KR20150035521A - 암의 시험관내 진단 및 추적 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 시료에서 Treg-세포 대 Th17 세포, Th1 세포 및/또는 Th2 세포의 그룹을 포함하는 적어도 하나의 다른 그룹의 T 세포의 비를 결정하는 것을 특징으로 하는, 암 질환의 진행을 진단 및/또는 모니터링 및/또는 예측하는 시험관내 방법에 관한 것이다.

Description

암의 시험관내 진단 및 추적 방법 {In Vitro Method for the Diagnosis and Surveillance of Cancer}
본 발명은 암 기간중 종양 침윤성 면역세포 패턴, 특히 난소암 전개의 변화를 입증하고 또한 상피성 난소암의 초기 단계에서 Treg에 만연하는 이펙터 T 세포의 존재로 나타나는 활성 항종양 면역 반응을 질환의 진행단계에서 현저한 면역억제로의 동적 이동을 명확하게 보여준다.
종양 미소환경 내에 존재 하는 면역 세포의 유형은 환자의 생존에 중요한 역할을 할 수 있다. 그러나 질환 진행 중에서 종양 침윤성 면역 세포의 동력학에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 난소암 환자의 종양 조직을 침윤한 면역세포는 상이한 질환 단계에서 연구되었다. 난소암의 전개의 초기단계는 강한 Th17 면역 반응을 나타낸 반면, 단계 II 환자에서 높은 수의 Th1 세포의 보충이 관찰되었다.
파종성 종양 (단계 III-IV)에서, 헬리오스+ 활성화 조절성 T 세포(Treg)의 지배적 개체군은 높은 수의 대식세포 및 골수 수지상세포(mDC)과 함께 검출되었다. 종양 침윤성 Treg는 순환성 Treg보다 CCR4를 현저하게 낮게 발현하였고, 종양 침윤성 Treg의 수는 난소암 세포 배양 상청액 중에 CCL22의 수준과 크게 상호관련되어 있었으며, 이것은 CCR4/CCL22 상호작용을 통한 이들의 보충을 제안한다. CCL22는 원발성 난소 종양에서 종양 세포, 대식세포 및 mDC에 의해 주로 생산되었고, 또한 그의 발현은 IFNγ에 대한 반응에서 현저하게 증가하였다. 종합해보면, 아마도 염증성 자극에 의해 촉발된, Treg의 특이적 보충은 난소암의 진행단계에서 현저한 면역 억제를 유도한다.
상기 요약된 발견은 다양한 암들, 특히 난소암의 시험관내 진단 및 추적 (surveillance) 방법에 사용된다. 상기 방법은 바람직하게는 세포의 표면상에 마커를 사용함으로써 상이한 세포 유형을 확인하는데 이용된다. T　세포 매개성 면역은 다양한 종류의 상이한 T 세포를 포함한다. 세포독성 T 세포는 예를 들면 표면 항원 CD8 (MHC 클래스 I 수용체)에 의해 나타난다. T 도움 세포는 여러 가지 서브그룹으로 나눌 수 있다. 본 발명에 있어서, 가장 관련된 T　세포는 표면 마커 CD4+ (MHC 클래스 II)를 가지며, 특히 호중구 반응을 증강하는 CD4+ Th17 세포를 포함하고, 특히 세포외 박테리아에 대해 효과적인 것으로 알려져 있다. Th17 세포는 종양에서 종양세포를 죽이는 효과를 갖는 것으로 추측된다. 세포의 또 다른 관심 있는 그룹은 CD4+ 조절성 T 세포인 Treg로 불리운다. 이러한 유형의 세포는 T 세포 반응을 억제한다. 통상적으로 이러한 종류의 세포는 과잉 면역 반응을 피하기 위한 효과를 갖는다. 그러나 종양 세포에서는 Treg 세포의 존재가 종양 세포에 대한 신체 자신의 면역방어를 하향 조절하고 따라서 궁극적으로 종양 성장을 증가시키는 것으로 추정된다.
선행기술
Cannon et al. (Expert Opin. Biol. Ther., 2011; 441-445)는 난소암에 대한 수지상 세포 예방접종을 기술한다. 암 면역 요법에서 Th17의 가능한 역할이 논의된다.
Kryczek et al. (J.Immunol., 2011, 4388-4395)는 조절성 T　세포, 즉 Foxp3+CD4+의 서브 개체군을 기술한다. 이들 세포는 만성 궤양성 대장염 또는 암과 같은 생리학적 미소환경에서 염증성 Treg 세포일 수 있는 것으로 추정된다.
Leveque et al. (J.Immunother., 2009, 101-108)는 IL-2의 존재 하에 체외 분리된 상피성 난소암 관련 Treg의 자극이 이들을 TH17 세포로 전환하는 것으로 보고하고 있다.
Curiel et al. (Nature Medicine, 2004, 942-949)는 난소암으로 감염된 환자에서 인간 종양 Treg 세포가 종양 특이적 T 세포 면역을 억제하고 생체내 인간 종양의 성장에 기여하는 것을 기술한다.
Zamarron 등 (Int.J.Biol.Sci., 2011, 651-658)은 Th17 세포, 조절성 T　림프구 및 면역조절성 사이토카인이 암 진행을 촉진하거나 저지하는 이중 역할을 하는 것으로 보고한다. 암 진행에서 이들의 궁극적인 역할은 종양 미소환경에 크게 의존한다.
Tosolini 등 (Cancer Res., 2011, 1263-1271)은 대장암의 환자에서 상이한 부류의 침윤성 T 세포독성 및 도움 세포(Th1, Th2, Treg, Th17)의 임상적 충격을 기술한다.
Kryczek 등 (Blood, 2009, 1141-1149)은 암 환자에서 Th17 세포의 능동 역할을 기술한다. 난소암 환자에서 Th17 세포, 관련 메카니즘 및 임상적 중요성이 연구되었다.
Chi 등 (Clinical and Experimental Immunology, 2010, 480-489)은 T 도움 세포 17 (Th17) 및 조절성 T 세포(Treg)의 염증 및 자가면역 장애의 발병기전에서 중요한 역할을 기술한다. 종양 및 말초 혈액에서 이러한 세포의 분포가 기술되었다.
선행기술은 Treg 세포 대 다른 그룹의 T 세포, 특히 Th17 세포의 비를 측정하고 이러한 비를 진단 및 잠재적 치료 전략에 이용하는 것을 제안하지 않았다.
발명의 배경
난소암은 세계적으로 여성의 가능 흔한 악성종양 중의 하나이고 부인과 암중에서 가장 높은 치사율을 갖는 것으로 알려져 있다. 민감성 및 특이적 바이오마커 때문에 및 질환이 빠르게 전개하고 확산하는 경향이 있다는 사실로 인하여, 환자의 거의 70%는 종양 파종의 진행단계에서 낮은 예후로 진단된다. 통상적인 치료가 난소암의 80% 이상에서 악성 세포 수의 현저한 감소를 유도한다고 하더라도, 환자의 대부분은 소수의 화학요법 내성 종양세포의 지속성 때문에 2-5년 이내에 질환의 최종 치사 재발을 경험한다. 난소암 환자의 예후를 개선하고 또한 종양 요법을 더 잘 적합하게 하기 위해서, 각각 고위험 환자를 확인하고 재발 가능성을 감소시킬 수 있는 우수한 예후 마커 및 새로운 치료 전략에 대한 필요성이 존재한다.
