커를 통해 인간 표피 성장 인자에 융합된 디프테리아 독소의 촉매적 및 전좌 도메인) 또는 TransMID-107R® (디프테리아 독소), 다카르바진, 닥티노마이신, 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산 (DMXAA), 에닐루라실, EVIZON.TM. (스쿠알라민 락테이트), DIMERICINE® (T4N5 리포좀 로션), 디스코데르몰라이드, DX-8951f (엑사테칸 메실레이트), 엔자스타우린, EPO906 (에피틸론 B), GARDASIL® (4가 인간 파필로마바이러스 (유형 6, 11, 16, 18) 재조합 백신), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (강글리오사이드 결합체 백신), GVAX® (전립선 암 백신), 할로푸기논, 히스테렐린, 하이드록시카바마이드, 이반드론산, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (신트레데킨 베수도톡스), IL-13-슈도모나스 외독소, 인터페론-알파, 인터페론-감마, JUNOVAN® 또는 MEPACT® (미파무르타이드), 로나파르닙, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 밀테포신 (헥사데실포스포콜린), NEOVASTAT® (AE-941), NEUTREXIN® (트리메트렉세이트 글루쿠로네이트), NIPENT® (펜토스타틴), ONCONASE® (리보뉴클레아제 효소), ONCOPHAGE® (흑색종 백신 치료), ONCOVAX® (IL-2 백신), ORATHECIN® (루비테칸), OSIDEM® (항체-기반 세포 약물), OVAREX® MAb (쥣과 모노클로날 항체), 파클리탁셀, PANDIMEX® (20(S)프로토파낙사디올 (aPPD) 및 20(S)프로토파낙사트리올 (aPPT)을 포함하는 인삼으로부터의 아글리콘 사포닌), 파니투무맙, PANVAC®-VF (시험용 암 백신), 페가스파르가스, PEG 인터페론 A, 페녹소디올, 프로카바진, 레비마스타트, REMOVAB® (카투막소맙), REVLIMID® (레날리도마이드), RSR13 (에파프록시랄), SOMATULINE® LA (란레오타이드), SORIATANE® (아시트레틴), 스타우로스포린 (스트렙토마이세스 스타우로스포레스), 탈라보스타트 (PT100), TARGRETIN® (벡사로텐), TAXOPREXIN® (DHA-파클리탁셀), TELCYTA® (칸포스파마이드, TLK286), 테밀리펜, TEMODAR® (테모졸로마이드), 테스밀리펜, 탈리도마이드, THERATOPE® (STn-KLH), 티미타크 (2-아미노-3,4-디하이드로-6-메틸-4-옥소-5-(4-피리딜티오)퀴나졸린 디하이드로클로라이드), TNFERADE® (아데노벡터: 종양 괴사 인자-알파에 대한 유전자를 함유하는 DNA 담체), TRACLEER® 또는 ZAVESCA® (보센탄), 트레티노인 (레틴-A), 테트란드린, TRISENOX® (삼산화 비소), VIRULIZIN®, 우크라인 (애기똥풀 식물로부터의 알칼로이드의 유도체), 비탁신 (항-alphavbeta3 항체), XCYTRIN® (모텍사핀 가돌리늄), XINLAY® (아트라센탄), XYOTAX® (파클리탁셀 폴리글루멕스), YONDELIS® (트라벡테딘), ZD-6126, ZINECARD® (덱스라족산), ZOMETA® (졸렌드론산), 크리조티닙, 조루비신 등을 포함한다.
또 하나의 바람직한 구현예에서, 치료제는 데스모글레인-2에 결합하는 화합물; 바람직하게는 DSG2와 결합하고 단단한 접합을 개방하는 화합물을 포함한다.
다른 구현예에서, 치료제는 방사성 입자/방사선 요법을 포함한다. 임의의 적합한 방사성 요법 또는 입자는 비제한적으로 코발트-60, 요오드-131, 이리듐-192, 스트론튬-89, 사마륨 153, 레늄-186 및 납-212를 포함하여, 주치의에 의해 적절한 것으로 간주될 때 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 치료제는 항종양 치료제이고 본원에 기재된 바와 같이 화학치료제 또는 항종양 모노클로날 항체를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 항종양 치료제는 트라스투주맙, 세투믹시맙, 페투주맙, 아포맙, 코나투무맙, 렉사투무맙, 베바시주맙, 베바시주맙, 데노수맙, 자놀리무맙, 린투주맙, 에드레콜로맙, 리툭시맙, 티실리무맙, 토시투모맙, 알렘투주맙, 에프라투주맙, 미투모맙, 젬투주맙 오조가마이신, 오레고보맙, 펨투모맙 다클리주맙, 파니투무맙, 카투막소맙, 오파투무맙, 및 이브리투모맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 포함한다. 유용한 항종양 mAb 및 그의 특정 용도의 비-제한적인 예는 상기 표 1에 열거되고, 본원에 참고로 포함된, 문헌[참고: Campoli,　M., et　al., Principles & Practice of Oncology　23(1&2):1-19 (2009)]에 추가로 기재된 바와 같다.
모노클로날 항체 치료제는 비제한적으로 표준 모노클로날 항체, 인간화된 모노클로날, 마우스 또는 다른 공급원으로부터 발생된 완전 인간 항체, 키메라 모노클로날, 및 그의 단편을 포함하는, 임의의 유형의 모노클로날 항체일 수 있다. "인간화된 모노클로날 항체"는 비-인간 모노클로날 항체, 예컨대 마우스 모노클로날 항체로부터 유도된 모노클로날 항체를 지칭한다. 대안적으로, 인간화된 모노클로날 항체는 모체, 비-인간, 모노클로날 항체의 항원-결합 특성을 유지하거나 실질적으로 유지하지만 인간에게 투여될 때 모체 모노클로날 항체와 비교하여 줄어든 면역원성을 나타내는 키메라 항체로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 키메라 모노클로날 항체는 인간 및 쥣과(murine) 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 영역 및 마우스 가변 영역을 포함할 수 있다. 인간화된 모노클로날 항체는, 비제한적으로 (1) 비-인간 모노클로날 항체로부터 인간 프레임워크 및 불변 영역 상에서 상보성 결정 영역의 그라프팅 ("인간화"), 및 (2) 비-인간 모노클로날 항체 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 재배치에 의해 이들을 인간-유사 표면으로 "클로킹 (cloaking)" ("veneering")을 포함하는 당해 분야에서 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들면, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994); 및 Kettleborough, C. A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)에 개시된다. 모노클로날 항체는 종래의 기술을 사용하여 단편화될 수 있고, 단편은 전체의 항체에 대해서와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝했다. 예를 들면, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 산출될 수 있다. 수득한 F(ab')2 단편은 Fab' 단편을 생산하기 위해 이황화물 다리를 감소시키도록 처리될 수 있다. Fab 단편은 IgG 항체를 파파인으로 처리하여 수득될 수 있고; F(ab') 단편은 IgG 항체의 펩신 소화로 수득될 수 있다. F(ab') 단편은 또한 티오에테르 결합 또는 이황화물 결합을 통해 하기 기재된 Fab'를 결합함으로써 생산될 수 있다. Fab' 단편은 F(ab')2의 힌지 영역의 이황화물 결합을 절단함으로써 수득된 항체 단편이다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편을 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 처리하여 수득될 수 있다. 항체 단편 펩타이드는 또한 재조합 세포에서 그와 같은 펩타이드를 인코딩하는 핵산의 발현에 의해 산출될 수 있다 (참고, 예를 들면, Evans et al., J. Immunol. Meth. 184: 123-38 (1995)). 예를 들면, F(ab')2 단편의 일부를 인코딩하는 키메라 유전자는 CH1 도메인 및 H 사슬의 힌지 영역을 인코딩하는 DNA 서열, 이어서 번역 정지 코돈을 포함하여 그와 같은 끝이 잘린 항체 단편 분자를 산출할 수 있다. 모노클로날 항체 단편의 비-제한적인 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH I 도메인으로 본질적으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab)2 및 F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 다리로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 1 이상의 단리된 CDRs 또는 작용성 파라토프를 포함한다.
본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합과 조합될 수 있는 하나의 바람직한 구현예에서, 장애는 Her-2 양성 종양을 포함하고, 방법은 적합한 모노클로날 항체 요법과 함께 본 발명의 AdB-2/3 섬유 다량체를 단독으로 또는 화학치료제, 방사선, 또는 그의 조합과 조합하여 공-투여함을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 모노클로날 항체는 트라스투주맙이다. 임의의 이들 구현예와 조합될 수 있는 추가의 바람직한 구현예에서, Her-2 양성 종양은 유방 종양, 위 종양, 결장 종양, 및 난소 종양으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은, 예컨대 종양 완화의 부족에 의해, 종양 재발에 의해, 또는 트라스투주맙에 대한 저항성의 발달에 의해 트라스투주맙에 적절하게 반응하지 않는 환자에 대해 수행된다. 이들 구현예의 방법은 또한 치료적 효능을 얻는데 필요한 트라스투주맙의 용량을 감소시키는 것을 돕기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 부작용 (예컨대 트라스투주맙-연관된 심장독성)을 한정시키기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합과 조합될 수 있는 또 하나의 바람직한 구현예에서, 장애는 EGFR-양성 종양을 포함하고, 방법은 적합한 모노클로날 항체 요법과 함께 AdB-2/3 섬유 다량체를 단독으로 또는 화학치료제, 방사선, 또는 그의 조합과 조합하여 공-투여함을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 모노클로날 항체는 세툭시맙이다. 임의의 이들 구현예와 조합될 수 있는 추가의 바람직한 구현예에서, EGFR-양성 종양은 폐 종양, 결장 종양, 유방 종양, 직장 종양, 두경부 종양, 및 췌장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 종양 완화의 부족에 의해, 종양 재발에 의해, 또는 세툭시맙에 대한 저항성의 발달에 의해 세툭시맙에 적절하게 반응하지 않는 환자에 대해 수행된다. 이들 구현예의 방법은 또한 치료적 효능을 얻는데 필요한 세툭시맙의 용량을 감소시키는 것을 돕기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 부작용 (예컨대 세툭시맙 요법 동안 흔히 일어나는 여드름-유사 발진)을 한정시키기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합과 조합될 수 있는 하나의 바람직한 구현예에서, 장애는 상피 종양을 포함하고, 방법은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제와 함께 AdB-2/3 섬유 다량체를 단독으로 또는 화학치료제, 방사선, 또는 그의 조합과 조합하여 공-투여함을 포함한다. 비제한적으로 베바시주맙을 포함하는 임의의 적합한 VEGF 억제제가 사용될 수 있다.
본원의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합과 조합될 수 있는 추가 구현예에서, 고형 종양이 관계되어 있는 방법은 종양 기질 단백질을 분해할 수 있는 화합물을 투여함을 추가로 포함한다. 종양 기질 단백질을 분해하기 위한 임의의 적합한 화합물이 비제한적으로 릴락신, 콜라게나제, 트립신, 디스파제, MMP(메탈로프로테이나제)-1, 및 MMP8을 포함하여, 사용될 수 있다. 그와 같은 화합물의 전달은 유전자 치료, AdB-2/3 섬유 다량체 및 치료제와의 별도의 투여, 또는 AdB-2/3 섬유 또는 치료제와의 결합체로서의 투여를 포함하는, 임의의 적합한 기전에 의할 수 있다.
본원의 임의의 구현예 또는 구현예의 조합과 조합될 수 있는 추가 구현예에서, 방법은 AdB-2/3 다량체를 다른 접합 개방제와 조합하여 투여함을 추가로 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "접합 개방제(junction opener)"는 세포간 접합부를 일시적으로 개방할 수 있는 화합물이다. 임의의 적합한 접합 개방제가 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 접합 개방제는 창자 상피 접합을 가역적으로 변경시키는 능력을 보유하여, 점막 장벽을 통한 거대분자의 통과를 가능하게 하는 폐쇄띠 독소 (Zot), 비브리오 콜레라에 (V. cholerae)-생산된 독소를 포함한다 (Fasano et al. (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88: 5242-5246)]. Zot-유도된 헥사펩타이드 (AT-1001)가 개발되었다. 또 하나의 구현예에서, 클로스트리듐 페르프린겐스 장독소는 박테리아 침입을 용이하게 하기 위해 크라우딘-3 및 -4를 단단한 접합부에서 제거한다 (Sonoda N, et al. (1999) J Cell Biol 147: 195-204.]. 추가 구현예에서, 인간 Ad, HPV, HTLV-1에 의해 인코딩된 종양단백질은 접합 단백질 ZO-1을 잘못 위치시켜 (mislocalizing) 상피 접합부를 일시적으로 개방할 수 있다 (Latorre IJ, et al. (2005) J Cell Sci 118: 4283-4293). 다른 구현예에서, 몇 개의 인간 바이러스는 단단한 접합부 또는 다른 세포 접합 분자를 끌어당겨서 상피 세포로의 진입을 달성한다. 이들 바이러스 중 하나가 C형 감염 바이러스 (Evans MJ, et al. (2007) Nature 446: 801-805), 레오바이러스 (Barton ES, et al. (2001) Cell 104: 441-451), 및 단순 포진 바이러스 (Geraghty RJ, et al. (1998) Science 280: 1618-1620)이다.
또 하나의 구현예에서, 치료제는 흡입 치료제이다. 임의의 적합한 흡입 치료제는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 다양한 비제한적인 구현예에서, 흡입 치료제는 코르티코스테로이드, 기관지확장제, 베타 작용제, 항콜린제, 알부테롤 (PROVENTIL®; VENOLIN®; ACCUNEB®; PROAIR®), 레발부테롤 (XOPENEX®), 피르부트롤 (MAXAIR®), 이프라트로피움 브로마이드 (ATROVENT®), 베클로메타손, 부데소나이드, 플루니솔라이드 (AEROBID®), 플루티카손, 트리암시놀론 아세토나이드, 플루티카손 (코르티코스테로이드) 및 살메테롤 (ADVAIR®), 포르모토롤 (지속성, 베타-작용제 기관지확장제) 및 부데소나이드 (코르티코스테로이드)(SYMICORT®), 알부테롤 (베타 작용제) 및 이프라트로피움 (COMBIVENT®; 항콜린제)(부데소나이드 (PULMICORT RESPULES®), 및 티오프로티움 (SPIRIVA®; 항콜린성 기관지확장제)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 하나의 구현예에서, 화합물은 진단제 또는 조영제를 포함한다. 본 발명의 방법은 관심 표적에 대한 접근이 제한될 수 있는 세포간 접합부를 포함하는 상피 조직에 임의 진단제, 조영제, 또는 다른 화합물의 전달을 위해 광범위하게 적용된다. 다양한 비제한적인 구현예에서, 조영제는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 산출할 수 있는 임의 화합물을 포함할 수 있다. 다수의 그와 같은 조영제는 당해 분야의 숙련가에게 공지된다. 개시된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 조영제의 예는 방사성 동위원소, 형광 분자, 자기성 입자 (나노입자 포함), 금속 입자 (나노입자 포함), 인광 분자, 효소, 항체, 리간드, 및 그의 조합이고, 한편 진단제는 그와 같은 조영제에 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다. 조영제에 의해 발생된 신호를 검출하고 측정하는 방법도 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된다. 예를 들면, 방사성 동위원소는 섬광 계수 또는 직접적인 가시화로 검출될 수 있으며; 형광 분자는 형광 분광측정기로 검출될 수 있으며; 인광 분자는 분광측정기로 검출되거나 카메라를 사용하여 직접적으로 가시화될 수 있으며; 효소는 효소에 의해 촉매된 반응 생성물의 검출 또는 가시화로 검출될 수 있으며; 항체는 항체에 커플링된 2차 검출 표지를 검출함으로써 검출될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 조영제 및/또는 진단제는 직접적인 종양 결합에 의한 것이든 조영제 또는 진단제를 종양과 결합할 수 있는 화합물과의 커플링에 의한 것이든, 종양을 검출하는데 사용될 수 있는 것이면 된다.
