KR20150042636A - Recombinant virus comprising polynucleotide encoding hCARP and uses thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to cell therapeutics for reinforcing blood vessels, which includes host cells transfected by a recombinant virus, which is characterized by including a nucleic acid encoding hCARP (human Cardiac Ankyrin Repeat Protein), and to a pharmaceutical composition including the recombinant virus or cell therapeutics for reinforcing blood vessels, or preventing or treating ischemic diseases. Also, the present invention relates to a method of reinforcing blood vessels of individuals, which includes a step of dosing the recombinant virus, the cell therapeutics or the pharmaceutical composition to individuals at a pharmaceutically effective dose. The recombinant virus of the present invention is conformed to express hCARP when transfected to a host cell, thereby enhancing the resistance against the chemical and physical stress. The hCARP has the effect of reinforcing the blood vessels, thereby being able to have effects of preventing and treating ischemic diseases. Accordingly, the recombinant virus of the present invention can be widely used in the gene therapy field against said diseases.

Description

hCARP를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 및 이의 용도{Recombinant virus comprising polynucleotide encoding hCARP and uses thereof}Recombinant virus comprising a nucleic acid encoding hCARP and use thereof < RTI ID = 0.0 > Recombinant < / RTI > virus comprising polynucleotide encoding hCARP and uses thereof,

본 발명은 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스를 포함하는 혈관 강화용 조성물, 상기 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제 및 상기 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 포함하는 허혈성 질환 또는 연조직 리모델링 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 재조합 바이러스, 상기 세포 치료제 또는 상기 약학적 조성물을 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관을 강화하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for vascular strengthening comprising a recombinant virus, which comprises a nucleic acid encoding hCARP (Human Cardiac Ankyrin Repeat Protein), a therapeutic agent for vascular strengthening comprising a host cell transfected with the recombinant virus, And a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic diseases or soft tissue remodeling-related diseases comprising the above recombinant viruses or cell therapeutic agents. Further, the present invention relates to a method for enhancing blood vessels of an individual, comprising the step of administering the recombinant virus, the cell therapy agent or the pharmaceutical composition to a subject in a pharmaceutically effective amount.

유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법이다. 이는, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다.Gene therapy refers to the treatment of inherited or acquired gene abnormalities that are difficult to treat by conventional methods by genetic engineering methods. Specifically, for the treatment and prevention of chronic diseases such as congenital or inherited genetic defects, viral diseases, cancer or cardiovascular diseases, genetic materials such as DNA and RNA are administered into the body to express therapeutic proteins Thereby inhibiting the expression of a specific protein. This is a method that is expected to be an alternative means of existing medical treatment as well as to overcome incurable disease since the cause of disease can be treated fundamentally by interpretation at the gene level.

유전자 치료를 위해서는 숙주세포 내로 핵산을 도입시키는 다양한 바이러스들이 연구되고 있다. 그 중에서 레트로바이러스는 single-stranded RNA 바이러스로 숙주 세포로 감염된 후에 레트로바이러스의 RNA가 reverse transcriptase에 의해 RNA-DNA double-strand로 만들어지게 된다. 그 다음 double-strand DNA가 되며 양 끝에 long terminal repeat sequence를 갖게 되며 integrase에 의해서 숙주의 염색체 사이로 끼어들어가게 된다. 이에 따라, 한번 레트로바이러스에 의하여 핵산이 도입된 세포는 세포분열 시에도 레트로바이러스의 유전자가 유지되며 지속적으로 발현이 일어나게 된다. 이에 따라, 영구적인 유전자 치료를 위하여 레트로바이러스를 이용하는 방안이 연구되고 있다.
For gene therapy, various viruses that introduce nucleic acid into host cells have been studied. Among them, retroviruses are single-stranded RNA viruses, and after infection with host cells, retroviral RNAs are made into RNA-DNA double-strands by reverse transcriptase. It then becomes double-stranded DNA, which has a long terminal repeat sequence at both ends and is inserted between chromosomes of the host by integrase. As a result, the retroviral gene is retained in the cell once the retrovirus has introduced the nucleic acid, and the expression is continuously generated even when the cell divides. Accordingly, methods for using retroviruses for permanent gene therapy have been studied.

한편, Cardiac Ankyrin Repeat Protein(CARP)는 1995년 혈관내피세포에서 cytokine에 의해 유도되는 전사조절인자로서 처음 동정이 되었다. 심근세포, 골격근세포 등 여러 세포에서 발현이 되는 것이 확인이 되었다. Vascular smooth muscle cell에 growth factor인 TGF β-1을 처리하였을 때 농도 및 시간에 따라서 CARP mRNA가 증가됨이 확인이 되었다. Rat wound healing model에서 adenovirus를 이용 CARP gene을 전달해 주었을 때 혈관생성이 촉진되었다. 그리고 CARP는 배아와 태아 단계의 cardiogenesis과정에서 높게 발현되고 YB-1 transcription factor의 cofactor로 이용되는 것으로 알려졌다. 이에 CARP는 혈관생성 signaling pathway에 중요한 factor로 예상되어 많은 연구가 진행되고 있다. On the other hand, Cardiac Ankyrin Repeat Protein (CARP) was first identified in 1995 as a transcription factor induced by cytokine in vascular endothelial cells. Myocardial cells, and skeletal muscle cells. It has been confirmed that CARP mRNA increases with concentration and time when VGF smooth muscle cells are treated with growth factor TGF β-1. In the rat wound healing model, the angiogenesis was promoted when CARP gene was transferred using adenovirus. CARP is highly expressed in the cardiogenesis process of embryonic and fetal stages and is known to be used as a cofactor of YB-1 transcription factor. Therefore, CARP is expected to be an important factor in the angiogenic signaling pathway and many studies are underway.

CARP는 특히 배아와 태아 단계에서 심장의 발달이 이루어 질 때 높게 나타난다. 실제로, 심장에서는 YB-1 transcription factor의 cofactor로 이용되며, 성체로 가면서 그 발현량이 감소하게 되는 특징이 있고 postnatal cardiomyocytes에서의 CARP 과발현은 심장 유전자들의 발현을 억제시키는 것으로 나타나 transcriptional co-repressor로도 작용할 것으로 예상되고 있다. 또한, 동맥 경화 과정에서 내피세포와 intimal smooth muscle cell(SMC)에서 CARP가 합성된다는 것이 알려져 있다. CARP는 TGF-β와 Smad3의 target gene임이 밝혀졌으며, wound healing 동안에 발현량이 증가하여 약 2주일간 유지되며, human과 murine의 죽상경화반에서 CARP의 발현이 증가됨을 확인하였다. Neovascularization에도 CARP가 관여한다는 것이 밝혀졌고, 최근에는 CARP의 upstream effector로 p53이 발견되었으며, myogenesis 과정에서 myogenic regulatory factor에 의한 신호를 증폭시켜 세포 주기의 arrest를 조절하는 것으로도 추정되고 있다. 그러나 이런 CARP의 다양한 역할 및 혈관 신생에 관련된 기능들에도 불구하고 CARP의 발현이 혈관 강화와 관련되어 어떤 기작을 가지는 지에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없었다.
CARP is particularly elevated when cardiac development occurs, especially at embryonic and fetal stages. Indeed, cardiac is used as a cofactor of the YB-1 transcription factor and its expression level decreases in the adult, and CARP overexpression in postnatal cardiomyocytes inhibits the expression of cardiac genes, thus acting as a transcriptional co-repressor It is expected. It is also known that CARP is synthesized in endothelial cells and intimal smooth muscle cells (SMC) during atherosclerosis. CARP was found to be a target gene for TGF-β and Smad3, and increased expression during wound healing was maintained for about 2 weeks. CARP expression was increased in human and murine atherosclerotic plaques. It has been shown that CARP also participates in neovascularization. Recently, p53 has been found as an upstream effector of CARP, and it is presumed that it regulates cell cycle arrest by amplifying myogenic regulatory factor signal during myogenesis process. However, in spite of the various roles of these CARPs and their functions related to angiogenesis, the mechanism of CARP expression in relation to vascular enhancement has not yet been elucidated.

한편, 노화 또는 혈관계 질환에 의한 혈관 약화, 즉 혈관벽의 약화는 심장마비, 뇌졸중, 동맥류, 정맥류 등의 위험성을 높이는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 혈관의 건강 특히 혈관 벽의 신축성을 높이고 혈관을 강화하는 것을 통하여 상기 질병에 대한 위험성을 낮출 수 있고, 증상을 완화할 수 있다. 특히, 모세혈관을 강화할 경우에는 모세혈관으로의 혈류를 증가시켜 각종 혈관장애에 의한 질환 및 대사 질환을 예방 또는 치료하는데 효과가 있다. 상기 혈관 약화에 의해서는 각종 허혈성 질환이 발생할 수 있다.On the other hand, it is known that the weakening of blood vessels caused by aging or vascular diseases, that is, the weakening of the blood vessel walls, increases the risk of heart attack, stroke, aneurysm, and varicose veins. Accordingly, it is possible to lower the risk of the disease by increasing the elasticity of blood vessels, particularly the blood vessel wall, and strengthening the blood vessels, thereby alleviating the symptoms. In particular, when capillary blood vessels are strengthened, blood flow to capillary blood vessels is increased to prevent or treat diseases or metabolic diseases caused by various vascular disorders. Various ischemic diseases may be caused by the vascular weakness.

허혈(Ischemia)이란 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 말하며, 궁극적으로 비가역적인 손상, 즉 세포 및 조직의 괴사로 이어지게 된다. 특히, 심장, 신장, 뇌는 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 예를 들어, 뇌졸중 또는 두부 손상 등에 의하여 뇌 조직 상에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 뇌 조직이 영구적으로 손상된다. Ischemia is a state of reduced blood supply to the body organs, tissues or areas and ultimately leads to irreversible damage, ie, necrosis of cells and tissues. In particular, heart, kidney, and brain are the most sensitive organs for lack of blood supply. For example, when ischemia occurs in the brain tissue due to stroke or head injury, a series of processes called ischemic cascade is triggered, It is permanently damaged.

허혈은 여러 가지 원인에 의하여 야기될 수 있으며, 예를 들면, 심장의 비정상적인 빠른 박동, 저혈압, 혈관외부로부터의 혈관 압박(예를 들어, 혈관 외부의 암에 의한 혈관 압박), 혈전, 색전증, 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 일과성 심장발작, 사고로 인한 뇌혈관 손상, 뇌일혈, 뇌경색, 동정맥 기형, 말초 동맥 폐색 질환 등에 의하여 허혈 증상이 나타날 수 있다.
Ischemia can be caused by a variety of causes including, for example, abnormal fast heartbeat of the heart, hypotension, vascular compression from outside the blood vessels (for example, vascular compression by cancer outside the blood vessels), thrombosis, Ischemic symptoms may be caused by transient ischemic attack, transient heart attack, accidental cerebral vascular injury, cerebral hemorrhage, cerebral infarction, arteriovenous malformation, peripheral arterial occlusive disease, and the like.

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 hCARP 유전자를 레트로바이러스를 통하여 세포에 도입하여 화학적, 물리적인 스트레스 등에 대한 세포의 저항성을 확인함으로써, hCARP이 혈관 강화 효과를 가질 수 있으며 이에 따라 허혈성 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있음을 확인하고 이를 이용한 유전자 치료에 대한 가능성을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have found that by introducing the hCARP gene into cells through a retrovirus and confirming the resistance of the cells to chemical and physical stresses, hCARP can have a vasoconstrictive effect and thus prevent and treat ischemic diseases And confirmed the possibility of gene therapy using the same, thus completing the present invention.

본 발명의 목적은 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스를 포함하는 혈관 강화용 조성물An object of the present invention is to provide a vascular strengthening composition comprising a recombinant virus, which comprises a nucleic acid encoding a human Cardiac Ankyrin Repeat Protein (hCARP)

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a therapeutic agent for vascular strengthening comprising a host cell transfected with the recombinant virus of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic diseases comprising the recombinant virus or cell therapy agent of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 이용하여 연조직 리모델링(soft tissue remodeling) 관련 질환을 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating soft tissue remodeling-related diseases using the recombinant virus or cell therapy agent of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 이용하여 혈관을 강화하는 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for enhancing blood vessels using the recombinant virus or cell therapy agent of the present invention.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈관 강화용 재조합 바이러스 발현벡터를 제공한다.
According to an aspect of the present invention, there is provided a vector for expressing a recombinant viral vector for enhancing blood vessels, which comprises a nucleic acid encoding hCARP (Human Cardiac Ankyrin Repeat Protein).

