KR20150030781A - 세포에 항암제를 전달하는 방법 - Google Patents

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Abstract

항암제와 함께, 유리 알데히드 및 플라보노이드를 함유하는 전달제의 접합체를 포함하고, 상기 전달제가 상기 플라보노이드의 A 고리의 C6 및/또는 C8 위치에 접합되는 전달 비히클이 제공된다. 그 결과물인 전달 비히클은 세포에 항암제를 전달하기 위해 사용될 수 있다.

Description

세포에 항암제를 전달하는 방법{METHOD OF DELIVERING AN ANTI-CANCER AGENT TO A CELL}
본 출원은 그 내용이 참조로 본 명세서에 포함되어 있는 2007년 10월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/960,969호를 우선권 주장한다.
본 발명은 일반적으로 대상 내에서 종양 세포를 포함하는 세포에 생활성제(bioactive agent)를 전달하는 방법에 관한 것이다.
플라보노이드는 식물 폴리페놀 중 가장 많고 가장 연구가 많이 된 군 중 하나이다. 플라보노이드는 과일 및 채소에서 자연적으로 발생하는 큰 군의 저분자량 폴리페놀성 물질로 이루어지며, 인간 식이(diet)의 필수적인 부분이다. 건조된 녹차잎은 30 중량%만큼의 플라보노이드를 함유할 수 있으며, (-)-에피카테킨, (-)-에피갈로카테킨, (+)-카테킨, (-)-에피카테킨 갈레이트 및 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트를 포함하는 카테킨(플라반-3-올 유도체 또는 카테킨계 플라보노이드)으로 알려져 있는 플라보노이드를 높은 백분율로 포함한다.
최근, 이들 녹차 카테킨은 큰 관심을 끌고 있는데, 그 이유는 이들이 항균, 항종양, 항트롬빈, 혈관확장(vasodilatory), 항산화, 항돌연변이, 항-암형성, 고콜레스테롤혈증, 항바이러스 및 항염증 특성을 포함하는 생물학적 및 약리학적 특성을 갖는 것으로 인식되고 있기 때문이며, 이에 대해서는 다수의 인간, 동물 및 시험관내 연구에서 알려져 왔다(Jankun J., et al., Nature 387, 561 (1997); Bodoni A. et al., J. Nutr . Biochem. 13, 103-111 (2002); Nakagawa K. et al. J. Agric . Food Chem. 47, 3967-3973 (1999)). 이들 생물학적 및 약물학적 특성은 질환을 예방하고 게놈의 안정성을 보호하는데 잠재적으로 유익하다.
카테킨의 많은 유익한 효과는 카테킨의 항산화 작용과 연관되어 있는 것으로 생각된다(Terao J., et al. Arch . Biochem . Biophys. 308, 278-284 (1994)). 카테킨 중에서, 녹차의 주된 성분인 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)는 아마도 트리히드록시 B 고리와 C3 위치에서의 갈레이트 에스테르 모이어티(moiety)로 인해 가장 높은 활성을 갖고 있는 것으로 생각된다(Isemura M., et al. Biofactors 13, 81-85 (2000); Ikeda I., et al. J. Nutr. 135, 155 (2005); Lill G., et al. FEBS Letters 546, 365-270 (2003); Sakanaka S. and Okada Y. J. Agric . Food Chem. 52, 1688-1692 (2004); Yokozawa T., et al. J. Agric . Food Chem. 48, 5068-5073, (2000)).
일반적으로, 플라보노이드의 활성 반감기는 체내에서 수시간으로 제한된다; 이들 화합물의 대사는 아직 확립되어 있지 않다. EGCG를 포함하는 카테킨의 유리한 항산화 및 항암 특성에도 불구하고, 많은 양의 녹차를 직접 섭취함으로써 체내에서 상기 화합물의 치료 레벨을 달성하는 것은 고유의 부피 제약(volume constraint)으로 인해 비현실적이다. 즉, 식이만을 통해 플라보노이드로부터 치료학적 또는 약리학적 유익을 얻기 위해서는 실제 소비하는 것보다 더 많은 양의 음식 및 음료를 섭취할 필요가 있을 것이다. 아울러, EGCG를 포함하는 몇 가지 플라보노이드에 대해서는 전-산화(pro-oxidant) 활성이 보고되어 왔는데, 이는 조(crude) 녹차를 직접 섭취하는 것을 EGCG를 전달하는 덜 효과적인 수단이 되게 한다(Yen G.C., et al. J. Agric . Food Chem. 45, 30-34 (1997); Yamanaka N., et al. FEBS Lett. 401, 230-234 (1997); Roedig-Penman A. and Gordon M.H. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 4267-4270).
다른 한편으로, 상대적으로 고분자 분획인 추출된 식물 폴리페놀(프로시아니딘) 및 합성 올리고머화 (+)-카테킨 및 루틴(rutin)은 저분자량 플라보노이드에 비해 항산화 및 항암 활성과 같은 증가된 생리학적 특성을 나타내고(Zhao J., et al. Carcinogenesis 20, 1737-1745 (1999); Ariga T. and Hamano M. Agric . Biol . Chem. 54, 2499-2504 (1990); Chung J.E., et al. Biomacromolecules 5, 113-118 (2004); Kurisawa M., et al. Biomacromolecules 4, 1394-1399 (2003); Hagerman A.E., et al. J. Agric . Food Chem. 46, 1887 (1998)), 전-산화 효과는 없는 것으로 보고되어 왔다(Hagerman A.E., et al. J. Agric . Food Chem. 46, 1887 (1998); Li C. and Xie B. J. Agric . Food Chem. 48, 6362 (2000)). 그러나, 자연 발생형뿐만 아니라 합성 고분자량 플라보노이드는 섭취 후 다른 조직으로 흡수 및 운반될 것으로 예상되는데, 그 이유는 이들 화합물은 전형적으로 크고, 단백질과 강한 복합체를 형성하며, 분해 방지성이 있기 때문이다(Zhao J., et al. Carcinogenesis, 20, 1737-1745 (1999)).
음식 및 음료의 경구 섭취를 통해 먹는 플라보노이드의 경우, 상기 플라보노이드는 소화 동안에 산화성 손상으로부터 소화관을 보호하는 항산화제 역할을 할 수 있다. 그러나, 플라보노이드는 단지 소화관 내에서만 남아있고, 따라서 그 유익한 생리학적 활성들은 다른 조직에서 이용되지 않을 것으로 예상될 수 있다. 아울러, 이들의 단백질과 복합체를 형성하는 경향뿐만 아니라 강한 소수성은 이들 화합물을 비경구적으로 전달하기 어렵게 만든다.
본 발명은 국제출원 공개공보 WO2006/124000 및 미국출원 공개공보 2008/102052에 이미 개시되어 있는 플라보노이드 접합체(conjugate) 및 전달제(delivery agent)를 이용하여 종양 세포를 포함하는 세포에 생활성 항암제를 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명은 플라보노이드계 전달제를 항암제를 세포에 전달하기 위해 사용하면 상기 항암 생활성제 및 플라보노이드 사이에 상승 효과가 나타난다는 놀라운 발견에 기초하고 있다. 따라서, 이들 접합체 및 전달제는 담체(carrier)로 작용하는 플라보노이드 부분 및 전달되는 생활성제로부터 발생되는 상승 치료 효과를 겸비한다.
한 측면에서, 유리(free) 알데히드와 플라보노이드를 함유하는 전달제의 접합체 및 항암제를 포함하는 전달 비히클(vehicle)이 제공되며, 상기 전달제는 상기 플라보노이드의 A 고리의 C6 및/또는 C8 위치에 접합되어 있다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 것과 같은 전달제를 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 항암제를 세포에 전달하는 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 것과 같은 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
다른 측면에서, 대상 내에서 항암제를 세포에 전달하기 위한 본 명세서에 개시된 것과 같은 마이셀(micell)-단백질 복합체의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 측면 및 특징들은 하기 개시된 본 발명의 특정한 구현예와 첨부된 도면을 조합하여 검토함으로써 본 기술분야의 당업자에게 자명해질 것이다.
플라보노이드는 항암 효과를 갖고 암 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하는 다양한 생물학적 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 플라보노이드를 포함하는 전달 비히클은 국제출원 공개공보 WO2006/124000 및 미국출원 공개공보 2008/102052에 이미 개시되어 있었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 플라보노이드 전달 비히클 및 생활성 항암제의 조합이 플라보노이드 전달 비히클 및 생활성 항암제가 각각 단독으로 사용되었을 때의 조합 효과보다도 더 큰 상승 항암 효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 따라서, 항암제로 로딩된(loaded) 이러한 전달 비히클은 세포에 항암제를 전달하는 효과적인 방법을 제공하며, 이 방법은 전달 비히클의 플라보노이드 부분의 항암 활성과 항암제의 항암 효과 사이의 상승 효과를 이용한다.
