KR20150028566A

KR20150028566A - 리그닌 분해효소의 고정화 방법 및 상기 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용한 염료 탈색방법

Info

Publication number: KR20150028566A
Application number: KR20130107360A
Authority: KR
Inventors: 유선화; 김명길; 최형태; 이성숙
Original assignee: 대한민국(산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2015-03-16

Abstract

본 발명은 리그닌 분해효소의 고정화 방법 및 상기 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용한 염료 탈색방법에 관한 것이다.
본 발명은 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서, 담체에 리그닌 분해효소 배양액을 첨가시키는 단계를 포함하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서, 담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액을 첨가하여 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 제공한다.
한편 본 발명은 염료 탈색 방법에 있어서, 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용하여 염료를 탈색시킬 수 있는 염료 탈색 방법을 제공한다.

Description

리그닌 분해효소의 고정화 방법 및 상기 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용한 염료 탈색방법{Method of immobilizing lignin degrading enzymes and method of decolorizing a dye using the immobilized enzymes}

본 발명은 리그닌 분해효소의 고정화 방법 및 상기 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용한 염료 탈색방법에 관한 것이다.

리그닌(lignin)은 자연계에서 분해가 매우 느리게 진행되는 가장 많은 페놀계 화합물이다. 리그닌을 분해하는 백색부후균류는 분해에 필요한 효소를 가지고 있는데, laccase, lignin peroxidase 및 manganese peroxidase 등이 보고되었다. 이 효소들은 기질특이성이 강하지 않기 때문에 폭약류(Cheong et al., 2006), 내분비계 장애물질 (Kim et al., 2008; Yeo et al., 2008)과 다양한 난분해성 물질(Baldrin, 2006)을 분해한다고 보고되었다.

경기도 광릉의 숲에서 분리한 아교버섯은 다양한 내분비계 장애물질을 더한 감자 덱스트로오스(potato dextrose) 한천배지에서 잘 생장하였기 때문에 이 균이 가지고 있는 리그닌 분해효소들에 대하여 연구를 수행하였다. 이 균의 laccase 유전자를 분리하고 phthalate 류에 의한 발현 상승을 보고하였고(Yeo et al., 2008), 정제한 laccase에 의한 4가지 내분비계 장애물질의 분해를 보고하였다(Kim et al., 2008).

또한 아교버섯 laccase 유전자를 도입한 형질전환체와 구름버섯의 manganese peroxidase 유전자를 도입한 형질전환체를 대상으로 methyl green과 remazol brilliant blue R (RBBR)의 탈색효과를 보고하였다 (금 등, 2010). 효소를 이용한 물질의 합성 및 분해반응에서 효소의 손실을 줄이기 위하여 고정화 효소를 제조하고 사용하는 것은 오래 전부터 시도되었다. 담체를 사용한 효소의 고정화는 열 안정성과 다양한 염류에 대한 안정성 등을 증대시키는 효과가 있으므로 적절한 고정화 효소의 제조가 효소를 이용한 물질의 분해에도 시도되고 있다 (Mogharabi et al., 2012; Songulashvili et al., 2012).

난분해성 물질을 분해하는 반응에 균주를 사용할 경우 분해반응 종료 후 투입한 균주의 처리문제가 남는다. 그러나 균주 대신 효소를 사용하면 최종 분해 산물을 처리하는데 더 효과적이므로 저자들은 고정화 효소를 사용하기 위하여 알긴산에 첨가물을 더한 담체를 사용하여 고정화 효소의 안정성을 증대시키고자 시도하였다. 또한 알긴산 담체를 만든 후에 효소를 고정화하는 기존의 방법 외에 알긴산을 직접 효소용액에 녹여 효소활성이 증가된 담체의 사용가능성을 제시하였다.

본 발명의 목적은 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기에서 언급한 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용한 염료 탈색방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서, 담체에 리그닌 분해효소 배양액을 첨가시키는 단계를 포함하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서, 담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액을 첨가하여 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 제공한다.