본 발명의 용어, "CARP(Cardiac Ankyrin Repeat Protein)"은 319개의 아미노산으로 구성되어 있고 36 kDa의 분자량을 갖는 단백질로, 포유동물에서 아미노산 서열과 기능성 도메인이 잘 보존되어있다. Protein/protein interaction의 중요할 것으로 예상되는 ankyrin 도메인이 4번 반복되어 존재하고 nuclear localization signal을 가지고 있어 전사조절인자로 작용할 수 있는 조건을 갖고 있다. 또한, coiled-coil region이 존재해 in vivo상에서 CARP가 homodimerization을 통해 이량체 형태로 존재한다. Ankyrin repeat 도메인은 NF-kB, p16, p19, DARP 등에서 protein/protein interaction을 담당하는 부위로, 이를 포함하고 있는 CARP는 titin과 같은 cytoplasmic protein 등과 결합한다고 알려져 있으며, 직접적으로 결합하여 생리적 활성을 나타내는 표적 분자들이 점점 밝혀지고 있다. 본 발명에서 CARP는 특히 인간 유래의 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)일 수 있으며, 이를 암호화하는 핵산이 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.The term " CARP (Cardiac Ankyrin Repeat Protein) " of the present invention is composed of 319 amino acids and has a molecular weight of 36 kDa. The amino acid sequence and functional domain are well conserved in mammals. The ankyrin domain, which is expected to be important for protein / protein interaction, is present four times and has a nuclear localization signal, which can act as a transcriptional regulator. In addition, CARP is present in dimeric form through homodimerization in vivo due to coiled-coil region. The ankyrin repeat domain is responsible for protein / protein interaction in NF-kB, p16, p19, and DARP. CARP, which contains it, is known to bind with cytoplasmic proteins such as titin. The molecules are becoming more and more evident. In the present invention, CARP may be human-derived hCARP (Human Cardiac Ankyrin Repeat Protein), and the nucleic acid encoding the CARP may be a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 용어 "혈관 강화"는 혈관벽의 물리적 스트레스에 대한 저항성을 높여, 노화 또는 혈관계 질환 등에 의한 혈관 약화를 예방하거나 치료하는 효과를 지니는 것을 의미하나, 이제 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 혈관 또는 혈관벽이 약화되는 경우에는 심장마비, 뇌졸증, 동맥류, 정맥류 등의 위험성을 높이는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 본 발명의 재조합 바이러스를 이용해 hCARP를 혈관 세포 또는 혈관 주변 세포에 도입하는 것을 통하여 혈관의 건강 특히 혈관 벽의 신축성을 높이고 혈관을 강화할 수 있다. 이를 통하여 상기 질병에 대한 위험성을 낮추거나, 증상을 완화할 수 있다. 특히, 모세혈관을 강화할 경우에는 모세혈관으로의 혈류를 증가시켜 각종 혈관장애에 의한 질환 및 대사 질환을 예방 또는 치료하는데 효과가 있다.
The term "vascular strengthening" of the present invention means enhancing resistance to physical stress of the blood vessel wall and preventing or treating vascular weakness caused by aging or vascular diseases, but the present invention is not limited thereto. Specifically, when a blood vessel or a blood vessel wall is weakened, it is known to increase the risk of heart attack, stroke, aneurysm, and varicose veins. Accordingly, by introducing hCARP into vascular cells or peripheral blood cells using the recombinant virus of the present invention, it is possible to enhance blood vessel health, in particular, to enhance elasticity of blood vessel walls and strengthen blood vessels. Whereby the risk to the disease can be lowered or the symptoms can be alleviated. In particular, when capillary blood vessels are strengthened, blood flow to capillary blood vessels is increased to prevent or treat diseases or metabolic diseases caused by various vascular disorders.

본 발명의 용어, "재조합 바이러스 발현벡터"는 상기 CARP를 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 발현벡터를 의미하며, 상기 핵산을 숙주세포에 형질감염시켜 CARP를 발현시킬 수 있는 한 그 유래 등에 한정되지 않는다. 본 발명의 바이러스 발현벡터는 당업계에 알려진 다양한 발현벡터를 이용할 수 있으며, 특히, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노부속바이러스, 백시니아바이러스 또는 알파바이러스 유래의 발현벡터일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 바이러스 발현벡터는 레트로바이러스 유래 발현벡터일 수 있으며, 특히 도 1에 기재된 pLPC-hCARP의 개열지도를 갖는 재조합 바이러스 발현벡터일 수 있다.The term "recombinant virus expression vector" of the present invention means a viral expression vector containing a nucleic acid encoding the CARP, and is not limited to the origin and so forth as long as the nucleic acid can be transfected into a host cell to express CARP . The virus expression vector of the present invention may be any of various expression vectors known in the art, and may be an expression vector derived from adenovirus, lentivirus, retrovirus, adeno-associated virus, vaccinia virus or alphavirus. Preferably, the virus expression vector of the present invention may be a retrovirus-derived expression vector, particularly a recombinant virus expression vector having the cleavage map of pLPC-hCARP described in Fig.

상기 레트로바이러스는 높은 유전자 전달효율, 미분화세포로 유전자를 전달하는 능력 및 높은 역가의 바이러스 저장물 제조의 용이성으로 인해 유망한 유전자 치료용 벡터로 인정받고 있다. 또한 세포의 증식에 관계없이 다양한 세포를 감염시킬 수 있으며 또한 감염 후 숙주의 유전자에 통합되어 한번 형질감염된 세포의 경우에는 지속적으로 치료효과가 유지되는 점에서 유전자 치료 전달 매체로서의 장점을 가지고 있다. 레트로바이러스는 기본적으로 gag, pol과 env 유전자를 공통적으로 가지고 있다. gag 유전자는 바이러스의 코어(core)와 구조단백질(structural protein)을 암호화하며, pol 유전자는 protease, integrase와 reverse transcriptase 등을 암호화하고, env 유전자는 retroviral coat protein을 암호화한다. 레트로바이러스는 double-strand RNA virus로 target 세포로 감여된 후에 숙주세포의 tRNA가 레트로바이러스의 RNA에 붙은 후 reverse transcriptase에 의해 RNA-DNA double strand로 된 후 polymeraseⅡ에 의해 double strand DNA 형태로 바뀐다. 이렇게 생성된 DNA는 양 끝에 long terminal repeat(LTR) sequence를 가지게 되며, integrase에 의해서 숙주의 염색체 사이로 끼어들어가며 외부 유전자가 세포분열 시에도 유지되며, 숙주 세포의 발현기작을 이용하여 지속적인 유전자 발현을 할 수 있게 된다. 이런 장점으로 레트로바이러스는 주로 hematopoietic marrow cell, hepatocytes, keratinocyte, endothelial cell에 적용되고 있다.The retroviruses are recognized as promising gene therapy vectors due to their high gene transfer efficiency, their ability to deliver genes into undifferentiated cells, and their ease of manufacture of viral stocks with high potency. In addition, it can infect various cells irrespective of cell proliferation. Furthermore, it is advantageous as a gene therapy delivery medium because the transfected cells are integrated into the gene of the host after infection to maintain the therapeutic effect continuously. Retroviruses have basically gag, pol and env genes in common. The gag gene encodes the virus core and structural protein, the pol gene encodes protease, integrase and reverse transcriptase, and the env gene encodes the retroviral coat protein. Retroviruses are double-stranded RNA viruses that are transformed into target cells. After the tRNAs of the host cells are attached to retroviral RNAs, they are transformed into RNA-DNA double strands by reverse transcriptase and then into double stranded DNA by polymerase II. The resulting DNA has a long terminal repeat (LTR) sequence at both ends and is inserted between the chromosomes of the host by integrase. The foreign gene is also retained during cell division, and the expression of the host gene is sustained . Because of these advantages, retroviruses are mainly applied to hematopoietic marrow cells, hepatocytes, keratinocytes, and endothelial cells.

레트로바이러스가 감염되기 위해서는 바이러스의 외피 단백질(envelope protein)과 특정 세포막 수용체 단백질(specific cell surface receptor protein)과 결합이 필요하다. VSV-G protein은 대부분의 진핵세포에 존재하는 인지질과 결합을 하기 때문에 레트로바이러스가 넓은 범위의 세포주에 감염이 가능하게 만들어준다. 이러한 특성은 세포막 수용체가 다양하지 않은 줄기세포로의 감염에도 용이하다. 또한 VSV-G는 물리적인 안정성을 가질 수 있도록 하여, 레트로바이러스의 감염 효율을 높이기 위하여 ultracentrifugation을 통하여 농축하여도 레트로바이러스의 역가와 감염효율을 최대화할 수 있다는 장점이 존재한다.In order for the retrovirus to be infected, it is necessary to bind the virus envelope protein and specific cell surface receptor protein. Because the VSV-G protein binds to phospholipids present in most eukaryotic cells, retroviruses make it possible to infect a wide range of cell lines. This characteristic is also easy to infect stem cells that do not have diverse cell membrane receptors. In addition, VSV-G has the advantage of maximizing retrovirus activity and infection efficiency even when it is enriched through ultracentrifugation in order to enhance physical efficiency of retrovirus infection.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 pLPCX 기반 레트로바이러스 벡터에 hCARP DNA를 삽입하여 재조합 레트로바이러스 발현벡터를 제조하였다(도 1). 이를 NIH3T3 세포주에 형질감염시켜 hCARP가 발현되는 것을 확인하였다.
In a specific embodiment of the present invention, a recombinant retrovirus expression vector was prepared by inserting hCARP DNA into a pLPCX-based retrovirus vector (Fig. 1). Which was transfected into NIH3T3 cell line to confirm expression of hCARP.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 발현벡터와 외피 벡터(envelope vector)를 포함하는, 혈관 강화용 재조합 바이러스 생산용 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition for producing a vascular enhancing recombinant virus, which comprises the recombinant viral expression vector and an envelope vector.

본 발명에서 외피 벡터는 상기 설명한 특정 세포막 수용체 단백질(specific cell surface receptor protein)과 결합할 수 있는 능력을 가지는 외피 단백질을 발현하는 모든 발현벡터를 포함하나, 특히 VSV-G를 발현하는 pVSV-G 벡터일 수 있다.
In the present invention, the envelope vector includes all the expression vectors expressing the envelope proteins capable of binding to the specific cell surface receptor protein described above. In particular, the envelope vector includes pVSV-G vectors expressing VSV-G Lt; / RTI >

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 생산용 조성물을 동물세포에 처리하는 단계; 및 상기 동물세포를 배양한 배양배지로부터 재조합 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는, 혈관 강화용 예방 또는 치료용 재조합 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a recombinant virus, comprising the steps of: treating an animal cell with the composition for producing a recombinant virus; And obtaining a recombinant virus from a culture medium in which the animal cells have been cultured. The present invention also relates to a method for producing a recombinant virus for preventing or treating vascular strengthening.

본 발명에서 용어, "동물세포"는 본 발명의 바이러스를 제조할 수 있는 세포는 제한 없이 포함되나, 포유류 세포 또는 조류 세포일 수 있으며, 예시적 포유류 세포는 돼지류 세포, 인간 세포, 소류 세포 및 조류 세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 GP293 세포주를 사용하여 레트로바이러스를 증폭,제작하였다.
The term "animal cell" in the present invention includes, but is not limited to, cells capable of producing the virus of the present invention, but may be a mammalian cell or an avian cell. Exemplary mammalian cells include porcine cells, human cells, But are not limited to, avian cells. According to one embodiment of the present invention, a retrovirus was amplified and prepared using GP293 cell line.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 혈관 강화용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for vascular strengthening comprising the recombinant virus of the present invention as an active ingredient.

상기 재조합 바이러스, 혈관 강화 등은 상기 설명한 바와 동일하다.
The above-mentioned recombinant virus, vascular strengthening and the like are the same as described above.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제를 제공하는 것이다. 즉, 숙주세포에 hCARP를 암호화하는 핵산을 도입시킨 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제를 제공하는 것이다.In another aspect, the present invention provides a therapeutic agent for vascular strengthening comprising a host cell transfected with a recombinant virus comprising a nucleic acid encoding the human Cardiac Ankyrin Repeat Protein (hCARP). That is, the present invention provides a therapeutic agent for vascular strengthening comprising a host cell into which a nucleic acid encoding hCARP is introduced into a host cell as an active ingredient.