본 발명자들은 플라보노이드 및 EGCG와 같은 플라보노이드의 접합체를 이용한 자기조립(self-assembly)에 의해 단백질, 핵산 또는 약물과 같은 항암제를 함유하는 전달 비히클을 개발하였다. 상기 전달 비히클은 자기조립에 의해 형성되었다. 예를 들면, 전달 비히클은 (ⅰ) 올리고머성 (-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트(OEGCG) 및 항암제의 조립, 및 이후의 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 EGCG의 접합체(PEG-EGCG)와 상기 미리-형성된 OEGCG-항암제 복합체의 조립을 포함하는 2 단계 자기조립 공정; 및 (ⅱ) PEG 및 OEGCG의 접합체(PEG-OEGCG) 및 항암제의 조립을 포함하는 1 단계 자기조립 공정에 의해 합성되었다. 양쪽 전달 비히클 모두 온화한 수용액 내에서 자발적인 자기조립을 통해 항암제가 로딩된 안정하고 고배향된(highly oriented) 마이셀성 복합체를 형성하였다. 결과물인 마이셀성 나노복합체는 특징적으로 PEG 외부 껍질(shell) 및 OEGCG-항암제 복합체를 포함하는 내부 코어(core)를 나타내었다.
마이셀성 나노복합체의 형성은 주로 소수성 상호작용과 수소결합에 의해 추진되기 때문에, 본 명세서에 개시된 전달 비히클은 세포로의 전달을 개선하기 위해 광범위한 항암제를 로딩하기 위해 사용될 수 있다.
상기 전달 비히클은 체내에 투여되었을 때 향상된 투과-보유(enhanced permeability and retention, EPR) 효과를 이용하고, 세망내피계(reticuloendothelial system, RES) 흡수를 피하도록 디자인되어서, 암 부위에서 선별적으로 축적되도록 한다. 이상적으로는, 상기 전달 비히클이 전달되는 동안 플라보노이드 분자 및 항암제 모두 활성을 잃어버리고 분해되는 것으로부터 안정성을 갖고 있어서, 세포에 전달되었을 때 상승 치료 효과를 나타내는 것이다. 상기 전달 비히클은 세포에 성공적으로 전달 및 방출될 때까지 상기 전달 비히클의 내부 코어 내에 플라보노이드 및 항암제 모이어티(moiety)를 격리시킴으로써 상기 플라보노이드와 항암제 활성의 활성화를 차단하고, 전달 비히클이 세포 부위에서 분리될 때에만 각 활성이 복원될 수 있다.
상기 전달 비히클에 의한 상승 치료 효과를 보여주기 위하여, 하기 실시예 1에 개시된 바와 같이 항암 단백질인 헤르셉틴(트라스투주맙, trastuzumab)을 상기 마이셀성 복합체 내로 로딩하였다. 상기 마이셀성 복합체는 그 본래 모습(integrity)을 유지하였고, 시간의 함수로서 크기 변화없이 혈청의 존재 하에 양호한 안정성을 나타내었으며, 상기 단백질은 마이셀성 복합체 내에서 단백질분해로부터 안전하게 보호되었다. 상기 헤르셉틴이 로딩된 전달 비히클은 개별 성분들(OEGCG, PEG-EGCG 및 헤르셉틴)과 비교할 때 더 큰 억제율을 보여주었다.
상기 전달 비히클의 형성은 주로 소수성 상호작용에 의해 추진되기 때문에, 양친매성(amphiphilic) 분자와 같은 소수성 경쟁자(competitor)에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 전달 비히클이 표적 세포 부위에 축적될 때, 상기 전달 비히클은 생(bio)-양친매성 분자(예컨대, 원형질막 지질)에 의해 분리되어 함유된 치료 플라보노이드 및 항암 화합물을 방출할 수 있다.
따라서, 세포에 항암제를 전달하는 방법이 제공된다. 국제출원 공개공보 WO2006/124000 및 미국출원 공개공보 2008/102052에 이미 개시되어 있는 것 및 하기 개시되어 있는 것과 같은 플라보노이드 및 항암제를 함유하는 전달 비히클이 사용된다. 이후, 상기 전달 비히클은 항암제가 전달되는 세포와 접촉한다.
플라보노이드 접합체 및 전달 비히클
유익한 플라보노이드 화합물의 이용성을 증가시키기 위하여, 전달제 상의 유리 알데히드기를 통해 플라보노이드의 A 고리에서 플라보노이드를 다양한 전달제에 접합시키면 상기 플라보노이드의 생물학적 및 약리학적 특성을 증대(augmenting)시키는 한편, 상기 플라보노이드의 폴리페놀 구조의 붕괴없이 플라보노이드의 물리적 특성이 변형되도록 한다.
즉, 플라보노이드에 전달제를 알데히드-매개 접합시키면 상기 플라보노이드 A 고리의 C6 및/또는 C8 위치에 상기 전달제가 부착하게 되며, 상기 플라보노이드의 B 및 C 고리 또는 상기 플라보노이드의 다양한 히드록시기가 붕괴되거나 영향을 미치지 않는다.
플라보노이드에 전달제를 접합시키면, 전달제와 함께 형성된 특정 비히클 내로 상기 플라보노이드를 포함시킴으로써 대상에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공할 수 있고, 식이를 통해 얻을 수 있는 것보다 더 높은 농도의 플라보노이드를 투여하도록 할 수 있다. 상기 전달제는 상기 조성물에 안정성을 제공하여 보다 느리게 대사 또는 분해되고, 따라서 접합되지 않은 플라보노이드 단독보다도 체내에서 더 긴 반감기를 가질 수 있는 조성물이 되도록 할 수 있다. 예를 들면, 상기 전달제는 플라보노이드가 상기 플라보노이드의 수용성을 향상시키는 조성물 내로 포함되어서, 세망내피계에 의해 흡수된 후 신장에서 제거되는 것을 피할 수 있고, 결과적으로 체내에서 더 긴 반감기를 갖는 것과 같은 성질을 가질 수 있다. 다른 전달제와 접합시키면 상기 플라보노이드를 효소 분해로부터 보호할 수 있다.
전달제는 산 촉매의 존재 하에 상기 전달제를 플라보노이드와 반응시킴으로써 플라보노이드에 접합될 수 있으며, 이때 상기 전달제는 유리 알데히드기 또는 산의 존재 하에 유리 알데히드기로 전환될 수 있는 기를 갖는다.
상기 플라보노이드는 코어 페닐벤질 피론 구조로부터 유래되는 일반적인 부류의 분자로부터의 임의의 플라보노이드일 수 있으며, 플라본, 이소플라본, 플라보놀, 플라바논, 플라반-3-올, 카테킨, 안토시아니딘 및 칼콘(chalcone)을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 플라보노이드는 카테킨 또는 카테킨계 플라보노이드이다. 카테킨 또는 카테킨계 플라보노이드는 일반적으로 카테킨(또는 플라반-3-올 유도체)으로 알려져 있는 부류에 속하는 임의의 플라보노이드이며, 카테킨, 및 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 카테킨, 에피카테킨 갈레이트 및 에피갈로카테킨 갈레이트를 포함하는 카테킨 유도체를 포함하고, 카테킨 또는 카테킨계 플라보노이드의 모든 가능한 입체이성질체(stereoisomer)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 카테킨계 플라보노이드는 (+)-카테킨 또는 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트이다. (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)는 아마도 상기 플라보노이드의 트리히드록시 B 고리 및 C3 위치의 갈레이트 에스테르 모이어티로 인해 카테킨계 플라보노이드 중에서 가장 높은 활성을 갖는 것으로 생각된다.
상기 전달제는 유리 알데히드기, 또는 아세탈기와 같이 산의 존재하에 유리 알데히드기로 전환될 수 있는 작용기를 함유하는 임의의 화학기 또는 모이어티이다. 상기 전달제는 전달 비히클 내에 형성될 수 있으며, 따라서 플라보노이드의 생물학적 또는 약리학적 특성을 손상시키지 않으면서 접합된 플라보노이드가 상기 전달 비히클 내에 포함되도록 한다. 마찬가지로, 상기 전달제는 생체적합성이어야 하며, 어떤 구현예에서는 생분해될 수 있다.