한편 본 발명은 염료 탈색 방법에 있어서, 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용하여 염료를 탈색시킬 수 있는 염료 탈색 방법을 제공한다.

본 발명은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용하여 염료를 탈색시 고정화된 리그닌 분해효소를 염료와 48시간 반응 후 75％ 이상의 탈색을 보여 탈색능이 우수하였으며, 또한 리그닌 분해효소가 담체에 고정화되어 있어 반복 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소들에 대한 RBBR(Remazol Brilliant Bleu R) 염료의 탈색능을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소들에 대하여 고정화 효소들의 재사용에 의한 RBBR 염료의 탈색능을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 4℃ 온도의 냉장고에 1∼3주(week) 동안 냉장보관시 냉장보관에 기간에 따른 고정화 효소에 대한 RBBR 염료의 탈색능을 나타낸 것이다(대조군[control]은 냉장고에 보관하지 않은 실시예 2에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소에 대한 RBBR 염료의 탈색능을 나타낸 것이다).
도 4는 대조구(control), 실시예 1에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소(Method A), 실시예 2에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소(Method B), 실시예 4에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소(Method C)들의 재사용에 의한 RBBR 염료의 탈색능을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소에 대한 RBBR 염료를 대상으로 탈색 효과를 반응 시간에 따라 측정하고 이를 도 5에 나타내었다.
도 6은 실시예 5 내지 실시예 7에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소에 대한 RBBR 염료를 대상으로 탈색 효과를 반응 시간에 따라 측정하고 이를 도 5에 나타내었다.

본 발명은 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 나타낸다.

본 발명은 리그닌 분해효소가 담체에 고정화된 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 나타낸다.

본 발명은 제1발명의 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서, 담체에 리그닌 분해효소 배양액을 첨가시키는 단계를 포함하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 나타낸다.

상기에서 담체는 증류수에 소디움 알지네이트(sidium alginate)를 용해시킨 용해액을 염화칼슘(CaCl₂)에 떨어뜨려서 제조한 것일 수 있다.

상기에서 담체는 증류수 97∼99중량％에 소디움 알지네이트 1∼3중량％를 용해시킨 용해액을 0.1∼0.5M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨려서 제조한 것일 수 있다.

상기에서 담체는 증류수 98.5중량％에 소디움 알지네이트1.5중량％를 용해시킨 용해액을 0.4M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨려서 제조한 것일 수 있다.

상기에서 담체는 증류수에 소디움 알지네이트를 용해시킨 용해액을 염화칼슘에 떨어뜨린 후 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 첨가하여 제조한 것일 수 있다.

상기에서 담체는 증류수 97∼99중량％에 소디움 알지네이트 1∼3중량％를 용해시킨 용해액을 0.1∼0.5M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨린 후 상기 용해액 중량 대비 5∼15중량％의 글루타알데히드를 첨가하여 제조한 것일 수 있다.

상기에서 담체는 증류수 98.5중량％에 소디움 알지네이트 1.5중량％를 용해시킨 용해액을 0.4M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨린 후 상기 용해액 중량 대비 10중량％의 글루타알데히드를 첨가하여 제조한 것일 수 있다.

본 발명은 제2발명의 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서, 담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액을 첨가하여 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법을 나타낸다.

상기에서 담체 제조시 소디움 알지네이트(sidium alginate)를 리그닌 분해효소 배양액에 용해시켜 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 염화칼슘(CaCl₂)에 떨어뜨림으로써 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시킬 수 있다.

상기에서 담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액 97∼99중량％에 소디움 알지네이트 1∼3중량％를 용해시킨 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 0.1∼0.5M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨림으로써 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시킬 수 있다.

상기에서 담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액 98.5중량％에 소디움 알지네이트 1.5중량％를 용해시킨 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 0.4M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨림으로써 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시킬 수 있다.

상기에서 담체 제조시 소디움 알지네이트를 리그닌 분해효소 배양액에 용해시켜 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 염화칼슘에 떨어뜨린 후 글루타알데히드를 첨가하여 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시킬 수 있다.