본 발명에서 용어 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다. The term "introduction" in the present invention means introduction of foreign DNA into a cell by transfection or transduction. The transfection can be carried out in the presence or absence of a sugar such as calcium phosphate-DNA coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, microinjection, liposomal fusion, lipofectamine and protoplast fusion Can be carried out by various methods known in the art. Transfection also refers to the transfer of genes into cells using virus or viral vector particles as a means of infection.

본 발명의 도입은 특히 hexadimethrine bromide(polybrene, sigma, USA)을 포함하여 감염의 효율이 증가될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, NIH3T3 세포주를 6-well 배양접시에 본 발명의 재조합 레트로바이러스를 감염시키며, polybrene을 첨가하는 농도를 달리하여 최적 감염 조건을 확인하였다. polybrene을 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 ㎍/㎖로 섞어 감염 효율을 확인한 결과, 최종적으로 8 ㎍/㎖일 때 가장 높은 감염 수치를 보여주는 것을 확인하였다.The introduction of the present invention may increase the efficiency of infection, especially including hexadimethrine bromide (polybrene, sigma, USA). In one specific embodiment of the present invention, the NIH3T3 cell line was infected with the recombinant retrovirus of the present invention in a 6-well culture dish and the optimal infection condition was determined by varying the concentration of polybrene added. When polybrene was mixed at 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 and 60 ㎍ / ㎖, the highest infection rate was obtained at 8 ㎍ / ㎖ Respectively.

본 발명의 숙주세포는 hCARP를 암호화하는 핵산이 도입되어 hCARP를 과발현시킬 수 있으며, 이를 통하여 혈관 약화에 대하여 예방 또는 치료효과를 가질 수 있는 세포는 제한없이 포함한다. 특히, 본 발명의 바이러스를 통하여 형질감염시켜 세포 치료제로 사용할 수 있는 다양한 숙주세포는 혈관내피세포(endothelial cell), 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell), 섬유아세포 (fibroblast), NIH3T3 및 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell) 등을 포함한다.The host cell of the present invention may include hCARP-overexpressing nucleic acid that encodes hCARP, and includes, without limitation, cells that can have a preventive or therapeutic effect against vascularization. In particular, various host cells that can be used as a cell therapy agent by transfecting through the virus of the present invention include endothelial cells, vascular smooth muscle cells, fibroblasts, NIH3T3, and mesenchymal stem cells Cells (mesenchymal stem cells) and the like.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 레트로바이러스를 NIH3T3 세포에 감염시켰다. 감염되어 hCARP를 발현하는 것을 확인한 hCARP NIH3T3 세포 및 normal NIH/3T3 세포에 대하여 세로로 scratch를 준 뒤, 광학현미경 및 Real-time cell analyzer(RTCA, xCELLigence, Roche)를 이용하여 인위적인 scratch에 대한 저항성 및 회복력을 확인하였다. 그 결과, hCARP NIH/3T3 cell 이 인위적인 scratch에 대한 저항성이 normal NIH/3T3 cell보다 13% 강하고, scratch 후 상처 회복정도가 상대적으로 65% 빠름을 확인하였다. 또한, RTCA에서 측정되는 Cell Index (CI) 값은 세포가 plate에 붙는 정도에 따라서 결정되는데, hCARP NIH/3T3 cell의 CI 값이 normal NIH/3T3 cell보다 1.8배 높게 측정이 되어, hCARP NIH/3T3 cell이 배양접시 바닥에 normal NIH/3T3 cell보다 넓고 강하게 부착함을 확인하였다. 이에 따라 본 발명의 재조합 바이러스에 형질감염되어 hCARP 유전자가 도입된 숙주세포 및 이를 유효성분으로 하는 세포 치료제는 혈관 강화에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
In a specific embodiment of the present invention, the retrovirus of the present invention was infected with NIH3T3 cells. The hCARP NIH3T3 cells and normal NIH / 3T3 cells, which had been infected and confirmed to express hCARP, were scrubbed longitudinally and then subjected to optical microscopy and real-time cell analyzer (RTCA, xCELLigence, Roche) Resilience was confirmed. As a result, hCARP NIH / 3T3 cells were found to be 13% more resistant to artificial scratch than normal NIH / 3T3 cells and 65% faster after scratching. The CI value of hCARP NIH / 3T3 cells was 1.8 times higher than that of normal NIH / 3T3 cells, and the hCARP NIH / 3T3 cells were measured by RTCA. cells were found to be wider and more strongly attached to the bottom of the culture dish than normal NIH / 3T3 cells. Thus, it has been confirmed that the host cell transfected with the recombinant virus of the present invention and having the hCARP gene introduced therein and the cell therapy agent containing the same as the active ingredient can be useful for vascular strengthening.

본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic diseases comprising the recombinant virus or cell therapy agent of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 조성물의 투여로 혈관 약화를 억제시키거나 약화를 지연시키거나 허혈성 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.The term "prophylactic" of the present invention means any action that inhibits or slows down the vasoconstriction or inhibits or delays the onset of ischemic diseases by administration of a recombinant virus, cell therapy or composition according to the present invention.

본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 조성물의 투여로 혈관의 신축성이나 물리적 강도가 호전되거나 허혈성 질환에 의한 후유증이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.The term "treatment" of the present invention means all actions that improve the elasticity or physical strength of a blood vessel by administration of a recombinant virus, a cell treatment agent, or a composition according to the present invention, or ameliorate or alleviate a sequela caused by an ischemic disease.

본 발명의 용어, "허혈성 질환"이란 허혈 증상을 나타내는 질환으로서, 관련되는 신체기관에 따라 뇌허혈, 심장허혈, 망막허혈, 심한사지허혈(critical limb ischemia), 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증 및 심근비대증 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 심장 근육에 혈류 공급이 불충분할 때 발생하는 심장 허혈은 협심증과 같은 가슴 통증, 심부전(cardiac failure)을 일으킬 수 있고, 뇌에 불충분한 혈류 공급으로 인하여 발생하는 뇌 허혈은 급성 허혈성 뇌졸중 또는 만성 뇌 허혈로 인한 혈관성 치매(vascular dementia)의 원인이 될 수 있다. 대장 또는 소장의 허혈은 허혈성 대장염 또는 장간막허혈을 야기할 수 있고, 피부로의 혈류 공급이 감소한 경우 반점성 피부 변색이 발생할 수 있다. The term "ischemic disease" of the present invention refers to a disease characterized by ischemic symptoms, which may include cerebral ischemia, cardiac ischemia, retinal ischemia, critical limb ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure and myocardial hypertrophy . ≪ / RTI > Specifically, cardiac ischemia that occurs when blood supply to the heart muscle is insufficient may cause chest pain, such as angina pectoris, cardiac failure, and brain ischemia resulting from inadequate blood supply to the brain may be caused by acute ischemic stroke or It can cause vascular dementia due to chronic brain ischemia. Ischemia of the large intestine or small intestine may cause ischemic colitis or mesenteric ischemia, and discoloration of the skin may occur when blood supply to the skin is decreased.

또한, 혈관이 부실함에 기인하여 신체 말단으로의 혈류공급이 불충분하여 사지절단술을 받아야만 하는 심한 사지 허혈(critical limb ischemia)을 야기할 수 있고, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 당뇨성 신경장애(diabetic neuropathy), 당뇨병성 혈관심장질환을 포함할 수 있다. 상기와 같은 허혈성 질환의 치료를 위하여 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 해소하기 위한 혈관생성(angiogenesis)을 이용하는 방법이 주로 연구되어 왔으나, 본 발명에서는 기존에 존재하는 혈관의 강화를 통하여 해결하고자 하였다.
In addition, it may lead to critical limb ischemia, which must undergo limb amputation due to insufficient blood supply to the body's distal end due to insufficient blood vessels, and may cause amyotrophic lateral sclerosis, diabetic neuropathy diabetic neuropathy, diabetic vascular heart disease. In order to treat the ischemic diseases as described above, a method of using angiogenesis for resolving the reduced state of blood supply to body organs, tissues or regions has been mainly studied. However, in the present invention, .

아울러, 본 발명의 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic diseases of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.

본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.Examples of pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, , Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, calcium carbonate, cellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 강황 또는 울금 추출물, 이로부터 분리된 리나로올 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories and sterilized injection solutions according to a conventional method . In the case of formulation, it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like which are generally used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one of the above-mentioned turmeric or herbal extracts, a linalool compound isolated therefrom or a pharmaceutically acceptable salt thereof One or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives are included . Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 유효성분으로 포함하는 연조직 리모델링(soft tissue remodeling) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating soft tissue remodeling-related diseases comprising the recombinant virus or cell therapy agent of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 용어, "연조직 리모델링 관련 질환"은 연조직이 신축성이나 결합력등이 약해짐에 따라, 조직의 원형태가 변성되는 질환을 의미하며, 특히 심장 리모델링(cardiac remodeling), 동맥 협착(arterial stenosis) 또는 동맥류(aneurysm)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The term " disease related to soft tissue remodeling "of the present invention means a disease in which the original shape of the tissue is denatured as the soft tissue is weakened due to the weakening of elasticity or binding force, and particularly, cardiac remodeling, arterial stenosis, Or aneurysm, but are not limited thereto.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물을 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관을 강화하는 방법 또는 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
In another embodiment of the present invention, the present invention provides a method for enhancing blood vessels of an individual or a method for preventing ischemic diseases, comprising administering the recombinant virus, cell therapy agent or pharmaceutical composition to a subject in a pharmaceutically effective amount Or < / RTI >

본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 국소투여가 바람직하다.
The term "pharmaceutically effective amount " of the present invention means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the sex of the patient, age, The activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art. Specifically, the recombinant virus, cell therapy agent or pharmaceutical composition of the present invention is preferably topically administered.

본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 혈관을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 혈관을 효과적으로 강화할 수 있으며 허혈성 질환을 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 혈관을 강화하는 방법은 인간을 제외한 동물을 대상으로 하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 혈관을 가지는 것을 고려할 때, 인간에 대해서도 충분히 사용되어 질 수 있다.
The term "individual" of the present invention means a mammal such as a horse, a sheep, a pig, a goat, a camel, an antelope, a dog, etc. having blood vessels whose symptoms can be improved by administration of a recombinant virus, a cell therapy agent or a pharmaceutical composition according to the present invention Or human. By administering the therapeutic composition according to the present invention to an individual, blood vessels can be effectively strengthened and ischemic diseases can be prevented and treated. The method for intensifying the blood vessel according to the present invention may be a method involving animals other than humans, but is not limited thereto. That is, human beings can be sufficiently used for humans, considering that they have blood vessels whose symptoms can be improved by administration of the recombinant virus, cell therapy agent or pharmaceutical composition according to the present invention.

본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. The term "administration" of the present invention means introduction of a predetermined substance into an animal by any appropriate method, and the route of administration of the recombinant virus, cell therapy agent or pharmaceutical composition according to the present invention may be any route It can be administered orally or parenterally via a conventional route. In addition, the therapeutic composition according to the present invention may be administered by any device capable of moving the active ingredient into the target cell.

본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 1 내지 10 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 5 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.The preferable dosage of the recombinant virus, cell therapy agent or pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the condition and body weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the administration route and the period, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered at 1 to 10 mg / kg, preferably 1 to 5 mg / kg per day. The administration may be carried out once a day or divided into several times.

본 발명의 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 단독으로, 또는 공지의 혈관 강화제 또는 허혈성 질환 치료제를 병용 투여하거나 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용하여 혈관 강화 또는 허혈성 질환 치료 효과를 증대시킬 수 있다.
The recombinant virus, cell therapeutic agent or pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with known therapeutic agents for vascular strengthening agents or ischemic diseases, or in combination with adjunctive therapeutic methods such as surgical surgical therapy to treat vascular strengthening or ischemic diseases The effect can be increased.

