KR20150019364A

KR20150019364A - 감자식물체의 형질전환 효율을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20150019364A
Application number: KR20130096126A
Authority: KR
Inventors: 이신우; 김태원; 구영민; 이민경
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2015-02-25

Abstract

본 발명은 감자식물체를 기내에서 재분화 시키거나 아그로박테리아를 이용하여 외래유용유전자를 도입한 형질전환식물체를 개발할 경우에 그 효율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 감자식물체 제조방법은, 형질전환을 수행하는 과정에서 감자의 소괴경으로부터 출현한 새로운 신초로부터 자란 식물체 또는 2회 이하 계대 배양한 식물체로부터 채취한 절편을 사용하고, 재조합 운반체를 포함하는 아그로박테리아와 식물 조직 절편체와의 공동배양 후 신초유기 배지에서 탄소원으로 기존에 사용한 수크로오스 대신에 글루코오스를 사용함으로써 감자식물체의 재분화율을 높이며, 형질전환 효율이 극히 낮은 감자 품종에서도 10%이상의 재분화식물체가 형질전환되는 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 방법을 감자의 형질전환에 적용한다면, 기존의 방법보다 고효율의 식물형질전환시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명은 일부 품종 또는 계통별로 형질전환 효율이 다소 낮으므로 대량으로 특정 유전자를 도입한 유전자변형감자를 개발하여 실용화하는데 더욱 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감자식물체의 형질전환 효율을 증가시키는 방법{Method for increasing transformation efficiency of potato plants}

본 발명은 감자식물체를 기내에서 재분화 시키거나 아그로박테리아를 이용하여 외래유용유전자를 도입함으로써 감자식물체의 형질전환 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

유전자재조합 기술을 이용하여 만든 유전자변형작물의 재배면적은 지난 15년간 꾸준히 증가하여 2012년도에 그 재배면적이 전 세계적으로 1억7,000만 핵타에 달하였다. 현재까지는 옥수수, 콩, 면화가 대다수이며 도입된 유전자들도 제초제 저항성유전자, 해충저항성 유전자 등이 대부분이다 (James, 2012, Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops. ISAAA Brief 44). 최근에는 antisense technology, RNAi technology 등을 이용하여 지방산조성이 변형된 콩, 리그닌 함량이 변형된 알팔파 등이 상용화되고 있어, 향후 제 2 또는 제3세대의 유전자변형 작물들의 상용화가 점차적으로 증가될 것으로 전망하고 있다.

특히 감자의 괴경에는 건물 중으로 약 3 - 6%의 단백질이 축적되어 있고 이들 저장단백질은 수확 후에도 수 개월 동안 protein body에 안전하게 저장되어 있다(Pots et al., 1999, J Agric Food Chem 47:4600-4605; Shewry, 2003, Ann. Bot 91:755-769). 따라서 이러한 감자의 단백질 축적 기작을 이용하여 제약업을 포함한 다양한 산업적으로 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 유전자변형 감자의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히 최근에는 RNAi 기술을 이용하여 괴경에 아밀로오스(amlyose)는 없고 아밀로펙틴(amylopectin)만 생산하는 amylose-free 감자를 개발하여 상용화 되었다(Otani 등, 2007, Plant Cell Report 26(10):1801-1807).

그러나 아직까지도 일부 감자의 품종 또는 계통들은 형질전환 효율이 극히 저조하여 이러한 유전자변형 감자의 개발에 큰 걸림돌이 되고 있다. 예로서 남미에서 재배되고 있는 대부분의 감자육성종은 기존에 보고된 형질전환 방법을 다양하게 수행하였으나 효율이 극히 저조하여 일부 호르몬이 변경된 배지를 이용하여 성공하였다고 보고하였다(Trujillo 등, 2001, Plant Cell Rep. 20:637-641).