면역 추적은 암 전개 및 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었다. 면역 결핍 마우스에서 실험들은 면역 시스템이 종양을 인지하고 근절할 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나, 암세포가 종양 특이적 면역 반응을 제공할 수 있다고 하더라도, 종양과 숙주 면역 시스템 간의 상호작용은 질환의 임상적 후퇴를 초래하지 않지만 대신 종양 조직 내에 면역 억제성 미소환경의 발전을 초래하며, 그리하여 면역 회피를 촉진할 수 있다. 더욱이, 실험실 마우스로부터 실험적으로 얻어진 결과들이 또한 암 환자에서 유효하다는 것은 확실치 않다.
정착된 종양을 근절시킬 수 없음에도 불구하고, 특정의 종양 침윤성 면역 세포의 존재는 암 환자에서 강한 예후 마커를 나타낼 수 있다. 높은 수의 종양 침윤성 CD3+ T 세포가 진행된 난소암 환자에서 유리한 임상적 결과와 연관되어 있는 것으로 보고되었다. 더욱 최근의 연구들은 개선된 생존이 CD8+ 세포독성 T　세포의 개선된 수와 관련되어 있다고 보고하였다. 반면, 종양 조직 내에서 높은 수의 CD4+CD25 + FoxP3++조절성 T 세포 (Treg), 형질세포같은 수지상 세포 및 B7-H4+ 대식세포는 낮은 예후를 나타낼 수 있다. CD4+ T 도움 세포의 역할은 잘 문서화되어 있지 않지만, Th17 세포는 암 면역에서 상당한 역할을 할 수 있다는 강력한 증거가 있다.
염증유발 Th17 세포는 자가면역 질환들 및 점막면역과 주로 관련되어 있다. Th17 세포는 난소암, 두경부암, 위암, 유방암, 대장암 및 전립선 암을 포함하는 상이한 유형의 종양내에 존재 하는 것으로 입증되었다. 광범위하게 연구되었지만, 종양 면역에서 Th17 세포의 정확한 역할 및 환자의 생존은 논쟁의 여지가 있다. 한편, IL-17-생산 세포는 항종양 면역을 촉진하는 것으로 보고되어 있지만, 다른 한편, IL-17은 종양 성장을 증진할 수 있는 혈관신생 인자로 작용하는 것으로 알려져 있다.
대부분의 발표된 연구들은 상이한 유형의 종양 침윤성 면역 세포의 패턴 및 예후 중요성에 중점을 두었다. 그러나 질환 진행중에 종양 조직 내에서 면역 반응의 동력학에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 상피성 난소암(EOC)의 상이한 단계에서 CD4+ 및 CD8+ T 림프구, 수지상 세포(DC) 및 대식세포의 분포, 표현형 및 임상 병리학적 중요성이 평가되었다. 본 발명의 결과들은 암 진행 중에 종양 침윤성 면역세포 패턴의 변화를 입증하고 또한 EOC의 초기 단계에서 Treg에 만연하는 이펙터 Th17세포 침윤을 질환의 진행단계에서 현저한 Treg 축적으로의 동적 이동을 명확하게 보여준다
본 발명의 바람직한 실시형태
본 명세서에서 면역학 분야에서 통상 사용되는 여러 가지 용어들이 사용된다. 따라서 용어들의 의미에 대하여 우리는 광범위한 CD 마커 리스트 및 그의 설명, 사이토카인 및 그의 통상 사용되는 약자들을 포함하는 특히 다음 문헌들을 언급한다:
- Janeway's Immunobiology, 7th edition, Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport (2008)
- Fundamental Immunology, 6th edition, William E. Paul (2008), Wolters Kluwer, 또는
- Pezzutto, Ulrichs, Burmester; Taschenatlas der Immunologie, Thieme, 2nd edition (2007).
본 발명의 과정에서 다음 관찰들이 이루어졌다.
A) Th17 림프구는 종양조직에서 축적되며 또한 이들의 비율은 질병 진행과 반비례 관계에 있다.
Th17 림프구는 분석된 난소 종양 시료 (범위 = 0.06 - 22.8%)의 100%에서 검출되었다. CD4+ T 서브세트 내에서 Th17 세포의 비율은 파종성 질환 (FIGO 단계 III-IV) 환자로부터 얻어진 종양조직에서보다 한정 질환 (FIGO 단계 I)의 환자로부터 얻어진 종양조직에서 현저하게 더 높았다 (도 1A, B 참조). 전체 종양 유래 단일 세포 현탁액 중에서 Th17 세포의 빈도는 동일한 패턴을 보여주었으며, 이것은 절대수의 Th17 세포가 진행된 질환에서 현저하게 감소하였음을 나타낸다. 이들 발견에 따라, 초기 단계 환자의 종양 조직 유도성 세포 배양 상등액 중에서 IL-17 및 IL-21의 농도는 비자극된 및 PMA- 및 이오노마이신-자극된 (도 1C 참조) 배양물에서 현저하게 더 높았다. 질환의 후기 단계에서 Th17 세포 비율의 현저한 감소에도 불구하고, 종양 침윤성 Th17 세포의 백분율은 환자의 말초 혈액과 비교하여 현저하게 더 높았다 (도 1D 참조). 말초 혈액 단독에서 Th17 세포의 빈도는 종양 조직에서 Th17 세포의 수 또는 비율을 예측하지 않았다. 그러나 대조 목적으로 사용할 수 있다.
B) 종양 침윤성 Treg 의 비율은 종양 조직에서 증가되고 질환 진행에 따라 증가한다.
Th17 세포에 비하여, CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Treg의 비율은 단계 I 질환의 환자로부터 시료들과 비교하여 파종성 질환 (FIGO 단계 III-IV)의 환자로부터 얻어진 종양조직에서 현저하게 더 높았다(도 2A,B 참조). 종양 침윤성 Treg (Ti-Treg)의 비율은 질환의 모든 단계에서 환자의 말초 혈액에서 발견된 것보다 현저하게 더 높았다 (도 2C 참조). Ti-Treg의 상태를 더 잘 특징화하기 위하여, Treg 활성화의 마커인 전사 인자, 즉 헬리오스(Helios)가 또한 분석되었다. 헬리오스+ Treg의 비율은 EOC 환자의 말초 혈액(56.3 ± 4.2%)에서 보다 종양 조직 (67.8 ± 2.5%)에서 현저하게 더 높았다 (도 2D 참조). 상이한 단계의 질환에서 헬리오스+Treg의 비율에서 차이는 없었다. 질환 진행중에 안정한 Ti-Treg의 비율증가는 정량적 실시간 PCR-기반 메틸화 분석을 사용하여 더욱 확인되었으며, 이것은 종양조직 유래 단일 세포 현탁액 중의 FoxP3 TSDR에서 탈메틸화된 안정한 Treg의 백분율을 평가하였다 (도 2E 참조). Treg 및 Th17 림프구의 비율은 동일한 종양에서 반비례 관계에 있으며(r = -0.44, p < 0.01) (도 2F 참조), 반면 Treg의 비율은 대식세포의 수와 정비례 관계에 있다 (r = 0.47, p < 0.01) (도 2G).
C) Th1 및 CD8 + T 림프구, 수지상 세포 (DC) 및 대식세포의 비율은 질환 진행중에 현저한 변화를 나타내지 않는다.
Th17 세포 및 Treg외에도, Th1 세포, CD8+ T 세포, pDC, 골수 수지상 세포(mDC) 및 대식세포를 포함하는 다른 면역 세포 서브세트의 존재를 종양 조직에서 분석하였다. 진행된 종양들에서 mDC 및 대식세포 비율의 증가에 대한 경향이 있었지만(도 3 참조), 이들 세포 유형의 어느 것도 난소암 진행 중에 임의의 통계적으로 현저한 동력학을 보여주지 않았다.