본 발명의 재조합 바이러스는 숙주세포에 형질감염시 hCARP를 발현하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 화학적, 물리적 스트레스에 대한 저항성이 증가하여, hCARP이 혈관 강화 효과를 가질 수 있으며 이에 따라 허혈성 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있음을 확인하였는바 이에 대한 유전자 치료 분야에서 널리 활용될 수 있을 것이다.
The recombinant virus of the present invention has been shown to express hCARP when transfected into a host cell, thereby increasing the resistance to chemical and physical stress, and hCARP may have a vasculoprotective effect, And it can be widely used in gene therapy field.

도 1a는 pLPCX 기반 레트로바이러스 벡터에 hCARP DNA를 삽입하여 재조합 레트로바이러스 발현벡터의 개열지도이다.
도 1b는 CARP 단백질 구조의 모식도로, CARP 단백질이 319 아미노산을 가지며, 4개의 ankyrin repeat elements (ANK1-4)를 가지고 nuclear localization signal (NLS)를 가지는 것을 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 레트로바이러스 생산 과정과 레트로바이러스의 유전자가 숙주세포에 유전자 삽입하는 과정을 나타낸 개요도이다.
도 3은 감염된 NIH3T3 세포주의 Human CARP의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도이다.
도 4는 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포에 대하여 Scratch assay를 하면서, 광학현미경 (CKX41, Olympus)을 이용하여 관찰한 사진이다.
도 5는 Real-time cell analyzer(RTCA, xCELLigence, Roche)의 구성, 작동 원리, 프로그램을 나타낸 사진이다.
도 6은 광학 현미경을 이용하여 Scratch assay의 결과를 확인한 도이다. 도 6의 A는 Scratch의 면적, B는 회복 면적, C는 회복 면적의 세포 숫자, D는 Scratch 부위의 회복 경계의 사진이다.
도 7은 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포에 대하여 세포 하나하나의 면적, 즉 세포 크기를 비교한 도면이다.
도 8은 RTCA-based scratch assay의 CI(cell index)를 측정한 것을 나타낸 도표이다.
도 9는 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포에 대하여 RTCA를 이용하여 Trypsin-EDTA에 대한 세포독성 실험 결과를 확인한 도표이다.
도 10은 hCARP NIH3T3 세포와 normal NIH3T3 세포에서 claudin-5의 발현을 확인한 도이다.1A is a cleavage map of a recombinant retrovirus expression vector by inserting hCARP DNA into a pLPCX-based retroviral vector.
FIG. 1B is a schematic diagram of the CARP protein structure, showing that the CARP protein has 319 amino acids and has nuclear localization signal (NLS) with four ankyrin repeat elements (ANK1-4).
FIG. 2 is a schematic diagram showing a process of producing a recombinant retrovirus and a process of gene insertion of a retrovirus gene into a host cell.
FIG. 3 shows Western blot analysis of the expression of human CARP in the infected NIH3T3 cell line.
FIG. 4 is a photograph of a normal NIH / 3T3 cell line and CARP NIH / 3T3 cells observed using an optical microscope (CKX41, Olympus) while performing a Scratch assay.
FIG. 5 is a photograph showing the configuration, operation principle, and program of a real-time cell analyzer (RTCA, xCELLigence, Roche).
6 is a view showing the results of a scratch assay using an optical microscope. FIG. 6A is a photograph of the area of Scratch, B is the recovery area, C is the cell number of the recovery area, and D is the recovery boundary of the scratch area.
FIG. 7 is a chart comparing the area of each cell, that is, the cell size, for normal NIH / 3T3 cell line and CARP NIH / 3T3 cell.
8 is a chart showing the measurement of the CI (cell index) of the RTCA-based scratch assay.
FIG. 9 is a chart showing the results of cytotoxicity test on Trypsin-EDTA using RTCA for normal NIH / 3T3 cell line and CARP NIH / 3T3 cell.
FIG. 10 shows the expression of claudin-5 in hCARP NIH3T3 cells and normal NIH3T3 cells.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. The following examples are provided to further understand the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

실시예Example 1:  One: HumanHuman CARPCARP 및  And nlsLacZnlsLacZ constructconstruct 제조 Produce

1-1. 1-1. hCARPhCARP 및  And nlsLacZnlsLacZ 유전자 수득 Gain genes

Human CARP(hCARP)는 pGEM-T-EASY 벡터(Promega)에 cloning되어 있는 hCARP를 받아(Kong, et al., The Korean Journal of Microbiology, Vol. 44, No. 4, 2008.12., p. 282-288) 이를 주형으로 하여 hCARP 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 hCARP DNA를 증폭하였다. 또한, ACP-nlsLacZ 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 nlsLacZ 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 nlsLacZ DNA를 증폭하였다. 이에 사용된 프라이머는 하기 표 1와 같다.Human CARP (hCARP) receives hCARP cloned in the pGEM-T-EASY vector (Promega) (Kong, et al., The Korean Journal of Microbiology, Vol.44, No. 4, 2008.12, 288). As a template, hCARP DNA was amplified by PCR using hCARP-specific primers. In addition, nlsLacZ DNA was amplified by PCR using nlsLacZ-specific primers using ACP-nlsLacZ plasmid DNA as a template. The primers used here are shown in Table 1 below.

PCR에 사용된 프라이머Primers used in PCR 프라이머primer 서열order 크기size 제한효소
서열Restriction enzyme
order hCARP forward
(서열번호 2)hCARP forward
(SEQ ID NO: 2) 5'-GAAGATCTATGATGGTACTGAAAGTAGAGGAACTG-3'5'-GAAGATCTATGATGGTACTGAAAGTAGAGGAACTG-3 ' 984 bp984 bp BglⅡ Bgl II hCARP reverse
(서열번호 3)hCARP reverse
(SEQ ID NO: 3) 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGAATGTAGCTATGCGAGAGG-3'5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGAATGTAGCTATGCGAGAGG-3 ' NotⅠ Note Ⅰ nlsLacZ forward
(서열번호 4)nlsLacZ forward
(SEQ ID NO: 4) 5'-GAAGATCTGTCGACGGCCTCTGAGCTATTC-3'5'-GAAGATCTGTCGACGGCCTCTGAGCTATTC-3 ' 3530 bp3530 bp BglⅡ Bgl II nlsLacZ reverse
(서열번호 5)nlsLacZ reverse
(SEQ ID NO: 5) 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCGGATCCGCCGAGTTTGTCAGAAA-3'5'-ATAGTTTAGCGGCCGCGGATCCGCCGAGTTTGTCAGAAA-3 ' NotⅠ Note Ⅰ

구체적으로는, 상기 5' 말단에 BglⅡ 제한효소 서열과 3' 말단에 NotⅠ 제한효소 서열을 삽입하기 위하여, 상기 표 1의 프라이머를 제작하여 XP cycler(Bioer, China)를 이용하여 PCR을 하였다. 40 ng/㎕ DNA 주형 1 ㎕, 10 pmol/㎕ forward 및 reverse 프라이머 1 ㎕, 10x buffer 5 ㎕, 2mM dNTP 5 ㎕, Neotherm Taq 0.5 ㎕, D.W. 36.5 ㎕를 넣고 실시하였다. Specifically, in order to insert the Bgl II restriction enzyme sequence at the 5 'end and the Not I restriction end sequence at the 3' end, the primers of Table 1 were prepared and PCR was performed using an XP cycler (Bioer, China) . 1 μl of 40 ng / μl DNA template, 1 μl of 10 pmol / μl forward and reverse primers, 5 μl of 10 × buffer, 5 μl of 2 mM dNTP, 0.5 μl of Neotherm Taq and 36 μl of DW.

hCARP 유전자 증폭은 95 ℃에서 5분간 초기 변성한 후, 95 ℃에서 30초 변성, 어닐링 62 ℃에서 30초 어닐링, 72 ℃에서 1분 증폭의 사이클을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합을 하였다.The hCARP gene amplification was initially performed at 95 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 62 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute, followed by 30 cycles of 72 ° C Respectively.

nlsLacZ 유전자 증폭은 95 ℃에서 5분간 초기 변성한 후, 95 ℃에서 30초 변성, 어닐링 64 ℃에서 40초 어닐링, 72 ℃에서 3분 40초 증폭의 사이클을 15회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합을 하였다.
The nlsLacZ gene amplification was initially denatured at 95 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 64 ° C for 40 seconds, and 72 ° C for 3 minutes and 40 seconds amplification. Minute polymerization.

1-2. 1-2. hCARPhCARP 및  And nlsLacZnlsLacZ 유전자  gene 클로닝Cloning

pGEM-T-EASY 벡터와 PCR product를 BglⅡ와 NotⅠ 제한효소로 반응시켜 잘라서, 아가로스 겔에 전기영동으로 분리한 후 gel extraction 방법을 통하여 잘려진 DNA 단편을 수득하였다.The pGEM-T-EASY vector and the PCR product were reacted with Bgl II and Not I restriction enzyme, and cut by electrophoresis on an agarose gel, followed by gel extraction to obtain a truncated DNA fragment.

각각 잘려진 벡터 : insert를 1 : 10 (molar ratio)로 섞은 후, T4 ligase(Roche, 독일)로 4℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. ligation product를 CaCl2를 이용하여 competent cell로 제작된 E. coli(DH5α)에 형질전환하였다. 구체적으로, 상기 ligation 반응물을 competent cell과 섞어준 후, 얼음 상에 30분간 기다린 뒤에 42℃에서 1분간 열충격을 주고, 1 ㎖의 새로운 LB 배지를 넣어주고 37 ℃에서 1시간 동안 shaking incubation하였다. 이를 50 ㎍/㎖의 ampicillin이 첨가된 고체 LB 배지에 plating한 후 37 ℃에서 12~ 16시간 동안 배양하였다. 이후 발생한 colony를 무작위적으로 선택하여 50 ㎍/㎖의 ampicillin이 존재하는 5 ㎖의 LB 배지에 접종하여 16시간 동안 37 ℃에서 shaking incubation하였다.Each truncated vector: insert was mixed at 1: 10 (molar ratio) and reacted with T4 ligase (Roche, Germany) at 4 ° C for 16 hours. The ligation product was transformed into competent E. coli (DH5α) using CaCl 2 . Specifically, the ligation reaction mixture was mixed with competent cells, followed by waiting for 30 minutes on ice, followed by thermal shock at 42 ° C for 1 minute, adding 1 ml of fresh LB medium, and shaking incubation at 37 ° C for 1 hour. It was plated on solid LB medium supplemented with ampicillin (50 μg / ml) and cultured at 37 ° C for 12 to 16 hours. Subsequent colonies were randomly selected and inoculated into 5 ml of LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and shaking incubated at 37 ° C for 16 hours.

상기에서 수득한 colony에 대해서 mini-preparation을 하여 제한효소 절단을 통해 유전자 삽입여부를 확인하였고, 염기서열 분석을 하였다.
The colonies obtained above were mini-prepared for restriction enzyme cleavage to confirm gene insertion and sequenced.

실시예Example 2 :  2 : pLPCXpLPCX 기반 레트로바이러스 벡터  Based retroviral vector constructconstruct 제작 making

pLPCX 기반 레트로바이러스 벡터들은 pLPC-eGFP 벡터를 이용하여 클로닝하였다. 즉, 상기 제작한 pGEM-T-EASY 벡터에 hCARP 및 nlsLacZ를 삽입한 플라스미드 DNA로부터 hCARP 및 nlsLacZ DNA를 수득하여 상기 pLPC 벡터에 삽입하였다.pLPCX-based retroviral vectors were cloned using the pLPC-eGFP vector. Namely, hCARP and nlsLacZ DNA were obtained from the plasmid DNA in which hCARP and nlsLacZ were inserted into the pGEM-T-EASY vector prepared above, and inserted into the pLPC vector.

pGEM-T-EASY 벡터에 hCARP 및 nlsLacZ를 삽입한 플라스미드와 pLPC-eGFP를 BglⅡ 및 NotⅠ로 처리하여 각각의 DNA 절단 단편을 수득하였다(Gel extraction kit, TAKARA, JAPAN). 이후 pLPCX 벡터와 각 insert를 1 : 20 (molar ratio)로 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 cloning을 실시하였으며, 염기서열분석을 하였다.The plasmid in which hCARP and nlsLacZ were inserted into pGEM-T-EASY vector and pLPC-eGFP were treated with Bgl II and Not I to obtain respective DNA cleavage fragments (Gel extraction kit, TAKARA, JAPAN). Then, the pLPCX vector and each insert were cloned in the same manner as in Example 1-2 with 1: 20 (molar ratio), and sequenced.