본 연구실에서는 지난 10년간 국내·외에서 육성된 감자 품종을 대상으로 카나마이신 저항성 유전자인 NPT II를 선발마커로 사용하여 형질전환을 시도하여 본 결과 국내 육성종 중 조원품종만 유일하게 80% 이상의 높은 형질전환 효율을 나타내었으나 추백, 남서, 조풍, 자심 등은 20% 미만으로 조원에 비하여 현저하게 낮게 나타났다(이정윤 등, 2003, 식물생명공학회지 30:27-33). 그러나 제초제저항성 유전자인 bar 유전자를 선발마커로 사용한 경우에는 조원품종도 20% 미만의 형질전환 효율을 보였으며, 다른 품종들은 거의 0 %에 가까운 형질전환 효율을 보였다(하영민, 2004, 진주산업대학교 농업기술연구소보 17:7-14). 이러한 결과는 중국 등에서 가장 많이 재배되고 있는 대서품종(Atalantic)도 동일한 결과를 나타내었다.

향후 지속적으로 개발되어야 하는 제 2 또는 제3 세대 유전자변형 감자를 개발하기 위해서는 모든 품종에서 단기간에 형질전환 효율이 높은 기술의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 특히 감자는 영양번식을 하고 배수체 작물이어서 한 품종에서 개발된 형질전환체를 일반적인 교배육종법을 이용하여 다른 품종에 유전자를 도입하는 것이 까다로워 더욱더 효율적인 형질전환 방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 감자 식물체를 기내에서 재배하여 생산한 감자의 소괴경(mini tuber)으로부터 얻은 신선한 신초 또는 줄기로부터 채취한 절편을 사용하고, 재조합 운반체를 함유하는 아그로박테리아와 공동 배양하여 일정한 기간 동안 3%의 수크로오스를 포함하는 신초 유기배지에서 배양한 후 1.6%의 글루코오스를 포함하는 신초유기배지로 옮겨 배양한 경우 신초의 출현율이 현저하게 증가하고 최종적으로 형질전환 효율도 크게 증가한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-0756889호

따라서 본 발명의 목적은 형질전환 효율을 증대시킬 수 있는 형질전환 감자식물체 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 (a) 감자의 소괴경을 유도하는 단계; (b) 상기 소괴경으로부터 신초 생산 후 신초로부터 절편체를 채취하는 단계; (c) 절편체를 배지에서 하루 동안 광 상태에서 전배양하는 단계; (d) 상기 전배양된 절편체에 아그로박테리움 튜머파시엔스 균을 감염시킨 후 공동배양하는 단계; (e) 감염된 절편체에서 균을 제거한 후 재분화 배지로 옮겨 계대배양하는 단계; 및 (f) 상기 재분화 배지에서 배양 후 5주부터 글루코오스 함유 배지에서 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양시키는 단계를 포함하는 형질전환 감자식물체 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 절편체는 감자의 소괴경으로부터 출현한 식물체로부터 채취한 잎 또는 줄기의 조직 절편; 또는 상기 식물체를 1회 또는 2회 계대배양하여 증식시킨 식물체의 잎 또는 줄기의 조직 절편일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계는 MS 기본배지에 BA 10 mg/L, NAA 10 mg/L, NH₄NO₃ 147 mg/L, CaCl₂ 80 mg/L, 수크로오스 30 g/L를 포함하는 액체배지에서 하루 동안 광 상태에서 전배양(pre-culture)을 수행하는 단계일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d) 단계는 전배양(pre-culture)을 통해 준비된 조직 절편체에 목적 유전자가 도입된 벡터를 함유한 아그로박테리움 튜머파시엔스 균 배양물을 침지시켜 감염시킨 후, 2 mg/L의 2,4-디클로로펙녹시아세트산과 30 g/L의 수크로오스를 포함하는 MS배지에서 공동배양하는 단계일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (e) 단계는 감염된 절편체에서 여분의 균을 제거하고 MS 기본배지에 NAA 0.01㎎/ℓ, Zeatin 2.0㎎/ℓ, GA₃ 0.1㎎/ℓ, 카르베니실린 500㎎/ℓ 및 PPT 0.5 mg/L가 첨가된 재분화 배지로 옮겨 2주 간격으로 새로운 배지로 계대배양하는 단계일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (f) 단계는 상기 (e)단계를 통해 재분화 배지로 옮겨진 감염된 절편체를 배양 후 5주부터 MS 기본배지에 16 g/L 글루코오스, 0.02 mg/L NAA, 0.15 mg/L GA₃, 0.75 mg/L PPT 및 500 mg/L 카르베니실린이 첨가된 배지로 옮겨 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양시키는 단계일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감자의 품종은 조원, 추백, 남서, 조풍, 자심 및 대서로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한, a) 감자의 소괴경으로부터 신초 생산 후, 신초의 절편체를 아그로박테리움 튜머파시엔스 균으로 감염시킨 후 공동배양하는 단계; 및 b) 아그로박테리움 튜머파시엔스 균으로 감염된 절편체를 재분화 배지를 이용하여 계대배양하면서 계대배양 5주부터는 수크로스 대신 글루코스 함유 배지로 계대배양하는 단계를 포함하는, 감자의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계의 절편체는 감자의 소괴경으로부터 생산된 새로운 식물체를 2회 이하 계대배양하여 생성된 식물체의 잎 또는 줄기 절편일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계의 계대배양은 재분화 배지로 옮겨진 감염된 절편체를 배양 후 5주부터 MS 기본배지에 16 g/L 글루코오스, 0.02 mg/L NAA, 0.15 mg/L GA₃, 0.75 mg/L PPT 및 500 mg/L 카르베니실린이 첨가된 배지로 옮겨 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양시킬 수 있다.