D) 종양 유래 단일 세포 현탁액의 사이토카인 및 케모카인 프로파일은 이들의 인사이투 프라이밍 ( in situ priming ) 및 분극화보다는 종양 조직내에 분극화 Th 림프구의 보충을 지지한다.
종양 미소환경을 더 잘 특성화하고, 사이토카인 프로파일이 T 림프구의 인사이투 프라이밍 및 분극화를 지지하는지를 평가하기 위하여, 종양 유래 세포 배양 상청액 중에 사이토카인 및 케모카인 프로파일이 평가되었다. 비자극화된 배양 상청액에서, 단지 3개의 사이토카인, 즉 IL-6, IL-10 및 TNFα가 상당량 검출되었다 (도 4A 참조). IL-2, IL-4, IL-12 및 IL-23 레벨은 대부분의 시험된 환자 시료에서 MILLIPLEXTM 분석의 검출 한계 이하이었고, IL-17은 단계 I의 질환에서 환자의 세포 상청액에서만 검출되었다. 중요하게는, Th17 분극화에 중요한 단지 최소 농도의 IL-1β(4.2 ± 2.5 pg/ml)이 종양 침윤성 Th17 세포의 최고 비율을 가진 I기 환자로부터 배양 상청액에서 검출되었다 (도 4C 참조). IL-17을 제외하고는, 질환 진행과의 다른 의미있는 상관관계는 비자극된 배양물에서 관찰되지 않았다. PMA 및 이오노마이신 자극 시, IL-12 및 IL-23을 제외하고는 대부분의 시험된 사이토카인이 생산되었다 (도 4A 참조). IL-21의 생산은 단계 I 환자의 배양 상청액과 비교하여 상기 질환의 진행 단계의 환자의 배양 상청액들 중에 현저하게 감소하였다 (도 1C 참조). TGFβ mRNA의 발현은 모든 환자의 시료에서 관찰되었으며 질환 단계와 현저하게 관련되어 있지 않았다 (도 4D).
비자극된 종양 유래 세포는 다량의 CCL20, CCL22 및 염증성 CXCL9 및 CXCL10을 생산하였지만(도 4B 참조), 소량의 CCL2, CCL5, CCL17, CCL19 및 CCL21를 생산하였다. CCL22 (도 5A 참조), CXCL9 및 CXCL10 (도시되지 않음)의 레벨은 질환 진행중에 증가하였다: 그러나 이들 데이터는 통계적으로 유의적이지 않았다. CXCL9의 레벨은 종양 침윤성 CD4+ (r = 0.65, p < 0.01) 및 CD8+ (r = 0.64, p < 0.01) T 림프구의 수와 현저하게 관련되어 있다. 특별한 Th 림프구 서브세트(도시되지 않음)와 상관관계는 없었다. 가장 중요하게는, CCL22의 레벨은 Ti-Treg (r = 0.66, p < 0.01)의 수와 현저하게 상관관계가 있었다 (도 5B). 케모카인과 종양 침윤성 면역 세포 사이의 다른 상관관계는 관찰되지 않았다.
E) Treg는 아마 CCL22 / CCR4 상호작용을 거쳐 종양 조직에 보충되며 또한 인사이투 증식한다.
상술한 바와 같이, Ti-Treg의 수는 종양세포 배양 상청액 중에 CCL22의 레벨과 크게 관련되어 있었다. 이들 관찰에 따라, Ti-Treg는 말초 혈액의 Treg보다 CCR4를 현저하게 더 낮게 발현하였다 (평균 형광 강도 6,280 ± 35 및 3,487 ± 333, 각각; n = 6) (도 5C 참조). Ti-Treg가 인사이투 증식하는지를 평가하기 위하여, Ki67 염색을 종양 조직 유래 세포 현탁액 및 PBMC중에서 수행하였다. 말초 혈액에서 Treg와 비교하여 현저하게 더 높은 백분율의 Ti-Treg가 Ki67를 발현하였다 (21.8 ± 5.1% 및 12.9 ± 1.8%, 각각; n = 6). Ki67는 Treg과 비교하여 현저하게 더 낮은 비율의 통상적인 CD4+FoxP3- T 세포에서 발현되었다 (종양 세포중에서 7.6 ± 2.7% 및 말초 혈액 중에서 2.3 ± 0.4%) (도 5D, E 참조).
F) 난소암 세포주는 IFN γ자극시 CCL22 를 포함하는 케모카인을 생산한다
난소암 세포주가 CCL22를 생산할 수 있었는지를 평가하기 위하여, OV-90 및 SKOV3 세포를 재조합 인간 IFNγ에 의한 자극 없이 또는 자극시 배양하였다. IFNγ는 유방암 세포주에서 CCL22 생산을 유발하는 것으로 나타났기 때문이다. 원발성 종양 유래 세포 현탁액과 대조적으로, 자연 CCL22 분비는 난소암 세포주에서 검출할 수 없었다. 그 결과는 본 연구에서 측정된 대부분의 다른 케모카인과 유사하였다. SKOV3 세포주는 소량의 CXCL9를 자발적으로 생산한 반면 (도 6A 참조), 비자극된 OV-90 세포는 다량의 CXCL9, CXCL10 및 CCL20를 생산하였다 (도 6B 참조). IFNγ의 첨가는 시험된 세포주의 둘 다에서 CCL19, CCL21 및 CCL22의 로버스트 분비를 유발하였다. 놀랍게도, CXCL9, CXCL10 및 CCL20의 생산은 IFNγ 자극시 SKOV3 에서 증가하지만 OV-90 세포에서는 감소하였다 (도 6A, B 참조).
G) 원발성 난소종양 유래 세포는 IFN γ 자극시 CCL22 생산을 현저하게 증가시켰다
원발성 종양 유래 단일 세포 현탁액에 대한 IFNγ의 효과를 평가하기 위하여, 환자 종양 조직(n = 6)으로부터 분리된 세포를 IFNγ의 존재 하에 배양하였다. 도 6C에서 도시된 바와 같이, 단지 CCL21, CCL22 및 CXCL10 농도는 IFNγ 자극시 종양 세포 배양 상청액에서 증가하였고, 가장 현저한 증가는 CCL22에서 관찰되었다. CCL22 분비의 근원으로서, EpCAM+ 종양 세포, 대식세포 및 mDC는 비자극된 배양물 뿐만 아니라 자극된 배양물에서 확인되었다 (도 6D 참조).
본 발명은 적어도 하나의 시료에서 Treg-세포 대 Th17 세포, Th1 세포 및/또는 Th2 세포의 그룹을 포함하는 적어도 하나의 다른 그룹의 T 세포의 비를 결정하는, 암 질환의 진행을 진단 및/또는 모니터링 및/또는 예측하기 위한 생체외 방법을 제공한다.
본 명세서에 기술된 생체외 방법의 이점은 특이적 유형의 암이 더 잘 진단될 수 있다는 것이다. 어떠한 종류의 치료제가 환자에게 투여되어야 하는지가 매우 종종 중요하다. 암의 유형을 더 잘 특징화함으로써, 상기 치료법은 환자의 유익에 적합할 수 있다.