상기에서 담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액 97∼99중량％에 소디움 알지네이트 1∼3중량％를 용해시킨 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 0.1∼0.5M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨린 다음 상기 리그닌 분해효소 배양액 및 소디움 알지네이트를 포함하는 용해액 중량 대비 5∼15중량％의 글루타알데히드를 첨가함으로써 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시킬 수 있다.

상기에서 담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액 98.5중량％에 소디움 알지네이트 1.5중량％를 용해시킨 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 0.4M 농도의 염화칼슘에 떨어뜨린 다음 상기 리그닌 분해효소 배양액 및 소디움 알지네이트를 포함하는 용해액 중량 대비 10중량％의 글루타알데히드를 첨가함으로써 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시킬 수 있다.

상기의 제1발명 및/또는 제2발명에서의 리그닌 분해효소 배양액은 아교버섯 라카아제(laccase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(TF2-1), 구름버섯 망가네즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(T5), 아교버섯 균주 중에서 선택된 어느 하나를 PDA 배지에서 생장시켜 균체를 얻는 단계; 상기의 균체를 절단하고 PDB 배지에 접종한 후 배양하여 배양물을 단계; 상기의 배양물을 갈아 PDB 배지에 접종하고 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계; 및 상기의 여과액을 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 것을 사용할 수 있다.

상기의 제1발명 및/또는 제2발명에서의 리그닌 분해효소 배양액은 아교버섯 라카아제(laccase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(TF2-1)를 PDA 배지에서 30∼37℃의 온도로 1∼3일 동안 생장시켜 균체를 얻는 단계; 상기의 균체를 1∼3cm× 1∼3cm(가로× 세로) 크기로 절단하고 절단한 균체 10∼15개를 PDB 배지에 접종한 후 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼3일 동안 배양하여 배양물을 단계; 상기의 배양물을 갈아 PDB 배지에 접종하고 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼5일 동안 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계; 상기의 여과액을 5000∼7000rpm으로 10∼20분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 상등액을 사용할 수 있다.

상기의 제1발명 및/또는 제2발명에서의 리그닌 분해효소 배양액은 구름버섯 망가네즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(T5)를 PDA 배지에서 30∼37℃의 온도로 1∼3일 동안 생장시켜 균체를 얻는 단계; 상기의 균체를 1∼3cm× 1∼3cm(가로× 세로) 크기로 절단하고 절단한 균체 10∼15개를 PDB 배지에 접종한 후 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼3일 동안 배양하여 배양물을 단계; 상기의 배양물을 갈아 PDB 배지에 접종하고 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼5일 동안 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계; 상기의 여과액을 5000∼7000rpm으로 10∼20분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 상등액을 사용할 수 있다.

상기의 제1발명 및/또는 제2발명에서의 리그닌 분해효소 배양액은 아교버섯 균주 중에서 선택된 어느 하나를 PDA 배지에서 30∼37℃의 온도로 1∼3일 동안 생장시켜 균체를 얻는 단계; 상기의 균체를 1∼3cm× 1∼3cm(가로× 세로) 크기로 절단하고 절단한 균체 10∼15개를 PDB 배지에 접종한 후 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼3일 동안 배양하여 배양물을 단계; 상기의 배양물을 갈아 PDB 배지에 접종하고 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼5일 동안 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계; 상기의 여과액을 5000∼7000rpm으로 10∼20분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 상등액을 사용할 수 있다.

본 발명은 제3의 발명으로써 염료 탈색 방법에 있어서, 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용하여 염료를 탈색시키는 염료 탈색 방법을 포함한다.

상기에서 염료는 Remazol Brilliant Blue R(RBBR), Poly R-478, 메틸 그린(Methyl Green) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue) 중에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.

상기에서 염료는 Remazol Brilliant Blue R(RBBR)일 수 있다.