본 발명의 형질전환 감자식물체 제조방법은, 형질전환을 수행하는 과정에서 감자의 소괴경으로부터 출현한 새로운 신초로부터 자란 식물체 또는 2회 이하 계대 배양한 식물체로부터 채취한 절편을 사용하고, 재조합 운반체를 포함하는 아그로박테리아와 식물 조직 절편체와의 공동배양 후 신초유기 배지에서 탄소원으로 기존에 사용한 수크로오스 대신에 글루코오스를 사용함으로써 감자식물체의 재분화율을 높이며, 형질전환 효율이 극히 낮은 감자 품종에서도 10%이상의 재분화식물체가 형질전환되는 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 방법을 감자의 형질전환에 적용한다면, 기존의 방법보다 고효율의 식물형질전환시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명은 일부 품종 또는 계통별로 형질전환 효율이 다소 낮으므로 대량으로 특정 유전자를 도입한 유전자변형감자를 개발하여 실용화하는데 더욱 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 연속적으로 기내에서 계대 배양하며 유지하여 온 감자식물체로부터 소괴경(미니튜브)을 형성하는 과정을 나타내는 도면이다(식물체를 계대배양하지 않고 두면 약 6 - 8주후에 소 괴경이 출현하며 이 괴경을 새로운 배지에 옮겨 두면 약 3 - 3주 후에 새로운 식물체가 출현함).
도 2는 감자의 새로운 소괴경으로부터 얻은 신선한 식물체의 절편체와 4회 이상 연속적으로 계대 배양한 식물체의 절편을 대상으로 유전자재조합 운반체를 내포하고 있는 아그로박테리아와 공동배양을 한 후 약 4 - 5주 동안의 배양상태를 비교한 것이다.
도 3은 감자의 새로운 소괴경으로부터 얻은 신선한 식물체로부터 채취한 절편체와 4회 이상 연속적으로 계대 배양한 식물체로부터 채취한 절편체를 이용하여 형질전환 한 후 신초의 유기과정을 비교한 것이다.
도 4는 감자의 형질전환 여부를 분자생물학적인 방법(형질도입된 bar 유전자의 존재 및 발현여부 분석)으로 확인한 결과로서, 4(A)는 genomic PCR 결과를 나타낸 것이며, 4(B)는 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 4(A)에서 레인 1은 음성대조구로 형질전환을 하지 않은 대서 식물체이며, 레인 2에서 15는 형질전환 대서식물체를 대상으로 genomic DNA를 분리하여 분석한 결과이다. 도 4(B)에서 1은 형질전환 하지 않은 대서식물체를 대상으로 그리고 레인 2~15는 형질전환 식물체를 대상으로 총 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과이다. 또한, 도4(B)에서 맨 아래 결과는 내재 유전자인 액틴(actin)에 대한 RT-PCR 결과이다.