본 명세서에 기술된 시험관내 방법은 차별적으로 강화된 보조 화학요법으로 치료할 수 있는 특이적 위험군으로 난소암의 환자를 계층화하는데 바람직하게 사용된다. 난소암 환자의 치료에 있어서, 환자가 어떠한 유형의 암이 있는지를 알아내는데 실질적인 이점이 있다. 한 그룹의 환자에서는 강력한 화학요법을 적용하는 것이 유리할 수 있는 반면, 동일한 유형의 치료가 다른 그룹의 환자에서 역효과를 낼 수 있다. 정맥내 카르보플라틴 및 파클리탁셀은 일반적으로 난소암의 표준요법으로 간주된다. 전이성 난소암의 유력한 복강 표면 관여로 비추어 보아, 활성 화학요법제는 또한 복강내 경로에 의해 공급될 수 있다. 대안적으로, 플라티늄 기본 화학요법이 적용될 수 있다. 리포좀 독소루비신 및 토포테칸 또는 겜시타빈과 같은 추가 화학요법 약물이 사용될 수 있다.
사용된 대체 치료 방식은 이포스파미드, 시스플라틴 및 파클리탁셀이며, 이에 따라 시스플라틴과 조합된 이포스파미드 또는 파클리탁셀과 조합된 이포스파미드가 바람직하다. 본 명세서에 기술된 시험관내 방법은 생체외 진단방법에 의해 측정된 특이적 위험군의 가장 효과적인 화학요법 치료의 선택을 허용한다.
또한 선택된 치료법의 효과에 따라 환자에서 암의 진행을 모니터하는 것이 중요하다. 본 명세서에 기술된 방법에 의해, 생체외 진단방법을 수행하고 특수 치료로 얻어진 결과들을 관찰하는 것이 가능하다. 진단 방법의 결과를 받은 후에, 치료법의 양상을 계속할지, 조정할지 또는 변경할지를 결정할 수 있다. 더욱이, 암 질환의 진행을 더 잘 예측하는 것이 종종 바람직하다.
본 시험관내 방법의 경우, 시료는 Treg 세포 대 Th17 세포의 비 또는 Treg 세포 대 Th1 및/또는 Th2 세포의 비를 결정하는 방식으로 처리된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, Treg 세포 대 Th17 세포의 비가 결정된다. 상기 결정은 당해 분야의 기술자에게 알려진 방법으로 수행된다. 흔히 세포는 세포 타입 개체군에 특징적인 특이적 표면 마커에 대한 항체에 의해 확인된다. 또한 특이적 표면 마커에 관한 여러 가지 항체들을 병용하는 것이 가능하다. 그러나 특수한 세포 유형에 특이적인 세포표면 마커에 대한 적어도 하나의 항체를 사용하는 것이 중요하다. Treg 세포를 확인하기 위하여, 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 안키-CD25, 항-CD127 및 항-CR4 및 특히 바람직하게는 항-FoxP3 및/또는 항-헬리오스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 두 개 및 가장 바람직하게는 적어도 세개의 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
세포의 특성화는 일반적으로 세포 개체군의 결정을 허용하는 세포 흐름 분석(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)에 의해 수행된다. 특히 바람직한 실시형태에서는 세포가 Treg 세포 개체군에 또는 Th17 세포 개체군에 속하는지를 결정한다.
분화 방법에서 사용되는 시료는 암조직 또는 암조직의 전이성 부위로부터 유래할 수 있다. 이러한 시료들은 예를 들면 원발성 종양 또는 더 큰 전이성 종양을 제거할 때 통상적인 수술 후에 환자로부터 제거할 수 있다. 시료들은 또한 생검에 의해 얻을 수 있다.
대안적으로, 시료는 종양 조직으로부터 유래 될 수 있는 세포 배양으로부터 유래 될 수 있다. 종양 조직을 가늘게 절단하고 통상의 조건에서 성장되는 종양 세포를 분리할 수 있다. 그러나 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있는 성장 배지에 사이토카인의 첨가에 의해 원인이 되는 잘못된 결과들을 피하기 위해 주의하였다.
대조 목적으로, 혈액으로부터, 특히 말초 단핵 혈액 세포로부터 얻어진 세포상에서 본 명세서에서 기술된 방법을 수행할 필요가 있을 수 있다.
종양 조직 내에 상이한 유형의 종양 침윤성 면역 세포의 존재 및 예후 값이 광범위하게 연구되었다. 그러나 질환 진행 도중 종양 조직 내에 면역 세포 패턴에서의 변화에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 암 조직 내에서 면역 세포 분포의 동역학을 조사하기 위하여, 초기 및 진행된 질환의 환자의 적절한 선택이 필수적이다. 그러나 EOC 환자의 겨우 15% 미만이 단계I에서 진단되기 때문에, 예측연구에서 초기 난소암 병변의 미소환경을 연구하는 것은 매우 힘들다. 초기 질환 환자로부터 새로운 종양 조직 시료들의 극히 낮은 이용가능성에도 불구하고, 단계 I 환자로부터 6개의 종양시료를 더욱 진행된 질환(II-IV 기)의 환자로부터 38개의 종양시료와 함게 분석할 수 있었다.
대부분의 실험들은 난소암 환자로 수행하였다. 그러나 결정된 T 세포의 비의 변화에 대한 일반적 원칙은 암의 진행에 따라 유사하게 변화하는 것으로 추측된다. 따라서 본 명세서에 기술된 방법은 모든 종류의 암, 특히 전립선 암, 유방암, 결장암에 적용할 수 있다. 그러나 난소암 환자에게 적용되는 시험관내 진단방법을 사용하는 것이 바람직하다.
상이한 서브세트의 CD4+ T 세포에서 질환 진행 중에 현저하게 상이한 패턴이 나타났지만 다른 면역 세포유형에서는 나타나지 않는 것으로 밝혀졌다. 당연히, EOC의 초기단계는 강력한 Th17 면역반응을 특징으로 하지만(도 1A 참조), 질환의 진행단계에서 조절성 T 세포의 지배적인 개체군이 검출되었다 (도 2A 참조). 놀랍게도, CD8+ T 림프구 및 pDC는 어떠한 실질적인 변화를 보여주지 않은 반면, mDC 및 대식세포의 비율은 질환 진행중에 증가하는 것으로 나타났다. Th1 세포의 비율은 단계II 종양에서 약간 증가한 다음 질환의 진행단계에서 다시 감소하였다. 그러나, mDC 및 대식세포에서 변화나 Th1 세포에서 변화도 통계적으로 현저하지 않았다. CD4+ 이펙터 T 세포의 유사한 동역학, 즉 다수개의 IFNγ-생산 세포에 의해 대체되는 Th17 세포의 초기 파열은 EAE 및 감염의 마우스 모델에서 기술되었다.
이들 관찰과 일치되게, Lohr 등 (Microbiol. Infect. 2009, 11, 589-593)은 항원-특이적 T 세포를 상기 T 세포에 의해 인지된 항원을 발현하는 형질전환 마우스로 전이하였으며 또한 Th17에 이어서 Th1 이펙터 세포의 연속적인 발전 후 질환의 후기에서 Treg 발전을 발견하였다. 이러한 동력학은 인간 종양의 미소환경에서 아직 설명되지 못했으며 마우스 모델에서 얻어진 시험 결과들이 인간에게 전환될 수 있는지가 불확실하였다.