본 발명의 리그닌 분해효소의 고정화 방법 및 상기 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용한 염료 탈색방법에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 리그닌 분해효소의 고정화 방법 및 상기 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용한 염료 탈색방법을 제공하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 고정화 효소 1 제조

증류수 98.5중량％에 소디움 알지네이트(sodium alginate)(입수처:Extra Pure, Code # 13035-1201, M.W. 220,000 Da; Junsei, Japan)를 1.5중량％를 첨가하고 100rpm으로 30분 동안 혼합하여 소디움 알지네이트를 포함하는 수용액을 얻고 이를 0.4M 농도의 염화칼슘(CaCl₂) 용액에 떨어뜨려 담체를 제조하였다.

상기의 담체에 담체 중량과 동일한 함량의 리그닌 분해효소 배양액을 첨가하고 50rpm으로 1시간 혼합하여 상기 담체에 리그린 분해효소를 고정화시켰다.

상기에서 리그닌 분해효소 배양액은 아교버섯 라카아제(laccase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(TF2-1)를 PDA 배지에서 30℃의 온도로 3일 동안 생장시켜 균체를 얻는 단계; 상기의 균체를 3cm× 3cm(가로× 세로) 크기로 절단하고 절단한 균체 15개를 PDB 배지 100ml에 접종한 후 30℃에서 150rpm으로 3일 동안 진탕배양기에서 배양하여 배양물을 단계; 상기의 배양물을 웨어링 블레더(waring blender)에서 갈아 PDB 배지에 접종하고 30℃에서 150rpm으로 5일 동안 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계; 상기의 여과액을 6000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 상등액을 사용하였다.

<실시예 2> 고정화 효소 2 제조

리그닌 분해효소 배양액 98.5중량％에 소디움 알지네이트(sodium alginate)(입수처:Extra Pure, Code # 13035-1201, M.W. 220,000 Da; Junsei, Japan)를 1.5중량％를 첨가하고 100rpm으로 30분 동안 혼합하여 리그닌 분해효소 배양액 및 소디움 알지네이트를 포함하는 용액을 얻고 이를 0.4M 농도의 염화칼슘(CaCl₂) 용액에 떨어뜨려 담체를 제조함과 동시에 리그린 분해효소를 고정화시켰다.

<실시예 3> 고정화 효소 3 제조

리그닌 분해효소 배양액 98.5중량％에 소디움 알지네이트(sodium alginate)(입수처:(Extra Pure, Code # 13035-1201, M.W. 220,000 Da; Junsei, Japan)를 1.5중량％를 첨가 후 상기 리그닌 분해효소 배양액 및 소디움 알지네이트를 포함하는 용액 중량 대비 10중량％의 글루타알데히드를 첨가한 다음 100rpm으로 30분 동안 혼합하여 용액을 얻고 이 용액을 0.4M 농도의 염화칼슘(CaCl₂) 용액에 떨어뜨려 담체를 제조함과 동시에 리그린 분해효소를 고정화시켰다.

<실시예 4>

증류수 87.3중량％에 소디움 알지네이트(sodium alginate)(입수처:(Extra Pure, Code # 13035-1201, M.W. 220,000 Da; Junsei, Japan)를 1.5중량％, 젤라틴(gelatin) 10중량％ 및 아가로스(agarose) 1.2중량％를 첨가하고 100rpm으로 30분 동안 혼합하여 소디움 알지네이트를 포함하는 수용액을 얻고 이를 0.4M 농도의 염화칼슘(CaCl₂) 용액에 떨어뜨려 담체를 제조하였다.

<실시예 5>

증류수 98.5중량％에 소디움 알지네이트(sodium alginate)(입수처:(Extra Pure, Code # 13035-1201, M.W. 220,000 Da; Junsei, Japan)를 1.5중량％를 첨가하고 100rpm으로 30분 동안 혼합하여 소디움 알지네이트를 포함하는 수용액을 얻고 이를 0.4M 농도의 염화칼슘(CaCl₂) 용액에 떨어뜨려 담체를 제조하였다.