그 결과, 도 1의 pLPC-hCARP의 벡터를 제작하였다. Packaging cell에 vesicular somatitis virus-G(VSV-G) 단백질 유전자를 암호화하는 pVSV-G 벡터와 레트로바이러스 벡터 pLPCX를 co-transfection시켜 재조합 레트로바이러스를 생산하였다. Packaging cell에서 만들어지는 레트로바이러스에는 packaging signal이 존재하는 RNA만 capsidation이 되는데, pLPC-hCARP에만 packaging signal이 존재한다. 따라서 만들어지는 레트로바이러스 안에는 replication에 필요한 유전자들이 들어가지 못하게 되어 감염은 가능하지만 복제가 불가능한 레트로바이러스가 만들어진다(도 2).As a result, a vector of pLPC-hCARP shown in Fig. 1 was prepared. The recombinant retrovirus was produced by co-transfection of the pVSV-G vector and the retroviral vector pLPCX encoding the vesicular somatitis virus-G (GV) protein gene in the packaging cell. In retroviruses produced in packaging cells, only the RNA with the packaging signal is encapsidated. Only the packaging signal is present in pLPC-hCARP. Therefore, the retroviruses that are created do not contain the genes necessary for replication, and thus can produce infectious retroviruses that can not be cloned (Fig. 2).

Human CARP와 nlsLacZ를 PCR을 통하여 pLPCX 레트로바이러스 벡터의 MCS(multi-cloning site)에 클로닝하기 위하여 5'에 BglⅡ와 3'에 NotⅠ 제한효소 서열을 넣어 프라이머를 제작하였다. PCR 산물과 레트로바이러스 벡터를 ligation하여 제작하였으며, 클로닝이 되지 않은 벡터는 T-blunt(Solgent, 한국)를 이용하여 클로닝하였다.In order to clone human CARP and nlsLacZ into the MCS (multi-cloning site) of pLPCX retrovirus vector through PCR, primers were prepared by adding Not I restriction enzyme sequence to Bgl II and 3 'at 5'. PCR products and retroviral vectors were ligated and cloned were cloned using T-blunt (Solgent, Korea).

pLPCX 벡터에 클로닝된 hCARP는 hCMV 프로모터와 pLPCX 3'LTR 특이적 프라이머를 이용하여 서열을 확인하여 mutation이 없는 것을 확인하였다.
The hCARP cloned into the pLPCX vector was sequenced using the hCMV promoter and pLPCX 3'LTR specific primers to confirm that there was no mutation.

실시예Example 3 : 형질감염( 3: Transfection ( transfectiontransfection ) 및 레트로바이러스 생산) And retroviral production

3-1. 형질감염(3-1. Transfection ( transfectiontransfection ))

형질감염(transfection) 14시간 전에 GP293 세포주를 10%(v/v) FBS를 포함하는 DMEM 배지 10ml을 이용하여 100 mm 세포 배양 접시에 6 x 106 세포를 접종하였다. The transfection (transfection) 10% (v / v) 6 x 10 6 cells in 100 mm cell culture plate using a 10ml DMEM medium containing FBS for 14 hours prior to GP293 cells were inoculated.

해당 세포에 LipofectamineTM 2000(인비트로젠, USA)을 이용하여 형질감염을 수행하였다. 구체적으로는 1.5 ㎖ DMEM(w/o serum)에 레트로바이러스 벡터 pLPCX(23 ㎍)와 envelope vector(pVSV-G) DNA를 1 : 0.1 (molar ratio)가 되도록 넣어주고 가볍게 흔들어 주었다. 다른 tube에서 1.5 ㎖ DMEM에 LipofectamineTM 2000을 60 ㎕를 넣어 섞어서 상온에서 5분간 반응시켰다. 5분 후 DNA가 들어있는 DMEM과 LipofectamineTM 2000이 들어있는 DMEM을 섞어서 상온에서 20분간 반응시켰다. 이렇게 제조한 혼합액을 100 mm 세포 배양접시에 골고루 뿌리고 동물세포 배양기에서 4시간 동안 형질감염시켰다. 4시간 후에 1xPBS로 1회 세척해준 후 6 ㎖의 항생제가 없는 DMED으로 교체해 주었다. 형질감염의 효율을 높이기 위해 6시간 후에 동일한 방법으로 다시 실시하였다. 이후 새 DMEM 배지로 교체하였다.
The cells were transfected with Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen, USA). Specifically, retroviral vector pLPCX (23 μg) and envelope vector (pVSV-G) DNA were added to 1.5 ml DMEM (w / o serum) at a molar ratio of 1: 0.1 and lightly shaken. In another tube, 60 μl of Lipofectamine ™ 2000 was added to 1.5 ml DMEM, and the mixture was reacted at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, DMEM containing DNA and DMEM containing Lipofectamine ™ 2000 were mixed and reacted at room temperature for 20 minutes. The mixture thus prepared was evenly distributed in a 100 mm cell culture dish and transfected in an animal cell incubator for 4 hours. After 4 hours, it was washed once with 1xPBS and then replaced with 6 ml of DMED without antibiotics. The same procedure was repeated 6 hours later to increase the efficiency of transfection. And then replaced with fresh DMEM medium.

3-2. 레트로바이러스 수확3-2. Retrovirus harvesting

새 DMEM 배지로 교체하고 16~20시간 동물세포 배양기에서 배양하였다. 배양접시에 있는 배지를 모아서 다른 tube로 옮기고 새로운 DMEM 10 ㎖로 교체하였다. Tube에 모은 배지를 0.45 ㎛ filter를 이용하여 천천히 떨어뜨려서 필터링한 후 1 ㎖씩 나누어 -80 ℃에 보관하였다(1차 수확). 배지를 교체한 후 16시간 후 동일한 방법으로 2차 수확을 하였다.
Replaced with fresh DMEM medium and cultured in an animal cell incubator for 16-20 hours. The media in the culture dish was collected and transferred to another tube and replaced with 10 ml of fresh DMEM. The media collected in the tube was slowly dropped by using a 0.45 ㎛ filter, and then filtered and stored at -80 ° C (1 st harvest). Sixteen hours after the medium was replaced, the second harvest was performed in the same manner.

실시예Example 4. 레트로바이러스 감염 세포주 수득 4. Obtain Retroviral Infected Cell Lines

4-1. 레트로바이러스 감염4-1. Retrovirus infection

감염하기 하루 전에 NIH3T3 세포주를 2 ㎖ DMEM 배지를 이용하여 2x105 세포/35 mm 세포 농도로 접종한 후 동물세포 배양기에서 배양하였다. 2.5 ㎖ DMEM에 polybrene 72 ㎍을 넣어주고 레트로바이러스가 들어있는 배지 1 ㎖을 상기 하루 전 접종한 NIH3T3 세포에 골고루 뿌려주고, 동물세포 배양기에서 하루 동안 배양시켰다. 감염시킨 레트로바이러스 5 MOI로 동일한 방법으로 2회에 걸쳐 감염시켰다.
One day prior to infection, NIH3T3 cells were inoculated in 2 ml DMEM medium at a concentration of 2 × 10 5 cells / 35 mm cells and cultured in an animal cell incubator. 72 poly of polybrene was added to 2.5 ml of DMEM, and 1 ml of the medium containing retrovirus was evenly distributed to the NIH3T3 cells inoculated the day before and cultured in an animal cell incubator for one day. Infected retrovirus 5 MOI was infected twice in the same manner.

4-2. 4-2. HumanHuman CARPCARP 발현조사 Expression investigation

상기 감염된 NIH3T3 세포주에 Human CARP의 발현을 확인하였다. NIH3T3 세포에 LPC-hCARP 레트로바이러스를 감염시키고 2, 3, 4일이 지났을 때의 세포에서 각각 단백질을 추출하였다. The expression of human CARP was confirmed in the infected NIH3T3 cell line. NIH3T3 cells were infected with LPC-hCARP retrovirus and proteins were extracted from the cells after 2, 3, and 4 days, respectively.

우선, 상기 감염된 NIH3T3 세포주를 키우는 배양접시로부터 배지를 제거한 후 PBS로 세척하고, RIPA buffer(25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 500 ㎕ 넣고 5분간 얼음상에서 반응시켰다. 세포를 1.5 ㎖ tube로 옮긴 후, 50 % pulse로 30초간 초음파 분쇄(sonication)하고, 4 ℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리 후, 상층액만 새로운 tube로 옮겨 micro BCA protein assay kit(Thermo, USA)를 이용하여 정량하였다.First, the medium was removed from the culture dish in which the infected NIH3T3 cell line was grown, followed by washing with PBS. The cells were washed with RIPA buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, Was added and reacted on ice for 5 minutes. Cells were transferred to a 1.5-ml tube, sonicated for 30 seconds at 50% pulse, centrifuged at 13,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C, and transferred to a new tube using a micro BCA protein assay kit (Thermo, USA ).

상기 추출된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동을 통하여 분리하고, PDVF western blotting membrane(Roche, USA)로 옮겨, Human CARP에 대한 항체(카톨릭대학교 이정화 교수 제공)을 이용한 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다(도 3).
The extracted proteins were separated by SDS-PAGE electrophoresis, transferred to a PDVF western blotting membrane (Roche, USA), and confirmed by Western blotting using an antibody against human CARP (provided by Professor Lee Jung Hwa, Catholic University) ).

실시예Example 5 :  5: ScratchScratch assayassay 측정 Measure

5-1. 5-1. ScratchScratch assayassay

6 well 배양접시에 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포 1.5 x 105개를 10% (v/v) FBS와 1% (v/v) 항생제(antibiotics)를 포함한 DMEM 배지 2 ㎖에 접종한 후 48 시간 뒤에 yellow tip을 이용하여 세로로 scratch를 주었다. 하나의 well에 2줄의 scratch를 주었으며 scratch로 인하여 부양되어 버린 cell의 안정화를 위해 2 시간 뒤의 모습부터 23 시간 뒤의 회복중인 scratch를 광학현미경 (CKX41, Olympus)을 이용하여 관찰하고 I'MEASURE 2.0 (INGPLUS) 프로그램을 이용하여 촬영을 하였다(n=5, 4x)(도 4). I'MEASURE 2.0 program을 이용해 촬영된 사진 속의 scratch의 면적을 구하여 scratch의 크기, 회복된 면적을 구하고 각각 비교하여 data를 얻었다.
1.5 x 10 5 normal NIH / 3T3 cells and 1.5 x 10 5 CARP NIH / 3T3 cells were seeded in 2 ml DMEM medium containing 10% (v / v) FBS and 1% (v / v) antibiotics in a 6-well culture dish After 48 hours, scratch was applied vertically using a yellow tip. Two rows of scratches were applied to one well. In order to stabilize the cells that had been floated due to scratching, scratches recovered after 2 hours were observed using an optical microscope (CKX41, Olympus) and I'MEASURE 2.0 (INGPLUS) program (n = 5, 4x) (Fig. 4). I'MEASURE 2.0 program was used to obtain the area of scratches in the photographs, and the size of the scratches and the recovered areas were obtained.

5-2. 세포의 크기 비교5-2. Comparison of cell size

hCARP NIH3T3 세포(n = 90)와 normal NIH3T3 세포(n = 82)의 세포 면적의 크기를 광학현미경(CKX41, Olympus)을 이용하여 관찰하고 I'MEASURE 2.0 (INGPLUS) 프로그램을 이용하여 데이터를 구하고 비교하였다. 세포 접종 후 48 시간이 지난 다음 세포의 크기를 관찰하였다.
The cell size of hCARP NIH3T3 cells (n = 90) and normal NIH3T3 cells (n = 82) were observed using an optical microscope (CKX41, Olympus) and data were obtained using the I'MEASURE 2.0 (INGPLUS) program Respectively. After 48 hours of cell inoculation, the size of the cells was observed.