일 예에서, 조영제는 형광 조영제를 포함할 수 있으며, 한편 진단제는 형광 조영제에 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다. 형광 조영제는 검출가능한 형광 신호를 갖는 임의의 화학적 물질이다. 이 조영제는 단독으로 사용되거나 다른 조영제와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 적합한 형광 시약의 예는, 비제한적으로, 플루오레신 (FITC), 5-카복시플루오레신-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 5,6-카복시메틸 플루오레신, 니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일 (NBD), 플루오레스카민, OPA, NDA, 인도시아닌 그린 염료, 시아닌 염료 (예를 들면, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7), 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디설폰산, 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐리나프탈이미드-3,5 디설포네이트, N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, BODIPY, 브릴리언트 옐로우, 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린 (쿠마란 151), 시아노사인, 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5''-디브로모파이로갈롤-설포나프탈레인 (브로모파이로갈롤 레드), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4,4'-디이소티오시아네이토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, 단실클로라이드), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (DABCYL), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트 (DABITC), 에오신, 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신 B, 에리트로신, 이소티오시아네이트, 에티듐 브로마이드, 에티듐, 5-카복시플루오레신 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레신 (DTAF), 2',7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레신 (JOE), 플루오레신 이소티오시아네이트, IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸엄벨리페론, 오르토 크레졸프탈레인, 니트로티로신, 파라로사닐린, 페놀 레드, B-파이코에리트린, o-프탈디알데하이드, 피렌, 피렌 부티레이트, 석신이미딜 1-피렌 부티레이트, 리액티브 레드 4 (사이바크론[R] 브릴리언트 레드 3B-A), 6-카복시-X-로다민 (ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리스사민 로다민 B 설포닐 클로라이드 로다민 (Rhod), 5,6-테트라메틸 로다민, 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 쿠마린-6, 등, 그의 조합을 포함한다. 이들 형광 이미지화 물질은 회사(Molecular Probes, Eugene, Oreg. and Research Organics, Cleveland, Ohio)를 포함하는 다양한 상업적 공급원에서 수득될 수 있거나 당해 분야의 숙련가에 의해 합성될 수 있다.
또 하나의 예에서, 조영제는 자기 공명 영상 (MRI) 시약을 포함할 수 있으며, 한편 진단제는 MRI 시약에 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다. MRI 시약은 검출가능한 자기성 공명 신호를 갖거나 또 하나의 시약의 자기성 공명 신호에 영향을 줄 수 있는 (예를 들면, 증가시키거나 이동시킬 수 있는) 임의의 화학적 물질이다. 이러한 유형의 조영제는 단독으로 또는 다른 조영제와 조합하여 사용될 수 있다. 또 하나의 예에서, 가돌리늄-기반 MRI 시약이 조영제로서 제공될 수 있다. 개시된 조영제 내로 혼입될 수 있는 적합한 MRI 시약의 예는 파라-아미노-벤질 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (p-NH2-Bz-DTPA, 화합물 7), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)의 결합가능한 형태이며, 이것은 가돌리늄과 강하게 결합하는 것으로 알려져 있고 자기성 공명 조영제로서의 임상 용도를 위해 승인되었다. 본원에서 개시된 바와 같이 큰 거대분자 예컨대 덴드리머 기질 상에 MRI 시약의 혼입은 신호를 증가시킬 수 있는 큰 T1 이완 (고 명암 대비) 및 단일 분자상에서 시약의 다중 카피를 가능하게 할 수 있다. MRI 조영제 및, 예를 들면, 형광 조영제를 조합함으로써, 수득된 시약은 검출되고, 이미지화되고, MR I를 통해 실시간으로 추적될 수 있다. 다른 조영제는 18F, 또는 64Cu 또는 68Ga에 대한 킬레이터를 혼입함으로써 제조될 수 있는 PET 시약을 포함한다. 또한, 방사선핵종의 부가는 SPECT 이미지화 또는 방사선 용량의 전달을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있으며, 한편 진단제는 PET 시약에 결합되는 특정한 상피 장애에 대한 진단 마커인 화합물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 진단제는 비제한적으로 위치 방출 단층촬영 (PET) 시약, 컴퓨터화된 단층촬영 (CT) 시약, 자기 공명 영상 (MRI) 시약, 핵자기 조영제 (NMI), 형광투시제 및 초음파 조영제를 포함하는, 진단 영상 시약이다. 그와 같은 진단제는 123I, 125I, 131I 등을 포함하는 요오드 (I), 바륨 (Ba), 가돌리늄 (Gd), 99Tc를 포함하는 테크네튬 (Tc), 31P를 포함하는 인 (P), 철 (Fe), 망간 (Mn), 탈륨 (Tl), 51Cr을 포함하는 크로뮴 (Cr), 14C를 포함하는 탄소 (C), 등과 같은 원소의 방사선동위원소, 형광으로 표지된 화합물, 또는 그의 복합체, 킬레이트, 부가물 및 결합체를 포함한다. 임의의 적합한 PET 시약은 비제한적으로 탄소-11, 질소-13, 산소-15, 불소-18,11C-메토미데이트, 및 비제한적으로 플루데옥시글루코오스 (불소-18로 표지된 글루코오스 유사체)를 포함하는 그의 글루코오스 유사체를 포함하여, 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 진단제는 세포에서 발현될 때 쉽게 검출가능한 단백질 (비제한적으로, 베타-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질, 루시퍼라아제, 등을 포함) 및 표지된 핵산 프로브 (예를 들면, 방사선표지된 프로브 또는 형광으로 표지된 프로브)를 인코딩하는 마커 유전자이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 AdB-2/3 다량체에 진단제의 공유 콘주게이션은 다양한 콘주게이션 공정에 따라서 달성된다. 다른 구현예에서, 진단제는 제공된 AdB-2/3 다량체와 비-공유적으로 관련된다.
추가 측면에서, 본 발명은 상피 조직에 물질의 전달을 개선시키는 방법으로서, 상피 조직을 (a) 상피 조직에 전달되는 1 이상의 화합물; 및 (b) 상피 조직에 1 이상의 화합물의 전달을 증대시키기에 충분한, 본 발명의 AdB-2/3 섬유 다량체의 양과 접촉시킴을 포함하는, 방법을 제공한다. 이 측면에서, 화합물은 임의의 적합한 화합물 예컨대 상기 상세히 기재된 것들일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 1 이상의 화합물은 조영제를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서 상피 조직은 본원에 개시된 것들 중 어느 것을 포함하는 고형 종양을 포함한다. 다양한 비제한적인 구현예에서, 고형 종양은 유방 종양, 폐 종양, 결장 종양, 직장 종양, 위 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 피부 종양, 내분비 종양, 자궁경부 종양, 신장 종양, 흑색종, 췌장 종양, 간 종양, 뇌종양, 두경부 종양, 비인두 종양, 위 종양, 편평상피 세포 암종, 선암종, 방광 종양, 및 식도 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 1 이상의 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함하는 예시적인 다량체는, 비제한적으로, AdB-2/3 비리온, AdB-2/3 캡시드, AdB-2/3 12면체 입자 (PtDd) (AdB-2/3의 복제 동안 AdB-2/3에 의해 생산된 서브바이러스 12면체 입자), 및 재조합 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함한다.
또 추가의 측면에서, 본 발명은 데스모글레인 2 (DSG2)를 발현시키는 세포 또는 조직에 물질의 전달을 개선시키는 방법으로서, DSG2를 발현시키는 세포 또는 조직을 (a) 세포 또는 조직에 전달되는 1 이상의 화합물; (b) 조직에 1 이상의 화합물의 전달을 증대시키기에 충분한, 본 발명의 AdB-2/3 섬유 다량체의 양과 접촉시킴을 포함하는, 방법을 제공한다. DSG2를 발현시키는 예시적인 조직 유형은, 비제한적으로 상피 세포/조직 (예컨대 본원에 개시된 것들), 인간 혈소판 및 과립구를 포함한다. 하기 실시예에서 보여주는 바와 같이, DSG2는 또한 비-극성화된 세포에서 수용체로서 작용한다. 따라서, 이들 방법은 상피 세포 및 조직에서의 적용을 발견할 뿐만 아니라, 예를 들면, AdB-2/3 병인 및 유전자 치료 목적을 위한 AdB-2/3 벡터의 혈관내 적용에도 관련된다. 이들 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 1 이상의 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함하는 예시적인 다량체는, 비제한적으로, AdB-2/3 비리온, AdB-2/3 캡시드, AdB-2/3 12면체 입자 (PtDd) (AdB-2/3의 복제 동안 AdB-2/3에 의해 생산된 서브바이러스 12면체 입자), 및 재조합 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함한다.
또 추가의 측면에서, 본 발명은 조직에서 상피 세포로부터 간엽 세포로의 전이 (EMT)를 유도하기 위한 방법으로서, 상피 조직을 EMT를 유도하기에 충분한, 본 발명의 AdB-2/3 섬유 다량체의 양과 접촉시킴을 포함하는, 방법을 제공한다. EMT는 상피 세포가 세포간 접합과 같은 특성을 잃어버리고 간엽 세포의 특성을 얻게 되는 세포성 전환분화 프로그램이다. EMT는 간엽 마커의 증가된 발현, 세포외 매트릭스 화합물의 증가된 발현, 상피 마커의 줄어든 발현, 전사 인자의 변경된 위치, 및 키나제의 활성화, 및 세포간 접합의 분리로 특징지워진다. 이들 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 1 이상의 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함하는 예시적인 다량체는, 비제한적으로, AdB-2/3 비리온, AdB-2/3 캡시드, AdB-2/3 12면체 입자 (PtDd) (AdB-2/3의 복제 동안 AdB-2/3에 의해 생산된 서브바이러스 12면체 입자), 및 재조합 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함한다.
본 발명의 방법의 모든 측면 및 구현예에서, 치료제, 진단제, 및/또는 조영제는 (예컨대 상기 개시된 본 발명의 조성물을 통해) AdB-2/3 다량체와 함께 투여될 수 있거나 별도로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 치료제 및 AdB-2/3 다량체는 임의의 적합한 공유 또는 비-공유 결합을 통해 부착된다. 하나의 비제한적인 구현예에서, AbB-2/3 다량체는 고형 종양 세포를 사멸시키기 위해 독소 또는 다른 약물에 부착될 수 있다.
AdB-2/3 섬유 다량체 및/또는 치료제는 어느 국소 또는 전신 투여 방식이 치료될 병태에 대해 가장 적절한지의 여부에 따라서, 주치의에 의해 적합한 것으로 간주되는 어떤 방식으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "전신 전달" 및 "전신 투여"는, 비제한적으로, 근육내　(IM), 피하, 정맥내　(IV), 동맥내, 흡입, 설하, 구강, 국소, 경피, 코, 직장, 질, 및 의도된 치료 작용의 단일 또는 다중 부위로 전달된 제제의 확산을 효과적으로 야기하는 다른 투여 경로를 포함하는 경구 및 비경구 경로를 포함하는 것으로 의도된다. 본 조성물에 대한 바람직한 전신 전달 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 및 흡입을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여는 예컨대 파종성 종양의 치료 (및 모노클로날 항체 전달)를 위해 사용된다. 또 하나의 구현예에서, 경구 전달은, 예를 들면, 위장관 (GI) 상피 장애를 치료하는데 바람직할 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 코 또는 에어로졸 전달은 폐로의 전달, 예컨대 폐 상피 장애를 위해 바람직할 수 있다.
AdB-2/3 섬유 다량체는 폴리펩타이드가 효소 분해되는 것을 방지하기 위해 또 하나의 분자, 예컨대 지질 또는 리포좀과 공동으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 접합은 체내에서 어떤 단백질이 효소 가수분해되는 것을 방지하고 이에 따라 반감기를 연장시키는데 사용되었다.
AdB-2/3 섬유 다량체 및/또는 치료제는 원하는 치료 효과 수준을 유지하기 위해 결정된 간격에서 주기적 기준으로 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥내 주사에 의한 투여는 1일 1회, 주당 1회, 2주 내지 4주당 1회 또는 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있다. 용량 계획은 제제의 조합 작용에 영향을 줄 수 있는 다양한 인자를 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이들 인자는 치료될 병태의 진행 정도, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 다른 임상 인자를 포함할 것이다. AdB-2/3 섬유 다량체 및/또는 치료제에 대한 용량은 투여될 다량체 및/또는 치료제의 기능, 뿐만 아니라 임의 약물 전달 비히클 (예를 들면, 지속 방출 전달 비히클)의 존재 및 성질에 따라 다양할 것이다. 또한, 용량은 전달된 제제(들)의 투여 빈도 및 약력학적 거동에서 변화에 맞도록 조정될 수 있다. AdB-2/3 섬유 다량체의 복용 범위는 일반적으로 0.01 내지 250　mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 10　mg/kg, 및 더 바람직하게는 0.10 내지 0.5　mg/kg의 범위일 것이다. 승인된 치료제의 용량은 개업의에 의해 쉽게 확인가능하다. 치료제는 또한 상피 조직 내로, 예컨대 암으로 증대된 침투에 기인하여 감소된 용량으로 투여될 수 있을 것이다.
AdB-2/3 섬유 다량체는 치료제의 투여 전, 동시에, 또는 후 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 치료제 및 AdB-2/3 섬유 다량체의 투여는 동시에 수행된다. AdB-2/3 섬유 다량체에 대해 치료제의 투여 시기는 가장 큰 치료 효과를 달성하기 위해 가변적일 수 있다. 바람직하게는, 치료제는 DSG2에 대한 AdB-2/3 섬유 다량체 결합에 의해 야기된 세포간 접합의 일시적 개방과 그의 접촉을 보장할 수 있는 시기에 투여된다. 예를 들면, 치료제는 AdB-2/3 섬유 다량체의 각 투여 전, 동시에, 후 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료제는 AdB-2/3 섬유 다량체의 투여 후, 예를 들면 AdB-2/3 섬유 다량체를 투여하고 최대 5　분, 10　분, 15　분, 30　분, 45　분, 1　시간, 2　시간, 3　시간, 4　시간, 5　시간, 6　시간, 8　시간, 10　시간, 12　시간, 18　시간, 24　시간, 30　시간, 36　시간, 40　시간, 42　시간, 48　시간, 54　시간, 60　시간, 66　시간, 72　시간, 78　시간, 84　시간, 90　시간, 또는 심지어 최대 96　시간 후에 투여될 수 있다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는 방법으로서, 장애를 치료하기에 충분한, 본 발명의 AdB-2/3 섬유 다량체의 양을 상피 조직과 관련된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법을 제공한다. 이 구현예에서, 다른 치료제는 전달되지 않는다. 비제한적인 구현예에서, 단일요법이 AdB-2/3 바이러스성 감염, 고형 종양, 또는 AdB-2/3-기반 유전자 전달 벡터를 사용하여 치료될 수 있는 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 장애를 치료하는데 사용된다. 예를 들면, 고형 종양 치료시, 상기 방법은 장애 부위에, 예컨대 침투 (예컨대 기존의 천연 살해 세포, T-세포 또는 수지상 세포의 종양내 침투)에 의해, 면역계 세포의 접근을 개선시킴을 포함한다. 상기 방법은 또한 표적 상피 세포에 면역계 세포의 개선된 접근으로부터 이익을 얻을 수 있는 상술한 상피 세포와 관련된 임의의 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 장애는 고형 종양이고, 상기 방법은 종양의 면역계 공격을 개선시킴을 포함한다. 상기 방법은 상술한 임의의 고형 종양에 사용될 수 있다. 본 발명의 제 1 측면의 모든 구현예 및 구현예의 조합은, 문맥에서 명확히 다르게 지시되지 않는 한, 이러한 제 2 측면에서 또한 사용될 수 있다. 이들 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 1 이상의 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함하는 예시적인 다량체는, 비제한적으로, AdB-2/3 비리온, AdB-2/3 캡시드, AdB-2/3 12면체 입자 (PtDd) (AdB-2/3의 복제 동안 AdB-2/3에 의해 생산된 서브바이러스 12면체 입자), 및 재조합 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는 것, 상피 조직으로의 물질의 전달을 개선하는 것 중 1 이상을 위하거나, DSG2를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키고, 조직에서 EMT를 유도하고/하거나, AdB-2/3 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 식별하기 위한 방법으로서,
(a) DSG2에 대한 다량체 결합을 촉진시키기 위한 조건 하에서 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체를 DSG2에 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉하는 단계를 1 이상의 시험 화합물의 존재 하에 수행하는, 단계; 및
(b) DSG2에 대한 결합을 위하여 상기 AdB-2/3 섬유 다량체와 경쟁하는 양성 시험 화합물을 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하고,
상기 양성 시험 화합물은 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는 것, 상피 조직으로의 물질의 전달의 개선하는 것 중 1 이상을 위하거나, DSG2를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키고, 조직에서 EMT를 유도하고/하거나 AdB-2/3 감염을 치료하기 위한 후보 화합물이다.