상기에서 리그닌 분해효소 배양액은 구름버섯 망가네즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(T5)를 PDA 배지에서 30℃의 온도로 3일 동안 생장시켜 균체를 얻는 단계; 상기의 균체를 3cm× 3cm(가로× 세로) 크기로 절단하고 절단한 균체 15개를 PDB 배지 100ml에 접종한 후 30℃에서 150rpm으로 3일 동안 진탕배양기에서 배양하여 배양물을 단계; 상기의 배양물을 웨어링 블레더(waring blender)에서 갈아 PDB 배지에 접종하고 30℃에서 150rpm으로 5일 동안 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계; 상기의 여과액을 6000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 상등액을 사용하였다.

<실시예 6>

리그닌 분해효소 배양액 98.5중량％에 소디움 알지네이트(sodium alginate)(입수처:(Extra Pure, Code # 13035-1201, M.W. 220,000 Da; Junsei, Japan)를 1.5중량％를 첨가하고 100rpm으로 30분 동안 혼합하여 리그닌 분해효소 배양액 및 소디움 알지네이트를 포함하는 용액을 얻고 이를 0.4M 농도의 염화칼슘(CaCl₂) 용액에 떨어뜨려 담체를 제조함과 동시에 리그린 분해효소를 고정화시켰다.

<실시예 7>

<실시예 8>

상기에서 리그닌 분해효소 배양액은 아교버섯 균주를 PDA 배지에서 30℃의 온도로 3일 동안 생장시켜 균체를 얻는 단계; 상기의 균체를 3cm× 3cm(가로× 세로) 크기로 절단하고 절단한 균체 15개를 PDB 배지 100ml에 접종한 후 30℃에서 150rpm으로 3일 동안 진탕배양기에서 배양하여 배양물을 단계; 상기의 배양물을 웨어링 블레더(waring blender)에서 갈아 PDB 배지에 접종하고 30℃에서 150rpm으로 5일 동안 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계; 상기의 여과액을 6000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 상등액을 사용하였다.

<실시예 9>

<실시예 10>

<시험예 1>

상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소들에 대하여 염료인 Remazol Brilliant Bleu R(RBBR)을 대상으로 탈색 능을 측정하고 이를 도 1에 나타내었다.

RBBR(300μM) 2㎖을 4g의 고정화 효소와 섞은 후 상온(25℃)에서 24시간 동안 RBBR 탈색실험을 진행한 다음 분광기를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 1에서와 같이 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 리그린 분해효소 중에서 RBBR 탈색능은 담체를 제조함과 동시에 리그린 분해효소를 고정화시킨 실시예 2의 고정화 효소가 가장 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 2>

상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소들에 대하여 고정화 효소들의 재사용에 의한 염료인 RBBR을 대상으로 탈색능을 측정하고 이를 도 2에 나타내었다.

RBBR(300μM) 2㎖을 4g의 고정화 효소와 섞은 후 상온(25℃)에서 12시간 동안 RBBR 탈색실험을 진행한 다음 분광기를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였고, 재사용 실험을 위해서 탈색 반응을 진행한 후 고정화 효소를 분리하고 증류수로 세척한 후 1회 사용했던 고정화 효소가 포함된 담체를 대상으로 다시 RBBR의 탈색능을 확인하였다. 이러한 과정을 3회 반복하였다.

도 2에서와 같이 glutaraldehyde를 첨가하지 않은 실시예 1의 고정화 효소 1 및 실시예 2의 고정화 효소 2는 염료 탈색 후 회수하여 재사용한 결과 3회 이상 사용시 활성 50％ 감소되나, glutaraldehyde를 첨가한 실시예 3의 고정화 효소 3은 초기 활성은 높지 않으나 염료 탈색에 대한 효소의 활성이 꾸준히 유지되어 glutaraldehyde 첨가가 고정화 효소의 안정화에는 효과가 있음을 알 수 있었다.

<시험예 3>

실시예 2에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 4℃ 온도의 냉장고에 1∼3주(week) 동안 냉장보관시 냉장보관에 기간에 따른 고정화 효소에 대한 염료인 RBBR의 탈색능을 나타내고 이를 도 3에 나타내었다(대조군[control]은 냉장고에 보관하지 않은 실시예 2에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소에 대한 RBBR의 탈색능을 나타낸 것이다).