하기 내용은 상기 플라보노이드가 카테킨계 플라보노이드이고 상기 전달제가 폴리머인 구현예에 관한 것이다. 그러나, 알데히드-함유 화학기와 플라보노이드 사이의 알데히드 축합 반응은 전술한 바와 같이 유리 알데히드기를 갖는 임의의 전달제(전달제를 하기 산 처리한 것을 포함함)를 임의의 플라보노이드에 접합하는데 적용할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
따라서, 상기 반응은 유리 알데히드기 또는 산의 존재하에 유리 알데히드기로 전환될 수 있는 기를 함유하는 폴리머를 카테킨계 플라보노이드에 접합시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 카테킨계 플라보노이드는 카테킨계 플라보노이드의 단일 모노머 유닛이거나, 하나 이상의 카테킨계 플라보노이드의 올리고머일 수 있다. 전술한 바와 같이, 플라보노이드에 대한 폴리머의 접합은 상기 플라보노이드의 생물학적 또는 약리학적 특성을 증대시키게 된다. 마찬가지로, 상기 카테킨계 플라보노이드의 올리고머는 카테킨계 플라보노이드와 연관된 생물학적 및 약리학적 특성의 레벨을 증폭 또는 증대시키는 경향이 있으며, 때로는 모노머성 카테킨계 플라보노이드와 연관되는 감소된 전-산화 효과를 가질 수도 있다. 따라서, 상기 카테킨계 플라보노이드는 증폭 또는 증대된 플라보노이드 특성을 갖는 올리고머화 카테킨계 플라보노이드이다.
효소-촉매성 산화적 커플링 및 알데히드-매개성 올리고머화를 통해 제조된 올리고머를 포함하여, 카테킨계 플라보노이드의 올리고머는 알려져 있다. 알데히드-매개성 올리고머화 공정은 예를 들면 한 모노머의 A 고리 상의 C6 또는 C8 위치로부터 다음 모노머의 A 고리 상의 C6 또는 C8 위치로 연결되는 CH-CH3 브릿지(bridge)와 같은 탄소-탄소 결합을 통해 소정의 결합을 갖는 분지되지 않은 올리고머가 되게 하며, 적용가능한 곳에서 가능한 입체배열(stereoconfiguration) 중 어느 하나를 포함한다. 따라서, 상기 CH-CH3 결합은 한 모노머의 A 고리의 C6 위치와 다음 모노머의 C6 또는 C8 위치 중 어느 하나 사이일 수 있으며, 또는 처음 모노머의 A 고리의 C8 위치와 다음 모노머의 C6 또는 C8 위치 중 어느 하나 사이일 수 있다.
상기 카테킨계 플라보노이드의 올리고머는 서로 결합된 2개 이상의 모노머 유닛일 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 카테킨계 플라보노이드 올리고머는 2 내지 100개 플라보노이드 모노머 유닛, 10 내지 100개, 2 내지 80개, 10 내지 80개, 2 내지 50개, 10 내지 50개, 2 내지 30개, 10 내지 30개, 2 내지 100개, 30 내지 100개 또는 50 내지 100개 모노머 유닛을 갖는다.
상기 폴리머는 상기 카테킨계 플라보노이드와 접합되기 전에 유리 알데히드기를 갖거나, 아세탈기와 같이 산의 존재하에 알데히드기로 전환되는 기를 갖는 임의의 폴리머일 수 있다. 아울러, 상기 폴리머는 비독성이고, 생체적합성이며, 약리학적 용도에 적합해야 함이 이해될 것이다. 상기 폴리머는 또한 다른 바람직한 특성을 가질 수 있으며, 예를 들면 상기 폴리머는 낮은 면역원성을 가질 수 있고, 예를 들면 체내의 특정 부위에서의 카테킨계 플라보노이드 및 항암제의 조절된 방출을 위하여 상기 조성물의 희망하는 생물학적 적용에 따라 생분해성 또는 비-생분해성일 수 있다.
상기 폴리머는 그 특정한 특징 및 특정 형태의 전달 비히클을 형성하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리머는 알데히드-말단(terminated) 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있고, 또는 알데히드기로 유도체화된(derivatized) 히알루론산 또는 이러한 폴리머의 유도체일 수 있다. 다른 한편으로, 상기 폴리머는 예를 들면 시클로트리포스파젠 코어 페녹시메틸(메틸히드라조노) 덴드리머(PMMH) 또는 티오포스포릴 코어 PMMH와 같은 PMMH일 수 있다. 또한, 상기 폴리머는 예를 들면 유리 알데히드기, 또는 알데히드-변형된 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드 또는 핵산과 같이 산의 존재하에 알데히드로 전환되는 기를 함유하도록 변형된 임의의 생물학적 폴리머일 수 있다. 한 특정 구현예에서, 상기 폴리머는 알데히드-말단 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG-CHO)이다. 다른 특정 구현예에서, 상기 폴리머는 알데히드-유도체화된 히알루론산, 아미노아세틸알데히드 디에틸아세탈로 접합된 히알루론산이거나, 또는 티라민으로 유도체화된 전술한 히알루론산 폴리머 중 어느 하나이다.
상기 폴리머 상의 유리 알데히드기는 조절된 방식으로 상기 폴리머를 상기 플라보노이드 구조의 A 고리의 C6 또는 C8 위치 중 어느 하나 또는 양쪽 모두에 접합하도록 하여, 상기 플라보노이드 구조, 특히 상기 플라보노이드의 B 및 C 고리의 붕괴를 방지하고, 따라서 상기 플라보노이드의 유익한 생물학적 및 약리학적 특성을 보존하도록 한다.
상기 폴리머는 폴리머의 알데히드기와 카테킨계 플라보노이드의 A 고리의 C6 및/또는 C8 위치의 반응을 통해 상기 카테킨계 플라보노이드에 접합된다.
상기 접합체는 산 촉매를 이용하여 상기 카테킨계 플라보노이드와 상기 폴리머의 알데히드기를 축합시키거나, 또는 산을 이용하여 상기 카테킨계 플라보노이드와 알데히드기의 축합 전에 상기 폴리머 상의 작용기를 유리 알데히드로 전환시킴으로써 합성된다.
상기 폴리머 및 카테킨계 플라보노이드를 접합시키기 위하여, 상기 폴리머 및 카테킨계 플라보노이드는 적합한 용매 내에 개별적으로 용해될 수 있다. 산의 존재하에 유리 알데히드를 갖는 폴리머는 카테킨계 플라보노이드를 함유하는 용액에 예를 들면 적가함으로써 첨가된다. 상기 반응이 완료되도록 한다. 상기 접합 반응에 이어서, 과량의 미반응 폴리머 또는 카테킨계 플라보노이드는 예를 들면 투석 또는 분자 체(molecular sieving)에 의해 접합된 조성물로부터 제거될 수 있다.
카테킨계 플라보노이드와 폴리머의 비는 상기 폴리머의 카테킨계 플라보노이드 부분에 단지 하나의 폴리머 모이어티만 부착되거나, 상기 폴리머 상의 하나 이상 위치에 카테킨계 플라보노이드 부분이 부착되거나, 상기 케타킨계 플라보노이드 부분이 상기 카테킨계 플라보노이드의 C6 및 C8 위치 중 어느 하나에 각각 부착된 2개의 폴리버 부분을 갖도록 변할 수 있다.
최종 조성물에서의 폴리머와 카테킨계 플라보노이드의 비는 출발 시약의 비를 통해 조절될 수 있다. 예를 들면, 폴리머 모이어티 대 카테킨계 플라보노이드 모이어티의 몰비가 약 1일 때, 단일 폴리머 모이어티가 단일 카테킨계 플라보노이드 모이어티에 부착될 것이다(모노머 또는 올리고머 중 하나가 사용될 수 있음). 그러나, 예를 들면 폴리머 대 카테킨계 플라보노이드의 몰비가 10:1인 고농도의 폴리머에서는, 폴리머-플라보노이드-폴리머의 트리-블록(tri-block) 구조를 갖는 조성물이 얻어질 수 있다.
플라보노이드의 A 고리의 C6 및/또는 C8 위치에 폴리머가 접합된, 유리 알데히드를 함유하는 폴리머와 카테킨계 플라보노이드의 접합체 또한 고려될 수 있다.