5-3. 5-3. RealReal -- TimeTime CellCell AnalyzerAnalyzer 를 이용한 Using scratchscratch assayassay

Real-time cell analyzer(RTCA, xCELLigence, Roche)는 바닥이 도금 micro-electrode로 처리된 RTCA 전용 16 well E-plate, E-plate를 장착하여 미세전류를 주기적으로 보내 변화하는 저항값을 측정할 수 있는 RTCA DP와 RTCA DP로부터 전달되는 data를 실시간으로 E-plate에 미세전류를 흘려보내 변화하는 저항값(Cell Index value: CI value)을 측정하여 cell의 증가와 감소, 부착능력 등의 변화를 측정하고 모니터링을 할 수 있는 장치이다(도 5).A real-time cell analyzer (RTCA, xCELLigence, Roche) is equipped with a 16-well E-plate for RTCA treated with a bottom-coated micro-electrode. Measurement of the change in cell resistance (Cell Index value: CI value) by flowing a microcurrent to the E-plate in real time from the RTCA DP and RTCA DP (Fig. 5).

RTCA를 이용하여 scratch assay의 저항성과 회복을 실시간으로 측정하였다. E-plate에 hCARP NIH3T3 세포(n = 10)와 normal NIH3T3 세포(n = 10)을 well에 각각 6,000개의 세포를 100 ㎕ 배지와 함께 깔아주고 48 시간 후에 white tip으로 scratch를 주었다. scratch 없는 대조군(n = 4)와 비교하여 측정하였다. 측정 간격은 10 분으로 설정하였고 266시간까지 측정하였다.
The resistance and recovery of the scratch assay were measured in real time using RTCA. E-plates were plated with hCARP NIH3T3 cells (n = 10) and normal NIH3T3 cells (n = 10) in wells with 6,000 cells each with 100 μl of medium, followed by scratching with a white tip for 48 hours. and compared with a control without scratch (n = 4). The measurement interval was set to 10 minutes and measured up to 266 hours.

5-4. 결과 분석5-4. Results analysis

상기 결과를 통하여 hCARP NIH/3T3 cell 이 인위적인 scratch에 대한 저항성이 normal NIH/3T3 cell보다 13% 강하고, scratch 후 상처 회복정도가 상대적으로 65% 빠름을 확인하였다. 또한, RTCA에서 측정되는 Cell Index (CI) 값은 세포가 plate에 붙는 정도에 따라서 결정되는데, hCARP NIH/3T3 cell의 CI 값이 normal NIH/3T3 cell보다 1.8배 높게 측정이 되었고 이는 hCARP NIH/3T3 cell이 배양접시 바닥에 normal NIH/3T3 cell보다 넓고 강하게 부착함을 의미한다(도 6 내지 도 8).
These results indicate that hCARP NIH / 3T3 cells are 13% more resistant to artificial scratch than normal NIH / 3T3 cells and 65% faster after scratching. The CI value of hCARP NIH / 3T3 cells was 1.8 times higher than that of normal NIH / 3T3 cells, which was measured by hCARP NIH / 3T3 cells cells are wider and more strongly attached to the bottom of the culture dish than normal NIH / 3T3 cells (FIGS. 6 to 8).

실시예Example 6: 세포 생존율 실험 6: Cell survival rate experiment

6-1. 6-1. TrypsinTrypsin -- EDTAEDTA 세포독성 실험 Cytotoxicity experiment

RTCA를 이용하여 Trypsin-EDTA에 대한 세포독성 실험을 진행하였다. E-plate에 hCARP 유전자로 형질감염된 NIH3T3 세포(n=4)와 normal NIH3T3 세포(n=4)를 well에 각각 6,000개 세포를 100 ㎕ 배지와 함께 깔아주고 24 시간 후에 1xtrypsin/EDTA를 배지에 40%, 20%, 10%로 희석시켜 100 ㎕를 넣어주었다. 측정 간격은 10 분으로 설정하였고, 276 시간까지 측정하였다. 얻어진 data로 trypsin/EDTA의 IC50 값을 구하였다(도 9).
The cytotoxicity test for Trypsin-EDTA was carried out using RTCA. 6,000 cells were plated in 100 μl of each well of the NIH3T3 cells (n = 4) and normal NIH3T3 cells (n = 4) transfected with the hCARP gene in the E-plate. After 24 hours, %, 20%, and 10%, respectively. The measurement interval was set at 10 minutes and measured up to 276 hours. IC 50 values of trypsin / EDTA were determined from the obtained data (FIG. 9).

6-2. 6-2. HypoxiaHypoxia mimeticsmimetics 세포독성 실험 Cytotoxicity experiment

RTCA를 이용하여 hypoxia mimetics에 대한 세포독성 실험을 진행하였다. Hypoxia mimetics로는 잘 알려진 Cobalt(Ⅲ) chloride hexahydrate(CoCl2, Sigma-aldrich, co., USA)와 2,2'-bipyridyl(Sigma-aldrich, co., USA)를 사용하였다. E-plate에 hCARP NIH3T3 세포(n = 3)와 normal NIH3T3 세포(n = 3)를 well에 각각 6,000개 세포를 100 ㎕ 배지와 함께 깔아주고 24 시간 후에 CoCl2를 300 μM, 450 μM, 600 μM의 농도로 처리하였다. 측정 간격은 10분으로 설정하였고, 276 시간까지 측정하였다. 얻어진 data로 CoCl2와 2,2'-bipyridyl의 IC50 값을 구하였다.
Cytotoxicity tests for hypoxia mimetics were performed using RTCA. Cobalt (Ⅲ) chloride hexahydrate (CoCl 2 , Sigma-aldrich, co. USA) and 2,2'-bipyridyl (Sigma-aldrich, co. USA) were used for Hypoxia mimetics. 6,000 cells were plated in 100 μl culture medium in the wells of hCARP NIH3T3 cells (n = 3) and normal NIH3T3 cells (n = 3) in the E-plate and CoCl 2 was added at 300 μM, 450 μM and 600 μM . ≪ / RTI > The measurement interval was set at 10 minutes and measured up to 276 hours. The IC 50 values of CoCl 2 and 2,2'-bipyridyl were determined from the obtained data.

6-3. 결과 분석6-3. Results analysis

상기 실험을 통하여 측정한 Trypsin/EDTA, CoCl2 및 2,2'-bipyridyl의 hCARP NIH3T3와 normal NIH3T3에 대한 IC50은 하기 표 2와 같았다.The IC 50 values of Trypsin / EDTA, CoCl 2, and 2,2'-bipyridyl of hCARP NIH3T3 and normal NIH3T3 measured through the above experiment were as shown in Table 2 below.

Trypsin/EDTATrypsin / EDTA CoCl2 CoCl 2 2,2'-bipyridyl2,2'-bipyridyl hCARP NIH3T3hCARP NIH3T3 3.9917x10%3.9917x10% 1.1246x104 M1.1246x10 4 M 9.7557x10-5 M9.7557x10 -5 M R2 : 0.99426R 2 : 0.99426 R2 : 0.87707R 2 : 0.87707 R2 : 0.9672R 2 : 0.9672 Normal NIH3T3Normal NIH3T3 3.1137x10%3.1137x10% 1.0888x103 M1.0888x10 3 M 7.8598x10-5 M7.8598x10 -5 M R2 : 0.98468R 2 : 0.98468 R2 : 0.9581R 2 : 0.9581 R2 : 0.99148R 2 : 0.99148

구체적으로, 측정된 CI(Cell Index) 값은 hCARP NIH/3T3 cell의 경우 mock이 7.5, 40% trypsin/EDTA가 6.4로 1.1의 차이를 보이며 약 15%가 감소하였다. Normal NIH/3T3 cell의 경우 mock이 3.4, 40% trypsin/EDTA가 2.6으로 0.8의 차이를 보이며 약 24%가 감소하였다. hCARP NIH/3T3 cell의 CI 값이 normal NIH/3T3 cell보다 더욱 많이 떨어졌지만 상대적 비율로 계산하면 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 약 9% trypsin/EDTA에 더욱 강한 것을 확인하였다. IC50 값은 hCARP NIH/3T3 cell이 3.9917x10%, normal NIH/3T3 cell이 3.1137x10%으로 측정되었다.Specifically, the measured CI (cell index) of hCARP NIH / 3T3 cell showed mock 7.5 and 40% trypsin / EDTA 6.4, showing a difference of 1.1 and 15%. In the case of normal NIH / 3T3 cells, the mock was 3.4 and 40% trypsin / EDTA was 2.6, which was about 0.8 and decreased about 24%. Although the CI value of hCARP NIH / 3T3 cell was much lower than that of normal NIH / 3T3 cell, it was confirmed that hCARP NIH / 3T3 cell was stronger than 9% trypsin / EDTA than normal NIH / 3T3 cell by relative ratio. IC 50 values were 3.9917x10% for hCARP NIH / 3T3 cells and 3.1137x10% for normal NIH / 3T3 cells.

RTCA를 사용하여 hCARP gene이 전달된 NIH/3T3 cell의 hypoxia mimetics cytotoxicity 확인 실험을 진행한 결과, CoCl2의 경우 hCARP NIH/3T3 cell에서 IC50 값이 1.1246x104 M, normal NIH/3T3 cell에서 IC50 값이 1.0888x103 M로 측정되었다. 이러한 결과는 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 CoCl2의 영향에 더 잘 견딤을 의미하는 결과이다. 2, 2'- bipyridyl에서는 hCARP NIH/3T3 cell에서 IC50 값이 9.7557x10-5 M, normal NIH/3T3 cell에서 IC50 값이 7.8598x10-5 M로 측정되었다. 이는 2, 2'-bipyridyl에서도 마찬가지로 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 2, 2'- bipyridyl의 영향에 잘 견딤을 의미한다. 이러한 결과는 hypoxia 상태에서 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 viability가 우수함을 제시한다.
As a result of confirming the hypoxia mimetics cytotoxicity of the NIH / 3T3 cells transfected with the hCARP gene using RTCA, the IC 50 value in the hCARP NIH / 3T3 cell was 1.1246 × 10 4 M in the case of CoCl 2 , 50 value was measured as 1.0888x10 < 3 > M. These results indicate that hCARP NIH / 3T3 cells are more resistant to the effects of CoCl 2 than normal NIH / 3T3 cells. 2, the 2'- bipyridyl The IC 50 value in hCARP NIH / 3T3 cell the IC 50 value 9.7557x10 -5 M, normal NIH / 3T3 cell was determined to be at 7.8598x10 -5 M. This suggests that hCARP NIH / 3T3 cells also endure the effects of 2, 2'-bipyridyl over normal NIH / 3T3 cells in 2, 2'-bipyridyl. These results suggest that hCARP NIH / 3T3 cells are more viable than normal NIH / 3T3 cells in the hypoxia state.

실시예Example 7:  7: ClaudinClaudin -5 발현 측정-5 expression measurement

혈관내벽의 지름이 감소하여 생기는 허혈에 대한 효과적인 치료방법으로는 굵고 튼튼한 혈관형성이 필수적이다. 이러한 혈관은 모세관이 형성된 뒤 자극을 받게 되면 cell-to-cell junction을 이루는 tight junction-related gene의 발현으로 혈관의 integrity를 증가시키는 과정을 거쳐 굵고 튼튼한 혈관으로 발전하게 된다. 내피세포에서 많이 발현되는 tight junction gene중 하나인 claudin-5의 발현을 hCARP를 전달해준 hCARP NIH3T3 세포와 normal NIH3T3 세포에서 확인하였다.
In order to effectively treat ischemia caused by a decrease in the diameter of the inner wall of the blood vessel, it is necessary to form thick and strong blood vessels. When these vessels are stimulated after capillary formation, the tight junction-related gene, which is a cell-to-cell junction, is expressed to increase the integrity of blood vessels and develop into thick and strong blood vessels. Expression of claudin-5, one of the tight junction genes that are highly expressed in endothelial cells, was confirmed in hCARP-NIH3T3 cells and normal NIH3T3 cells.