DSG2에 대한 결합을 위해 AdB-2/3 섬유 다량체와 경쟁하는 양성 시험 화합물은 DSG2와 그들의 상호작용을 통해 세포내 접합부를 일시적으로 개방하기 위한 후보 화합물이다. DSG2와 그들의 상호작용을 통해 세포내 접합부를 일시적으로 개방하는 상기 화합물의 능력을 입증하기 위한 후속조치 검정은, 비제한적으로 하기 실시예에 개시된 연구를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 상피 조직과 관련된 장애를 치료하거나, 상피 조직에 물질의 전달을 개선하거나, DSG2를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키거나, 조직에서 EMT를 유도하는 것으로 확인된 화합물은 본 발명의 임의의 방법에서 AdB-2/3 다량체에 대해 대체물로서 사용될 수 있다. 더욱이, AdB-2/3은 기도 감염 (일부 절단된다; some sever) 및 인두결막열을 유발하는 중요한 인간 병원체를 나타낸다. 따라서 AdB-2/3 감염을 치료할 수 있는 화합물은 유용할 것이다. 본원에서 개시된 바와 같이, AdB-2/3에 의해 사용된 일차 고-친화성 수용체로서의 DSG2, 및 이에 따른 DSG2에 대한 AdB-2/3 결합을 약화시킬 수 있는 화합물은 AdB-2/3 감염을 치료하거나 AdB-2/3 감염의 진행을 제한하기 위한 후보 화합물이다.
이들 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 1 이상의 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함하는 예시적인 다량체는, 비제한적으로, AdB-2/3 비리온, AdB-2/3 캡시드, AdB-2/3 12면체 입자 (PtDd) (AdB-2/3의 복제 동안 AdB-2/3에 의해 생산된 서브바이러스 12면체 입자), 및 재조합 AdB-2/3 섬유 다량체를 포함한다. 임의의 적합한 대조군이 비제한적으로 시험 화합물의 부재 하에 DSG2에 결합하는 AdB-2/3 다량체를 포함하여, 사용될 수 있다.
일 구현예에서, DSG는 재조합 DSG2를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 방법은 세포 표면 상에서 DSG2를 (내인성으로 또는 재조합으로) 발현시키는 세포를 사용한다.
하나의 비제한적인 구현예에서, 고정된 재조합 DSG2를 함유한 센서를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 연구는, DSG2 경쟁 연구와 결합하여, AdB-2/3 섬유 다량체가 DSG2와 결합하는 후보 화합물을 확인하는데 사용될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 상기 확인은, 결합을 약화시키는 시험 화합물의 능력이 DSG2-발현 상피 세포를 형질도입시키는 작용성 AdB-2/3 비리온의 능력의 감소로서 검출되는 형질도입 연구를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, DSG2-발현 세포 추출물은 전기영동으로 분리되고 웨스턴 블롯되고, 표지된 AdB-2/3 섬유 다량체는 시험 화합물의 존재 하에 웨스턴 블롯을 탐침하기 위해 사용된다. 추가 구현예에서, 점블롯(dot-blot) 검정, 예컨대 문헌[참조: Wang et al., J. Virology (2007) 81:12785-12792; 및 Wang et al. (2008) 82:10567-10579]에 기재된 것들이 사용될 수 있다.
시험 화합물이 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우, 그와 같은 폴리펩타이드는 화학적으로 합성되거나 재조합으로 발현될 수 있다. 재조합 발현은 상기 개시된 바와 같이, 당해 분야의 표준 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 그와 같은 발현 벡터는 박테리아 또는 바이러스 발현 벡터를 포함할 수 있고, 그와 같은 숙주세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 공지된 고체상, 액체상 기술, 또는 펩타이드 축합 기술, 또는 이들의 임의 조합을 사용하여 제조된 합성 폴리펩타이드는 천연 및 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 합성에 사용된 아미노산은 표준 탈보호, 중화, 커플링 및 세척 프로토콜을 갖는 표준 Boc (Nα-아미노 보호된 Nα-t-부틸옥시카보닐)아미노산 수지, 또는 표준 염기-불안정한 Nα-아미노 보호된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc)아미노산일 수 있다. Fmoc 및 Boc Nα-아미노 보호된 아미노산 둘 모두는 회사(Sigma, Cambridge Research Biochemical), 또는 당해 분야의 숙련가에게 익숙한 다른 화학 회사로부터 수득될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 당해 분야의 숙련가에게 익숙한 다른 Nα-보호 그룹으로 합성될 수 있다. 고체상 펩타이드 합성은 당해 분야의 숙련가에게 익숙한 기술에 의해 달성될 수 있으며, 예컨대 자동화된 합성기를 사용함으로써 제공될 수 있다.
시험 화합물이 항체를 포함하는 경우, 그와 같은 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 항체는 인간화되거나, 완전 인간 또는 쥣과 형태의 항체일 수 있다. 그와 같은 항체는 공지된 방법, 예컨대 문헌[참고: Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.
시험 화합물이 핵산 서열을 포함하는 경우, 그와 같은 핵산은 마찬가지로 화학적으로 합성되거나 재조합으로 발현될 수 있다. 재조합 발현 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다 (참고, 예를 들면, Sambrook, et al., 1989, 상기). 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 유사하게, 그와 같은 핵산은 당해 분야의 표준 기술을 사용하여 매뉴얼 또는 자동화된 반응에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성되거나 시험관내 효소 합성에 의해 합성된다면, 핵산은 세포 내로의 도입 전에 정제될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 용매 또는 수지로의 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피, 또는 그의 조합에 의해 혼합물로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 샘플 가공으로 인한 손실을 피하기 위하여 정제 없이 또는 최소의 정제로 사용될 수 있다.
시험 화합물이 폴리펩타이드, 항체, 또는 핵산 이외의 화합물을 포함하는 경우, 그와 같은 화합물은 유기 화학 합성을 수행하기 위해 당해 분야의 다양한 방법 중 어느 것에 의해 제조될 수 있다.
실시예. 아데노바이러스 섬유 노브 도메인 및 데스모글레인 2의 상호작용에 대한 구조적 및 작용성 연구.
요약
인간 아데노바이러스 (Ad) 혈청형 Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, 및 최근에 부각된 신규 균주 Ad14 (Ad14p1)는 감염을 위해 수용체로서 상피 접합 단백질 데스모글레인 2 (DSG2)를 사용한다. CAR 및 CD46과의 Ad 상호작용과 달리, DSG2에 대한 Ad 결합에 대한 구조적 세부사항은 여전히 이해하기 어렵다. 랜덤 Ad3 및 Ad14p1 섬유 노브 돌연변이체의 대장균 발현 라이브러리를 토대로 한 접근법을 사용하여, 본 발명자들은, 개별적으로 돌연변이될 때, DSG2에 대한 Ad 노브 결합을 제거하거나 감소시켰던 아미노산 잔기를 확인했다. 이들 잔기는 섬유 노브의 극단 말단부에서 하나의 홈 내부에 3개의 클러스터를 형성했다. Ad3 섬유 노브 돌연변이체 라이브러리를 또한 DSG2에 대한 친화도가 증가된 변이체를 확인하는데 사용했다. 본 발명자들은 야생형 Ad3 노브와 비교하여 10의 몇승 정도 더 높은 DSG2에 대한 친화도를 야기하는 Ad3 노브의 EF 루프 내에서 또는 EF 루프 근처에서 수많은 돌연변이를 발견했다. 돌연변이체들 중 하나의 결정 구조 분석은 도입된 돌연변이가 EF 루프를 더 가요성일 수 있게 만들고, 이것은 DSG2와의 상호작용을 용이하게 할 수 있을 것임을 보여주었다. 본 발명자들의 조사결과는 암 치료를 위해 실제적인 관련성을 갖는다. 본 발명자들은 재조합 단백질 (JO-1)을 함유하는 Ad3 섬유 노브가 상피 암 세포들 사이의 접합부의 개방을 유발시킬 수 있으며, 결국, 이는 종양내 침투 및 치료제의 효능을 크게 개선시킨다고 최근에 보고했다. 여기서 본 발명자들은 JO-1의 친화도-증대 버전이 일련의 암 모델에서 모체 단백질보다 치료적으로 더 강함을 보여준다.
도입
본 발명자들은 아데노바이러스 혈청형 3 (Ad3), 인간 모집단에 널리 분포된 혈청형을 포함하는 종 B 아데노바이러스의 그룹에 대한 주요 수용체로서 DSG2를 최근에 확인했다 (42). 본 발명자들은 Ad3 내의 DSG2 상호작용 도메인(들)이 몇 개의 섬유 노브에 의해 형성된다는 것을 발견했다 (41). 이러한 특이적 방식의 Ad3-섬유 노브-DSG2 상호작용은 고결합능을 제공하고 상피 접합부의 개방에 대해 기능적으로 관련된다 (41, 42). 후자는 DSG2의 클러스터링 및 MAP 키나아제의 인산화 및 접합 단백질 발현의 하향조절을 포함하는, 상피 세포로부터 간엽 세포로의 전이를 연상시키는 경로의 활성화를 수반한다 (6, 40, 42). 상피 접합부를 개방하는 능력은 기도 상피 세포로의 Ad3 침투 및 기도 상피 세포 내로의 Ad3 확산에 중요한 것으로 나타났다 (40-42). 최근 연구에서, 본 발명자들은 DSG2에 대한 효율적인 결합을 수여하는 Ad3 캡시드 내의 최소 물질(moiety)을 발견하려고 시도되었다 (41). 본 발명자들은 Ad3 섬유 노브, 및 삼량체 Ad3 섬유 노브의 자가-이량체화를 가능하게 하는 도메인을 함유하는 작은 재조합 단백질 (JO-1)을 생성하였다 (41). JO-1은 대장균에서 쉽게 생산될 수 있으며 친화성 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 극성화된 상피 세포 배양물에서, JO-1은 세포간 접합의 개방을 유발했으며, 한편 상피 종양을 지닌 마우스로의 JO-1의 정맥내 주사는 항암 약물의 더 나은 침투를 가능하게 했다 (5, 6).
본 연구의 제 1 목표는 Ad3 섬유 노브-DSG2 상호작용의 구조적 특징을 추가로 상술하기 위한 것이었다. 이것은 DSG2에 대한 결합과 관련된 Ad3 섬유 노브 내의 아미노산 잔기를 확인하고 DSG2에 대한 결합이 감소되고 제거된 JO-1 돌연변이체를 생성하는 것이었다. 번역 관련성을 갖는, 이 연구의 제 2 목표는 DSG2에 대한 친화도를 증대시키고, 그렇게 함으로써 치료 효과를 증가시킴으로써 JO-1을 추가로 개선시키기 위한 것이었다. 이것은 DSG2에 대한 결합이 증가된 돌연변이체를 확인함으로써 수행되었다.
두 가지 목표는 Ad3 섬유 노브 돌연변이체의 대장균 발현 라이브러리를 사용하여 달성되었다. 본 발명자들은 DSG2에 대한 결합과 중요하게 관련된 Ad3 섬유 노브 내의 3개의 상이한 클러스터에서의 잔기들을 확인했다. 모든 잔기는 수용체와 마주 대하는 섬유 노브의 말단부에서 하나의 홈 내에 위치된다. 그때 본 발명자들은 시험관내 극성화된 상피 세포에서 상피통과 전기적 저항성을 측정함으로써 상피 접합부를 개방하는 섬유 노브의 능력, 및 상피 이종이식 종양을 지닌 마우스에서 화학요법 약물의 효능을 증대시키는 능력에 대한 이들 돌연변이의 영향을 평가했다. 예상대로, DSG2에 대한 친화도가 감소된 돌연변이가 JO-1 내로 도입되는 경우, 수득한 단백질은 상피 접합부를 덜 개방할 수 있었다. 다른 한편으로, DSG2에 대한 JO-1의 친화도를 증가시켰던 수많은 돌연변이는 상피 접합부의 개방시 더 강한 활성을 보여주었다. 종합적으로, 이들 연구는 DSG2에 대한 Ad3-섬유 노브의 친화도 및 상피 접합부상의 후속 영향 사이의 상관관계를 명시한다.
이 연구의 제 3 목표는 또 하나의 DSG2-표적 Ad 혈청형; 모체 균주 (Ad14-deWit)(10, 16, 22)보다 더 병원성/악성인 것으로 여겨지는 새로 부각된 균주 Ad14p1 (44)의 섬유 노브 잔기와 상호작용하는 DSG2를 상술하기 위한 것이었다. Ad14p1의 베타 시트 분포는 Ad3의 것과 상이하며, 이것은 DSG2 결합 방식의 차이를 잠재적으로 야기할 것이다. 따라서 본 발명자들은 Ad14p1의 DSG2-상호작용 잔기를 확인하기 위하여 Ad14p1 섬유 노브 돌연변이체의 대장균 발현 라이브러리를 생성하였다.
물질 및 방법
단백질 . 재조합 인간 DSG2 단백질은 회사(Leinco Technologies, Inc. (St. Louis, MO))로부터 수득했다. Ad3 섬유 노브를 ATCC로부터 수득된 Ad3 바이러스, GB 균주로부터 유도했다. Ad14p1 섬유 노브는 질환 통제 및 예방 센터 (Atlanta, GA)에 의해 제공된, Ad14p1 바이러스, 균주 Portland 2971/2007로부터 유도된다 (44). N-말단 6-His 태그를 갖는 섬유 노브는 pQE30 발현 벡터 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 대장균에서 생산되었고 다른 곳에 기재된 바와 같이 Ni-NTA 아가로스 크로마토그래피로 정제되었다 (43).
세포주. 293, HeLa, 및 A549 세포를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 (P/S), 2 mM 글루타민 (Glu) 및 1x MEM 비-필수적인-아미노산 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 보강된 DMEM에서 유지했다. 결장암 T84 세포 (ATCC CCL-248)를 햄 F12 배지 및 DMEM의 1:1 혼합물, 10% FBS, Glu 및 P/S에서 배양했다. Ovc316 세포는 난소암 생검으로부터 유도된 Her2/neu 양성 상피 종양 세포이다 (32). Ovc316 세포를 1% FBS, 100 I.U. 페니실린, 100μg/L 스트렙토마이신, 10mg/L 시프로플록사신으로 보강된, 3μg/L hEGF, 5μg/L 인슐린, 5mg/L 하이드로코르티손, 26mg/L 소 뇌하수체 추출물, 25mg/L 암포테리신 B)(Lonza)를 함유하는 MEGM (Lonza, Mapleton , IL)에서 배양했다. MDA-MB-231 세포, 삼중-음성 유방암 세포주 (ATCC-HTB-26)를 10% FBS, 100 I.U. 페니실린, 100μg/L 스트렙토마이신으로 보충된 라이보비츠 L-15 배지에서 배양했다. TC1-DSG2를 HPV16 E6 및 E7를 발현시키는 TC1 세포, C57Bl/6 폐암 세포주로부터 유도했다 (36). TC1 세포는 인간 DSG2를 발현시키는 VSVG-위형(pseudotyped) 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다 (42). 인간 종양에서 보여지는 수준으로 인간 DSG2를 발현시켰던 클론은 생체내 연구를 위해 선택되었다.
아데노바이러스 . 야생형 Ad3의 전파, 메틸-3H 티미딘 라벨링, 정제 및 정량하기(titering)를 다른 곳에 기재된 바와 같이 수행했다 (37). Ad3-GFP는 E3 영역 내로 삽입되는 CMV-GFP 발현 카세트를 함유하는 야생형 Ad3-기반 벡터이다 (42). 바이러스 입자 (VP) 농도는 260 nm에서의 광학 밀도 (OD260)를 측정함으로써 분광광도법적으로 결정되었다. 플라크 형성 단위 (pfu)의 역가(titer)는 다른 곳에 기재된 바와 같이 293 세포를 사용하여 수행되었다 (29). VP 대 pfu 비는 모든 바이러스 제제에 대해 20:1이었다.
Ad3 노브 라이브러리. 마지막 2개의 샤프트 반복을 함유하는 Ad3 노브의 코딩 서열 (aa 108-319)은 프라이머 P1: 5' ATCACGGATCCGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTCTAACAAACTTTGCAGTAAACTC 3' (서열번호: 35) 및 P2: 5'CTCAGCTAATTAAGCTTAGTCATCTTCTCTAATATAGGA 3'(서열번호: 36)를 사용하여 Ad3 DNA로부터 PCR에 의해 수득되었고, 대장균에서의 발현을 위해 pQE30 (Qiagen, Valencia, CA) 내로 클로닝되었다. 수득한 플라스미드는 pQE-Ad3노브라고 지칭되었다. 랜덤 돌연변이유발 PCR은 다른 곳에 공개된 프로토콜을 토대로 수행되었다 (7, 8). 간단히 말하면, 20 펨토몰 pQE-Ad3노브 DNA 템플레이트, 30 펨토몰 (각각의) PCR 프라이머 (Pmut1: 5'- CCAATTCTATTGCACTTAAGAATAACACTTTATGGACAGGT -3' (서열번호: 37) 및 Pmut2: 5'- GTCCAAGCTCAGCTAATTAAGCTTAGTCATCTTC -3' (서열번호: 38), 2.5 μl, 3.5 μl, 5 μl 또는 10 μl의 10x 돌연변이유발 버퍼 (70 mM MgCl2, 500 mM KCl, 100 mM 트리스 (25℃에서 pH8.3), 및 0.1% (w/v) 젤라틴), 10 μl 5mM MnCl2, 10 μl dNTP 혼합물 (2 mM dGTP, 2 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dTTP) 및 5 유닛의 Taq 중합효소 (Promega, Madison, WI)를 100μl의 최종 용적으로 혼합했다. PCR 조건은 1 min 동안 94℃, 1 min 동안 45℃, 및 1 min 동안 72℃였다 (30 사이클). 돌연변이체 PCR 생성물 (섬유 노브 헤드의 해독틀에서 돌연변이만을 함유하는 615bp 길이)을 정제하고, 적절한 효소로 소화시키고, 플라스미드 pQE-Ad3노브 내로 클로닝했다. 랜덤 돌연변이유발 라이브러리의 품질 조절을 위해, 결찰 생성물을 대장균 M15 (Qiagen, Valencia, CA) 내로 형질전환시키고, 카나마이신 및 암피실린 플레이트 위에서 플레이팅하고, 50 콜로니를 서열분석을 위해 무작위로 채집했다.