폴리머의 접합은 또한 카테킨계 플라보노이드가 다양한 조성물 또는 비히클 내로 포함되도록 한다. 폴리머의 물리적 특성에 기초하여 유리 알데히드기를 함유하는 특정 폴리머를 선택함으로써 다양한 형태의 상이한 비히클 내로 플라보노이드를 포함시킬 수 있으며, 이는 상이한 맥락(context)에서 고농도의 플라보노이드가 체내의 다양한 표적 영역으로 전달되도록 한다.
따라서, 전술한 반응의 결과물인 접합체는 상기 접합체의 폴리머 부분의 성질에 따라 전달 비히클 내에 형성될 수 있다. 전달 비히클은 상기 전달 비히클의 성질에 따라 상기 카테킨계 플라보노이드를 체내의 특정 표적화된 부위를 포함하는 체내로 전달하는데 사용될 수 있다.
항암제
항암제는 상기 전달 비히클 내에 포함되며, 이후 상기 항암제가 전달되는 세포와 접촉한다. 따라서, 폴리머 상의 유리 알데히드기를 통해 폴리머에 접합되는 카테킨계 플라보노이드를 포함하고, 추가로 항암제를 포함하는 전달 비히클이 제공된다.
상기 항암제는 세포독성, 아폽토시스성(apoptotic), 항-유사분열성(anti-mitosis), 항-혈관형성(anti-angiogenesis) 또는 전이 억제 효과와 같은 항-종양 효과를 포함하는 세포에 대한 항암 효과를 갖는 임의의 제제일 수 있다. 상기 항암 효과는 종양 세포 성장의 억제 또는 감소, 암발생의 억제 또는 감소, 종양 세포를 죽임, 또는 종양 세포를 포함하는 세포의 암발생 또는 종양발생 특성의 억제 또는 감소를 포함하는 의도이다.
항암제는 단백질, 핵산, 소분자 또는 약물을 포함한다. 단백질인 항암제는 펩티드, 항체, 호르몬, 효소, 성장 인자 또는 사이토카인(cytokine)일 수 있다. 핵산인 항암제는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, siRNA일 수 있으며, 또는 항암제 생성물을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 항암제의 범주에는 화학요법제 또는 혈관형성 억제제가 포함된다. 상기 항암제는 종양 세포-표면의 마커에 대한 단일클론 항체를 포함하는 항체, 면역조절성 펩티드, 사이토카인 또는 성장 인자일 수 있다. 상기 항암제는 헤르셉틴(트라스투주맙) 또는 TNP470일 수 있다.
항암제를 함유하는 전달 비히클의 형성
한 특정 구현예에서, 상기 전달 비히클은 카테킨계 플라보노이드 및 항암제를 대상의 체내의 특정 부위에 위치하는 세포를 포함하는 세포에 비경구 전달하기에 적합한 마이셀성 나노복합체이다.
상기 항암제를 함유하는 전달 비히클을 형성하기 위하여, 상기 폴리머는 상기 조성물의 카테킨계 플라보노이드 부분과 조립하여서 상기 플라보노이드가 용액 환경으로부터 보호되도록 하는 특성을 갖도록 선택된다. 상기 접합체의 폴리머 부분이 가용성이고 상기 카테킨계 플라보노이드보다 더 가용성인 적합한 용매가 선택되면, 상기 접합체는 자기조립하여 상기 플라보노이드 코어로부터 용액을 배제하게 되고, 따라서 마이셀성 복합체가 조립되도록 한다.
상기 마이셀성 나노복합체 전달 비히클의 특정 구현예에서, 선택된 폴리머는 알데히드-말단 PEG 또는 그 유도체이다. PEG는 약리학적 성분으로 널리 사용되는 폴리머이며, 낮은 생분해성과 더불어 양호한 친수성, 비독성, 비면역원성 및 생체적합성 특징을 갖고 있다.
PEG-CHO를 카테킨계 플라보노이드에 접합함으로써, 강한 자기조립 경향을 갖는 접합체가 형성된다. 한 구현예에서, PEG는 카테킨계 플라보노이드의 모노머에 접합되어 PEG-플라보노이드를 형성한다. 상기 전달 비히클은 접합되지 않은 카테킨계 플라보노이드 및 항암제와 함께 형성된다. 따라서, 중심 코어는 상대적으로 높은 농도의 플라보노이드 및 항암제를 함유하는 반면, 마이셀성 나노복합체의 외부 껍질은 상기 접합된 PEG-모노머성 플라보노이드를 포함하고, 2 단계 공정으로 조립된다. 특정 구현예에서, 상기 중심 코어는 올리고머성 EGCG (OEGCG)이고, 외부 껍질은 접합된 PEG-EGCG로 이루어진다.
2 단계 조립에 의한 전달 비히클의 형성 결과, 상기 전달 비히클의 코어 내로 포함된 올리고머성 플라보노이드의 생물학적 활성이 일시적으로 부분 또는 완전히 차단될 뿐만 아니라 상기 항암제가 세포에 전달되기 전에 분해되는 것이 방지된다. 예를 들면, 전달 비히클의 코어 내로 조립될 때, 상기 전달 비히클의 조립된 코어 부분 내 다른 분자와의 물리적인 상호작용으로 인해 상기 올리고머화 EGCG의 증대된 특성의 이용성이 떨어지게 된다. 예를 들면, 상기 비히클과 세포성 인지질막과의 융합에 의해 상기 전달 비히클로부터 방출될 때, 상기 전달 성분들이 분리되어 올리고머성 카테킨계 플라보노이드의 생물학적 특성이 드러나고(unmasking), 항암제를 방출하여 세포 내로 전달한다.
전달 비히클의 상기 구현예는 항암제를 전달하기에 아주 적합하다. 상기 카테킨계 플라보노이드는 단단하고(rigid), 다중-고리인 코어 구조를 갖고 있기 때문에, 이들 분자는 아마도 상기 카테킨 고리와 상기 항암제 상의 고리 또는 고리들과의 중첩(stacking)에 의해 단백질 및 핵산과 같은 항암제뿐만 아니라 고리 구조를 함유하는 다른 분자들과도 잘 결합한다. 따라서, 올리고머성 카테킨계 플라보노이드는 마이셀성 나노복합체 내에서 조립하기 전에 항암제와 결합하는데 사용될 수 있다.
상기 항암제의 농도는 체내의 특정 부위로 전달되는 항암제의 총량과, 마이셀성 구조를 불안정화시키지 않으면서 상기 마이셀성 나노복합체 내에 포함될 수 있는 항암제의 양에 따라 선택된다. 어떤 구현예에서, 상기 항암제는 마이셀성 복합체의 50 w/w%까지, 또는 40 w/w%까지 구성될 수 있다.
또한, 상기 항암제의 생물학적 활성은 본 발명의 전달 비히클 내에 포함될 때 일시적으로 부분 또는 완전히 차단된다. 상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드와 마찬가지로, 항암제가 전달 비히클 내에 조립될 때 항암제의 생물학적 특성이 차단 또는 격리되어 이들을 이용하기 어렵게 하며, 이는 상기 항암제는 상기 전달 비히클 내에 함유될 때 항암 활성을 나타내거나 생활성 방식으로 다른 분자들과 상호작용할 수 없고, 또한 다른 분자들의 활성으로부터 보호된다는 것을 의미한다. 상기 전달 비히클로부터 항암제가 방출되면, 항암제의 생물학적 특성을 다시 이용할 수 있고, 상기 항암제는 세포에 전달될 때 항암 효과를 나타낼 수 있다.
다른 구현예에서, PEG는 올리고머성 카테킨계 플라보노이드에 접합된다. 전달제의 상기 구현예는 강한 자기조립 특성을 가지며, 1 단계 공정으로 자기조립될 수 있다. 상기 2 단계 조립 마이셀성 나노복합체와 마찬가지로, 상기 1 단계 조립 마이셀성 나노복합체는 상기 항암제를 포함한다.
상기 마이셀성 나노복합체는 나노규모 치수이며, 직경 약 1 ㎚ 내지 약 10,000 ㎚, 또는 직경 약 20 ㎚ 내지 약 4,000 ㎚, 또는 직경 약 20 ㎚ 내지 약 100 ㎚일 수 있다. 상기 마이셀성 나노복합체의 크기는 올리고머화 카테킨계 플라보노이드의 길이, 상기 폴리머의 길이 및 접합되지 않은 올리고머화 카테킨계 플라보노이드의 농도를 변경함으로써 달라질 수 있다. 상기 마이셀성 나노복합체의 크기는 사용되는 폴리머에 따라 pH 의존적일 수 있다. 예를 들면, 접합된 폴리머가 PEG인 마이셀성 나노복합체에서, 상기 마이셀의 직경은 pH가 증가함에 따라 감소하는 경향이 있다.