분명히, 종양 침윤성 Th17 세포의 기원 및 종양 면역에서 이들의 정확한 역할은 논쟁의 여지가 있다. Kryczek 등 [Blood (2009), 114, 1141-1149]은 EOC 조직들로부터 분리된 대식세포가 시험관내에서 Th17 세포를 유도할 수 있다고 보고하였다. 그러나 IL-1β, IL-6 및 IL-23은 인간 Th17 세포의 분화에 필수적인 것으로 생각되며, 본 발명에서 관찰된 종양 미소환경의 사이토카인 프로파일, 특히 IL-23의 완전한 결여와 함께 단계 I 환자에서 IL-1β의 매우 낮은 수준(도 4C 참조)은 인사이투 Th17 분극화의 가설을 뒷받침하지 않는다. Th17 트래피킹(trafficking)은 CCR6/CCL20축을 통해 매개할 수 있는 것으로 나타났다. 놀랍게도, 본 연구에서 종양 조직에서 Th17 세포의 수와 CCL20 수준 사이의 상관관계는 관찰되지 않았다.
Th17 세포에 비하여, 더 많은 연구들이 종양에서 Treg의 트패피킹 성질 및 예후 중요성에 집중되었다. Curiel 등 [Nat. Med. (2004) 10, 942-949]은 Treg 침윤성 난소암 조직이 시험관내 및 생체내에서 TAA-특이적 면역을 효과적으로 억제하며 또한 종양 성장에 기여한다는 것을 제시하였다. 또한 이들 저자들은 Treg 종양 트래피킹이 CCL22에 의해 매개될 수 있다는 것을 제안하였다. CCL22/CCR4를 거쳐 종양 조직내에 Treg 보충은 최근에 유방암 환자에서 확인되었다.
본 연구에서, Ti-Treg는 주로 헬리오스+ 활성화된 것으로 나타났다. 상당수의 이들 Ti-Treg는 FoxP3 TSDR에서 탈메틸화되었다. 천연적으로 발생하되, 시험관내에서 TGFβ 유도되지 않은, Foxp3+ Treg는 TSDR의 선택적 탈메틸화와 관련된 안정한 Foxp3 발현을 하는 것으로 나타났다. 유사하게, Ikaros 패미리 멤버인 헤리오스는 천연적으로 발생하는 티믹 유래 (thymic-drived) Treg (nTreg)와 천연 CD4+ T 세포 (iTreg)로부터 말초성으로 유도된 것들 사이를 식별하는데 유용한 마커인 것으로 보고되었지만, 이들 발견들은 매우 최근에 문제가 되고 있다. 따라서 nTreg와 iTreg 사이를 식별하는 것보다는, 헬리오스는 이들의 기원에도 불구하고 활성화된 Treg를 나타내는데 유용한 것으로 보인다. 종합해보면, 본 명세서에 기술된 바와 같이 EOC 조직중 Ti-Treg에서 발견된 TSDR의 탈메틸화와 함께 헬리오스의 높은 발현은 이들 세포의 안정성 및 고도로 활성화된 상태를 나타낸다.
Treg 종양 트래피킹에 관한 연구에 따라, Ti-Treg의 수는 난소 종양 세포 배양 상청액 중 CCL22의 농도와 현저하게 관련되어 있는 것으로 입증되었다. 일관적으로, Ti-Treg는 순환성 Treg보다 CCR4를 현저하게 더 낮게 발현하였다. 낮은 레벨의 CCR4는 CCL22와 적극적인 관계로 인하여 그의 내재화를 반영한다. 또한 대부분의 Ti-Treg (21.8 ± 5.1%)는 이들의 광범위한 국부 팽창을 나타내는 증식 마커 Ki67를 발현한 것으로 관찰되었다.
Faget 등 [Cancer Research (2011), 71, 6143-6152]은 IFNγ가 유방 종양 세포에 의한 CCL22의 생산을 촉발한다는 것을 입증하였다. 실제로, 종양 세포와 면역 세포 침윤물(특히 대식세포 및 NK 세포)사이의 협력은 다량의 CCL22를 유도하는데 필수적인 것으로 나타났다. 유사하게, 난소암 세포주는 IFNγ 자극시 상당 수준의 CCL22를 포함하는 케모카인을 생산한 것으로 관찰되었다. 가장 중요하게, 원발성 난소암 조직 유래 세포에서, 재조합 IFNγ는 시험된 다른 케모카인에 대한 단지 작은 효과로 CCL22를 선택적으로 증가시켰다 (도 6C 참조). 종양 세포, 대식세포 및 mDC는 우리의 연구에서 암조직 시료중의 CCL22의 핵심근원으로 확인되었다.
요약하면, 상기 실험적 데이터는 난소암 환자에서 항-종양 면역 반응의 진행이 크게 동력학적이다는 것을 제시한다. 질환의 초기 단계에서, Th17 세포의 강력한 보충이 관찰되고, 이어서 Th1 세포, 대식세포 및 mDC의 보충이 관찰되었다. EOC의 후기 단계에서, 증가된 비율의 대식세포 및 mDC와 함께, 아마 이주 세포에 의해 생산된 증가된 수준의 IFNγ는 CCL22의 생산 및 CCL22/CCR4을 통한 Treg의 보충을 좋게 할 수 있으며, 따라서 억제성 미소환경의 진전을 촉진한다. 따라서 기술된 발견들은 활성 항-종양 면역반응에서 진행된 EOC에서 현저한 면역 억제로의 동력학적 이동을 명확하게 보여주기 때문에, 새로운 암 면역요법 프로토콜의 개발은 면역 증강 전략들을 수반해야 할 뿐만 아니라 진행된 질환에서 면역 억제성 종양 미소환경을 표적으로 해야 한다.
실험들의 결과는 도면에 요약된다.
도 1
질환의 단계에 따라 원발성 난소 종양 조직 및 말초혈액 내에서 Th17 세포의 비율은 모든 CD4+ T 세포와 관련된 % Th17 림프구로서 나타낸다.
(A) 데이터는 CD4+ T 세포 중에서 Th17 림프구의 비율로서 표현되며 또한 각 단계에서 평균치를 나타낸다.
(B) 점도표는 CD3+CD4+ 세포에 관한 것이고, 두 개의 대표적인 환자에서 IL-17 및 IFNγ를 나타낸다.
(C) 칼럼들은 PMA + 이오노마이신 자극된 종양 조직 유도 세포에 의해 생산된 IL-17 및 IL-21의 평균수준 + S.E.M.을 나타낸다.
(D) 칼럼들은 종양 조직 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 th17 세포의 평균 비율 + S.E.M.을 나타낸다. *p < 0.05, ** p < 0.01 (A, ANOVA 이어서 Scheffe 검정; D, 대응표본 t-검정)
도 2
질환의 단계에 따라 원발성 난소 종양 조직 및 말초 혈액 내에서 Treg의 비율
(A) 데이터는 CD4+ T 세포 중에서 CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Treg의 비율로서 표현되며 또한 각 단계에서 평균치를 나타낸다.
(B) 점도표는 CD3+CD4+ 세포에 관한 것이며 2개의 대표적인 환자에서 CD25+FoxP3+ Treg를 나타낸다.
(C) 칼럼들은 종양 조직 및 PBMC에서 Treg의 평균비율 + S.E.M를 나타낸다.
(D) 점도표는 CD3+CD4+ CD25+CD127- 세포에 관한 것이며 또한 대표적인 환자의 종양 조직에서 FoxP3+Helios+ Treg를 나타낸다. 박스 플롯은 CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Treg중에서 Helios+ Treg의 비율을 나타낸다. 박스의 경계는 백분위수 25% 및 75%를 나타내며, 박스 내의 라인은 중간값을 나타낸다. 수염 (whisker)는 백분위수 90% 및 10%를 나타낸다.
(E) 칼럼들은 질환들의 상이한 단계에서 원발성 난소 종양 조직으로부터 분리된 세포 중에서 FoxP3 TSDR중에 탈메틸화된 Treg의 비율을 나타내고, 오차범위(error bar)는 S.E.M.을 나타낸다.