Ad14 라이브러리: 마지막 2개의 샤프트 반복을 함유하는 Ad14p1 노브의 코딩 서열 (aa 108-323)은 프라이머 P1: 5' CATCACGGATCCGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTCTAATAAACTTTGTACCAAATTGGGAGAAGG 3' (서열번호: 39) 및 P2: 5' GCTAATTAAGCTTAGTCGTCTTCTCTGATGTAGTAAAAGG 3'(서열번호: 40)을 사용하여 Ad14p1 DNA로부터 PCR에 의해 수득되었고, 대장균에서의 발현을 위해 pQE30 (Qiagen, Valencia, CA) 내로 클로닝되었다. 수득한 플라스미드는 pQE-Ad14p1노브라고 지칭되었다. 랜덤 돌연변이유발 PCR은 PCR 프라이머 (Pmut1: 5'- AACACCCTGTGGACAGGAGTTAACCC -3' 및 Pmut2: 5'- CTCAGCTAATTAAGCTTAGTCGTC -3')를 사용하여 수행되었다. 돌연변이체 PCR 생성물 (섬유 노브 헤드의 해독틀에서 돌연변이만을 함유하는 594bp 길이)을 정제하고, 적절한 효소로 소화시키고, 플라스미드 pQE-Ad14p1노브 내로 클로닝했다. 랜덤 돌연변이유발 라이브러리의 품질 조절을 위해, 결찰 생성물을 대장균 M15 (Qiagen, Valencia, CA) 내로 형질전환시키고, 카나마이신 및 암피실린 플레이트 위에서 플레이팅하고, 50 콜로니를 서열분석을 위해 무작위로 채집했다.
콜로니 검정. Ad3 또는 Ad14p1 노브 돌연변이체 플라스미드 라이브러리를 XL1 블루 또는 M15 대장균 숙주 균주로 형질전환시키고 적절한 항생제, 즉 각각 Amp 또는 Amp+Kan을 포함한 LB 플레이트 위에서 플레이팅했다. 밤새 성장시킨 후, 0.45 μm 듀라포어 필터 막 (Millipore, Billerica, MA)을 콜로니의 상부에 놓았다. 상기 막을 벗겨내고, 위쪽으로 마주 대하는 콜로니와 함께, 항생제 및 1mM IPTG로 보충된 LB 배지에 잠겨있는 2개 시트의 3MM 종이 위에 주의 깊게 놓았다. 상기 콜로니의 단백질 발현을 30℃에서 6 시간 동안 유도하고, 그 후 콜로니를 지닌 필터를 원상태 세포용해 버퍼 {20 mM 트리스-Cl (pH8), 300 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0.1 mg/ml 리소자임, 0.75 mg/ml DNAse I, ½ 완전한 EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제/10ml (Roche, Palo Alto, CA)}에 잠겨있는 니트로셀룰로오스 필터 및 와트만 3MM 종이의 상부에 놓았다. "필터 샌드위치"를 실온에서 10 min 동안 인큐베이션하고 그 다음 -80℃에서 10 min 및 30℃에서 10 min 동안 4회 냉동-해동시켰다. 니트로셀룰로오스 막을 상기 샌드위치로부터 제거하고 4℃에서 밤새 TBST에서 3% BSA로 차단시켰다. 그 다음 블롯을 TBST/BSA에서 0.1 ng/ml의 재조합 DSG2 단백질 (Leinco, St.Louis, MO)로 인큐베이션하고, 그 다음 마우스 모노클로날 항-DSG2 항체 (Clone 6D8; SeroTec Ltd., Oxford, UK) 및 항-마우스 IgG 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 결합체로 인큐베이션했다. DSG2 결합이 없는 콜로니를 채취하고 3 ml LB 배지에서 밤새 배양했다. 단백질 발현은 5 시간 동안 1 mM IPTG로 유도되었고, 그 다음 박테리아를 펠렛화시키고, SDS 로딩 버퍼에 재현탁시키고 3회 동결/융해시켰다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로오스로 변형시키고 항-His 항체 (MCA1396, Sertec)로 인큐베이션하여 Ad 노브 삼량체화를 평가했다. DSG2에 대해 더 강한 결합을 갖는 돌연변이체에 대해 스크리닝하기 위해, Ad3 노브 돌연변이체 라이브러리를 M15 대장균 숙주 균주 내로 형질전환시켰다. 콜로니의 단백질 발현은 실온에서 단지 20 min 동안만 유도되었다. 가장 강한 DSG2 결합 신호를 보여주었던 콜로니를 채집했다.
웨스턴 블롯 : 4-15% 구배 폴리아크릴아미드를 갖는 Mini-PROTEAN 프리캐스트 겔 (BIO-RAD, Hercules, CA)을 사용했다. 2x 로딩 버퍼 (10 mM 트리스-HCl, pH6.8, 200 mM DTT, 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.2% 브로모페놀 블루)와 혼합된 총 1 g 단백질을 레인마다 로딩했다. 샘플을 5 분 동안 끓이거나 (B) 끓이지 않고 (UB) 로딩했다. 하기 작동 버퍼를 사용했다: 25mM 트리스, pH8.3, 0.192 M 글리신, 0.1% SDS. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로오스로 변형시키고 이전에 기재된 바와 같이 재조합 인간 DSG2 단백질 및 항-DSG2 항체로 인큐베이션했다 (42). 웨스턴 블롯을 ImageJ 1.32 소프트웨어 (미국 국립 보건원, Bethesda, MD)를 사용하여 스캐닝하고 정량화했다. JO-1 밴드 세기를 100%로 설정했다. MAP 키나아제 활성의 분석을 위해, 극성화된 T84 배양물을 얼음 위에서 20mM Hepes (pH 7.5), 2mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% TritonX100, 1mM PMSF, 200μM Na3VO4 및 프로테아제 억제제)에 용해시켰다. 초음파처리 후, 샘플을 펠렛화하고 상청액을 함유하는 단백질을 -80℃에서 보관했다. 15 g의 총 단백질을 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204)에 대한 mAb (Cell Signaling Danvers, MA) 또는 마우스 항-Erk1/2에 대한 mAb (Cell Signaling)와 함께 웨스턴 블롯팅을 위해 사용했다.
경쟁 검정. HeLa 세포를 Versene로 인큐베이션하여 배양 접시로부터 떼어내고 PBS로 세정했다. 튜브당 총 105 세포를 상이한 농도의 Ad3 섬유 노브 단백질을 함유하는 50 μl의 빙냉 접착 버퍼 (2 mM MgCl2, 1% FBS, 및 20 mM HEPES로 보강된 DMEM)에 재현탁시키고, 얼음 위에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 3H-표지된 야생형 Ad3 바이러스를 100 μl의 최종 용적이 되도록 세포당 8,000 바이러스 입자 (vp)의 감염다중도 (MOI)로 접착 버퍼에 부가했다. 얼음 위에서 1h 인큐베이션 후, 세포를 펠렛화하고 0.5 ml의 빙냉 PBS로 2회 세정했다. 마지막 세척 후, 상청액을 제거하고 세포-연관된 방사능을 섬광 계수기로 결정했다. 세포당 결합된 VP의 수를 비리온 특이 방사능 및 세포의 수를 사용하여 계산했다.
표면 플라즈몬 공명: 자료 수집을 BIAcore 3000 기기 상에서 수행했다. 2 mM CaCl2로 보강된 HBS-N (GE-Healthcare, Pittsburgh, PA)을 모든 실험에서 5 μl/min의 유속으로 작용 버퍼로서 사용했다. CM4 센서칩 (BIAcore) 위의 고정화는 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (EDC)/N-하이드록시석신이미드 (NHS) 활성화된 유동-세포 위에서 10 분 동안 주입된 10 mM 아세테이트 버퍼 pH 4.5에 희석된 10 μg/ml에서 DSG2를 사용하여 수행되었다. 대조군 유동-세포를 (EDC/NHS)로 활성화시키고 에탄올아민으로 불활성화시켰다. 상이한 농도의 Ad3 섬유 노브 단백질을 3 분 연합 시간에 이어서 2.5 분 해리 시간 동안 주입하고, 신호를 에탄올아민 탈활성화된 EDC-NHS 유동 세포의 배경에서 자동으로 배제했다. 동력학 및 친화도 상수를 BIAeval 소프트웨어를 사용하여 계산했다.
결정학: wtAd3 및 K217E/F224S 노브 돌연변이체에 대한 결정화 조건은 Hauptman Woodward 의학 연구소에서 High Throughput Screening Lab의 서비스를 사용한 것이었다. 회절 연구를 위해, wtAd3 및 K217E/F224S 노브 돌연변이체를 현적 (hanging drop) 방법을 사용하여 결정화시켰다. 결정은 TAPS 버퍼 0.1M pH9.0 중 1.65M MgSO4(7H20)의 저장소 용액 및 15mg/ml의 단백질 용액을 사용하여 성장시켰다. 결정을 85% 저장소 및 15% 글리세롤 (v/v)로 구성된 동결보호제를 사용하여 냉동시켰다. 데이타 수집은 EDNA 파이프라인을 사용하여 ESRF의 ID14-4 상에서 100K에서 수행되었다 (19). 데이타는 색인을 달고 XDS/XSCALE를 사용하여 스케일링되었으며(20, 21), 구조는 프로그램 PHASER를 사용하여 분자 재배치 (PDB 1H7Z)에 의해 해결되었다 (25). 모델은 각각 COOT (14) 및 PHENIX (2)를 사용하여 구축되고 정제되었다 (표 1). 도입부 "아데노바이러스 3 노브 도메인 K217E 및 F224S 돌연변이체의 구조"는 RCSB ID 코드 rcsb080687 및 PDB ID 코드 4LIY로 할당되었다.
표 1 데이타 수집 및 세분 통계.
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가장 높은-분해능 쉘에 대한 통계는 소괄호로 보여준다.
3D 구조: Pymol 소프트웨어가 구조를 분석하는데 사용되었다. Ad3 노브 도메인에서의 돌연변이 (pdb 1H7Z)를 자주색 등위면 상에서 상이한 색상을 사용하여 염색했다. Ad3 노브 돌연변이체 K217E/F224S의 단량체는 스틱으로 그려진 돌연변이와 함께 채색된 카툰으로 그려져 있고, 야생형 Ad3 섬유 노브의 회색 카툰 도면 위에 겹쳐져있다.
음성-균주 전자 현미경검사: 재조합 JO-2 단백질은 그의 어셈블리 상태를 평가하기 위하여 음성-균주 EM으로 가시화되었다. 표준 운모-탄소 제제는 0.1 mg/ml의 단백질과 함께 사용되었다. 샘플을 1% (wt/vol) 규텅스텐산나트륨 (pH 7.0)을 사용하여 염색하고 100 kV에서 JEOL-1200 전자현미경 상에서 가시화했다.
투과성 검정. 총 5x105 T84 세포를 12mm 트랜스웰 인서트 (PET 막, 0.4 μm 공극 크기를 가짐 (Corning, NY))에 시딩하고 상피관통 전기적 저항성 (TEER)이 안정할 때까지 >14 일 동안 배양했다. 배양 배지를 2-3일 마다 교체했다. 세포를 실온에서 15 min 동안 부착 배지 (DMEM, 1% FBS, 2 mM MgCl2, 20 mM HEPES) 중 DSG2 리간드 (20 μg/ml)에 노출시키고 TEER를 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정하고 계산했다 (39).
동물 연구: 동물을 수반하는 모든 실험은 워싱턴 대학에 의해 제시된 규격화된 지침에 따라서 수행되었다. 마우스는 특정-무병원체 시설에 수용되었다. 면역결핍 ( CB17 ) 마우스 [균주명: NOD.CB17-Prkdcscid/J]를 잭슨 실험실로부터 수득했다. 인간 DSG2 이식유전자 마우스는 90kb의 인간 DSG2 로커스를 함유하고 인간과 유사한 수준에서 유사한 패턴으로 hDSG2를 발현시킨다 (40).
A549, MDA-MB-231, 및 ovc316 이종이식 종양은 CB17 마우스의 유선 지방 패드 (매트리겔과의 1:1) 내로 상응하는 종양 세포의 주사로 도입되었다. TC1-DSG2 종양은 DSG2 이식유전자 마우스 내로 TC1-DSG2 세포의 피하 주사로 도입되었다. JO-0, JO-1, JO-2, 또는 JO-4는 하기 화학치료 약물의 적용 1 시간 전에 정맥내로 주입되었다: 이리노테칸/캄프토사르™ (Pfizer Inc., Groton, CT), 페길화된 리포좀 독소루비신/Lipodox™ (Sun Pharmaceuticals IN, India), 세툭시맙/어비툭스™ (ImClone, Somerville, NJ), 나노입자 알부민 접합된 파클리탁셀/아브락산™ (Abraxis Biosciences, Summit, NJ). 종양 용적을 매주 3회 측정했다. 각 처리 그룹은 최소 5 마리의 마우스로 이루어졌다. 상기 그룹 중 하나에서의 종양이 800 mm3의 용적에 도달하거나 종양이 궤양화된 것으로 나타날 때 동물을 희생시키고 실험을 종료했다.
항- JO4 항체: 인간 혈청 샘플에서 항-JO-4 항체 농도를 ELISA로 측정했다. 플레이트는 토끼 폴리클로날 항-Ad3 섬유 항체 (42), 그 다음 재조합 JO-4, 인간 혈청 샘플 (1:2 내지 1:1000 희석), 및 항-인간 IgG-HRP로 코팅될 것이다. 난소암 환자로부터의 혈청 샘플은 태평양 난소암 연구 컨소시엄에 의해 제공되었다.
3D 구조: Ad3 섬유 노브 (MMDB ID: 16945, PDB ID: 1H7Z (13))의 3D 구조를 가시화하기 위해 Pymol 소프트웨어를 사용했다.
통계적 분석: 모든 결과는 평균 +/- SD로 표현된다. 다중 시험을 위한 2-웨이 ANOVA를 적용했다. 동물 수 및 P 값은 도 범례에 명시된다.
결과
DSG2 결합에 중대한 잔기 . 본 발명자들은 우선 Ad3에 대한 작업에 집중했다.