도 3에서와 같이 본 발명의 리그닌 분해효소의 고정화 방법에 의해 얻은 고정화 효소는 냉장 보관시 염료에 대한 탈색능이 크게 감소하지 않아, 고정화 효소를 냉장고에서 냉장보관시 언제든지 사용할 수 있음을 나타내고 있어 본 발명의 리그닌 효소의 고정화 방법에 의해 얻은 리그닌 효소 고정화는 고정화 효소에 대한 재사용 효과가 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 4>

상기 실시예 1에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소(Method A), 실시예 2에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소(Method B), 실시예 4에서 제조한 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소(Method C) 및 대조구(control)에 대하여 염료인 RBBR을 대상으로 탈색능을 측정하고 이를 도 4에 나타내었다.

상기에서 대조구(control)는 RBBR을 포함하지 않은 반응액을 의미한다

RBBR(300μM) 2㎖을 4g의 각각의 고정화 효소와 섞은 후 상온(25℃)에서 12시간 동안 RBBR 탈색실험을 진행한 다음 분광기를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였고, 재사용 실험을 위해서 탈색 반응을 진행한 후 고정화 효소를 분리하고 증류수로 세척한 후 1회 사용했던 고정화 효소가 포함된 담체를 대상으로 다시 RBBR의 탈색능을 확인하였다. 이러한 과정을 3회 반복하였다.

도 4에서와 젤라틴 및 아가로스를 첨가하지 않은 실시예 1의 고정화 효소 1 및 실시예 2의 고정화 효소 2는 염료 탈색 후 회수하여 재사용한 결과 2회 이상 재사용에 대한 RBBR의 탈색능이 우수하다. 즉, 염료 탈색에 대한 효소의 활성이 꾸준히 유지되어 고정화 효소의 활성 유지와 안정화시 젤라틴 및/또는 아가로스의 첨가가 효과적임을 알 수 있었다.

<시험예 5>

상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소에 대한 RBBR 염료를 대상으로 탈색 효과를 반응 시간에 따라 측정하고 이를 도 5에 나타내었다.

RBBR(300 μM) 2㎖을 4g의 고정화 효소와 섞은 후 상온(25℃)에 일정 기간 (12시간, 24시간, 48시간) 두고 탈색실험을 진행하여 분광기를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하여 RBBR의 잔류 농도를 측정하고 이를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 RBBR은 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 첨가하지 않은 것을 나타내고, 1-12는 실시예 1의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 1-24는 실시예 1의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 24시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 1-48은 실시예 1의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 48시간 동안 탈색실험을 한 것이다.

도 5에서 2-12는 실시예 2의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 2-24는 실시예 2의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 24시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 2-48는 실시예 2의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 48시간 동안 탈색실험을 한 것이다.

도 5에서 3-12는 실시예 3의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 3-24는 실시예 3의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 24시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 3-48는 실시예 3의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 48시간 동안 탈색실험을 한 것이다.

도 5의 결과에서처럼 RBBR 염료의 탈색은 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 이내에 실시하는 것이 보다 효과적으로 RBBR 염료를 탈색시킬 수 있음을 알 수 있었다.

<시험예 6>

상기 실시예 5 내지 실시예 7에서 제조한 각각의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소에 대한 RBBR 염료을 대상으로 탈색 효과를 반응 시간에 따라 측정하고 이를 도 6에 나타내었다.

RBBR(300 μM) 2㎖을 4g의 고정화 효소와 섞은 후 상온(25℃)에 일정 기간 (12시간, 24시간, 48시간) 두고 탈색실험을 진행하여 분광기를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하여 RBBR의 잔류 농도를 측정하고 이를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 RBBR은 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 첨가하지 않은 것을 나타내고, 1-12는 실시예 5의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 1-24는 실시예 5의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 24시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 1-48는 실시예 5의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 48시간 동안 탈색실험을 한 것이다.

도 6에서 2-12는 실시예 6의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 2-24는 실시예 6의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 24시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 2-48는 실시예 6의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 48시간 동안 탈색실험을 한 것이다.