일반적으로, 상기 항암제를 함유하는 마이셀성 복합체는 자기조립을 하게 되며, 따라서 합성이 거의 요구되지 않는다. 상기 2 단계 공정의 경우, 항암제를 포함하여 코어를 형성하는 성분들은 예를 들면 희석된 DMSO 또는 메탄올과 같은 적합한 용매 내에 용해하여 조립되게 된다. 상기 용매는 상기 코어 성분이 용해되고, 물과 섞일 수 있거나 휘발성일 수 있으며, 그렇지 않다면 이로부터 조립된 마이셀이 단리 또는 추출될 수 있는 용매이다. 상기 나타낸 바와 같이, 상기 코어 성분은 항암제 및 올리고머성 카테킨계 플라보노이드와 같은 카테킨계 플라보노이드를 포함한다. 이후, 상기 외부 껍질을 형성하는 폴리머-카테킨계 플라보노이드 접합체를 상기 용액에 첨가하여 마이셀성 복합체가 형성되도록 한다.
상기 1 단계 자기조립 공정의 경우, 상기 항암제와 함께 폴리머-카테킨계 플라보노이드 접합체는 상기 2 단계 공정에 대해 개시된 것과 같은 적합한 완충액(buffer) 내에 용해되어 마이셀성 나노복합체가 조립되도록 한다.
상기 마이셀성 나노복합체 시스템은 상기 PEG 외부 껍질로 인해 카테킨계 플라보노이드의 조절된 생체분포(biodistribution) 및 혈류에서의 연장된 순환 반감기뿐만 아니라 상기 카테킨계 플라보노이드 화합물의 증폭된 병리학적 활성을 달성할 수 있도록 하며, 이러한 화합물은 상기 마이셀의 내부 코어 내에 로딩된 항암제의 치료 효과와 동반될 수 있다는 추가적인 이점을 갖는다. 상기 항암제가 단백질과 같은 민감성 분자일 때, 상기 나노규모 마이셀은 단백질과 같은 민감성 생활성 항암제가 변성되도록 할 수 있는 현재 사용되는 종래 캡슐화 기술과 결합될 수 있는 기계적, 열적 및 화학적 응력을 포함하지 않는 부드러운(gentle) 자기조립 방법의 이점을 갖는 편리한 전달 비히클을 제공한다.
다른 특정 구현예에서, 상기 전달 비히클은 항암제의 지속 방출 전달용 드레싱(dressing) 또는 조직 재생용 지지체(suppoer)로 사용될 수 있는 히드로겔(hydrogel)이다.
상기 폴리머는 양호한 팽창 특징을 갖고 상기 폴리머 모이어티의 가교에 이용될 수 있는 적당한 기를 갖도록, 또한 비독성 및 생체적합성이고, 어떤 구현예에서는 생분해성이 되도록 선택된다.
상기 히드로겔의 특정 구현예에서, 상기 폴리머는 알데히드 유도체화된 히알루론산 또는 히알루론산 아미노아세틸알데히드 디에틸아세탈 접합체와 같은 히알루론산의 유도체, 또는 알데히드 유도체화된 히알루론산의 티라민 유도체 또는 히알루론산 아미노아세틸알데히드 디에틸아세탈 접합체이다.
히알루론산-카테킨계 플라보노이드를 포함하는 접합체는 플라보노이드의 생물학적 또는 약리학적 특성의 손상없이 쉽게 가교되어 히드로겔을 형성할 수 있다. 이러한 히드로겔은 또한 상기 히드로겔이 적용되는 부위에서 세포에 항암제를 방출하기 위하여 전술한 바와 같은 항암제를 포함한다.
상기 히알루론산-플라보노이드 접합체는 상기 히알루론산과 카테킨계 플라보노이드를 산성 조건, 예를 들면 약 1 내지 약 5, 또는 예를 들면 약 1의 pH 하에 반응시킴으로써 합성된다. 이후, 상기 접합된 폴리머-플라보노이드를 예를 들면 투석에 의해 정제한 후, 상기 항암제 및 과산화수소와 같은 가교제와 혼합한다. 고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 같은 가교 촉매를 첨가한 후, 가교 반응이 완료되기 전에 상기 히드로겔을 신속하게 주형 내로 부어서 원하는 모양을 형성할 수 있다. 예를 들면, 상기 히드로겔은 상처 드레싱과 같은 적용시에 적합한 슬랩(slab) 내에 형성될 수 있다.
또한, 상기 히드로겔의 성분은 예를 들면 항암제와 함께, 과산화수소 및 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 가교 촉매와 같은 가교제와 함께 가교되지 않은 접합체를 주사함으로써 생체내에서 히드로겔을 형성하기 위해 주사 및 반응할 수 있다. 이러한 히드로겔은 체내의 특정 부위로의 약물 전달 또는 조직 공학용으로 유용하다.
히알루론산은 상기 접합 반응 동안에 상기 플라보노이드와 반응할 수 있는 다중 부위를 갖고 있기 때문에, 반응 시작시 카테킨계 플라보노이드의 농도를 변경시킴으로써, 상기 히알루론산 폴리머와 카테킨계 플라보노이드 사이의 접합 정도를 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 반응물의 비는 결과물인 접합체가 상기 플라보노이드와 접합된 폴리머 상 부위의 약 1% 내지 약 10%를 갖도록 조정될 수 있다. 다른 한편으로, 접합되지 않은 별도의 히알루론산이 히드로겔의 가교 전에 상기 혼합물에 첨가되어, 히드로겔 내의 폴리머 분자의 일부가 플라보노이드에 접합되지 않도록 할 수도 있다.
세포로의 항암제의 전달
상기 플라보노이드-함유 전달 비히클을 이용하여 항암제를 세포에 전달하기 위하여, 항암제를 포함하는 전달 비히클을 세포와 접촉시켜서 항암제가 세포 내로 흡수되도록 할 수 있다.
따라서, 세포로의 항암제의 전달은 항암제를 함유하는 전달 비히클과 세포의 표면을 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, 상기 전달 시스템은 원형질막의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 분리되고, 따라서 항암제는 수동 표적화(passive targeting)에 의해 세포 부위에 방출되어서, 세포 내로 방출될 수 있다.
항암제가 전달되는 세포는 시험관내 세포, 배양되는 세포, 또는 대상 내의 생체내 세포를 포함하는 임의의 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "세포"라는 용어는 달리 특정하지 않는 한 맥락이 허용하는 단일 세포, 복수의 세포 또는 세포의 군집(population)을 나타내고 이를 포함한다. 상기 세포는 대상으로부터 외식(explant)된 세포를 포함하는 시험관내 세포이거나, 대상 내의 생체내 세포일 수 있다. 유사하게, "세포"에 대한 참고문헌은 달리 특정하지 않는 한 맥락이 허용하는 단일 세포에 대한 참고문헌을 포함한다.
상기 세포는 임의의 생물, 예를 들면 인간을 포함하는 포유동물을 포함하는 동물로부터 유래될 수 있다.
세포에 전달될 때, 항암제는 전술한 바와 같이 그 항암 기능을 유지하고 있으며, 세포 내로 전달될 수 있다. 당업자는 상기 항암제가 세포 내로 전달되었는지 여부를 단백질 검출법, 면역분석 및 형광 표지 기술을 포함하는 공지된 방법 및 기술을 이용하여 쉽게 결정할 수 있다.
전술한 조성물 및 전달 비히클은 대상의 체내의 특정 부위로 카테킨계 플라보노이드와 함께 항암제를 조절 및 표적 전달하는데 매우 적합하다. 상기 플라보노이드는 표적 부위에 항균, 항종양, 항트롬빈, 혈관확장, 항산화, 항돌연변이, 항-암형성, 고콜레스테롤혈증, 항바이러스 및 항염증 활성을 제공할 수 있다. 아울러, 전달 비히클은 항암제를 포함해서, 상기 전달 비히클이 암의 치료에 유용하도록 한다. 예를 들면, 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 면역조절 펩티드 및 단백질은 암을 치료하기 위한 중요한 부류의 약물로 부상하고 있다.
따라서, 본 발명은 유리 알데히드 및 카테킨계 플라보노이드를 함유하는 폴리머의 접합체를 포함하는 전달 비히클을 투여하는 단계를 포함하는 대상에게 항암제를 전달하는 방법이 제공되며, 전술한 바와 같이 상기 플라보노이드의 A 고리의 C6 및/또는 C8 위치에 접합된 폴리머 또한 고려된다. 어떤 구현예에서, 상기 접합체는 전술한 바와 같이 마이셀성 나노복합체 또는 히드로겔과 같은 전달 비히클 내에 형성된다.