DSG2에 대한 고-친화성 결합 및 차후의 상피 접합 개방은 비리온, PtDd, 또는 이량체화된 (삼량체) Ad3 섬유 노브 (예를 들면 JO-1)에 존재하는 공간 배치에서 몇 개의 삼량체 섬유 노브를 필요로 한다 (41). 2개의 샤프트 모티브를 갖지만, 이량체화 도메인이 없는 재조합 (삼량체) 섬유 노브 ("Ad3 노브 단량체")는 JO-1보다 덜한 차수의 크기의 친화도를 가지면서 DSG2에 결합하고, Ad3 감염을 차단할 수 없고, 접합부 개방을 촉발시키지 못한다 (37, 41, 42). 그러나 "Ad3 노브 단량체"의 친화도는 가용성 DSG2가 프로브로서 사용되는 웨스턴 블롯에서 결합을 검출하기에 충분히 높다. 따라서 본 발명자들은 DSG2 결합을 위해 중대한 Ad3 섬유 노브 내의 아미노산 잔기를 확인하기 위해 His-태그된 "Ad3 노브 단량체" 돌연변이체의 대장균 발현 라이브러리를 사용했다. 이러한 라이브러리를 산출하기 위해, 본 발명자들은 평균적으로 노브당 1 내지 2개의 아미노산 치환을 산출하는 프로토콜로 돌연변이유발 PCR (7, 8)을 이용했다. XL-1 블루 대장균에서 Ad3 섬유 노브 라이브러리를 한천평판 위에 플레이팅하고, 노브 발현을 IPTG로 유도하고, 콜로니를 재조합 DSG2 및 항-DSG2 항체를 사용하여 DSG2 결합에 대해 스크리닝했다. DSG2에 결합하지 않는 변이체에 대해 ~10,000 콜로니의 제 1 스크리닝 라운드로 240 후보 콜로니가 드러났다. 6xHis 태그에 대해 웨스턴 블롯으로 분석될 때, 240 콜로니 중 40 콜로니가 삼량체 섬유 노브의 발현을 보여주었고, 이것은 주요 형태적 변화의 부재를 명시한다. 잔여 변이체는 끝이 잘린 섬유 노브를 가지거나 삼량체를 형성하지 않았다. 상응하는 40 플라스미드를 시퀀싱했다. 대다수의 콜로니는 섬유 노브 내에서 단일 아미노산 치환을 가졌다. 노브당 다중 아미노산 치환에 직면하게 된다면, 개별적으로 상응하는 돌연변이를 함유하는 신규 Ad3 노브 게놈이 합성되었다. 추가 라운드의 콜로니 스크리닝은 다른 영역을 포괄하지 않았고, 이것은 모든 DSG2-상호작용 잔기가 발견되었음을 명시한다. 그 다음 총 8개의 독립적인 돌연변이체를 차후의 연구에 사용했다 (도 1A). 모든 차후의 연구를 위해, 본 발명자들은 Ad3 섬유 돌연변이체의 자가-이량체화된 형태를 산출했고 (도 1B) 이들을 NTA-Ni 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피로 정제했다. 정제된 이량체화된 노브 돌연변이체를 웨스턴 블롯에 의해 DSG2 결합에 대해 분석했다 (도 1C-F). 모든 돌연변이체는 JO-1 (즉 wtAd3 섬유 노브를 함유한 이량체화된 형태)과 비교할 때 결합이 심각하게 감소되었다. 돌연변이체 D261N 및 F265L은 DSG2 결합에 대해 거의 완전히 제거되었으며, 반면 다른 돌연변이체는 상이한 수준의 잔류 DSG2 결합을 가졌다 (wt Ad3 노브의 3.6% - 20%)(표 2, "웨스턴 블롯"). DSG2에 대한 Ad3 노브 결합에 중대한 확인된 잔기는 D-루프/D-베타 시트 (N186D, V189G, S190P), FG-루프/G-베타 시트 (D261N, F265L), 및 H-베타 시트/HI-루프 (L292A, L296R, E299V) 내의 Ad3 섬유 노브의 3개의 상이한 영역에 존재했다 (도 1A). Ad3 섬유 노브 (PDB 수납 번호 1H7Z_A)의 3D 모델에서, 모든 확인된 잔기는 섬유 노브의 윗쪽에 위치하고 노브에서 하나의 특정 홈이 뒤따랐다 (도 2). F265L을 제외하고, 모든 다른 치환은 상응하는 잔기의 전하에서 변화를 야기했음이 주목할만하다. 폴리아크릴아미드 겔(예를 들면 D261N에 대해)에서 이동 패턴의 차이는 치환이 형태적 변화를 야기했음을 명시한다. 본 발명자들은 현재 이들 돌연변이체의 3D 구조를 분석하기 위해 이들을 결정화하려고 시도중이다.
Ad3 섬유 노브, 및 결국 DSG2 결합이 최대로 제거된 Ad3 바이러스를 생성하기 위해, 본 발명자들은 3개의 확인된 영역에 다중 돌연변이, 구체적으로 N186D 및 D261N의 조합, D261N 및 L296R의 조합, 모든 3개의 N186D, D261N, 및 L296R의 조합을 도입했다. 예상대로 모든 3개의 중대 영역에서의 돌연변이의 조합이 최고 수준의 제거를 제공했다 (표 2,"웨스턴 블롯), 도 1F).
　 웨스턴 블롯
잔류 DSG2 결합
(wtAd3 노브 = 100%) * 		이량체 노브의 존재 하에 감염의 억제
(JO-1=100%) 		이량체 노브의 존재 하에 부착의 억제 (JO-1=100%)
N186D 5.3% 32.7 56.5
V189G 14 54 81
S190P 7.1 30.9 73.4
D261N 0 5.3 45
F265L 0 17.6 55.6
L296R 3.6 5.1 73.7
E299V 20 50.7 97.3
N186D , D261N 7.0 5.2 23.5
D261 , L296R 7.0 1.5 20.1
N186D , D261N , L296R 0 0 18.5
표 2: Ad3 섬유 돌연변이체의 분석. 제 2 세로열은 Ad3 노브 삼량체에 상응하는 웨스턴 블롯 밴드의 정량 분석을 보여준다. wt Ad3 섬유 노브의 세기는 100%로 간주되었다. 제3 세로열의 데이타는 Ad3-GFP 감염을 억제하는 이량체 Ad3 섬유 노브 돌연변이체의 능력을 반영한다 (참고 도 3B). 백분율이 더 높을수록, 억제가 더 강하다. JO-1 (이량체 wtAd3 노브)에 의한 억제는 100%로 간주된다. 제 4 세로열은 Ad3 바이러스 부착에 대한 상응하는 데이타를 보여준다. N=3. 평균하여 보여준다. 표준 편차는 10% 미만이었다.
최근에 부각된 병원체로서 이의 관련성 때문에, 본 발명자들은 또한 ("단량체") Ad14p1 섬유 노브 돌연변이체의 라이브러리를 생성하였다. 제 1 스크리닝으로 DSG2에 결합하지 않는 변이체에 대해 ~300 후보 콜로니가 드러났다. 6xHis 태그에 대해 웨스턴 블롯으로 분석될 때, 300 콜로니 중 45 콜로니가 삼량체 섬유 노브의 발현을 보여주었다. 이들 변이체의 서열분석으로 DSG2에 대한 결합이 감소된 15개의 독립적인 돌연변이체가 나타났다 (도 1A). 흥미롭게도, 상이한 베타 시트 분포에도 불구하고, Ad14p1 노브 결합에 대해 중대했던 아미노산 잔기가 Ad3 섬유 노브에 대해 확인되었던 동일한 3 영역에 존재했다. 이들 유사성으로 인해, 본 발명자들은 선택된 Ad3 섬유 노브 돌연변이체에 대해서만 추가 연구를 수행했다.
작용성 검증. 경쟁 연구는 DSG2를 발현시키는 HeLa 세포에서 수행되었다 (42). 우선 본 발명자들은 이량체 Ad3 섬유 노브를 갖는 세포의 예비-인큐베이션 후 3H-표지된 Ad3 바이러스의 부착을 연구했다 (도 3A). Ad3 바이러스 결합의 감소는 JO-1, 즉 야생형 Ad3 섬유 노브를 함유한 이량체 단백질과의 예비-인큐베이션과 비교했다. JO-1에 의한 결합의 억제는 100%로 간주되었다. 돌연변이체 L296R, D261N, 및 F265L은 Ad3 바이러스 결합을 가장 적게 차단했고 (5.1, 5.3, 및 17.6%), 그 다음 돌연변이체 S190P, N186D, 및 E299V (각각 30.9, 32.7, 및 50.7%의 결합 감소)였다 (표 2, "부착"). Ad3-GFP 벡터에 의해 HeLa 세포의 형질도입을 차단하는 이량체 Ad3 노브 돌연변이체의 능력을 측정하기 위해 유사한 검정 셋업을 사용했다. 형질도입은 GFP 발현을 토대로 측정되었다 (도 3B). 본 발명자들이 부착 연구에서 관측했던 것과 유사하게, Ad3-GFP 감염은 돌연변이체 D261N 및 F265L과의 예비-인큐베이션에 의해 최소로 감소되었고, 그 다음은 돌연변이체 N186D, S190P, L296R, 및 V189G였다. DSG2 결합 (웨스턴 블롯), 부착, 및 감염 경쟁 데이타를 종합하여, 본 발명자들은 잔기 261 내지 265를 함유하는 영역이 DSG2 결합에 가장 중요한 영역이라고 결론내렸다. 잔기 186-190 주변 영역도 또한 결합에 기여하지만, 잔기 299를 함유하는 영역은 결합과 미미하게 관련된 것으로 나타났다. 조합된 돌연변이를 갖는 이량체 Ad3 노브 돌연변이체도 또한 부착 (도 3C) 및 감염 (도 3D)을 위한 Ad3 바이러스와 경쟁하는 그의 능력에 대해 분석되었다. 모든 3개의 영역 (N185, D261, L296)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체는 심지어 200ug/ml의 농도에서도 Ad3 결합 또는 감염을 차단하지 않았으며, 이것은 DSG2 결합에 대해 거의 제거됨을 명시한다. 현저하게, 야생형 Ad3 섬유의 웨스턴 블롯에서 프로브로서 sCD46을 사용할 때, 특이적 결합이 관찰되지 않았다 (도 4). 이것은 Ad3만이 CD46에 비효율적으로 결합함을 명시한다.
감소된 DSG2 결합 및 상피 접합부를 개방하는 더 약한 능력의 상관관계. 이량체 Ad3 노브 돌연변이체의 접합부 개방 기능에 대한 간단한 검정은 트랜스웰 세포 배양시 상피 관통 전기적 저항성 (TEER)을 측정함을 토대로 한다. 상피 암 세포는, 주요 세포간 접합이 형성될 경우, TEER이 일정할 때까지 배양된다. 트랜스웰 배양물의 윗쪽에 1 시간 동안 JO-1의 부가는 TEER의 급속한 감소를 야기했고, 이것은 접합부의 개방을 명시한다 (도 5a). 돌연변이체 D261N과의 인큐베이션은 TEER에 어떠한 영향도 주지 않았다. N186D 및 E299V는 DSG2에 대한 상응하는 섬유 노브의 잔류 결합과 관련된 중간 효과를 가졌다. 이전의 연구에서, 본 발명자들은 또한 JO-1이 이종이식 종양의 상피 접합에서 변화를 유발하고 고분자량을 갖는 화학치료제, 예를 들면 이리노테칸의 항종양 효능을 증가시켰음을 확립했다. (이리노테칸은 586.7 Da의 분자량을 갖고 결장암 및 폐암을 치료하는데 사용된다). 본 발명자들은 생체내 이량체 Ad3 노브 돌연변이체의 기능을 평가하기 위해 이러한 효과를 사용했다 (도 5b). 본 발명자들이 시험관내 관찰했던 것과 유사하게, JO-1은 이리노테칸 요법을 증대시켰지만, DSG2 결합이 감소된 돌연변이체는 이리노테칸 효능에 대해 어떠한 유의미한 효과도 갖지 않았다.
친화도 증대된 이량체 Ad3 섬유 노브 . 상기에 개괄된 바와 같이, JO-1은 암 치료와 관련된다. 따라서 DSG2와 그의 상호작용의 구조적 세부사항을 더 잘 이해하고 DSG2에 대한 친화도가 증가된 JO-1 돌연변이체를 생성하는 것이 중요하다. 생물제제의 친화도 증대는 i) 생물제제의 효과적인 용량을 감소시키고, ii ) 생물제제의 반감기를 증가시키고, iii) 생물제제의 치료 효과를 잠재적으로 증가시키고, iv) 생물제제에 대해 환자에 의해 발생된 항체의 역효과 (예를 들면, 약동학에 대한 중화 또는 변화)를 피하는데 사용된다. 친화도가 증가된 JO-1 유사체를 제조하기 위해, 본 발명자들은 DSG2에 대한 결합이 증가된 변이체에 대해 JO-1 내에서 랜덤 돌연변이를 갖는 대장균 발현 라이브러리를 스크리닝했다. 플레이팅된 10,000 콜로니 중에서, 가장 강한 DSG2 신호를 갖는 20 콜로니를 채집하고 플라스미드 DNA를 시퀀싱했다. 1 또는 2 아미노산 치환을 갖는 7개의 상이한 돌연변이체를 확인했다: Y250F, K217E+F224S, N293S, V239D, F224L, E248G+K258E, 및 L277R+N293D. Ad3 섬유 노브의 일차 및 3D 구조에서 잔기의 위치는 도 6에서 보여준다. 현저하게, 대부분의 돌연변이는 EF 루프 내에서 위치되었고, 이것은 이 루프가 Ad3 및 DSG2 사이의 상호작용을 안정화시키는데 관련됨을 명시한다. V239 및 Y250은 노브 표면에 노출되지 않으며, 이것은 DSG2에 대한 직접적인 결합에 관여라기보다는 노브에서의 구조적 변화를 시사한다 (도 6B, 우측 패널). 그 다음 재조합 돌연변이체 이량체 Ad3 노브 단백질을 정제했다. DSG2에 대한 돌연변이체의 친화도를 측정하기 위해, 본 발명자들은 표면 플라즈몬 공명 연구를 수행했다. 이량체화 도메인을 함유한 노브에 의한 연구 결과는 복잡했고, 이것은 아마도 이들 돌연변이체가 다량체 복합체를 형성한다는 사실 때문일 것이다. 따라서, 본 발명자들은 이량체화 도메인이 결핍된 노브 단백질에 의한 연구를 수행했다 ("noDD"). 연합 속도 상수 (ka 또는 kon) 및 해리 속도 상수 (kd 또는 koff) 뿐만 아니라 wt Ad3 노브 및 모든 노브 돌연변이체의 KD는 도 7에서 보여준다. 이전의 연구 (41)에 따라서, 본 발명자들은 이량체화 도메인이 없는 wt Ad3 노브가 비교적 저친화도 (KD=10μM)로 DSG2에만 결합했음을 발견했다. 돌연변이체 L227R/noDD+N293D/noDD를 제외하고는, 콜로니 블롯 스크린에서 확인된 모든 돌연변이체는 DSG2에 대해 더 큰 친화도를 가졌다. 현저하게, 돌연변이체 Y250F/noDD 또는 V239D/noDD의 친화도는 wt Ad3노브/noDD의 것보다 885배 또는 405배 더 높았다. 상이한 돌연변이체의 높은 친화도는 해리 속도의 변화보다는 DSG2에 대한 더 빠른 연합에 주로 기인한 것이었다. 이러한 추세의 유일한 예외는 돌연변이체 N293S/noDD였으며, 이 돌연변이체에 대해서는 다른 돌연변이체와 비교할 때 연합 속도가 가장 낮았다. 그러나, 이것은 더 낮은 해리 속도에 의해 부분적으로 보상되었다. 이들 결과는 함께 DSG2에 대한 wt Ad3 노브 (noDD) 결합이 돌연변이 패널에 의해 개선될 수 있는 느린 연합 속도에 의해 주로 제한됨을 명시한다. 이들 돌연변이는 이러한 상호작용의 안정성을 변형시키는 것으로 나타나지 않지만, 수용체에 대해 리간드의 더 큰 친화도를 야기하는 연합 대 해리의 밸런스를 변형시키는 것으로 나타난다.
DSG2에 대한 결합을 증대시키는 구조적 요소를 더 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 돌연변이체 K217E/F224S에 대해 더 상세한 분석을 수행했다. 이량체화 도메인을 함유한 우라닐 아세테이트 염색된 K217E/F224S 섬유 노브에 의한 투과 전자 현미경검사는 이량체화된 삼량체 섬유를 나타내는 6개의 노브를 갖는 입자를 보여주었다 (도 8A, 두꺼운 화살표 및 도 8B). 흥미롭게도, 이들 조건 하에 섬유 노브는 또한 붕괴된 PtDd와 닮은 규칙적으로 형상화된 애로게이트(arrogate)(~30nm 직경을 갖는)를 형성했다(도 8A, 얇은 화살표 및 도 8C). 그 다음 본 발명자들은 원자 수준에서 K217E/F224S 돌연변이체의 구조를 분해하기 위해 x-선 결정학 연구를 수행했다 (도 8D-H). 예상대로, K217E/F224S 돌연변이체는 섬유 노브의 단일삼량체를 형성했다 (도 8E). 돌연변이체의 3D 구조는 야생형 Ad3 섬유 노브의 것과 겹쳐졌다 (도 8F-H). 이것은 K217E/F224S 돌연변이체에서의 EF 루프가 완전히 무질서했음을 나타냈다. 이 루프는 섬유 샤프트와의 접합시 노브 도메인의 기저에 있다. 따라서 K217E/F224S 돌연변이는 이 루프 영역의 가요성을 증가시킴으로써 더 쉽게 결합하게 할 수 있다.
상피 접합부를 개방시키는 더 강한 능력과의 증가된 친화도의 상관관계.