본 발명은 형질전환 효율을 증대시킬 수 있는 형질전환 감자식물체 제조방법을 제공하는데 그 특징이 있다.

본 발명은 (a) 감자의 소괴경을 유도하는 단계;

(b) 상기 소괴경으로부터 신초 생산 후 신초로부터 절편체를 채취하는 단계;

(c) 절편체를 배지에서 하루 동안 광 상태에서 전배양하는 단계;

(d) 상기 전배양된 절편체에 아그로박테리움 튜머파시엔스 균을 감염시킨 후 공동배양하는 단계;

(e) 감염된 절편체에서 균을 제거한 후 재분화 배지로 옮겨 계대배양하는 단계; 및

(f) 상기 재분화 배지에서 배양 후 5주부터 글루코오스 함유 배지에서 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때 까지 배양시키는 단계를 포함하는 형질전환 감자식물체 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 (a) 단계는 감자의 소괴경을 유도하는 단계로서, 자세하게는 수크로오스를 포함하는 MS기본 고체 배지에 3 내지 4주마다 기내 감자식물체의 절간을 잘라서 증식시켜 계대배양한 다음, 이들 식물체로부터 소괴경을 유기하기 위하여 신선한 고체배지에서 계대배양 없이 약 8주 동안 유지함으로써 다수의 소괴경을 유도할 수 있다.

본 발명의 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계를 통해 유도된 소괴경으로부터 신초 생산 후 신초로부터 절편체를 채취하는 단계로서, 상기 절편체는 소괴경으로부터 출현한 식물체로부터 채취한 잎 또는 줄기의 조직 절편; 또는 이들을 1회 또는 2회 계대배양하여 증식시킨 식물체로부터 채취한 잎 또는 줄기의 조직 절편일 수 있다.

본 발명의 하기 실시예 4에서는, 형질전환에 사용되는 신초의 조직 절편에 있어서 신초의 계대배양 횟수(빈도)에 따른 감자식물체의 재분화 및 형질전환에 미치는 영향을 살펴보았으며, 그 결과 소괴경으로부터 출현한 식물체를 1회 또는 2회 계대배양하여 증식한 식물체의 절편을 이용하여 형질전환을 시킨 경우, 소괴경으로부터 출현한 식물체를 4회 이상 계대배양하여 증식한 식물체의 절편을 이용하여 형질전환을 시킨 경우보다 절편체가 보다 밝은 녹색을 띄면서 갈변을 하지 않고, 캘러스 및 신초의 출현율이 훨씬 높은 것을 확인할 수 있었다(도 2-3 및 표 4 참조).

따라서 감자의 소괴경에서부터 출현한 새로운 신초로부터 자란 식물체를 4회 이상 연속 배양한 계통들로부터 채취한 절편을 대상으로 하는 형질전환 효율은 극히 저조하기 때문에, 본 발명의 상기 (b) 단계를 통해 채취되는 신초의 조직 절편으로는 소괴경으로부터 출현한 식물체 또는 이들을 2회 이하 계대 배양하여 증식시킨 식물체로부터 채취한 잎 또는 줄기의 조직 절편을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 (c) 단계는 절편체를 배지에서 하루 동안 광 상태에서 전배양(pre-culture)하는 단계로서, 자세하게는 상기 (b) 단계를 통해 수득한 조직 절편체를 MS 기본배지에 BA 10 mg/L, NAA 10 mg/L, NH₄NO₃ 147 mg/L, CaCl₂ 80 mg/L, 수크로오스 30 g/L를 포함하는 액체배지에서 하루 동안 광 상태에서 전배양(pre-culture)을 수행할 수 있다.