상기 대상은 항암제 치료가 필요한 인간을 포함하는 임의의 동물이다.
따라서, 전술한 바와 같은 항암제 및 플라보노이드를 함유하는 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 일상적으로 약학적으로 허용가능한 농도의 염, 완충제, 방부제 및 다양한 상용성 담체를 함유할 수 있다. 모든 전달 형태에 있어서, 상기 전달 비히클은 생리학적 염 용액 내에 제형화될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체의 비율 및 본래 모습은 적용할 경우 선택된 투여 경로, 적절한 생물학적 활성 단백질과의 상용성 및 표준 약학적 실무에 의해 결정된다.
상기 약학적 조성물은 대상에게 투여하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 의해 제조되어서, 유효량의 전달 비히클 및 임의의 추가 활성 물질 또는 물질들이 혼합물 내에서 약학적으로 허용가능한 비히클과 조합되도록 할 수 있다. 유효량의 전달 비히클이 상기 대상에게 투여된다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "유효량"이라는 용어는, 투여량(dosage) 및 원하는 결과를 얻기 위해 필요한 기간 동안에, 예를 들면 항암제를 대상 내의 표적 세포 또는 세포 군집에 전달하기에 효과적인 양을 의미하며, 항암제의 효과, 플라보노이드의 효과 및 항암제와 플라보노이드 모두의 상승 효과를 포함하는 인자들에 기초하는 세포에 대한 항암제의 원하는 양을 포함한다.
적합한 비히클은 예를 들면 레밍턴의 약학 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 1985)에 개시되어 있다. 이를 기초로, 상기 조성물은, 배타적인 것은 아니지만, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 희석제와 결합되고, 적합한 pH 및 생리액(physiological fluid)과 등장인(iso-osmotic) 완충 용액 내에 포함되는 전달 비히클 용액을 포함한다.
보통의 저장 및 사용 조건 하에, 이러한 약학적 조성물은 미생물의 성장을 방지하고 항암제의 임의의 생물학적 활성을 유지하기 위한 방부제를 함유할 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 적합한 제형을 제조하는 방법을 알 것이다. 적합한 제형을 선별 및 제조하기 위한 종래 절차 및 성분들은, 예를 들면 레밍턴의 약학 과학 및 미국 약전(The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19), 1999년 판)에 개시되어 있다. 다른 한편으로, 상기 전달 비히클은 사용하기에 충분히 가까운 시점에서 상기 성분들을 혼합함으로써 방부제 필요없이 제형화될 수 있다.
상기 전달 비히클은 공지된 방법을 이용하여 투여될 수 있으며, 이는 전달 비히클의 형태에 따라 다를 것이다. 비경구 경로가 바람직하다. 전달 비히클이 용액 또는 마이셀성 나노입자의 형태로 제형화된다면, 상기 전달 비히클은 정맥내, 근육내 또는 표적 조직 또는 기관 내에 직접 주사를 포함하는 비경구적으로 전달될 수 있다. 상기 전달 비히클이 히드로겔로 제형화된다면, 상기 접합체는 국소 적용되거나 상처 부위에 외과적으로 삽입될 수 있다.
대상에게 투여될 때, 상기 전달 비히클은 유효량 및 투여량으로 원하는 결과를 얻기에 충분한 기간 동안 투여된다. 예를 들면, 상기 전달 비히클은 질환 또는 질병의 완화, 향상, 경감, 개선, 안정화, 확산 방지, 진행을 늦추거나 지연시키거나 치료하거나, 질환과 관련된 효소의 활성을 억제, 감소 또는 손상시키는 기능을 할 수 있는 항암제를 전달하기에 필요한 양 및 투여량으로 투여될 수 있다. 질환과 관련된 효소는 대사 또는 생화학적 경로에 관여하는 효소로서, 상기 경로가 방해받거나 상기 효소 또는 경로의 조절성 제어가 방해받거나 억제되면, 상기 효소의 활성은 예를 들면 암과 같은 질환 또는 질병의 개시 또는 진행에 관여되게 된다.
대상에게 투여되는 전달 비히클의 유효량은 항암제, 폴리머 모이어티 및 카테킨계 플라보노이드 모이어티를 포함하는 전달 비히클의 약리학적 특성, 투여 방식, 대상의 연령, 건강 및 체중, 질병 또는 질환 상태의 성질 및 정도, 치료 빈도 및 병행 치료가 있다면 그 유형 및 전달 비히클의 농도 및 형태와 같은 많은 인자에 따라 변할 수 있다.
본 기술분야의 당업자는 상기 인자에 기초하여 적절한 양을 결정할 수 있다. 상기 전달 비히클은 초기에는 대상의 임상 반응에 따라 필요한 대로 조정될 수 있는 적합한 양으로 투여될 수 있다. 전달 비히클의 유효량은 경험적으로 결정될 수 있으며, 안전하게 투여될 수 있는 전달 비히클의 최대량에 의존한다. 그러나, 투여되는 전달 비히클의 양은 원하는 결과가 얻어지는 최소량이어야 한다.
또한, 항암제 및 플라보노이드를 함유하는 전술한 바와 같은 전달 비히클이 제공된다.
또한, 세포가 대상 내의 생체내 세포인 것을 포함하여 세포에 항암제를 전달하기 위한 전술한 전달 비히클의 용도, 또는 세포에 항암제를 전달하기 위한 약제를 제조하기 위한 전술한 전달 비히클의 용도가 제공된다.
도면에서는 실시예를 통해서만 본 발명의 구현예를 예시한다.
도 1은 HMEC에 대한 (□) EGCG, (▲) OEGCG 및 (○) PEG-EGCG의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 샘플의 경우 N=5, 대조군의 경우 N=8.
도 2는 혈청의 (○) 부재 및 (●) 존재시 마이셀성 복합체의 크기를 보여주는 그래프이다. N=3.
도 3은 프로티나제 K의 존재시 (□) 유리 FITC-BSA, (○) FITC-BSA 및 OEGCG 복합체, (△) PEG-EGCG 복합체 내의 (FITC-BSA + OEGCG); 및 (■) 프로티나제 K의 부재시 유리 FITC-BSA의 형광 강도를 보여주는 그래프이다. N=3.
도 4는 (□) PEG-EGCG, (■) OEGCG, (△) 헤르셉틴, (●) PEG-EGCG 복합체 내의 (헤르셉틴 + OEGCG), (▲) PEG-EGCG 복합체 내의 (BSA + OEGCG) 및 (○) 대조군(미처리 세포)의 존재시 SKBR-3 세포의 시험관내 세포 증식을 보여주는 그래프이다. 샘플의 경우 N=5, 대조군의 경우 N=8.
도 5는 현탁 희석시킨 PEG-EGCG 복합체 내의 (헤르셉틴 + OEGCG)의 크기를 보여주는 그래프이다. N=3.
도 6은 OEGCG, PEG-EGCG, 헤르셉틴, PEG-EGCG 복합체 내의 (헤르셉틴 + OEGCG) 및 PEG-EGCG 복합체 내의 (BSA + OEGCG)(막대는 각 군당 왼쪽에서 오른쪽 순서임)의 존재시 SKBR-3 세포의 시험관내 증식을 보여주는 그래프이다. 세포 증식 백분율은 각 시점에서 대조군을 이용하여 표준화되었다. 샘플의 경우 N=5, 대조군의 경우 N=8.
도 7은 (△) 마이셀성 복합체와 헤르셉틴, (□) 헤르셉틴 단독, 또는 (○) PBS 대조군으로 1달 동안 주당 2회 처리된 종양-함유 Balb/nude 마우스 내의 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
하기 비제한적인 실시예에 의해 본 발명을 추가로 설명한다.
실시예 1: 녹차 유도체로 이루어지는 단백질- 로딩된 마이셀성 복합체의 상승 치료 효과
재료 및 방법
OEGCG 및 PEG - EGCG 의 합성: EGCG (Kurita Ltd.) 및 아세트알데히드(pH 2)의 Baeyer 반응에 의해 OEGCG를 합성하였다. PEG-EGCG를 합성하기 위하여, 상기 알데히드-말단 PEG (Mw 5,000, NOF Co.) 및 EGCG를 pH=2에서 반응시켰다.
상기 마이셀성 복합체는 국제출원 공개공보 WO2006/124000 및 미국출원 공개공보 2008/102052에 이미 개시되어 있는 것과 같이 형성되었다.