하기 연구를 위해 본 발명자들은 이량체화 도메인을 함유하는 Ad3 섬유 노브 형태를 사용했다. 선택된 고-친화도 돌연변이체를 분석하기 위해, 본 발명자들은 HeLa 세포에서의 Ad3-GFP 및 친화도 증대된 Ad3 섬유 돌연변이체의 이량체 형태와 경쟁 감염 연구를 수행했다 (도 9A). GFP 발현을 토대로 하여, 돌연변이체 L277R+N293D를 제외한 모든 이량체 돌연변이체는 JO-1보다 더 유의미하게 Ad3-GFP 감염을 억제했다. 현저하게, DSG2에 대해 친화도가 증가된 Ad3 섬유 노브의 비-이량체화 형태는 형질도입 연구에서 경쟁자로서 작용할 수 없었다 (도 9B). DSG2에 대한 더 높은 친화도는 트랜스웰 배양물에서 상피 접합부를 개방하는 능력의 증가를 야기했다 (도 9C). JO-1과 비교하여, 돌연변이체 V250F, V239D, 및 K217E+F224S와 인큐베이션된 배양물에서의 TEER이 유의미하게 더 높았다.
JO-1, Y293D 및 V250F의 친화도 증대된 버전 중 2개를 생체내 검정에서 분석했다. 본 발명자들은 각각 이들을 돌연변이체 JO-2 및 JO-4로 지칭했다. 제 1 연구는 도 5b에 대해 기재된 연구와 유사한 A549 세포에서 유도된 이종이식 모델에서 수행되었다. 도 10A는 친화도-증대된 돌연변이체 JO-2 및 JO-4가 JO-1보다 더 유의미하게 이리노테칸 요법을 증가시켰음을 보여준다 (27 일로부터 개시하여 p<0.05). 더욱이, JO-4 (Kd=11.4nM)는 JO-2 (Kd-24.9nM)보다 유의미하게 더 효율적이었고, 이것은 DSG2에 대한 친화도 및 치료 효과 사이의 상관관계를 명시한다. 추가의 연구는 ovc316 세포로부터 유도된 이종이식 종양에서 수행되었다 (30, 32). Ovc316 세포는 난소암 생검으로부터 유도된 Her2/neu 양성 상피 종양 세포이다. 이들 세포는 시험관내 및 생체내의 특정 조건 하에 EMT 및 반대 과정, 간엽세포의 상피세포로의 전이 (MET)를 겪을 수 있다. Nanog, CD133, 및 E-카드헤린에 대해 양성인 ovc316 세포의 소분획물을 암 줄기세포, 즉 만능 포텐셜 및 종양 형성 능력을 갖는 자가-재생 세포를 위해 농축시킨다 (30). 따라서 Ovc316 세포는 원위치에 종양에서 보여진 이종성 및 가소성을 밀접하게 모방한다. 난소암의 화학요법에 널리 사용되는 약물인 페길화된 리포좀 독소루비신 (PLD)의 주사 1 시간 전 2mg/kg의 용량으로 JO-1의 정맥내 주사는 치료 효율을 유의미하게 증가시켰다 (도 10B). 중요하게, 0.5mg/kg 용량에서 JO-4는 PLD 요법에 대해 더욱 더 큰 자극 효과를 나타냈다. 마지막으로, 본 발명자들은 삼중-음성 유방암 (TNBC)에 대한 모델에서 JO-4를 시험했다. TNBC는 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR)의 발현 부재 또는 최소 발현 및 Her2/neu 과발현의 부재로 특징지워진다. TNBC는 전체 유방암의 15%를 차지한다. 전체 생존은 다른 표현형을 지닌 환자의 전체 생존과 비교하여 좋지 못하다. TNBC의 특징적인 특징은 높은 수준의 DSG2 및 상피 접합이다. TNBS의 치료에서 유망한 임상 결과는 나노입자, 알부민-접합된 파클리탁셀 (nab-파클리탁셀/아브락산™)을 단독으로 EGFR-표적 mAb 세툭시맙/어비툭스™와 조합하여 달성했다 (38). 본 연구는 JO-4가 동소이식 TNBC 종양을 갖는 마우스 모델에서 nab-파클리탁셀/세툭시맙 요법을 유의미하게 증가시켰음을 보여주었다 (도 10C). JO-4의 치료적 관련성으로 인해, 본 발명자들은 적절한 마우스 종양 모델에서 JO-4를 추가로 연구했다. Ad3 바이러스 및 Ad3 섬유 노브 유도체가 마우스 세포 및 조직에 결합하지 않기 때문에, 본 발명자들은 인간과 유사한 패턴으로 유사한 수준에서 인간 DSG2를 발현시키는 인간 이식유전자 마우스를 사용했다 (40). 이들 마우스는 동계의 TC1-hDSG 종양으로 피하로 이식되었다. 종양이 ~600mm3의 용적에 도달하면, 안전성 및 효능 연구를 위해 JO-1 또는 JO-4를 정맥내로 주입했다. JO-1 및 JO-4 혈청 농도는 주사 후 1 시간 이내에 10배 초과로 감소했으며, 이로써 상기 감소는 JO-4에 대해 유의미하게 더 컸다 (주사 후 1 시간 동안 p<0.01)(도 11A). 주사 후 1 시간 후 JO-1 및 JO-4 농도는 ~100ng/ml로 안정기에 도달했다. 본 발명자들은 또한 정맥내 JO-1 및 JO-4 주사 후 혈액 파라미터를 분석했다. 혈액 화학은 비정상적 변화를 보여주지 않았다. 혈구수는 주사 후 초기에 줄어들었던 림프구 및 혈소판 수를 제외하고는 정상이었다 (도 11B). 림프구 및 혈소판 수는 JO-4에 대해 유의미하게 더 낮은 수로 24 시간 p.i.에서 바닥에 도달했다 (p<0.01). 흥미롭게도 림프구 및 혈소판 수는 JO-1 처리된 동물에서보다 JO-4 주입된 마우스에서 더 빠르게 정상 수준으로 복귀했다.
JO-1 및 JO-4는 바이러스-유도된 단백질이고 면역원성이다. 면역적격 마우스에서, 이들 단백질에 대한 혈청 IgG 항체는 주사 2 주 후 ELISA로 검출될 수 있다 (5). 치료 단백질의 친화도 증대를 위한 이론적 전제 중 하나는 치료 단백질이 혈청 항체의 중화를 피한다는 점이다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 TC1-hDSG2 종양을 갖는 면역적격 hDSG2 마우스 종양 모델에서 JO-1 및 JO-4의 반복된 주사를 수행했다 (도 11C). JO-1 및 PLD의 2회 처리 사이클 후, 처리를 멈추고 종양을 재성장시켰다. 제 3 및 제 4 처리 사이클을 각각 28 일 및 35 일에 개시했다. 제 3 사이클시, 혈청 항-JO-1 항체는 ELISA로 검출가능했다. 중요하게, 제 3 및 제 3 처리 사이클 모두에서, JO-1 및 JO-4는 PLD 요법에 대해 개선 효과를 나타냈고, 이로써 개선 효과는 JO-4에 대해 유의미하게 더 강했다.
종합하여, 친화도-증대된 이량체 Ad3 섬유 돌연변이체에 의한 본 작용성 연구는 DSG2 친화도 및 상피 접합부 개방/치료 효과 사이의 상관관계를 실증한다.
논의
DSG2 에 대한 Ad3 노브 결합과 관련된 잔기 . CAR 및 CD46과의 Ad 상호작용과 달리(4, 28), DSG2 상호작용과 함께 Ad 상호작용에 대한 구조적 세부사항은 여전히 이해하기 어렵다. Ad3 섬유 노브의 결정 구조가 해결되었더라도, DSG2에 대해, 4개의 세포외 도메인 (ECD)의 가장 원위 만의 3D 구조가 이용가능하다 (MMDB ID: 59843). 그러나, 상이한 DSG2 도메인에 대한 모노클로날 항체를 사용한 본 발명자들의 이전의 경쟁 연구는 ECD 3 및 4가 Ad3에 대한 결합에 연관된다고 명시했다 (42). 이 연구에서 본 발명자들은 DSG2에 대한 결합에 중대한 Ad3 섬유 노브 내의 아미노산 잔기를 확인하기 위해 돌연변이유발-기반 분석을 사용했다. DSG2의 돌연변이유발 분석은, 대장균에서 발현될 때, 단백질이 Ad3에 결합하지 않았기 때문에 가능하지 않았으며, 이것은 DSG2 내의 활성 Ad3 결합 부위를 생성시키기 위해 번역후 처리가 필요함을 명시한다 (데이타는 도시되지 않음). DSG2에 대한 Ad3 노브 결합에 중대한, 확인된 잔기는 Ad3 섬유 노브의 3개의 상이한 영역에 존재하며, 수용체와 마주 대하는, 섬유 노브의 원위 말단에서의 홈에서 위치된 포텐셜 결합 포켓을 형성했다. 현저하게, CAR 또는 CD46에 대한 다른 Ad 혈청형의 결합은 상응하는 섬유 노브의 측면 또는 기저면에서의 영역을 주로 포함한다 (27, 43). 본 데이타는 Ad3이 상이한 결합 전략을 이용함을 명시한다. 본 발명자들은 이량체 Ad3 섬유 노브 및 DSG2에 의한 결정학 연구를 현재 수행하고 있다. 다량체 Ad3 섬유 노브가 몇 개의 DSG2 분자를 밀집시킨다는 점을 고려할 때 (41), 이러한 복합체의 3D 구조는 복잡할 것으로 기대된다. DSG2에 대한 Ad3 섬유 노브 결합에 중대한 잔기가 또한 DSG2에 대한 다른 종 B Ads의 결합에 연관될 것인지 여부는 아직 연구되지 않았다. 현저하게, D261, F265, 및 E299는 모든 4개의 DSG2-상호작용 Ad (Ad3, 7, 11, 14)에서 보존되더라도, 다른 중요 잔기 (N186, V189, L296)는 이들 혈청형 사이에서 상이하다 (도 12).
Ad14는 신규 균주 (Ad14p1)의 최근 출현으로 인해 중요한 연구 대상이다. 미국에서 이전에 문서로 기록된 적이 없기 때문에, Ad14p1은 몇 개의 미국 군인-신병 훈련 센터에서 일상적인 감시 동안 2006년 3월 및 4월에 처음 보고되었다 (26). 후년의 3월 - 6월 동안, 확인된 HAdV-B14p1 호흡기 병 중 총 140회의 추가 사례가 오레곤주, 워싱턴주 및 텍사스주의 환자에서 보고되었다 (3). 집중 관리 시설에 입원된 17%를 포함하는, 이들 환자 중 38 퍼센트가 입원했으며; 환자 중 5%가 사망했다. HAdV-B14p1의 발발은 차후에 다른 5개의 베이스 및 워싱턴주 (1) , 오레곤주 (23) , 알래스카주 (15) , 위스콘신주, 및 펜실베이니아주 (10, 22) 뿐만 아니라 캐나다 (16), 중국 (33) 및 한국 (34)에서의 민간인 모집단에서 검출되었다. 이 시점에, Ad14p1의 고 병원성 및/또는 발병력에 대한 분자적 기초는 불확실하다. 본 발명자들은 DSG2에 대한 Ad14p1 결합을 위한 구조적 요소를 상세히 설명하려고 시도했다. Ad14p1의 베타 시트 분포는 Ad3의 것과 상이하다 (도 1A). 따라서, CD46-상호작용 혈청형 (11, 12)과 유사하게, DSG2-상호작용 Ad는 DSG2에 대한 그의 결합 전력에서 가변적일 수 있으며, 이것은 상이한 DSG2 결합 영역을 야기할 수 있다. 그러나, Ad14p1 섬유 노브 돌연변이체 라이브러리의 스크리닝은 이 가설을 지지하지 않는다. DSG2 결합에 연관된 영역은 Ad3 및 Ad14p1 섬유 노브에 대해 본질적으로 동일했다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들의 조사결과는 Ad14p1 바이러스혈증의 치료, 구체적으로 Ad14p1 억제제, 또는 혈액 순환 또는 기도에 존재하는 바이러스의 옵소닌화를 촉발시킬 수 있는 고 친화성 유인물의 생산을 위해 관련된다.
DSG2 이외에, Ad3은 DSG2가 부재한 경우 세포를 감염시키는 수용체로서 CD46을 사용할 수 있다고 보고되었다 (35). 이전에, 본 발명자들은 극성화된 정상 상피 세포에서 DSG2는 단단한 접합부에 포획되어 윗쪽으로부터 접근가능하지 않으며, 반면 CD46은 양쪽 막 측면에 존재함을 발견했다 (42). 따라서 본 발명자들은 CD46이 Ad3에 대해 비교적 비효율적인 진입 수용체로서 작용할 수 있고, 반면 새롭게(de novo) 생산된 Ad3 및 Ad3 펜톤-12면체는 DSG2와 상호작용하고, 상피 접합부를 개방하고 Ad3의 효율적인 측면 확산 및 더 깊은 조직 층들 및 혈액 순환 내로의 침투를 가능하게 한다고 추측한다. 각각 DSG2 및 CD46 결합에 중대한 Ad3 노브 잔기를 개별적으로 제거하는 능력은 그것이 이 가설을 입증할 수 있어야만 할 것이다.
친화도-증대된 섬유 노브 . DSG2에 대해 친화도가 증가했던 대부분의 돌연변이는 EF 루프 내에서 위치되었고, 이것은 Ad3 및 DSG2 사이의 상호작용을 안정화시키는데 연관됨을 명시한다. 흥미롭게도, Ad7, 11, 및 14와 달리, Ad3 섬유 노브는 이 영역에서 2개의 추가 잔기 (VL)에 이어서 프롤린을 갖는다. 따라서 이 루프는 추가로 확장될 수 있고 프롤린은 수용체와의 더 나은 상호작용을 가능하게 할 수 있는 방식으로 배향할 수 있었다. 원자 수준에서 이들 돌연변이체 중 하나의 3D 구조의 분석은 이 결론을 지지한다. 이들 연구는 도입된 돌연변이가 루프를 더 가요성이게 만들고, 이것은 DSG2와의 상호작용을 용이하게 할 수 있음을 명시한다.
wt Ad3 노브보다 더 높은 친화도를 갖는 Ad3 노브의 확인은 Ad3-매개된 유전자 치료에 대해 밀접한 관계를 갖는다. 최근에, Ad3을 토대로 한 유전자 전달 벡터는 임상시험에서 암 치료에 대한 가능성을 보여주었다 (18). 이론적으로, 친화성 증대된 Ad3 벡터는 더 낮은 용량에서 사용될 수 있고 중화 항체를 능가할 수 있었다. 최근에, 생체내 표적 세포 감염의 효능 및 특이성을 증가시키기 위하여 홍역 바이러스 (17) 및 Ad5-기반 벡터 (3, 9, 45) 내로 고 친화도 리간드를 혼입시키려는 시도가 진행되었다. 이 연구에서의 조사결과를 토대로 하여, 이제 유사한 전략이 Ad3 벡터에 대해 추구될 수 있다.
Ad3 벡터의 개선 외에도, JO-1의 친화도-증대 버전은 번역 관련성을 갖는다. 대부분의 고형 종양은 상피 기원이고, 악성 세포가 탈분화되더라도, 이들은 원발성 종양 뿐만 아니라 전이성 병변 둘 모두에서 세포간 접합, 상피 세포의 주요 특징을 유지한다 (5, 31). 이들 세포간 접합은 숙주 면역계에 의한 공격에 대한 보호 기전을 나타내고 모노클로날 항체 및 화학요법 약물을 포함하는 암 치료제의 종양내 침투 및 전파를 방지하는 물리적 차단을 제기한다 (5, 31). 이종이식 또는 동계의 DSG2 이식유전자 종양을 갖는 마우스 내로 정맥내로 주입될 때, JO-1은 다양한 화학요법 약물 뿐만 아니라 모노클로날 항체로의 치료 효과를 현저하게 증대시켰다 (5, 6). 이 연구에서, 본 발명자들은 JO-1의 신규 친화도-증대 버전 (예를 들면 JO-4)이 4개의 종양 모델 (A549, ovc316, MDA-MB231, 및 TC1-DSG2)에서 JO-1 (이리노테칸, nab-파클리탁셀, 페길화된 리포좀 독소루비신, 세툭시맙)보다 더 유의미하게 암 치료제의 효능을 증가시켰음을 보여준다. 동계의 종양을 갖는 DSG2 이식유전자 마우스에서의 연구는 혈청 JO-4 수준이 조직에서 DSG2에 대한 결합으로 인해 아마도 빠르게 감소함을 보여주었다. 이전의 연구는, 종양 이외에, hDSG2 이식유전자의 림프구 및 혈소판이 (인간 및 원숭이와 유사한) hDSG2를 발현시킴을 보여주었다 (40, 42). 이러한 입장에 따라 본 발명자들은 JO-4 주사가 림프구 및 혈소판 수의 일시적 감소를 야기함을 발견했다.