(F) 선은 종양 침윤성 Treg와 Th17 세포의 % 사이의 반비례 관계를 나타낸다.
(G) 선은 종양 침윤성 Treg의 %와 종양 침윤성 대식세포의 수 사이에 반비례 관계를 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01 (A, ANOVA 이어서 Scheffe 검정; C, D, 대응표본 t-검정).
도 3
질환의 단계에 따라 원발성 난소 종양 조직 내에 Th1 림프구, 골수 수지상 세포 (mDC) 및 대식세포의 비율. (A) 데이터는 CD4+ T 세포 중에서 CD3+CD4+IFNγ + Th1 세포의 평균비율 + S.E.M.으로서 표현된다. (B) 칼럼들은1 M의 분리된 종양 유래 세포에서 CD45+ 계통 -HLA-DR+CD14-CD11c+ mDC의 평균수 + S.E.M.를 나타낸다. (C) 칼럼들은 1 M의 분리된 종양 유래 세포 중에서 CD45+ 계통 -HLA-DR+CD14+ 대식세포의 평균수 + S.E.M.를 나타낸다.
도 4
종양 유래 단일세포 현탁액의 사이토카인 및 케모카인 프로파일. (A) 백색 칼럼들은 평균 자연 사이토카인 생산을 나타내고; 흑색 칼럼들은 PMA 및 이오노마이신 자극시 사이토카인 생산을 나타낸다. (B) 칼럼들은 평균 자연 케모카인 생산을 나타낸다. 모든 오차범위는 S.E.M를 나타낸다. (C) 플롯은 질환 진행중에 Th17 분극 사이토카인 및 IL-17의 평균 자연 생산의 동력학을 나타낸다. (D) 플롯은 질환 진행중에 TGFβ mRNA 발현의 동력학을 나타내며, 이것은 β-액틴 mRNA 발현의 평균 비율로 표시된다.
도 5
난소 종양 조직내에 Treg의 보충은 아마 CCL22-매개성이다. (A) 칼럼들은 종양 조직 유래 세포 배양 상청액 중에 CCL22 (대식세포 유래 사이토카인) 생산 + S.E.M.을 나타낸다. (B) 산란 플롯은 CCL22 생산과 Ti-Treg의 수 사이에 비례 관계를 표현한다. (C) 히스토그램은 대표적인 환자에서 종양 조직 (흑색선) 및 말초 혈액 (회색선, 엷은 색)중 CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Treg의 CCR4 발현을 나타낸다. 칼럼들은 종양 조직 및 말초 혈액 중 CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Treg에 대한 CCR4의 평균 형광 강도+ S.E.M. (n = 6)을 나타낸다. (D) 칼럼들은 종양 조직 및 말초 혈액 중 증식성 Ki67+CD4+CD25+CD127-FoxP3+ Treg 및 CD4+FoxP3- 통상적 T 세포 (Tconv)의 평균 비율 + S.E.M. (n = 6)을 나타낸다. (E) 점도표는 CD3+CD4+ 세포에 관한 것이며 또한 대표적인 단계 III 환자에서 Ki67+ FoxP3+ Treg 및 FoxP3- Tconv의 비율을 나타낸다. * p < 0.05 (대응 t-검정).
도 6
IFNγ는 난소암 세포주 및 환자에서 케모카인 생산을 유도한다. (A, B) 칼럼들은 IFNγ 자극시 (흑색 칼럼) 또는 비자극시 (백색 칼럼) 난소암 세포주에서 평균 케모카인 생산 + S.E.M.을 나타낸다. (C) 데이터는 비자극된 배양물에 비하여 IFNγ-자극된 원발성 종양 유래 세포 배양물에서 케모카인 수준의 평균 폴드 변화 + S.E.M.으로 표현된다. (D) 히스토그램은 원발성 종양 유래의 세포에서 CCL22의 자연 발현을 나타낸다. 세포는 CD45-EpCAM+ 종양 세포; CD45+ 계통 -HLA-DR+CD14+ 대식세포 및 CD45+ 계통 -HLA-DR+CD14-CD11c+ mDC이다.
도 7
Treg 대 Th17 세포 사이의 비의 차이는 상이한 단계의 난소암에서 나타난다. 도 7은 평균치가 FIGO 단계 I에서 약 0.7, FIGO 단계 II에서 약 6.7 및 FIGO 단계 III/IV에서 약 47임을 명확하게 나타낸다.
실시예 1
a) 환자 및 조직 시료들
말초 혈액 및 원발성 상피 난소암 시편들은 2009년 3월과 2011년 10월 사이에 프라하 대학병원 모톨(University Hospital Motol)에서 초기 세포감퇴수술을 행한 44명의 환자로부터 입수하였다. 본 연구에서 등록된 환자는 수술 전에 보조화학요법을 받지 않았다. 모든 조직 시편들은 환자 동의로 수집하였고, 본 연구는 대학병원 모톨의 기관 심사위원회에 의해 승인되었다.
변수 수 %
환자의 총수 44
연령
평균
범위
56
33-83
FIGO 단계
I
II
III
IV
6
5
32
1
13.6
11.4
72.7
2.3
조직학적 서브타입
장액
점액
투명세포
기타
27
9
3
5
61.4
20.4
6.8
11.4
분화
양호
보통
불량
없음
6
9
21
8
13.6
20.4
47.7
18.3
표 1은 EOC 환자의 임상병리학적 특징들을 보여준다.
종양 조직을 가위로 자르고, 37℃에서 30 분 동안 1 mg/ml의 콜라게나제 D (Roche, Basel, Switzerland) 함유 PBS 중에 소화시키고, gentleMACSTM Dissociator (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용하여 기계적으로 분리시키고, 100㎛ 나일론 세포 스트레이너 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에 통과시켰다. 혈액 시료들로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)은 Ficoll-Paque 밀도구배 용액(GE Healthcare, Waukesha, WI)을 사용하여 분리하였다.
b) 세포주
난소암 세포주 OV-90 및 SKOV3는 37℃에서 10% 열-비활성화 FCS, L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신 (모두 캘리포니아 칼즈배드 Invitrogen로부터 입수) 및 5% CO2로 보충된 RPMI 1640 중에 배양하였다.
실시예 2 - 사용된 분석방법
2.1 유세포분석 (( flow cytometry analysis ))
종양 침윤성 골수 DC (mDC), 형질세포 DC (pDC) 및 대식세포를 검출하기 위하여, 단일 세포 현탁액을 CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD20, CD45, CD56 (체코 베스텍 Exbio), CD123 (캘리포니아 산디에고 Bioscience) 및 HLA-DR (BD Biosciences)에 대하여 특이적 항체로 염색하였다. 조절성 T 세포(Treg)은 항-CD3 (Exbio), 항-CD4 (eBioscience), 항-CD8 (Exbio), 항-CD25, 항-CD127 및 항-CCR4 (BioLegend) 항체들로 표면 염색한 후 Foxp3 염색 완충액 세트 (eBioscience)에 의한 고착 및 투과처리 및 항-FoxP3 (eBioscience) 및 항-Helios (BioLegend) 항체들에 의한 세포내 염색에 의해 확인하였다. 세포내 사이토카인의 검출을 위해, 세포 현탁액을 브레펠딘 A (BioLegend)의 존재 하에 4 시간 동안 50 ng/ml의 PMA 및 1 ㎍/ml의 이오노마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 자극시켰다. 4 시간 배양 후, 세포를 CD3 (Exbio), CD4 (eBioscience) 및 CD8 (Exbio)에 대하여 항체들로 염색하고, Foxp3 염색 완충액 세트(eBioscience)로 고착 및 투과처리하고, 항-IL-17 (BioLegend) 및 항-IFNγ (BD Biosciences)항체들로 염색시켰다. CCL22 검출을 위해, 세포는 4 시간 동안 브레펠딘의 존재 하에 배양하고, 상술한 바와 같이 DC/대식세포 확인을 위해 사용된 항체들, EpCAM (BioLegend) 및 CCL22 (R&D, Minneapolis, MN)로 표지하였다. 시료들은 FlowJo 소프트웨어(TreeStar, Ashland, OR)를 사용하여 BD FACSAria (BD Biosciences)상에서 분석하였다.