도 6에서 3-12는 실시예 7의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 3-24는 실시예 7의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 24시간 동안 탈색실험을 한 것이고, 3-48는 실시예 7의 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 48시간 동안 탈색실험을 한 것이다.

도 6의 결과에서처럼 RBBR 염료의 탈색은 리그린 분해효소를 고정화시킨 고정화 효소를 RBBR과 섞은 후 12시간 이내에 실시하는 것이 보다 효과적으로 RBBR 염료를 탈색시킬 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용하여 염료를 탈색시 고정화된 리그닌 분해효소를 염료와 48시간 반응 후, 75% 이상의 탈색을 보여 탈색능이 우수하였으며, 또한 리그닌 분해효소가 담체에 고정화되어 있어 반복 사용할 수 있는 효과가 있어 리그닌 분해효소를 적용할 수 있는 산업에 대하여 산업상 이용가능성이 있다.

Claims

리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서,
담체에 리그닌 분해효소 배양액을 첨가시키는 단계를 포함하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
제1항에 있어서,
담체는 증류수에 소디움 알지네이트(sidium alginate)를 용해시킨 용해액을 염화칼슘(CaCl₂)에 떨어뜨려서 제조한 것 임을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
제1항에 있어서,
담체는 증류수에 소디움 알지네이트를 용해시킨 용해액을 염화칼슘에 떨어뜨린 후 글루타알데히드(glutaraldehyde) 첨가하여 제조한 것 임을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
리그닌 분해효소의 고정화 방법에 있어서,
담체 제조시 리그닌 분해효소 배양액을 첨가하여 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
제4항에 있어서,
담체 제조시 소디움 알지네이트(sidium alginate)를 리그닌 분해효소 배양액에 용해시켜 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 염화칼슘(CaCl₂)에 떨어뜨림으로써 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
제4항에 있어서,
담체 제조시 소디움 알지네이트(sidium alginate)를 리그닌 분해효소 배양액에 용해시켜 용해액을 얻은 후 상기 용해액을 염화칼슘(CaCl₂)에 떨어뜨린 후 글루타알데히드를 첨가하여 담체를 제조함과 동시에 리그닌 분해효소를 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
리그닌 분해효소 배양액은 아교버섯 라카아제(laccase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(TF2-1), 구름버섯 망가네즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(T5), 아교버섯 균주 중에서 선택된 어느 하나를 PDA 배지에서 생장시켜 균체를 얻는 단계;
상기의 균체를 절단하고 PDB 배지에 접종한 후 배양하여 배양물을 단계;
상기의 배양물을 갈아 PDB 배지에 접종하고 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계;
상기의 여과액을 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 것 임을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
리그닌 분해효소 배양액은 아교버섯 라카아제(laccase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(TF2-1), 구름버섯 망가네즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자를 포함하는 아교버섯 형질전환체(T5), 아교버섯 균주 중에서 선택된 어느 하나를 PDA 배지에서 30∼37℃의 온도로 1∼3일 동안 생장시켜 균체를 얻는 단계;
상기의 균체를 1∼3cm× 1∼3cm(가로× 세로) 크기로 절단하고 절단한 균체 10∼15개를 PDB 배지에 접종한 후 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼3일 동안 배양하여 배양물을 단계;
상기의 배양물을 갈아 PDB 배지에 접종하고 30∼37℃에서 100∼200rpm으로 1∼5일 동안 배양한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계;
상기의 여과액을 5000∼7000rpm으로 10∼20분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하여 얻은 상등액 임을 특징으로 하는 리그닌 분해효소의 고정화 방법.
염료 탈색 방법에 있어서,
청구항 제1항 또는 제4항의 방법에 의해 얻은 고정화된 리그닌 분해효소를 이용하여 염료를 탈색시키는 것을 특징으로 하는 염료 탈색 방법.
제9항에 있어서,
염료는 Remazol Brilliant Blue R(RBBR) 임을 특징으로 하는 염료 탈색 방법.