세포독성 검사: EGCG 유도체의 세포독성을 인간의 정상 유방 상피세포(HMEC, Cambrex, USA)를 이용하여 조사하였고, 미변형(intact) EGCG의 경우와 비교하였다. 샘플 및 대조군에 있어서 세포를 각각 96-웰(well) 마이크로플레이트에서 5회 중복(quintuplicate) 및 8회 중복(octuplicate)으로 플레이팅하였고(유방 상피 성장 배지에서 웰 당 1×104 세포), 밤새 부착하도록 두었다. 상기 세포를 상이한 농도의 EGCG, OEGCG 또는 PEG-EGCG로 2일 동안 처리한 후, 세포의 시토크롬 c 활성에 의해 환원되는 염료인 알라마르 블루(Alamar Blue)를 이용하여 세포의 생존율을 추정하였다.
단백질분해 평가: 형광 분광광도계(Hitachi, Japan, λex = 490 ㎚ 및 λem = 530 ㎚)를 이용하여 샘플에 프로티나제 K (0.05 ㎎/㎖) 처리시 FITC-BSA에서의 형광 강도 증가를 관찰함으로써 단백질의 분해를 측정하였다. 모든 측정은 3회 중복(triplicate) 실시하였다.
암세포 증식 평가: 샘플 및 대조군에 있어서 SKBR-3 세포(ATCC, HTB3O, USA)를 각각 96-웰 마이크로플레이트에서 5회 중복 및 8회 중복으로 플레이팅하였고(McCoy의 5A 배지에서 웰 당 1×104 세포), 밤새 부착하도록 두었다. 이후, 상기 배양 배지를 샘플(OEGCG, PEG-EGCG, 헤르셉틴(0.5 ㎎/㎖), 헤르셉틴-로딩된 마이셀성 복합체 및 BSA-로딩된 마이셀성 복합체)을 함유하는 배지로 교체하였고, 상기 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 지시된 시점에서 상기 배양 배지를 10%의 알라마르 블루를 함유하는 페놀 레드가 없는 배지로 교체하였다. 4시간 배양 후 570 ㎚ 및 600 ㎚에서의 염료 흡광도 감소로부터 세포의 증식을 측정하였다.
결과
상기 마이셀성 복합체는 (ⅰ) 적용가능한 해당 단백질(형광 마커 단백질 또는 항암제)을 함께 포함하는 올리고머성 (-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트(OEGCG)의 조립 및 이후의 미리-형성된 OEGCG(플러스 단백질) 복합체와 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 EGCG의 접합체(PEG-EGCG)와의 조립을 포함하는 2 단계 자기조립 공정; 또는 (ⅱ) PEG 및 OEGCG의 접합체(PEG-OEGCG)(및 적용가능한 해당 단백질)의 조립을 포함하는 1 단계 자기조립 공정에 의해 합성되었다. 양쪽 경우 모두에 있어서, 상기 마이셀성 복합체는 온화한 수용액 내에서 자발적인 자기조립을 통해 해당 단백질과 함께 로딩된 것을 포함하여 즉시 안정하고 고배향된 마이셀성 복합체를 형성하였고, PEG 외부 껍질과 OEGCG(플러스 단백질) 복합체를 포함하는 내부 코어를 나타내었다.
상기 PEG-EGCG는 세포독성을 나타내지 않은 반면, OEGCG 및 EGCG는 HMEC에 대해 낮은 세포독성을 나타내었다(도 1 참조). 상기 마이셀성 복합체는 그 본래 모습을 유지하였으며, 크기 변화없이 혈청의 존재 하에 양호한 안정성을 나타내었다(도 2 참조).
상기 마이셀성 복합체를 형광-표지된 단백질(FITC-BSA)과 함께 로딩하였고, 프로테아제(프로티나제 K)를 처리하여 시간에 따른 단백질 분해를 조사하였다(도 3). 유리 FITC-BSA의 형광 강도는 시간에 따라 크게 증가하였는데, 이는 프로티나제 K에 의한 단백질 분해를 나타낸다. 대조적으로, 상기 마이셀성 복합체에 로딩된 FITC-BSA의 형광 강도는 매우 낮은 채로 유지되었는데(심지어 프로티나제 K 부재시의 FITC-BSA의 경우보다 낮음), 이는 본 시스템에서 상기 단백질이 단백질분해로부터 강력하게 보호된다는 것을 설명한다.
HER2-과발현 전이성 유방암 종양의 퇴행을 유도하는 HER2/neu (erbB2) 수용체에 대한 인간화 단일클론 항체인 헤르셉틴(트라스투주맙)과 함께 로딩된 상기 마이셀성 복합체에 대해 시험관내에서 암세포 성장 억제를 분석하였다(도 4). 상기 헤르셉틴-로딩된 마이셀성 복합체는 크기 감소를 나타내지 않았으며, 1,000배 희석까지 검사하였다(도 5). SKBR-3(HER2-과발현 인간 유방암 세포주)에 유리 헤르셉틴 또는 담체 성분(OEGCG 또는 PEG-EGCG) 중 하나를 처리하였을 때, 세포 성장이 억제되는 것이 관찰되었다. BSA와 함께 로딩된 상기 마이셀성 복합체는 OEGCG 또는 PEG-EGCG 단독보다 더 많은 억제 효과를 보여주었다(반면, BSA 자체는 효과가 없었음). 특히, 상기 헤르셉틴-로딩된 마이셀성 복합체는 전달된 개별 성분(OEGCG, PEG-EGCG 또는 헤르셉틴) 및 BSA-로딩된 마이셀성 복합체와 비교하여 인상깊게 큰 억제 효과를 보여주었다.
마이셀성 나노복합체의 형성은 주로 소수성 상호작용에 의해 추진되기 때문에, 상기 복합체는 계면활성제의 소수성 경쟁에 의해 분리될 수 있다. 상기 복합체가 세포와 함께 보유되는 동안, 상기 복합체는 세포막의 지질과 같은 생-양친매성 분자와의 상호작용에 의해 점차 분리되어 성분들을 방출할 수 있다. 상기 마이셀성 복합체는 치료 효과를 나타내기 전에 시간 차이(time lag)를 나타내었고(도 6), 즉 이른 시점(예를 들면, 10시간)에서는 효과를 나타내지 않은 반면, 유리 단백질 및 개별 담체 성분들은 즉시 항암 효과를 발휘하기 시작하였다. 이는 PEG 외부 껍질 내에 단백질과 함께 로딩된 마이셀성 복합체의 구조적인 이점을 설명한다. 지연된 방출 이외에도, 상기 마이셀성 복합체는 세포와의 상호작용 결과로 분리됨으로써 치료 분자(단백질 및 담체 성분)를 서서히 방출하게 된다. 이들 특성은 치료 활성을 나타내기 이전에 상기 담체가 투여된 곳으로부터 원하는 표적 부위로 이동할 필요가 있을 것이라는 사실의 견지에서 특히 유용하고 유익할 것이다.
논고
공간적으로 정렬된 구조로 단백질과 결합하도록 디자인된 2가지 EGCG 유도체를 이용하여 코어-껍질 마이셀성 나노복합체 담체를 합성하였다. 이들 복합체는 수용액 내에서 자발적인 자기조립을 통해 마이셀성 나노복합체를 형성하였다(도 1). 상기 마이셀성 나노복합체는 2가지 자기조립 공정에 의해 유도되었다: (ⅰ) 올리고머화 EGCG (OEGCG) 및 단백질 사이의 복합체화(complexation)를 통한 코어의 형성, 및 (ⅱ) 상기 미리-형성된 코어를 둘러싸는 폴리(에틸렌 글리콜)-EGCG (PEG-EGCG)의 복합체화를 통한 껍질의 형성. 그 결과물인 마이셀성 나노복합체는 PEG 껍질과 OEGCG-단백질 복합체 코어를 나타내었다. 이러한 구조적 특징은 단백질의 면역원성을 감소시키고, 신장에서 빠르게 제거되는 것과 세망내피계 흡수를 통한 단백질의 단백질분해를 방지하는 역할을 해서, 빈번한 주사 또는 주입 치료의 필요성을 줄여준다. 상기 고수용성 PEG 껍질 및 맞춤형 크기(< 100 ㎚)는 길어진 혈장 반감기뿐만 아니라 향상된 투과-보유 효과를 제공하여서, 종양 및 감염 및 염증 부위에서 선별적으로 축적되게 된다.