본 발명의 상기 (d) 단계는 전배양된 절편체에 목적 유전자가 도입된 벡터를 함유한 아그로박테리움 튜머파시엔스 균을 감염시킨 후 공동배양하는 단계로서, 자세하게는 상기 (c)를 거친 전배양된 절편체에 목적 유전자가 도입된 벡터를 함유한 아그로박테리움 튜머파시엔스 균 배양물을 침지시켜 감염시킨 후, 2 mg/L의 2,4-디클로로펙녹시아세트산과 30 g/L의 수크로오스를 포함하는 MS배지에서 공동배양할 수 있다.

본 발명에서 사용한 아그로박테리움 튜머파시엔스 균 배양물은 재조합 운반체를 내포하고 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101을 리팜피신, 스펙티도마이신, 겐타마이신이 함유된 YEP 배지에서 36-48시간 배양한 후, 25㎖ YEP의 배지에 배양한 균을 넣고, 같은 온도 하에서 8-10시간 계대 배양한 다음, 적정 농도 (OD=0.6-0.7)로 성장시켜 사용할 수 있으며, 상기 재조합 운반체는 대상 식물체를 형질전환시키고자 하는 목적에 적합한 목적 유전자를 포함하는 벡터일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 목적 유전자로서 제조체 저항성 유전자인 bar를 사용하였고 상기 벡터로서 pSIOR을 사용하였다.

본 발명의 상기 (e) 단계는 감염된 절편체에서 균을 제거한 후 재분화 배지로 옮겨 계대배양하는 단계로서, 자세하게는 상기 (d) 단계를 통해 수득한 감염된 절편체를 여과지 위에 치상하여 여분의 균을 제거하고 재분화 배지로 옮겨 2주 간격으로 새로운 배지로 계대 배양하는 단계이다.

본 발명에서 상기 (e) 단계에서 사용한 재분화 배지는 MS 기본배지에 NAA 0.01㎎/ℓ, Zeatin 2.0㎎/ℓ, GA₃ 0.1㎎/ℓ, 카르베니실린 500㎎/ℓ 및 PPT 0.5 mg/L가 첨가된 배지일 수 있으나, 절편체를 재분화시킬 수 있는 배지라면 특별히 그 구성을 상기와 같이 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 상기 (f) 단계는 상기 재분화 배지에서 절편체 배양 후 5주부터 글루코오스 함유 배지에서 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양시키는 단계로서, 자세하게는 상기 (e) 단계에서 감염된 절편체를 재분화 배지로 옮긴 다음 계대배양을 하다가, 배양 후 5주부터는 글루코오스가 함유된 배지에서 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양하여 완전한 식물체를 재분화 시키는 단계이다.

본 발명에서 상기 (f) 단계에서 사용하는 글루코오스가 함유된 배지는 MS 기본배지에 16 g/L 글루코오스, 0.02 mg/L NAA, 0.15 mg/L GA₃, 0.75 mg/L PPT 및 500 mg/L 카르베니실린이 첨가된 배지일 수 있으며, 상기 구성의 배지를 10일 간격으로 교체해 주면서 배양할 수 있다.

본 발명의 하기 실시예 3에서는, 감자식물체의 형질전환에 있어서 배지 내 탄소원의 종류에 따라 형질전환효율에 미치는 영향을 살펴보았으며, 그 결과 재분화 배지에서 절편체 배양 후 5주부터 글루코오스가 함유된 배지로 교체하여 배양한 감자식물체의 경우 형질전환 효율이 증진되는 것을 확인할 수 있었다(표 3 참조).