7-1. 7-1. totaltotal RNARNA 분리( detach( isolationisolation ))

hCARP NIH3T3 세포와 normal NIH3T3 세포에서 total RNA를 분리하였다. Reagent는 Trizol(인비트로젠)을 사용하였다. 각각의 세포가 100 mm 배양접시에 가득차게 되었을 때, 1xPBS 5 ㎖로 2회에 걸쳐 세척한 후, Trizol 2 ㎖을 처리하여 5분 동안 상온에서 배양하였다. 파이펫팅을 통하여 cell을 배양접시로부터 분리한 후 클로로포름을 360 ㎕ 첨가하고, vortex하여 4 ℃ 원심분리기에서 10분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 새로운 tube에 옮긴 후 동일 volume의 isopropanol을 첨가하여 vortex하고 상온에서 15분간 배양한 뒤 4 ℃ 원심분리시에서 30분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 70 %(v/v) 에탄올을 200 ㎕ 첨가하여 7분 동안 4 ℃ 원심분리기에서 13,000 rpm으로 원심분리하고 상층액을 제거하고 DEPC를 처리한 H2O 12 ㎕에 녹였다.
Total RNA was isolated from hCARP NIH3T3 cells and normal NIH3T3 cells. Reagent used Trizol (Invitrogen). When each cell was filled in a 100 mm culture dish, it was washed twice with 5 ml of 1xPBS, treated with 2 ml of Trizol, and cultured at room temperature for 5 minutes. After the cells were separated from the culture dish by pipetting, 360 μl of chloroform was added, followed by vortexing and centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes in a 4 ° C centrifuge. The supernatant was transferred to a new tube, and the same volume of isopropanol was added. After vortexing for 15 min at room temperature, centrifugation was performed at 13,000 rpm for 30 min at 4 ° C. The supernatant was removed and 200 μl of 70% (v / v) ethanol was added. The mixture was centrifuged at 13,000 rpm for 7 min at 4 ° C for 7 min. The supernatant was removed and dissolved in 12 μl of DEPC-treated H 2 O.

7-2. 7-2. ReverseReverse transcriptiontranscription 실험 Experiment

상기 실시예 7-1에서 분리한 total RNA 중 0.5 ㎍을 10 pmole의 18 mer oligo dT와 섞은 후 65 ℃에서 5분간 배양한 다음, 4 ℃에서 10분간 보관하였다. 그 후, 10x RT buffer, 10 mM의 dNTP mix와 섞은 후 M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, 한국)를 첨가하여 37 ℃에서 1시간 반응하고, 75 ℃에서 5분간 가열하여 역전사 효소의 활성을 완전히 억제한 뒤 4 ℃에서 보관하였다.
0.5 μg of the total RNA isolated in Example 7-1 was mixed with 10 pmole of 18 mer oligo dT and incubated at 65 ° C. for 5 minutes and then stored at 4 ° C. for 10 minutes. Then, the mixture was mixed with 10 × RT buffer and 10 mM dNTP mix, followed by reaction with M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, Korea) at 37 ° C. for 1 hour and heating at 75 ° C. for 5 minutes to completely inhibit the activity of reverse transcriptase And stored at 4 ° C.

7-3. 7-3. PCRPCR 확인 Confirm

실시예 7-2에서 얻은 cDNA를 이용하여 10xPCR buffer, dNTP mix, GAPDH 특이적 프라이머와 Diastar Taq polymerase(Solgent, 한국)로 PCR 반응을 수행하였다. 이를 통하여 reverse transcription이 잘 수행되어졌음을 확인하고, mouse claudin-5 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 2).Using the cDNA obtained in Example 7-2, PCR reaction was performed with 10x PCR buffer, dNTP mix, GAPDH specific primer and Diastar Taq polymerase (Solgent, Korea). PCR was carried out using mouse claudin-5-specific primers (Table 2).

PCR에 사용된 프라이머Primers used in PCR 프라이머primer 서열order 크기size mClaudin-5 forward
(서열번호 6)mClaudin-5 forward
(SEQ ID NO: 6) 5'-GTA GCA CTC TTT GTT ACC TTG A-3'5'-GTA GCA CTC TTT GTT ACC TTGA-3 ' 696 bp696 bp mClaudin-5 reverse
(서열번호 7)mClaudin-5 reverse
(SEQ ID NO: 7) 5'-CCA GGA TCT CAG TAG GAA CTG TT-3'5'-CCA GGA TCT CAG TAG GAA CTG TT-3 ' mGAPDH forward
(서열번호 8)mGAPDH forward
(SEQ ID NO: 8) 5'-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA-3'5'-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA-3 ' 210 bp210 bp mGAPDH reverse
(서열번호 9)mGAPDH reverse
(SEQ ID NO: 9) 5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3 '

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이, 기존 normal NIH/3T3 cell에서는 claudin-5 발현이 확인되지 않은 반면, hCARP NIH/3T3 cell에서는 mRNA의 발현이 확인되었다.
As a result, as shown in FIG. 10, no expression of claudin-5 was observed in the normal normal NIH / 3T3 cell, whereas mRNA expression was observed in the hCARP NIH / 3T3 cell.