2.2 ELISA 분석
상술한 것과 유사한 방식으로, 세포는 적절한 항체들을 ELISA 형태로 사용하여 확인하고 식별하였다. T 세포의 표면 마커들에 대하여 항체들을 사용함으로써, 세포를 용이하게 식별할 수 있다.
2.3. 실시간 PCR
다른 대체 실시형태에서, 세포의 분화는 실시간 PCR에 의해 수행할 수 있다. 이 방법에서 관련 표면 마커의 발현을 나타내는 특성 유전자들에 특이적인 프라이머가 사용되었다. 적절한 프라이머 조합을 사용하여, 시료 내에 존재 하는 Th17 세포에 비교한 Treg 세포를
단순 PCR 검정으로 결정할 수 있다.
2.4. 사이토카인 및 케모카인 검출
종양 조직 유래의 세포 현탁액(1 x 106 세포/ml)을 PMA + 이오노마이신의 존재 하에 10% 열-비활성화 FCS, L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen)로 보충된 RPMI 1640 중에 배양하였다. 케모카인의 IFNγ-매개성 유도를 위해, 난소암 세포주 및 원발성 종양 조직 유래의 세포 현탁액 (1 x 106 세포/ml)은 10, 50 및 100 ng/ml의 재조합 인간 IFNγ (Invitrogen)의 존재 하에 배양하였다. 배양 24시간 후에, 배양 상청액을 수거하고 사용시까지 -80℃에서 저장하였다. 배양 상청액내에 방출된 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-17a, IL-21, IFNγ 및 TNFα의 농도는 MILLIPLEXTM 인간 사이토카인/케모카인 키트 (Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 측정하였다. 케모카인(CCL2, CCL5, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CXCL9 및 CXCL10)의 농도는 Quantibody® Array Kit (Raybiotech, Norcross, GA)를 사용하여 분석하였다.
2.5. 유전체 DNA의 추출 및 정량적 실시간 PCR-기본 메틸화 분석
유전체 DNA (gDNA)는 PureLink Genomic DNA Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 사용하여 2 x 106 종양 유래의 세포 함유 용해물로부터 분리하였다. 추출된 gDNA의 농도는 Nanodropⓒ 2000c UV-Vis 분광광도계 (Thermo Scientific, Waltham, USA)로 측정하였다. gDNA의 4 내지 5개 미생물을 메틸코드 중아황산염 전환 키트(Invitrogen)을 사용하여 중아황산 나트륨으로 처리하였다. 메틸화 및 탈메틸화 FoxP3 Treg-특이적 탈메틸화 영역(TSDR)의 정량적 실시간 PCR 증폭을 중아황산염-처리된 gDNA, 0.5　U 플라티늄 Taq DNA 중합효소 (Invitrogen), MgCl2 불함유 PCT 완충액, 3 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs (각각), 1 μM 프라이머 및 0,2 μM TaqManⓒ 프로브를 사용하여 수행하였다. PCR 반응들은 CFX 96 사이클러 (BioRad, Hercules, USA)를 사용하여 수행하였다. 메틸환-특이적 및 탈메틸화 특이적 프라이머 및 TaqManⓒ 프로브는 상업적으로 합성하였다(독일 베를린 TIB MOLBIOL). 메틸화 및 탈메틸화 FoxP3 TSDR DNA의 양은 Rasmussen 등[Meuer, Wittwer, Nagawara (2001), Rapid Cycle Real-time PCR, Springer, pp. 21-34]에 기술된 바와 같은 제2 유도체 최대 방법을 사용하여 교차점 선형 회구에 의해 검정 곡선으로부터 평가하였다. 탈메틸화 FoxP3 TSDR에 의한 세포의 비율은 탈메틸화 FoxP3 TSDR DNA 대 메틸화 및 탈메틸화 FoxP3 TSDR DNA의 총합의 비로서 계산하였다 [Wiezorek et al., Cancer Res. (2009), 69, 599-608 and de Vries et al., Clin. Cancer Res. (2011), 17, 841-848].
2.6. 플라스미드 구축물
메틸화 및 탈메틸화 FoxP3 TSDR (86 bp)의 DNA 단편들은 HindIII 및 EcoRI 제한부위를 사용하여 pUC18 플라스미드(Amersham Biosciences, Amersham, UK)로 크로닝하였다. 플라스미드 구축물의 동일성은 서열화 후 Wizard Plus Midipreps kit (미국 매디슨 Promega)를 사용하여 플라스미스 DNA 정제하고, 3,34 x 10-7 내지 3,34 x 10-1 범위의 플라스미드 카피를 나타내는, 100, 10 및 1 pg/㎕ 및 100, 10, 1 및 0,1 fg/㎕의 7개의 최종 농도로 희석시켜 확인하였다. 계단 희석은 분석의 특이성을 입증하였고 메틸화 및 탈메틸화 FoxP3 TSDR의 정량화를 위한 표준으로 사용하였다.
2.7 RNA 추출 및 정량적 실시산 PCR
총 RNA를 RNA Easy Mini Kit (독일 힐덴 Qiagen)를 사용하여 2 x 106 종양-조직 유래 세포로부터 추출하였다. RNA 농도는 Nanodropⓒ 2000c UV-Vis 분광광도계 (Thermo Scientific)로 측정하고 RNA 완전성은 Experion 자동화 시스템(BioRad)을 사용하여 평가하였다. 상보적 DNA는 M-MLV 역전사 효소(Invitrogen)를 사용하여 총 RNA로부터 합성하고, TGFβ 및 β-액틴 하우스키핑 유전자에 특이적인 TaqManⓒ 프로브 및 프라이머의 존재 하에 정량적 실시간 PCR로 증폭시키고, 내부 참조로서 사용하였다. 모든 프라이머 및 프로브는 상업적으로 합성하였다(TIB MOLBIOL). 각각의 분석에서 qPCR 산물의 완전성은 서열화에 의해 확인하였다. 표적 유전자의 상대적 발현은 β-액틴의 발현으로 정규화하였다.
2.8 통계적 분석
통계적 분석은 Statistica® 10.0 소프트웨어(StatSoft, Tulsa, OK)를 사용하여 수행하였다. 데이터의 파라미터 추정은 정규성을 위한 Kolmogorov-Smirnov 검정을 사용하여 확인하였다. 불일치의 균일성은 Levene 검정으로 시험하였다. 종양 침윤성 면역 세포 사이의 상관관계는 피어슨 r 계수를 사용하여 평가하였다. 종양 조직과 말초 혈액시료 사이의 차이는 대응표본 t-검정을 사용하여 분석하였다. 나머지 데이터는 ANOVA에 이어서 Scheffe검정을 사용하여 분석하였다. 결과들은 p < 0.05일 때 통계적으로 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 3
추가의 검정에서, 환자의 종양 (난소암)으로부터 시료는 전술한 바와 같이 사용하였다. Treg의 백분위수 대 Th17 세포의 백분위수의 비는 각 환자 원발성 종양에 대해 측정하고 도 7에 도시 하였다. 이들 비는 질환의 단계별로 그룹화하였다. 각각의 점은 단일 환자에 대해 측정한 비를 나타낸다. 평균비 및 평균값의 표준오차를 질환의 각 단계에 대해 측정하였다. 이 실험에서 얻어진 값들은 표 2에서 관련 통계 값과 함께 제공된다.