따라서 감자식물체의 형질전환 효율을 증진시키기 위해서는 아그로박테리아로 감염된 절편체에서 균을 제거한 후 재분화 배지로 옮겨 계대 배양하면서, 배양 후 5주부터는 배지의 조성을 변화시켜 글루코오스 함유 배지에서 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 형질전환체 제조방법을 적용할 수 있는 감자의 품종으로는, 예를 들어 조원, 추백, 남서, 조풍, 자심 및 대서 등이 가능하나, 품종 간의 형질전환 효율은 다를 수 있다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 통해 궁극적으로 감자의 형질전환 효율을 향상시킬 수 있는 최적의 조건을 확립하였다는 특징을 갖는다.

감자의 형질전환 효율 향상을 위해 본 발명에서 규명한 최적 조건은 특히 감자식물체를 기내에서 재분화시키거나 아그로박테리아를 이용하는 형질전환 방법에 응용될 수 있는데, 구체적으로 1) 형질전환 대상은 감자의 소괴경으로부터 출현한 새로운 식물체, 바람직하게는 상기 새로운 식물체를 2회 이하 계대배양하여 생성된 식물체의 잎 또는 줄기 절편을 사용할 수 있고, 2) 형질전환 대상 절편체는 목적 유전자가 도입된 벡터를 함유한 아그로박테리아와 공동배양을 통해 상기 절편체를 형질감염 시킨 후, 재분화 배지에서 계대 배양을 통해 고효율로 형질전환된 감자 식물체를 수득할 수 있다. 이때, 상기 재분화 배지는 탄소원으로 수크로스 대신 글루코스를 사용함으로써 감자식물체의 재분화율을 향상시킬 수 있고, 형질전환 효율이 낮은 특정 품종에서도 형질전환 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 글루코스가 함유된 배지의 사용은 바람직하게 재분화 배지에서 배양 후 5주부터 사용하는 것이 바람직하며, 5주 이전까지는 수크로스 함유 배지를 사용한다.

따라서 본 발명은 감자의 형질전환 효율을 향상시키는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은, a) 감자의 소괴경으로부터 생산된 새로운 식물체의 절편체를 아그로박테리움 속 세균으로 감염시킨 후 공동배양하는 단계; 및 b) 상기 세균으로 감염된 절편체를 재분화 배지를 이용하여 계대 배양하면서 계대 배양 5주부터는 수크로스 대신 글루코스 함유 배지로 계대 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 a) 단계의 절편체는 바람직하게 감자의 소괴경으로부터 생산된 새로운 식물체를 2회 이하 계대배양하여 생성된 식물체의 잎 또는 줄기 절편을 사용할 수 있으며, 상기 아그로박테리움 속 세균은 아그로박테리움 튜머파시엔스일 수 있다.

또한, 상기 b) 단계의 계대 배양은 재분화 배지로 옮겨진 감염된 절편체를 배양 후 5주부터 MS 기본배지에 16 g/L 글루코오스, 0.02 mg/L NAA, 0.15 mg/L GA₃, 0.75 mg/L PPT 및 500 mg/L 카르베니실린이 첨가된 배지로 옮겨 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때 까지 배양시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

시료

하기 실험에서 사용한 조원 품종은 농촌진흥청 국립식량과학원 고령지농업연구센터에서 분양받았으며, 대서 품종은 한국생명공학연구원에서 분양받았고, 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101(Agrobacterium tumefaciens GV3101)은 한국생명공학연구원으로부터 분양받은 것을 사용하였다. 또한, 본 실험에서 사용한 시약들은 하기 표 1에 정리하였다.

실험에서 사용한 시약 종류 및 구입처

시약명	농도	회사명	기타
MS	4.4g/L	Duchefa
Sucrose	30g/L
spectinomycin	1g/L
Rifampicin	25mg/L
Gentamycin	25mg/L
PPT	0.5mg/L, 1.0mg/L
carbenicillin	500mg/L
NAA	10mg/L, 0.01mg/L
GA3	0.1mg/L
Zeatin	2mg/L
BA	10mg/L	Sigma
2.4-D	2mg/L	Sigma
CaCl₂	80mg/L	Bioshop
NH₄NO₃	147mg/L	Kokusan
Bacto peptone	10g/L	Duchefa	아그로 박테리움 배양시 사용
Nacl	5g/L	Biopure
Bacto yeast extract	10g/L	BD