상술한 결과를 종합하면, 본 발명의 재조합 레트로바이러스를 이용한 hCARP 유전자 형질감염을 통하여 혈관내피세포 등의 세포들의 부착성 향상 및 외부 물리적 및 hypoxia 등의 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 hCARP 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스를 이용하여 혈관 강화 또는 허혈성 질환 유전자 치료 분야에서 널리 사용될 수 있음을 확인하였다.
Taken together, it was confirmed that hCARP gene transfection using the recombinant retrovirus of the present invention can increase the adhesion of cells such as vascular endothelial cells and increase resistance to external physical and hypoxia stresses . That is, it was confirmed that the recombinant retrovirus containing the hCARP gene of the present invention can be widely used in the field of vascular strengthening or ischemic disease gene therapy.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
From the above description, it will be understood by those skilled in the art to which the present invention pertains that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention, rather than the above detailed description, as well as all changes or modifications derived from the meaning and scope of the appended claims and their equivalents.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Recombinant virus comprising polynucleotide encoding hCARP and uses thereof <130> PA130802KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> human Cardiac Ankyrin Repeat Protein <400> 1 atgatggtac tgaaagtaga ggaactggtc actggaaaga agaatggcaa tggggaggca 60 ggggaattcc ttcctgagga tttcagagat ggagagtatg aagctgctgt tactttagag 120 aagcaggagg atctgaagac acttctagcc caccctgtga ccctggggga gcaacagtgg 180 aaaagcgaga aacaacgaga ggcagagctc aaaaagaaaa aactagaaca aagatcaaag 240 cttgaaaatt tagaagacct tgaaataatc attcaactga agaaaaggaa aaaatacagg 300 aaaactaaag ttccagttgt aaaggaacca gaacctgaaa tcattacgga acctgtggat 360 gtgcctacgt ttctgaaggc tgctctggag aataaactgc cagtagtaga aaaattcttg 420 tcagacaaga acaatccaga tgtttgtgat gagtataaac ggacagctct tcatagagca 480 tgcttggaag gacatttggc aattgtggag aagttaatgg aagctggagc ccagatcgaa 540 ttccgtgata tgcttgaatc cacagccatc cactgggcaa gccgtggagg aaacctggat 600 gttttaaaat tgttgctgaa taaaggagca aaaattagcg cccgagataa gttgctcagc 660 acagcgctgc atgtggcggt gaggactggc cactatgagt gcgcggagca tcttatcgcc 720 tgtgaggcag acctcaacgc caaagacaga gaaggagata ccccgttgca tgatgcggtg 780 agactgaacc gctataagat gatccgactc ctgattatgt atggcgcgga tctcaacatc 840 aagaactgtg ctgggaagac gccgatggat ctggtgctac actggcagaa tggaaccaaa 900 gcaatattcg acagcctcag agagaactcc tacaagacct ctcgcatagc tacattctga 960 960 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCARP forward primer <400> 2 gaagatctat gatggtactg aaagtagagg aact 34 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCARP reverse primer <400> 3 atagtttagc ggccgctcag aatgtagcta tgcgagagg 39 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nlsLacZ forward primer <400> 4 gaagatctgt cgacggcctc tgagctattc 30 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nlsLacZ reverse primer <400> 5 atagtttagc ggccgcggat ccgccgagtt tgtcagaaa 39 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mClaudin-5 forward primer <400> 6 gtagcactct ttgttacctt ga 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mClaudin-5 reverse primer <400> 7 ccaggatctc agtaggaact gtt 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH forward primer <400> 8 tgacatcaag aaggtggtga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH reverse primer <400> 9 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 10 <211> 7179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLPC-hCARP <400> 10 tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60 ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120 tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180 gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240 ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300 tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360 taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420 agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480 ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540 ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc acgacggggg tctttcattt gggggctcgt 600 ccgggatttg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggcc 660 agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg tttgatgtta tgcgcctgcg 720 tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa ctgacgagtt 780 ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc gtttttgtgg 840 cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg tggttctggt 900 aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggaa 960 ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagcg ctgcagcatc gttctgtgtt gtctctgtct 1020 gactgtgttt ctgtatttgt ctgaaaatta gggccagact gttaccactc ccttaagttt 1080 gaccttaggt cactggaaag atgtcgagcg gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa 1140 gaagagacgt tgggttacct tctgctctgc agaatggcca acctttaacg tcggatggcc 1200 gcgagacggc acctttaacc gagacctcat cacccaggtt aagatcaagg tcttttcacc 1260 tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 1320 tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc 1380 atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440 tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattgatccc ccgggctgca ggtcggccgc 1500 cacgaccggt gccgccacca tcccctgacc cacgcccctg acccctcaca aggagacgac 1560 cttccatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg 1620 ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc 1680 cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 1740 tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 1800 cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 1860 gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 1920 aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 1980 tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 2040 tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 2100 ccgccgacgt cgagtgcccg aaggaccgcg cgacctggtg catgacccgc aagcccggtg 2160 cctgacgccc gccccacgac ccgcagcgcc cgaccgaaag gagcgcacga ccccatggct 2220 ccgaccgaag ccgacccggg cggccccgcc gaccccgcac ccgcccccga ggcccaccga 2280 ctctagtaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 2340 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2400 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2460 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2520 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2580 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2640 atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2700 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2760 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2820 cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg ctagcgctac 2880 cggactcaga tctatgatgg tactgaaagt agaggaactg gtcactggaa agaagaatgg 2940 caatggggag gcaggggaat tccttcctga ggatttcaga gatggagagt atgaagctgc 3000 tgttacttta gagaagcagg aggatctgaa gacacttcta gcccaccctg tgaccctggg 3060 ggagcaacag tggaaaagcg agaaacaacg agaggcagag ctcaaaaaga aaaaactaga 3120 acaaagatca aagcttgaaa atttagaaga ccttgaaata atcattcaac tgaagaaaag 3180 gaaaaaatac aggaaaacta aagttccagt tgtaaaggaa ccagaacctg aaatcattac 3240 ggaacctgtg gatgtgccta cgtttctgaa ggctgctctg gagaataaac tgccagtagt 3300 agaaaaattc ttgtcagaca agaacaatcc agatgtttgt gatgagtata aacggacagc 3360 tcttcataga gcatgcttgg aaggacattt ggcaattgtg gagaagttaa tggaagctgg 3420 agcccagatc gaattccgtg atatgcttga atccacagcc atccactggg caagccgtgg 3480 aggaaacctg gatgttttaa aattgttgct gaataaagga gcaaaaatta gcgcccgaga 3540 taagttgctc agcacagcgc tgcatgtggc ggtgaggact ggccactatg agtgcgcgga 3600 gcatcttatc gcctgtgagg cagacctcaa cgccaaagac agagaaggag ataccccgtt 3660 gcatgatgcg gtgagactga accgctataa gatgatccga ctcctgatta tgtatggcgc 3720 ggatctcaac atcaagaact gtgctgggaa gacgccgatg gatctggtgc tacactggca 3780 gaatggaacc aaagcaatat tcgacagcct cagagagaac tcctacaaga cctctcgcat 3840 agctacattc tgagcggccg cctcggccaa acatcgataa aataaaagat tttatttagt 3900 ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta 3960 acgccatttt gcaaggcatg gaaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg 4020 tcaggaacag atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc 4080 tgccccggct cagggccaag aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct 4140 gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc 4200 agccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa 4260 tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct 4320 tctgctcccc gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggggcgc cagtcctccg 4380 attgactgag tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac 4440 ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg 4500 ggtctttcat ttgggggctc gtccgggatc gggagacccc tgcccaggga ccaccgaccc 4560 accaccggga ggtaagctgg ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 4620 cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 4680 gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca 4740 cgtagcgata gcggagtgta ctgataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag 4800 gtctgaagag gagtttacgt ccagccaagc tagggccgcg atccggaacc cttaatataa 4860 cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cagtactggc ttaactatgc ggcatcagag 4920 cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4980 aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 5040 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 5100 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 5160 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 5220 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 5280 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 5340 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 5400 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 5460 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 5520 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 5580 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 5640 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 5700 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5760 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5820 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5880 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5940 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 6000 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 6060 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 6120 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 6180 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 6240 gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 6300 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 6360 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6420 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 6480 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 6540 tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 6600 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 6660 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6720 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6780 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6840 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6900 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 6960 ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaatt gctagcaatt 7020 gctagcaatt gctagcaatt cataccagat caccgaaaac tgtcctccaa atgtgtcccc 7080 ctcacactcc caaattcgcg ggcttctgcc tcttagacca ctctacccta ttccccacac 7140 tcaccggagc caaagccgcg gcccttccgt ttctttgct 7179 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Recombinant virus comprising polynucleotide encoding hCARP and          uses thereof <130> PA130802KR <160> 10 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> human Cardiac Ankyrin Repeat Protein <400> 1 atgatggtac tgaaagtaga ggaactggtc actggaaaga agaatggcaa tggggaggca 60 ggggaattcc ttcctgagga tttcagagat ggagagtatg aagctgctgt tactttagag 120 aagcaggagg atctgaagac acttctagcc caccctgtga ccctggggga gcaacagtgg 180 aaaagcgaga aacaacgaga ggcagagctc aaaaagaaaa aactagaaca aagatcaaag 240 cttgaaaatt tagaagacct tgaaataatc attcaactga agaaaaggaa aaaatacagg 300 aaaactaaag ttccagttgt aaaggaacca gaacctgaaa tcattacgga acctgtggat 360 gtgcctacgt ttctgaaggc tgctctggag aataaactgc cagtagtaga aaaattcttg 420 tcagacaaga acaatccaga tgtttgtgat gagtataaac ggacagctct tcatagagca 480 tgcttggaag gacatttggc aattgtggag aagttaatgg aagctggagc ccagatcgaa 540 ttccgtgata tgcttgaatc cacagccatc cactgggcaa gccgtggagg aaacctggat 600 gttttaaaat tgttgctgaa taaaggagca aaaattagcg cccgagataa gttgctcagc 660 acagcgctgc atgtggcggt gaggactggc cactatgagt gcgcggagca tcttatcgcc 720 tgtgaggcag acctcaacgc caaagacaga gaaggagata ccccgttgca tgatgcggtg 780 agactgaacc gctataagat gatccgactc ctgattatgt atggcgcgga tctcaacatc 840 aagaactgtg ctgggaagac gccgatggat ctggtgctac actggcagaa tggaaccaaa 900 gcaatattcg acagcctcag agagaactcc tacaagacct ctcgcatagc tacattctga 960                                                                          960 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCARP forward primer <400> 2 gaagatctat gatggtactg aaagtagagg aact 34 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCARP reverse primer <400> 3 atagtttagc ggccgctcag aatgtagcta tgcgagagg 39 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nlsLacZ forward primer <400> 4 gaagatctgt cgacggcctc tgagctattc 30 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nlsLacZ reverse primer <400> 5 atagtttagc ggccgcggat ccgccgagtt tgtcagaaa 39 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mClaudin-5 forward primer <400> 6 gtagcactct ttgttacctt ga 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mClaudin-5 reverse primer <400> 7 ccaggatctc agtaggaact gtt 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH forward primer <400> 8 tgacatcaag aaggtggtga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH reverse primer <400> 9 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 10 <211> 7179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLPC-hCARP <400> 10 tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60 ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120 tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180 gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240 ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300 tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360 taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420 agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480 ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540 ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc acgacggggg tctttcattt gggggctcgt 600 ccgggatttg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggcc 660 agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg tttgatgtta tgcgcctgcg 720 tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa ctgacgagtt 780 ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc gtttttgtgg 840 cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg tggttctggt 900 aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggaa 960 ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagcg ctgcagcatc gttctgtgtt gtctctgtct 1020 gactgtgttt ctgtatttgt ctgaaaatta gggccagact gttaccactc ccttaagttt 1080 gaccttaggt cactggaaag atgtcgagcg gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa 1140 gaagagacgt tgggttacct tctgctctgc agaatggcca acctttaacg tcggatggcc 1200 gcgagacggc acctttaacc gagacctcat cacccaggtt aagatcaagg tcttttcacc 1260 tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 1320 tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc 1380 atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440 tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattgatccc ccgggctgca ggtcggccgc 1500 cccgaccggt gccgccacca tcccctgacc cacgcccctg acccctcaca aggagacgac 1560 cttccatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg 1620 ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc 1680 cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 1740 tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 1800 cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 1860 gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 1920 aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 1980 tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 2040 tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 2100 ccgccgacgt cgagtgcccg aaggaccgcg cgacctggtg catgacccgc aagcccggtg 2160 cctgacgccc gccccacgac ccgcagcgcc cgaccgaaag gagcgcacga ccccatggct 2220 ccgaccgaag ccgacccggg cggccccgcc gaccccgcac ccgcccccga ggcccaccga 2280 ctctagtaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 2340 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2400 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2460 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2520 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2580 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2640 atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2700 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2760 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2820 cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg ctagcgctac 2880 cggactcaga tctatgatgg tactgaaagt agaggaactg gtcactggaa agaagaatgg 2940 caatggggag gcaggggaat tccttcctga ggatttcaga gatggagagt atgaagctgc 3000 tgttacttta gagaagcagg aggatctgaa gacacttcta gcccaccctg tgaccctggg 3060 ggagcaacag tggaaaagcg agaaacaacg agaggcagag ctcaaaaaga aaaaactaga 3120 acaaagatca aagcttgaaa atttagaaga ccttgaaata atcattcaac tgaagaaaag 3180 gaaaaaatac aggaaaacta aagttccagt tgtaaaggaa ccagaacctg aaatcattac 3240 ggaacctgtg gatgtgccta cgtttctgaa ggctgctctg gagaataaac tgccagtagt 3300 agaaaaattc ttgtcagaca agaacaatcc agatgtttgt gatgagtata aacggacagc 3360 tcttcataga gcatgcttgg aaggacattt ggcaattgtg gagaagttaa tggaagctgg 3420 agcccagatc gaattccgtg atatgcttga atccacagcc atccactggg caagccgtgg 3480 aggaaacctg gatgttttaa aattgttgct gaataaagga gcaaaaatta gcgcccgaga 3540 taagttgctc agcacagcgc tgcatgtggc ggtgaggact ggccactatg agtgcgcgga 3600 gcatcttatc gcctgtgagg cagacctcaa cgccaaagac agagaaggag ataccccgtt 3660 gcatgatgcg gtgagactga accgctataa gatgatccga ctcctgatta tgtatggcgc 3720 ggatctcaac atcaagaact gtgctgggaa gacgccgatg gatctggtgc tacactggca 3780 gaatggaacc aaagcaatat tcgacagcct cagagagaac tcctacaaga cctctcgcat 3840 agctacattc tgagcggccg cctcggccaa acatcgataa aataaaagat tttatttagt 3900 ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta 3960 acgccatttt gcaaggcatg gaaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg 4020 tcaggaacag atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc 4080 tgccccggct cagggccaag aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct 4140 gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc 4200 agccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa 4260 tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct 4320 tctgctcccc gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggggcgc cagtcctccg 4380 attgactgag tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac 4440 ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg 4500 ggtctttcat ttgggggctc gtccgggatc gggagacccc tgcccaggga ccaccgaccc 4560 accaccggga ggtaagctgg ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 4620 cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 4680 gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca 4740 cgtagcgata gcggagtgta ctgataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag 4800 gtctgaagag gagtttacgt ccagccaagc tagggccgcg atccggaacc cttaatataa 4860 cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cagtactggc ttaactatgc ggcatcagag 4920 cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4980 aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 5040 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 5100 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 5160 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 5220 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 5280 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 5340 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 5400 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 5460 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 5520 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 5580 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 5640 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 5700 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5760 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5820 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5880 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5940 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 6000 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 6060 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 6120 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 6180 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 6240 gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 6300 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 6360 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6420 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 6480 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 6540 tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 6600 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 6660 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6720 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6780 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6840 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6900 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 6960 ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaatt gctagcaatt 7020 gctagcaatt gctagcaatt cataccagat caccgaaaac tgtcctccaa atgtgtcccc 7080 ctcacactcc caaattcgcg ggcttctgcc tcttagacca ctctacccta ttccccacac 7140 tcaccggagc caaagccgcg gcccttccgt ttctttgct 7179

Claims (12)

hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 혈관 강화용 조성물.
and a recombinant virus comprising a nucleic acid encoding hCARP (human Cardiac Ankyrin Repeat Protein).
hCARP를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제.
A cell therapy agent for vascular strengthening comprising a host cell transfected with a recombinant virus comprising a nucleic acid encoding hCARP.
제2항에 있어서,
상기 hCARP를 암호화하는 핵산은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 것인, 세포 치료제.
3. The method of claim 2,
Wherein the nucleic acid encoding the hCARP is a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제2항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 이를 발현하는 발현벡터가 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노부속바이러스, 백시니아바이러스 또는 알파바이러스 유래의 발현벡터인 것인, 세포 치료제.
3. The method of claim 2,
Wherein the expression vector expressing the recombinant virus is an expression vector derived from adenovirus, lentivirus, retrovirus, adeno-associated virus, vaccinia virus or alphavirus.
제4항에 있어서,
상기 레트로바이러스 유래의 발현벡터는 도 1에 기재된 pLPC-hCARP의 개열지도를 갖는, 세포 치료제.
5. The method of claim 4,
Wherein said retrovirus-derived expression vector has cleavage map of pLPC-hCARP shown in Fig. 1.
제2항에 있어서, 상기 숙주세포는 혈관내피세포(endothelial cell), 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell), 섬유아세포 (fibroblast), NIH3T3 및 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 세포 치료제.
3. The method of claim 2, wherein said host cell is selected from the group consisting of endothelial cells, vascular smooth muscle cells, fibroblasts, NIH3T3 and mesenchymal stem cells Cell therapy.
hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 제2항에 따른 세포 치료제를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
A recombinant virus comprising a nucleic acid encoding hCARP (Human Cardiac Ankyrin Repeat Protein) or a cell therapeutic agent according to claim 2 for the prophylaxis or treatment of ischemic diseases.
제7항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
8. A pharmaceutical composition according to claim 7, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
제7항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 뇌허혈, 심장허혈, 망막허혈, 심한사지허혈(critical limb ischemia), 허혈성 대장염, 장간막허혈, 허혈성 급성 신부전증, 궤양 (ulcer), 및 상처치유의 지연 (delayed wound healing)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. The method of claim 7, wherein the ischemic disease is selected from the group consisting of cerebral ischemia, cardiac ischemia, retinal ischemia, critical limb ischemia, ischemic colitis, mesenteric ischemia, ischemic acute renal failure, ulcer, and delayed wound healing). &lt; RTI ID = 0.0 &gt; 11. &lt; / RTI &gt;
hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 제2항에 따른 세포 치료제를 포함하는 연조직 리모델링 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
A recombinant virus comprising a nucleic acid encoding hCARP (Human Cardiac Ankyrin Repeat Protein) or a cell therapeutic agent according to claim 2 for the prevention or treatment of soft tissue remodeling-related diseases.
제10항에 있어서, 상기 연조직 리모델링 관련 질환은 심장 리모델링(cardiac remodeling), 동맥 협착(arterial stenosis) 또는 동맥류(aneurysm)인 것인, 연조직 리모델링 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[Claim 11] The pharmaceutical composition according to claim 10, wherein the disease related to soft tissue remodeling is cardiac remodeling, arterial stenosis or aneurysm.
hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스, 제2항에 따른 세포 치료제 또는 제7항에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관을 강화하는 방법.



a recombinant virus comprising a nucleic acid encoding a human Cardiac Ankyrin Repeat Protein (hCARP), a cell therapy agent according to claim 2 or a pharmaceutical composition according to claim 7 in a pharmaceutically effective amount to a subject other than human, Comprising the method of enhancing the blood vessels of an individual.



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NCBI Genbank Accession No. BC018667 (2006.07.15.) *
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신성호. 레트로바이러스를 이용한 Cardiac Ankyrin Repeat Protein 유전자 전달과 그 효능 분석. 단국대학교 석사학위논문 (2010)* *

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