인간의 대략 1/3이 Ad3에 대한 중화 항체를 갖고 있다는 사실에도 불구하고 (42), 난소암 환자로부터의 혈청을 이용한 최근 연구에서, 본 발명자들은 환자 중 단지 10% (N=38)에서만 JO-4에 대한 검출가능한 (결합) 항체를 발견했다 (도 13). 그러나, 정맥내로 투여된 JO-4에 대한 적응성 면역 반응은 특히 반복된 주사 후에 인간에서 발달될 것임이 분명하다. 그러나 이 문맥에서 면역적격 마우스 내로의 주사 후 발생된 항-JO-4 항체가 JO-4의 기능을 중대하게 억제하지 않는 것으로 나타났다는 것은 주목할만하다. 도 11C에서 보여주는 데이타는 JO-1 및 JO-4가 심지어 검출가능한 항체의 존재 하에서도 다중 처리 사이클 후 계속 효과적임을 실증한다. 반복된 주사 후 치료 효과가 JO-4에 대해 유의미하게 더 크기 때문에, 본 발명자들은 JO-4가 접합 개방에서 뿐만 아니라 접합 개방제 및 혈청 항체 사이의 복합체를 붕괴시키는데 있어서 더 강하다고 추측한다.
요약하면, 본 연구는 DSG2에 대한 Ad3 및 Ad14p1 섬유 노브 결합의 중요한 구조적 세부사항을 밝혀냈다. 더욱이 그것은 DSG2에 대한 Ad3-섬유 노브의 친화도 및 상피 접합에 대한 차후의 효과 사이의 상관관계를 보여준다. 마지막으로, 친화성-증대된 재조합 이량체 Ad3 섬유 노브의 발생은 암 치료에 대해 밀접한 관계를 갖는다.
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<222> (110) <223> Xaa is N or P <220> <221> VARIANT <222> (111) <223> Xaa is N, D or V <220> <221> VARIANT <222> (112) <223> Xaa is N or A <220> <221> VARIANT <222> (113) <223> Xaa is S or G <220> <221> VARIANT <222> (114) <223> Xaa is R or T <220> <221> VARIANT <222> (115) <223> Xaa is E or H <220> <221> VARIANT <222> (116) <223> Xaa is N, K or absent <220> <221> VARIANT <222> (117) <223> Xaa is E, G or absent <220> <221> VARIANT <222> (119) <223> Xaa is Y or F <220> <221> VARIANT <222> (121) <223> Xaa is Y or F <220> <221> VARIANT <222> (123) <223> Xaa is T or Q <220> <221> VARIANT <222> (125) <223> Xaa is H or Y <220> <221> VARIANT <222> (127) <223> Xaa is T, K or E <220> <221> VARIANT <222> (131) <223> Xaa is H, G or R <220> <221> VARIANT <222> (132) <223> Xaa is T or A <220> <221> VARIANT <222> (133) <223> Xaa is L or A <220> <221> VARIANT <222> (136) <223> Xaa is L or I <220> <221> VARIANT <222> (137) <223> Xaa is D or E <220> <221> VARIANT <222> (138) <223> Xaa is I or V <220> <221> VARIANT <222> (139) <223> Xaa is S or T <220> <221> VARIANT <222> (144) <223> Xaa is Q, R or K <220> <221> VARIANT <222> (146) <223> Xaa is A or L <220> <221> VARIANT <222> (147) <223> Xaa is I, P or L <220> <221> VARIANT <222> (148) <223> Xaa is R, N or D <220> <221> VARIANT <222> (149) <223> Xaa is A, S, N or D <220> <221> VARIANT <222> (150) <223> Xaa is D, E, or R <220> <221> VARIANT <222> (154) <223> Xaa is C or V <220> <221> VARIANT <222> (155) <223> Xaa is I or M <220> <221> VARIANT <222> (156) <223> Xaa is R or T <220> <221> VARIANT <222> (157) <223> Xaa is I, V or F <220> <221> VARIANT <222> (158) <223> Xaa is T or L <220> <221> VARIANT <222> (161) <223> Xaa is W or L <220> <221> VARIANT <222> (162) <223> Xaa is N or S <220> <221> VARIANT <222> (163) <223> Xaa is T or A <220> <221> VARIANT <222> (165) <223> Xaa is D, L or V <220> <221> VARIANT <222> (170) <223> Xaa is S or T <220> <221> VARIANT <222> (171) <223> Xaa is A or Q <220> <221> VARIANT <222> (172) <223> Xaa is A or T <220> <221> VARIANT <222> (175) <223> Xaa is V or I <220> <221> VARIANT <222> (182) <223> Xaa is Y or S <400> 2 Thr Leu Trp Thr Gly Xaa Xaa Pro Xaa Ala Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Lys Leu Xaa Leu Xaa Leu Val Lys Xaa 20 25 30 Gly Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Asn Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Leu 50 55 60 Xaa Phe Asp Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ser Ser Leu Lys 65 70 75 80 Thr Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ala Xaa 85 90 95 Xaa Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Ile Xaa Gly Xaa Cys Xaa Tyr Xaa Ala 115 120 125 Ser Asp Xaa Xaa Xaa Phe Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Val Met Leu Asn Xaa 130 135 140 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ser 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Pro Glu Thr Xaa Xaa Xaa Thr Leu Xaa Thr 165 170 175 Ser Pro Phe Thr Phe Xaa Tyr Ile Arg Glu Asp Asp 180 185 <210> 3 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa is V or P <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa is N or K <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa is E or R <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Xaa is Q or I <220> <221> VARIANT <222> (14) <223> Xaa is M or I <220> <221> VARIANT <222> (15) <223> Xaa is M or E <220> <221> VARIANT <222> (16) <223> Xaa is Y, A, N or D <220> <221> VARIANT <222> (17) <223> Xaa is S or G <220> <221> VARIANT <222> (18) <223> Xaa is S or K <220> <221> VARIANT <222> (19) <223> Xaa is E or Q <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa is S or N <220> <221> VARIANT <222> (21) <223> Xaa is P or N <220> <221> VARIANT <222> (23) <223> Xaa is C or S <220> <221> VARIANT <222> (26) <223> Xaa is I or T <220> <221> VARIANT <222> (28) <223> Xaa is I or T <220> <221> VARIANT <222> (32) <223> Xaa is N or T <220> <221> VARIANT <222> (34) <223> Xaa is A or G <220> <221> VARIANT <222> (35) <223> Xaa is L or I <220> <221> VARIANT <222> (37) <223> Xaa is T or N <220> <221> VARIANT <222> (38) <223> Xaa is A or G <220> <221> VARIANT <222> (39) <223> Xaa is F or Y <220> <221> VARIANT <222> (41) <223> Xaa is T or Y <220> <221> VARIANT <222> (42) <223> Xaa is V or L <220> <221> VARIANT <222> (43) <223> Xaa is I or M <220> <221> VARIANT <222> (45) <223> Xaa is V or A <220> <221> VARIANT <222> (47) <223> Xaa is N or D <220> <221> VARIANT <222> (48) <223> Xaa is N, Y or D <220> <221> VARIANT <222> (49) <223> Xaa is F or V <220> <221> VARIANT <222> (51) <223> Xaa is M or T <220> <221> VARIANT <222> (53) <223> Xaa is F or T <220> <221> VARIANT <222> (54) <223> Xaa is K or T <220> <221> VARIANT <222> (55) <223> Xaa is Y, H or N <220> <221> VARIANT <222> (56) <223> Xaa is R or K <220> <221> VARIANT <222> (58) <223> Xaa is I or V <220> <221> VARIANT <222> (59) <223> Xaa is N or S <220> <221> VARIANT <222> (60) <223> Xaa is F or I <220> <221> VARIANT <222> (61) <223> Xaa is T or N <220> <221> VARIANT <222> (62) <223> Xaa is A or V <220> <221> VARIANT <222> (65) <223> Xaa is F or Y <220> <221> VARIANT <222> (68) <223> Xaa is A or S <220> <221> VARIANT <222> (69) <223> Xaa is A or T <220> <221> VARIANT <222> (71) <223> Xaa is N or H <220> <221> VARIANT <222> (72) <223> Xaa is L or I <220> <221> VARIANT <222> (74) <223> Xaa is T or P <220> <221> VARIANT <222> (75) <223> Xaa is S, R or D <220> <221> VARIANT <222> (76) <223> Xaa is L or S <220> <221> VARIANT <222> (82) <223> Xaa is P or D <220> <221> VARIANT <222> (84) <223> Xaa is N or E <220> <221> VARIANT <222> (85) <223> Xaa is H, L or P <220> <221> VARIANT <222> (86) <223> Xaa is K or E <220> <221> VARIANT <222> (87) <223> Xaa is S or Y <220> <221> VARIANT <222> (88) <223> Xaa is G or K <220> <221> VARIANT <222> (90) <223> Xaa is N or T <220> <221> VARIANT <222> (92) <223> Xaa is I, L or D <220> <221> VARIANT <222> (93) <223> Xaa is T, F, S, or L <220> <221> VARIANT <222> (94) <223> Xaa is N or S <220> <221> VARIANT <222> (96) <223> Xaa is K or R <220> <221> VARIANT <222> (97) <223> Xaa is S or G <220> <221> VARIANT <222> (108) <223> Xaa is V, D or absent <220> <221> VARIANT <222> (110) <223> Xaa is N or P <220> <221> VARIANT <222> (111) <223> Xaa is N, D or V <220> <221> VARIANT <222> (112) <223> Xaa is N or A <220> <221> VARIANT <222> (113) <223> Xaa is S or G <220> <221> VARIANT <222> (114) <223> Xaa is R or T <220> <221> VARIANT <222> (115) <223> Xaa is E or H <220> <221> VARIANT <222> (116) <223> Xaa is N, K or absent <220> <221> VARIANT <222> (117) <223> Xaa is E, G or absent <220> <221> VARIANT <222> (119) <223> Xaa is Y or F <220> <221> VARIANT <222> (121) <223> Xaa is Y or F <220> <221> VARIANT <222> (123) <223> Xaa is T or Q <220> <221> VARIANT <222> (125) <223> Xaa is Y or H <220> <221> VARIANT <222> (127) <223> Xaa is T, K or E <220> <221> VARIANT <222> (131) <223> Xaa is H, G or R <220> <221> VARIANT <222> (132) <223> Xaa is T or A <220> <221> VARIANT <222> (133) <223> Xaa is L or A <220> <221> VARIANT <222> (136) <223> Xaa is L or I <220> <221> VARIANT <222> (137) <223> Xaa is D or E <220> <221> VARIANT <222> (138) <223> Xaa is I or V <220> <221> VARIANT <222> (139) <223> Xaa is S or T <220> <221> VARIANT <222> (144) <223> Xaa is Q, R, or K <220> <221> VARIANT <222> (146) <223> Xaa is A or L <220> <221> VARIANT <222> (147) <223> Xaa is I, P or L <220> <221> VARIANT <222> (148) <223> Xaa is R, N or D <220> <221> VARIANT <222> (149) <223> Xaa is A, S, N or D <220> <221> VARIANT <222> (150) <223> Xaa is E, R or D <220> <221> VARIANT <222> (154) <223> Xaa is C or V <220> <221> VARIANT <222> (155) <223> Xaa is I or M <220> <221> VARIANT <222> (156) <223> Xaa is R or T <220> <221> VARIANT <222> (157) <223> Xaa is I, V or F <220> <221> VARIANT <222> (158) <223> Xaa is T or L <220> <221> VARIANT <222> (161) <223> Xaa is W or L <220> <221> VARIANT <222> (162) <223> Xaa is N or S <220> <221> VARIANT <222> (163) <223> Xaa is T or A <220> <221> VARIANT <222> (165) <223> Xaa is D, L or V <220> <221> VARIANT <222> (170) <223> Xaa is S or T <220> <221> VARIANT <222> (171) <223> Xaa is A or Q <220> <221> VARIANT <222> (172) <223> Xaa is A or T <220> <221> VARIANT <222> (175) <223> Xaa is V or I <220> <221> VARIANT <222> (182) <223> Xaa is Y or S <400> 3 Thr Leu Trp Thr Gly Xaa Xaa Pro Xaa Ala Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Lys Leu Xaa Leu Xaa Leu Val Lys Xaa 20 25 30 Gly Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Asn Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Leu 50 55 60 Xaa Phe Asp Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ser Ser Leu Lys 65 70 75 80 Thr Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ala Xaa 85 90 95 Xaa Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Ile Xaa Gly Xaa Cys Xaa Tyr Xaa Ala 115 120 125 Ser Asp Xaa Xaa Xaa Phe Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Val Met Leu Asn Xaa 130 135 140 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ser 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 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130 135 140 Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser 145 150 155 160 Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr 165 170 175 Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp 180 185 <210> 10 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr 1 5 10 15 Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn 20 25 30 Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr 35 40 45 Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu 50 55 60 Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp Ser Ser Ser Leu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Leu Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Leu Ser Ala Arg 85 90 95 Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Val Leu Pro Asn Ala 100 105 110 Gly Thr His Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala 115 120 125 Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr Val Met Leu Asn Lys 130 135 140 Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser 145 150 155 160 Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr 165 170 175 Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp 180 185 <210> 11 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr 1 5 10 15 Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn 20 25 30 Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr 35 40 45 Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu 50 55 60 Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp Ser Ser Ser Leu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Leu Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Phe Ser Ala Arg 85 90 95 Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Val Leu Pro Asn Ala 100 105 110 Gly Thr His Asn Gly Asn Tyr Ile Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Glu Ala 115 120 125 Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr Val Met Leu Asn Lys 130 135 140 Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser 145 150 155 160 Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr 165 170 175 Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp 180 185 <210> 12 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa is T or S <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Xaa is L or V <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa is T or N <220> <221> VARIANT <222> (14) <223> Xaa is T or A <220> <221> VARIANT <222> (15) <223> Xaa is G or S <220> <221> VARIANT <222> (24) <223> Xaa is G or S <220> <221> VARIANT <222> (30) <223> Xaa is D or T <220> <221> VARIANT <222> (32) <223> Xaa is D or N <220> <221> VARIANT <222> (34) <223> Xaa is T, F or S <220> <221> VARIANT <222> (36) <223> Xaa is Q, K or E <220> <221> VARIANT <222> (40) <223> Xaa is G, K or S <220> <221> VARIANT <222> (41) <223> Xaa is A or V <220> <221> VARIANT <222> (42) <223> Xaa is T or N <220> <221> VARIANT <222> (46) <223> Xaa is T or V <220> <221> VARIANT <222> (48) <223> Xaa is T or S <220> <221> VARIANT <222> (49) <223> Xaa is G or N <220> <221> VARIANT <222> (53) <223> Xaa is G or N <220> <221> VARIANT <222> (55) <223> Xaa is S or P <220> <221> VARIANT <222> (56) <223> Xaa is L or I <220> <221> VARIANT <222> (58) <223> Xaa is A, P or N <220> <221> VARIANT <222> (61) <223> Xaa is G or Q <220> <221> VARIANT <222> (62) <223> Xaa is T or I <220> <221> VARIANT <222> (63) <223> Xaa is D or E <220> <221> VARIANT <222> (64) <223> Xaa is Q or E <220> <221> VARIANT <222> (69) <223> Xaa is T, S or A <220> <221> VARIANT <222> (73) <223> Xaa is E, Q or N <220> <221> VARIANT <222> (78) <223> Xaa is N or D <220> <221> VARIANT <222> (80) <223> Xaa is N or S <220> <221> VARIANT <222> (82) <223> Xaa is I or S <220> <221> VARIANT <222> (83) <223> Xaa is I or C <220> <221> VARIANT <222> (84) <223> Xaa is I or A <220> <221> VARIANT <222> (85) <223> Xaa is D, N or L <220> <221> VARIANT <222> (86) <223> Xaa is D or K <220> <221> VARIANT <222> (88) <223> Xaa is I or absent <400> 12 Gly Val Leu Xaa Leu Lys Cys Xaa Xaa Pro Leu Thr Thr Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Ser Leu 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Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr 195 200 205 Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met 210 215 220 Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp 245 250 255 Asp <210> 29 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Lys Val Ser Ala 1 5 10 15 Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys 20 25 30 Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ile 50 55 60 Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn 65 70 75 80 Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu 85 90 95 Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met 100 105 110 Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser 115 120 125 Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp 130 135 140 Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Glu Leu Glu Tyr Lys Gln Thr Ala 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe 165 170 175 Val Leu Pro Asn Ala Gly Thr His Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln 180 185 190 Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr 195 200 205 Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met 210 215 220 Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp 245 250 255 Asp <210> 30 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Lys Val Ser Ala 1 5 10 15 Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys 20 25 30 Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ile 50 55 60 Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn 65 70 75 80 Cys Ile Ile 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Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys 20 25 30 Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ile 50 55 60 Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn 65 70 75 80 Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu 85 90 95 Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met 100 105 110 Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser 115 120 125 Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp 130 135 140 Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala 145 150 155 160 Asp Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe 165 170 175 Asp Leu Pro Asn Ala Gly Thr His Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln 180 185 190 Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr 195 200 205 Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met 210 215 220 Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp 245 250 255 Asp <210> 32 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Lys Val Ser Ala 1 5 10 15 Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys 20 25 30 Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ile 50 55 60 Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn 65 70 75 80 Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu 85 90 95 Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Leu Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met 100 105 110 Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser 115 120 125 Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp 130 135 140 Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Glu Pro Lys Tyr Lys Gln Thr Ala 145 150 155 160 Asp Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe 165 170 175 Val Leu Pro Asn Ala Gly Thr His Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln 180 185 190 Cys Tyr Tyr Glu Ala Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr 195 200 205 Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met 210 215 220 Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp 245 250 255 Asp <210> 33 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Lys Val Ser Ala 1 5 10 15 Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys 20 25 30 Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ile 50 55 60 Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn 65 70 75 80 Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu 85 90 95 Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met 100 105 110 Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser 115 120 125 Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp 130 135 140 Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala 145 150 155 160 Asp Leu Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe 165 170 175 Val Leu Pro Asn Ala Gly Thr His Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln 180 185 190 Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr 195 200 205 Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met 210 215 220 Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp 245 250 255 Asp <210> 34 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Lys Val Ser Ala 1 5 10 15 Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys 20 25 30 Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ile 50 55 60 Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn 65 70 75 80 Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu 85 90 95 Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met 100 105 110 Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser 115 120 125 Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp 130 135 140 Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala 145 150 155 160 Asp Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe 165 170 175 Val Leu Pro Asn Ala Gly Thr His Asn Gly Asn Tyr Ile Phe Gly Gln 180 185 190 Cys Tyr Tyr Glu Ala Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr 195 200 205 Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met 210 215 220 Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp 245 250 255 Asp <210> 35 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 atcacggatc cggtggcggt tctggcggtg gctccggtgg cggttctaac aaactttgca 60 gtaaactc 68 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ctcagctaat taagcttagt catcttctct aatatagga 39 <210> 37 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 ccaattctat tgcacttaag aataacactt tatggacagg t 41 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 gtccaagctc agctaattaa gcttagtcat cttc 34 <210> 39 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 catcacggat ccggtggcgg ttctggcggt ggctccggtg gcggttctaa taaactttgt 60 accaaattgg gagaagg 77 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 gctaattaag cttagtcgtc ttctctgatg tagtaaaagg 40

Claims (56)

  1. 하기 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드:
    TLWTG(V/P)(N/K)P(--/T)(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/N)(N/P)D(C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G)(L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D)(N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL(F/Y)FD(S/A)(A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3 (S/Y)(G/K)Q(N/T)(M/--)(A/--)(T/--)(G/--)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 (--/L)(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/--) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN(Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T/L)WS(W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APE(G/V/--)(Q/--)T(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (서열번호: 1); 여기서
    X2는 H, L, 또는 P이고;
    X3은 K 또는 E이고;
    X4는 T, F, S, 또는 L이고;
    X5는 V, D이거나, 부재하고;
    X6은 E, G이거나, 부재하고
    X7은 Y 또는 F이고;
    X8은 T, K, 또는 E이고;
    X9는 N 또는 S이고;
    여기서 하기 중 적어도 하나는 참이다:
    X2는 P이거나;
    X3은 E이거나;
    X4는 S, 또는 L이거나;
    X5는 D이거나;
    X6은 G이거나;
    X7은 F이거나;
    X8은 E이거나;
    X9는 S이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 하기 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드:
    TLWTG(V/P)(N/K)P(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/N)(N/P)D(C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G)(L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D)(N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL(F/Y)FD(S/A)(A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3 (S/Y)(G/K)Q(N/T)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 (--/L)(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/--) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN(Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T/L)WS(W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APET(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (서열번호: 2).