< 실시예 1>

기내 소괴경의 생산 및 소괴경으로부터 신선한 식물체 생산

조원 및 대서 각각의 감자품종을 기내에서 오랫동안 보존하기 위하여 3%의 수크로오스를 포함하는 MS기본 고체배지(Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15:473-497)에 3-4주마다 기내 식물체의 절간을 잘라서 증식시켜 계대배양하였다. 이들 식물체로부터 소괴경을 유기하기 위하여 신선한 고체배지에서 계대배양하지 않고 약 8주 동안 유지한 후 다수의 소괴경을 유도하였다. 상기 과정을 통해 생성된 소괴경을 수확하여 신선한 고체배지에서 배양하면서 눈으로부터 새로운 식물체를 출현시켰으며(하기 도 1 참조), 생성된 신초의 절간 마디를 잘라서 새로운 고체배지에서 증식시킨 후 이들의 절편체를 채취하여 하기의 형질전환용 시료로 사용하였다. 참고로, 식물체를 계대배양하지 않고 두면 약 6-8주후에 소괴경이 출현하며, 이 괴경을 새로운 배지에 옮겨 두면 약 3-4주 후에 새로운 식물체가 출현한다.

< 실시예 2>

감자의 형질전환

제초제저항성 유전자인 bar유전자를 내재하고 있는 재조합운반체(pSJ001)를 포함하는 아그로박테리아를 이용하여 기본적으로는 Visser 등(1989, Plant. Mol. Biol. 12:329-337)이 확립한 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 1을 통해 준비한 식물체의 조직 절편체를 MS 기본배지에 BA 10 mg/L, NAA 10 mg/L, NH₄NO₃ 147 mg/L, CaCl₂ 80 mg/L, 수크로오스 30 g/L를 포함하는 M1 액체배지에서 하루 동안 광 상태에서 전배양(pre-culture)을 수행하였다. 한편 재조합운반체를 내포하고 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101은 리팜피신(25mg/L), 겐타마이신(25mg/L), 스펙티노마이신 (1.0g/L)이 함유된 3㎖의 YEP 배지에서 28℃로 48시간 동안 배양한 후, 25㎖ YEP의 배지에 상기 배양한 균을 250㎕넣고, 같은 온도 하에서 10시간 계대배양하였다. 이후, 적정 농도 (OD=0.6-0.7)로 자란 균을 하루 동안 상기 전배양(pre-culture)을 통해 준비된 절편체에 침지시켜 15분간 감염시킨 후 M2 고체배지(2mg/L의 2.4-D와 30g/L의 수크로오스를 포함하는 MS배지)에서 2일간 공동배양하였다. 감염된 절편체를 여과지 위에 치상하여 여분의 균을 제거하고 재분화 배지(M3: MS, NAA 0.01㎎/ℓ, 제아틴 2.0㎎/ℓ, GA₃0.1㎎/ℓ, 카르베니실린 500㎎/ℓ, PPT 0.5 mg/L)로 옮겨 2주 간격으로 새로운 배지로 계대배양하였으며, 5주부터는 M4 배지 (MS + 16g/L 글루코오스, 0.02 mg/L NAA, 0.15mg/L GA₃, 0.75mg/L PPT, 500mg/L 카르베니실린)에서 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양하여 완전한 식물체로 재분화시켰다(하기 표 2 참조).

감자 형질전환을 위한 배양배지 조성

배지	Sucrose (g/L)	Glucose (g/L)	BA (mg/L)	NAA (mg/L)	2.4-D (mg/L)	GA₃ (mg/L)	Zeatin (mg/L)	기타
M1	30	-	10	10	-	-	-	NH₄NO₃(147mg/L),CaCl₂(80mg/L)
M2	30	-	-	-	2	-	-
M3	30	-	-	0.01	-	0.1	2	PPT (0.5mg/L), Carbenicillin (500mg/L)
M4	-	16	-	0.02	-	0.15	-	PPT (0.5mg/L), Carbenicillin (500mg/L)

< 실시예 3>

배지 내 탄소원의 종류에 따른 감자의 형질전환효율 변화

본 실험에서는 감자식물체의 형질전환에 있어서 배지 내 탄소원의 종류에 따라 형질전환효율에 미치는 영향을 살펴보았다.