단백질에 대한 EGCG의 친화성을 이용하여 항암 단백질과 함께 상기 마이셀성 복합체를 로딩하였다. 상기 단백질-로딩된 복합체는 유리 단백질 또는 담체 자체보다 훨씬 큰 항암 효과를 나타내었다. 상기 마이셀성 시스템은 다용도 플라보노이드-유도체화된 담체와 연관된 상승 치료 효과 및 전달 효과의 이점을 이용하여 다양한 생물학적 분자의 개선된 전달을 제공할 수 있다.
실시예 2: 헤르셉틴을 함유하는 마이셀성 복합체를 이용한 Balb / nude 마우스의 치료
다음과 같이 하여 Balb/nude 마우스에 종양을 유도하였다. 17β-에스트라디올 펠렛(0.72 ㎎, 60일 방출)을 각각의 마우스에 피하 주사로 투여하였다. 다음날, BT474 세포(8.1×106 세포/100 ㎕ 마트리겔)의 현탁액을 각각의 마우스에 피하 주사하였다. 2주 동안 종양이 발생하도록 하였다.
BT474 세포 주사 2주 후, 상기 마우스를 헤르셉틴과 함께 로딩된 마이셀성 나노입자, 헤르세틴 단독 또는 대조군인 PBS 중 하나로 1개월 동안 주 2회씩 정맥 주사로 치료하였다. 상기 치료 요법 후 종양의 크기를 평가하였다. 그 결과는 도 7에 나타나 있다.
본 기술분야의 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 상기 예시적인 구현예에 많은 변형이 가능하다. 본 발명은 특허청구범위에 의해 정의된 것과 같이, 그 범위 내에 이러한 변형 모두를 포괄하려는 의도이다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 참고문헌으로 모두 포함된다.
본 발명의 다양한 구현예가 본 명세서에 개시되어 있지만, 본 기술분야의 당업자의 통상의 일반적인 지식에 따라 본 발명의 범위 내에서 많은 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 실질적으로 동일한 방식으로 동일한 결과를 달성하기 위하여 본 발명의 임의의 측면에 대해 공지된 등가물로 치환하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 달리 정의하지 않는 한 본 발명의 기술분야의 당업자 중 하나에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
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Claims (31)

  1. 유리 알데히드 및 플라보노이드를 함유하는 전달제의 접합체 및 항암제를 포함하며, 상기 전달제는 상기 플라보노이드의 A 고리의 C6 및/또는 C8 위치에 접합되는 전달 비히클.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 전달제는 폴리머이고, 상기 플라보노이드는 카테킨계 플라보노이드인 전달 비히클.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 플라보노이드는 (-)-에피카테킨, (-)-에피갈로카테킨, (+)-카테킨, (-)-에피카테킨 갈레이트 또는 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트인 카테킨계 플라보노이드인 전달 비히클.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라보노이드는 모노머성이거나, 상기 플라보노이드는 올리고머성인 전달 비히클.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 플라보노이드는 올리고머성이고, (ⅰ) 효소-촉매성 산화적 커플링; (ⅱ) 알데히드-매개성 올리고머화; 또는 (ⅲ) 제1 모노머 유닛의 A 고리 상의 C6 또는 C8 위치와 제2 모노머 유닛의 A 고리 상의 C6 또는 C8 위치 사이의 탄소-탄소 결합을 통해 올리고머화되는 전달 비히클.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 플라보노이드는 제1 모노머 유닛의 A 고리 상의 C6 위치와 제2 모노머 유닛의 A 고리 상의 C8 위치 사이의 탄소-탄소 결합을 통해 올리고머화되거나, 또는 상기 플라보노이드는 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 모노머의 탄소-탄소 C6-C6, C6-C8, C8-C6 또는 C8-C8 결합을 통해 올리고머화된 올리고머성 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(OEGCG)인 전달 비히클.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 폴리머는 알데히드-말단 폴리(에틸렌 글리콜), 알데히드-유도체화된 히알루론산, 히알루론산 아미노아세틸알데히드 디에틸아세탈 접합체, 알데히드-유도체화된 히알루론산-티라민, 히알루론산 아미노아세틸알데히드 디에틸아세탈 접합체-티라민, 시클로트리포스파젠 코어 페녹시메틸(메틸히드라조노) 덴드리머 또는 티오포스포릴 코어 페녹시메틸(메틸히드라조노) 덴드리머인 전달 비히클.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 폴리머는 알데히드-말단 폴리(에틸렌 글리콜)이고, 상기 전달 비히클은 마이셀성 나노복합체인 전달 비히클.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 마이셀성 나노복합체는 올리고머성 카테킨계 플라보노이드에 접합된 알데히드-말단 폴리(에틸린 글리콜)을 포함하는 전달 비히클.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 마이셀성 나노복합체는 올리고머성 카테킨계 플라보노이드를 함유하는 내부 코어 및 상기 접합체를 함유하는 외부 껍질을 포함하고, 상기 접합체는 모노머성 카테킨계 플라보노이드에 접합된 알데히드-말단 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 전달 비히클.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드는
    (ⅰ) 효소-촉매성 산화적 커플링; (ⅱ) 알데히드-매개성 올리고머화; 또는 (ⅲ) 제1 모노머 유닛의 A 고리 상의 C6 또는 C8 위치와 제2 모노머 유닛의 A 고리 상의 C6 또는 C8 위치 사이의 탄소-탄소 결합을 통해 올리고머화되는 전달 비히클.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드는 제1 모노머 유닛의 A 고리 상의 C6 위치와 제2 모노머 유닛의 A 고리 상의 C8 위치 사이의 탄소-탄소 결합을 통해 올리고머화되거나, 또는 상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드는 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 모노머의 탄소-탄소 C6-C6, C6-C8, C8-C6 또는 C8-C8 결합을 통해 올리고머화된 올리고머성 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(OEGCG)인 전달 비히클.
  13. 청구항 10에 있어서,
    상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드가 상기 마이셀성 나노복합체 내에 조립될 때 상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드의 생물학적 활성이 차단되고, 상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드가 상기 마이셀성 나노복합체로부터 방출될 때 상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드의 생물학적 활성이 드러나는(unmasked) 전달 비히클.
  14. 청구항 7에 있어서,
    상기 폴리머는 알데히드-유도체화된 히알루론산, 히알루론산 아미노아세틸알데히드 디에틸아세탈 접합체, 알데히드-유도체화된 히알루론산-티라민, 히알루론산 아미노아세틸알데히드 디에틸아세탈 접합체-티라민 또는 이들의 조합이고, 상기 전달 비히클은 히드로겔인 전달 비히클.
  15. 청구항 14에 있어서,
    가교제와 함께 가교되지 않은 폴리머-플라보노이드 접합체를 주사함으로써 생체내에서 형성되는 전달 비히클.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라보노이드는 증대된 생물학적 플라보노이드 특성을 갖는 전달 비히클.
  17. 청구항 10에 있어서,
    상기 올리고머성 카테킨계 플라보노이드는 증대된 생물학적 플라보노이드 특성을 갖는 전달 비히클.
  18. 청구항 10에 있어서,
    상기 항암제가 상기 마이셀성 나노복합체 내에서 조립될 때 상기 항암제의 생물학적 활성이 차단되고, 상기 생활성제가 상기 마이셀성 나노복합체로부터 방출될 때 상기 생활성제의 생물학적 활성이 드러나는 전달 비히클.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항암제는 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자, 약물, 항체, 호르몬, 효소, 성장 인자, 사이토카인, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, siRNA, 항생제, 화학요법제, 혈관형성 억제제, 종양 세포-표면의 마커에 대한 항체, 면역조절성 펩티드, 사이토카인 또는 성장 인자인 전달 비히클.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 항암제는 종양 세포-표면 마커에 대한 항체인 전달 비히클.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 항체는 트라스투주맙인 전달 비히클.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항의 전달 비히클과 세포를 접촉하는 단계를 포함하는 세포에 항암제를 전달하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 세포는 시험관내 세포인 방법.
  24. 청구항 22에 있어서,
    상기 세포는 생체내 세포이고, 상기 방법은 항암 치료를 필요로 하는 대상에게 상기 전달 비히클을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 대상은 인간인 방법.
  26. 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
    투여는 주사, 외과적 삽입 또는 국소 적용을 포함하는 방법.
  27. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  29. 대상에서 세포에 항암제를 전달하기 위한 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 전달 비히클의 용도.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 대상은 인간인 용도.
  31. 청구항 29 또는 청구항 30에 있어서,
    상기 전달 비히클은 주사, 외과적 삽입 또는 국소 투여용으로 제형화되는 용도.
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