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 하기 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드:
    TLWTG(V/P)(N/K)P(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/N)(N/P)D(C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G)(L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D)(N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL(F/Y)FD(S/A)(A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3 (S/Y)(G/K)Q(N/T)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 L(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN(Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T/L)WS(W/L) X9 (T/A)G(D/L/V) APET(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (서열번호: 3).
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드:
    TLWTGPKPEA NCIIEYGKQN PDSKLTLILV KNGG(I/L)VNGYV TLMGASDYVN TLFKNKNVSI NVELYFDATG HILPDSSSLK TDLE X2 X3 YKQT AD X4 SARGFMP STTAYPF X5 LPNAGTHN X6 N X7 IFGQCYY X8 ASDGALFPLEVTV MLNKRLPDSR TSYVMTFLWS L X9 AGLAPETT QATLITSPFT FSYIREDD (서열번호: 4).
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열번호: 5 내지 서열번호: 11로 이루어진 군으로부터 선택된, 단리된 폴리펩타이드:
    (a)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 5);

    (b)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELEYKQTADSSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 6);

    (c)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLSAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 7);

    (d)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFDLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 8);

    (e)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLEPKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 9);

    (f)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADLSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 10); 및

    (g)TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 11).
  6. 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드로서,
    (a) 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, 또는 그의 작용성 등가물;
    (b) 상기 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인에 작동가능하게 연결되고 C-말단에 위치한 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 (knob) 도메인으로서, 상기 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 도메인이 청구항 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 노브 도메인; 및
    (c) 상기 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인에 작동가능하게 연결되고 N-말단에 위치한 1 이상의 비-AdB-2/3-유도된 이량체화 도메인
    을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드가 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 테일 도메인을 포함하지 않는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 각각의 샤프트 도메인이 Ad3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad7 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad11 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad 14 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, Ad14a 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인, 그의 조합, 및 그의 작용성 등가물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  9. 청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1 이상의 샤프트 도메인이 1-22 샤프트 도메인을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  10. 청구항 6 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 샤프트 도메인이 하기 서열번호: 12 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드:
    서열번호: 12
    GVL(T/S)LKC(L/V)(T/N)PLTT(T/A)(G/S)GSLQLKVG(G/S)GLTVD(D/T)T(D/N)G(T/F/S)L(Q/K/E)ENI(G/S/K)(A/V)(T/N)TPL(V/T)K(T/S)(G/N)HSI(G/N)L(S/P)(L/I)G(A/P/N)GL(G/Q)(T/I)(D/E)(E/Q)NKLC(T/S/A)KLG(E/Q/N)GLTF(N/D)S(N/S)N(I/S)(C/I)(I/A)(D/N/L)(D/K)N(I/--)NTL
    서열번호: 13
    GVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLT(V/I)DDTDG(T/F)L(Q/K)ENI(G/S)ATTPLVKTGHSIGL(S/P)LG(A/P)GLGT(D/N)ENKLC(T/A)KLG(E/Q)GLTFNSNNICI(D/N)DNINTL.
  11. 청구항 6 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 샤프트 도메인이 서열번호:14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, SEID NO: 17, 및 서열번호:18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  12. 청구항 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이량체화 도메인이 EVSALEK (서열번호:24) 및/또는 KVSALKE (서열번호: 25)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  13. 청구항 6 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AdB-2/3 폴리펩타이드가 각각 Ad3 샤프트 도메인을 포함하는 1 이상의 샤프트 도메인을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  14. 청구항 6 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열번호: 28 내지 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드:
    (a)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 28);

    (b)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELEYKQTADSSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 29);

    (c)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLSAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 30);

    (d)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFDLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 31);

    (e)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLEPKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 32);

    (f)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADLSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 33); 및

    (g)MRGSHHHHHHGSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (서열번호: 34).
  15. 청구항 6 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드가 단일 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인을 함유하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  16. 청구항 6 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드가 다량체화된, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  17. 청구항 6 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드가 이량체화된, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  18. 청구항 6 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드에 접합된 1 이상의 화합물을 추가로 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 1 이상의 화합물이 치료제, 진단제, 및 조영제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 1 이상의 화합물이 적어도 하나의 치료제를 포함하고, 상기 치료제는 항체, 면역결합체, 나노입자, 화학치료제, 방사성 입자, 바이러스, 백신, 세포성 면역요법 치료제, 유전자 치료 작제물, 핵산 치료제, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드.
  21. 청구항 1 내지 19 중 어느 하나의 상기 단리된 펩타이드 또는 상기 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산.
  22. 청구항 21의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  23. 청구항 22의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주세포.
  24. 약제학적 조성물로서,
    (a) 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 상기 AdB-2/3 섬유 다량체; 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 담체
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 상피 조직과 관련된 장애의 치료적 처리, 또는 진단을 증대시키고/시키거나 상피 조직을 이미지화하는 방법으로서,
    (a) 상기 장애를 치료하기에 충분한 1 이상의 치료제, 상기 장애를 진단하기에 충분한 진단제, 및/또는 상기 상피 조직을 이미지화하기에 충분한 조영제의 양; 및
    (b) 상기 1 이상의 치료제, 진단제, 및/또는 조영제의 효능을 증대시키기에 충분한, 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체, 또는 청구항 24의 약제학적 조성물의 양
    을 상기의 것들을 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상피 조직과 관련된 상기 장애가 고형 종양, 과민성 장 증후군, 염증성 창자 장애, 크론병, 궤양성 대장염, 변비, 위식도 역류 질환, 바렛 식도, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 기관지염, 폐 폐공기증, 낭포성 섬유증, 사이질 폐질환, 폐렴, 일차 폐 고혈압, 폐 색전증, 폐 유육종증, 결핵, 췌장염, 췌관 장애, 담관 폐색, 담낭염, 온담낭관돌증, 뇌 장애, 건선, 피부염, 사구체신염, 간염, 당뇨병, 갑상선 장애, 연조직염, 감염, 신우신염, 및 담석으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상피 조직과 관련된 상기 장애가 고형 종양인, 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 고형 종양이 유방 종양, 폐 종양, 결장 종양, 직장 종양, 위 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 피부 종양, 내분비 종양, 자궁경부 종양, 신장 종양, 흑색종, 췌장 종양, 간 종양, 뇌종양, 두경부 종양, 비인두 종양, 위 종양, 편평상피 세포 암종, 선암종, 방광 종양, 및 식도 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 청구항 25 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AdB-2/3 섬유 다량체가 AdB-2/3 비리온, AdB-2/3 캡시드, AdB-2/3 12면체 입자 (PtDd), 재조합 AdB-2/3 섬유 다량체, 및 그의 작용성 등가물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  30. 청구항 25 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 화합물이 적어도 하나의 치료제를 포함하고, 상기 치료제는 항체, 면역결합체, 바이러스, 나노입자, 화학치료제, 방사성 입자, 백신, 세포성 면역요법 치료제, 유전자 치료 작제물(gene therapy constucts), 핵산 치료제, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 청구항 25 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 화학치료제 또는 모노클로날 항체를 포함하는, 방법.
  32. 청구항 25 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 항종양 모노클로날 항체를 포함하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 항종양 모노클로날 항체가 트라스투주맙, 세투믹시맙, 페투주맙, 아포맙, 코나투무맙, 렉사투무맙, 베바시주맙, 베바시주맙, 데노수맙, 자놀리무맙, 린투주맙, 에드레콜로맙, 리툭시맙, 티실리무맙, 토시투모맙, 알렘투주맙, 에프라투주맙, 미투모맙, 젬투주맙 오조가마이신, 오레고보맙, 펨투모맙 다클리주맙, 파니투무맙, 카투막소맙, 오파투무맙, 및 이브리투모맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 포함하는, 방법.
  34. 청구항 25 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상피 조직과 관련된 상기 장애가 Her-2 양성 종양을 포함하는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 Her-2 양성 종양이 유방 종양, 위 종양, 결장 종양, 및 난소 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 청구항 34 또는 35에 있어서, 상기 치료제가 트라스투주맙을 포함하는, 방법.
  37. 청구항 25 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 화학치료제, 방사선, 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  38. 청구항 34 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 트라스투주맙 치료에 반응하지 않는, 방법.
  39. 청구항 25 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상피 조직과 관련된 상기 장애가 EGFR-양성 종양을 포함하는, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 EGFR-양성 종양이 폐 종양, 결장 종양, 유방 종양, 직장 종양, 두경부 종양, 및 췌장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  41. 청구항 39 또는 40에 있어서, 상기 치료제가 세툭시맙을 포함하는, 방법.
  42. 청구항 25 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 VEGF 억제제를 포함하는, 방법.
  43. 청구항 39 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 화학치료제, 방사선, 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  44. 청구항 39 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 세툭시맙 치료에 반응하지 않는, 방법.
  45. 상피 조직과 관련된 장애의 치료 방법으로서, 상기 장애를 치료하기에 충분한, 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체, 또는 청구항 24의 약제학적 조성물의 양을 상기 치료가 필요로 한 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 장애가 AdB-2/3 바이러스성 감염 또는 고형 종양인, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 장애가 고형 종양이고, 상기 고형 종양은 유방 종양, 폐 종양, 결장 종양, 직장 종양, 위 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 피부 종양, 내분비 종양, 자궁경부 종양, 신장 종양, 흑색종, 췌장 종양, 간 종양, 뇌종양, 두경부 종양, 비인두 종양, 위 종양, 편평상피 세포 암종, 선암종, 방광 종양, 및 식도 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  48. 상피 조직에 화합물의 전달을 개선시키는 방법으로서, 상기 상피 조직을
    (a) 상기 상피 조직에 전달되는 1 이상의 화합물; 및
    (b) 상기 1 이상의 화합물의 상기 상피 조직으로의 전달을 증대시키기에 충분한, 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체, 또는 청구항 24의 약제학적 조성물의 양
    과 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  49. 청구항 48에서, 상기 1 이상의 화합물이 진단제 또는 조영제를 포함하는, 방법.
  50. 청구항 48 또는 49에 있어서, 상기 상피 조직이 고형 종양을 포함하는, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 고형 종양이 유방 종양, 폐 종양, 결장 종양, 직장 종양, 위 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 피부 종양, 내분비 종양, 자궁경부 종양, 신장 종양, 흑색종, 췌장 종양, 간 종양, 뇌종양, 두경부 종양, 비인두 종양, 위 종양, 편평상피 세포 암종, 선암종, 방광 종양, 및 식도 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  52. 데스모글레인 2 (DSG2)를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키는 방법으로서, DSG2를 발현시키는 상기 조직을
    (a) 상기 조직에 전달되는 1 이상의 화합물; 및
    (b) 상기 1 이상의 화합물의 상기 조직으로의 전달을 증대시키기에 충분한, 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체, 또는 청구항 24의 약제학적 조성물의 양
    과 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  53. 조직에서 상피 세포로부터 간엽 세포로의 전이 (EMT)를 유도하는 방법으로서, 상기 상피 조직을, EMT를 유도하기에 충분한, 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체, 또는 청구항 24의 약제학적 조성물의 양과 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  54. 청구항 45 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 AdB-2/3 섬유 다량체가 Ad3 섬유 다량체, Ad7 섬유 다량체, Ad11 섬유 다량체, Ad14 섬유 다량체, Ad14a 섬유 다량체, 그의 조합, 및 그의 작용성 등가물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는 것, 상피 조직으로의 물질의 전달을 개선하는 것 중 1 이상을 위하거나, DSG2를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키고, 조직에서 EMT를 유도하고/하거나, AdB-2/3 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 식별하기 위한 방법으로서,
    (a) DSG2에 대한 다량체 결합을 촉진시키기 위한 조건 하에서 청구항 16 내지 20 중 어느 하나의 AdB-2/3 섬유 다량체를 DSG2에 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉하는 단계를 1 이상의 시험 화합물의 존재 하에 수행하는, 단계; 및
    (b) DSG2에 대한 결합을 위하여 상기 AdB-2/3 섬유 다량체와 경쟁하는 양성 시험 화합물을 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하고,
    상기 양성 시험 화합물은 상피 조직과 관련된 장애를 치료하는 것, 상피 조직으로의 물질의 전달의 개선하는 것 중 1 이상을 위하거나, DSG2를 발현시키는 조직에 물질의 전달을 개선시키고, 조직에서 EMT를 유도하고/하거나 AdB-2/3 감염을 치료하기 위한 후보 화합물인, 방법.
  56. 청구항 24에 있어서, 상피 조직과 관련된 장애를 치료하기에 충분한 1 이상의 치료제, 상피 조직과 관련된 장애를 진단하기에 충분한 진단제, 및/또는 상피 조직을 이미지화하기에 충분한 조영제의 양을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
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