실시예 3에서 얻어진 결과들은 도 7에 요약된다. 원발성 난소 종양 조직 내에서 Treg 대 Th17 T 세포의 비는 질환의 단계에 따라 나타낸다. Treg의 백분위수 대 Th17 T 세포의 백분위수의 비를 각 환자의 종양 조직에 대해 측정하였다. 그래프 상의 각 점은 한 환자의 비를 나타낸다. 질환의 각 단계에 대한 평균 및 SEM도 또한 나타낸다(unpaired Student's T-검정, *p<0.05).
FIGO 단계 I II IIII/IV
값의 수 6 5 29
최소값 0.33 2.83 1.84
백분위수 25% 0.33 2.91 6.23
중앙값 0.445 6.92 16.53
백분위수 75% 1.338 10.3 31.35
최대값 1.72 11.87 462.5
평균값 0.7467 6.666 46.72
표준편차 0.5826 3.86 94.65
표준오차 0.2379 1.726 17.58
평균값의 95% CI 이하 0.1352 1.873 10.72
평균값의 95% CI 이상 1.358 11.46 82.73
표 2
상기 값들로부터 질환 FIGO 단계에 따라 비의 현저한 차이가 있다는 것이 명확하다. 약자 "FIGO"는 "Federation Internationale de Gynecologie et d'Obstetique"를 의미한다. 이 기관은 미국 암 합동 위원회(AJCC)와 공동으로 난소 상피 암을 규정하는 병기(staging)를 지정하였다. FIGO 시스템은 가장 통상적으로 사용된다. 단계 I의 경우 평균값은 약 0.75이고, 단계 II의 경우 평균값은 약 6.7이고, 단계 III-IV의 경우 평균값은 46.7이다.
이들 데이터는 특이적 질환 단계에서 모든 환자로부터 계산된 Treg 대 Th17 세포의 평균비가 질환의 중증도에 따라 증가한다는 것을 보여준다. 상기 진단 및 추적은 각 단계의 평균 비와 각 환자에 대해 측정한 실제 비와의 비교를 기본으로 해야 할 것이다. FIGO 단계 I에서 진단된 암의 환자에 대해 0.75의 계산 평균비보다 더 낮은 비, 또는 FIGO 단계 II에서 진단된 암의 환자에 대해 6.6의 계산된 평균비보다 더 낮은 비는 더 양호한 예후로 해석될 수 있다. 마찬가지로, FIGO 단계 III-IV에서의 환자는 단계 I 또는 II에서 측정된 평균비에 상응할 만한 비를 가질 수 있다. 당업자는 각 단계에 대한 평균비율보다 더 낮은 비를 갖는 환자가 동일한 질환 단계에서 높은 비를 갖는 환자보다 더 양호한 예후를 가진다고 추정할 것이다. 따라서 예후는 개개의 비와 전체 평균비를 비교하여 확립할 수 있고, 예후를 기본으로 하는 의료치료가 최적화될 수 있다.

Claims (14)

  1. 적어도 하나의 시료에서 Treg-세포 대 Th17 세포, Th1 세포 및/또는 Th2 세포의 그룹을 포함하는 적어도 하나의 다른 그룹의 T 세포의 비를 결정하는 것을 특징으로 하는, 암 질환의 진행을 진단 및/또는 모니터링 및/또는 예측하는 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서, Treg 세포 대 다른 그룹의 T 세포의 비를 결정하기 위해 Th1 세포 및 Th2 세포가 단일 그룹으로 간주되는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 진단이 환자를 특이적 위험군으로 계층화하는데 사용되는, 시험관내 방법.
  4. 제1항에 있어서, Treg 세포 대 Th17 세포의 비를 결정하는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 종양 또는 종양으로부터 유래된 세포배양으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 종양의 생검 시편인 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 난소암 시료인 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포의 비가 유세포분석 (flow cytometry analysis)에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  9. 제8항에 있어서, Treg 세포의 유세포분석이 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 항-CD127, 항-CR4, 항-FoxP3 및 항-헬리오스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항체로 표면 염색하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 T 세포 대비 Treg 세포의 비가 ELISA에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포의 백분율이 실시간 PCT에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  12. 시험 대상체에서 제1항에 따른 암 질환의 진행을 진단 및/또는 모니터링 및/또는 예측하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 상기 시험 대상체로부터 얻어진 시료에서 Treg 세포의 개체군과, Th17 세포, Th1 세포 및/또는 Th2 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 그룹의 T 세포 개체군을 측정하는 단계;
    (b) 단계 a)에서 측정된 상기 Treg 세포의 개체군 대 단계 a)에서 측정된 상기 적어도 하나의 다른 그룹의 T 세포의 개체군의 비를 결정하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 결정된 비를 미리 결정된 기준 문턱값과 비교하는 단계로, 여기서 측정된 차이가 암을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (b)에서 결정된 비와 단계 (c)에서 개시된 미리 결정된 기준 문턱값 사이의 관계를 기준으로 상기 시험 대상체를 특이적 암 단계 또는 위험군으로 분류하는 단계 (d)를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 그룹의 T 세포가 Th17 세포를 포함하는, 시험관내 방법


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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2514591A (en) * 2013-05-30 2014-12-03 Mologen Ag Predictive biomarker for cancer therapy
ES2701092T5 (es) 2014-02-24 2022-05-12 Ventana Med Syst Inc Procedimientos, kits y sistemas para puntuar la respuesta inmunitaria al cáncer por detección simultánea de CD3, CD8, CD20 y FOXP3
CA2942721A1 (en) * 2014-03-14 2015-09-17 Czerniecki, Brian J. Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
US20160266125A1 (en) * 2015-03-12 2016-09-15 John Wayne Cancer Institute Methods of treating and predicting progression of cancer based on t cell subsets
JP2018519295A (ja) * 2015-06-22 2018-07-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 粘膜固有層調節性ｔ細胞の誘導
JP6100867B1 (ja) * 2015-11-06 2017-03-22 振武 曽 免疫状態の分析のための検査方法
CN106932576A (zh) * 2017-03-22 2017-07-07 山东大学深圳研究院 一种人调节性t细胞的免疫抑制功能的检测方法
US11573234B2 (en) 2017-05-19 2023-02-07 Royal Melbourne Institute Of Technology Predicting responders to cyclophosphamide therapy
TWI793151B (zh) 2017-08-23 2023-02-21 瑞士商諾華公司 3-(1-氧異吲哚啉-2-基)之氫吡啶-2,6-二酮衍生物及其用途
CN108508196B (zh) * 2018-04-13 2020-10-27 何韶衡 一种检测人调节性t细胞亚型的试剂盒及检测方法
WO2020012334A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Novartis Ag 3-(5-hydroxy-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and their use in the treatment of ikaros family zinc finger 2 (ikzf2)-dependent diseases
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020058308A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Ventana Medical Systems, Inc. Size-based gating to analyze flow cytometry data

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de Aguiar et al. Malignant and tuberculous pleural effusions: immunophenotypic cellular characterization
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