상기 실시예 2의 방법으로 감자식물체의 형질전환 효율을 비교하여 본 결과, 4회 이상 연속 계대 배양하여 온 식물체(계대배양은 3 - 4 주마다 시행하였으며, 따라서 4회 이상 연속 배양한 경우는 4 - 5개월 동안 계대배양하면서 유지한 식물체에 해당함)로부터 채취한 절편을 대상으로 3%의 수크로오스를 포함하는 M3 배지에서 신초를 유기시킨 경우와 4주 동안은 M3 배지에서 그 이후는 글루코오스를 포함하는 M4 배지에서 배양한 경우를 비교하였다.

그 결과 하기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 4주 동안은 M3 배지에서 그 이후는 글루코오스를 포함하는 M4 배지에서 배양한 경우 형질전환 효율이 증진되는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 조원에 비하여 대서의 경우에는 조직이 물러지면서 심한 갈색으로 변하여 고사하는 절편이 많아 불과 0.5%의 낮은 효율을 보였으며 그나마 줄기의 경우에는 전혀 형질전환체를 확인할 수가 없었다.

배지 내 탄소원의 종류가 형질전환효율에 미치는 영향

품종	배지	조직	재분화 식물체 (개체수)	PPT(1.0mg/L) 저항성 식물(%)	형질전환체(PCR) (%)
조원(Jowon)	M3	잎	118	37.3	10.1
	M3	줄기	140	32.1	8.9
	M3-M4	잎	119	54.0	18.4
	M3-M4	줄기	148	44.2	16.3
대서(Atlantic)	M3	잎	12	0	0
	M3	줄기	0	0	0
	M3-M4	잎	10.1	1.1	0.5
	M3-M4	줄기	8.3	1.7	0

< 실시예 4>

신초의 계대배양 빈도에 따른 감자의 재분화 및 형질전환 효율 변화

본 실험에서는 감자식물체의 형질전환에 있어서 신초의 계대배양 횟수(빈도)에 따른 감자의 재분화 및 형질전환에 미치는 영향을 살펴보았다.

상기 실시예 3에서 살펴본 바와 같이 대서품종의 형질전환 효율이 매우 낮은바, 본 실험에서는 대서품종을 포함한 감자의 형질전환효율을 보다 높이기 위하여, 소괴경으로부터 출현한 식물체의 계대배양 횟수(빈도)를 달리하여 실험을 진행하였다. 자세하게는 상기 실시예 1을 통해 준비된 소괴경으로부터 새로운 식물체를 출현시킨 후, 새로운 식물체를 1회 또는 2회 계대배양하여 증식한 신초의 잎 또는 줄기의 절편과 4회 이상을 계대 배양하여 증식한 식물체의 잎 또는 줄기의 절편을 채취한 후, 이들 각각(1-2회 계대배양 vs 4회 이상 계대배양)을 아그로박테리아와 M2 배지에서 공동배양하였으며, 이후 처음 4주간은 수크로오스를 포함하는 M3배지에서 배양하고, 그 후 글루코오스를 포함하는 M4 배지에서 배양하였다.

그 결과 도 2 및 도 3에서 나타낸 바와 같이, 소괴경으로부터 출현한 식물체를 1회 또는 2회 계대 배양하여 증식한 식물체의 절편을 이용하여 형질전환을 시킨 경우, 소괴경으로부터 출현한 식물체를 4회 이상 계대 배양하여 증식한 식물체의 절편을 이용하여 형질전환을 시킨 경우보다 절편체가 보다 밝은 녹색을 띄면서 갈변을 하지 않고, 캘러스 및 신초의 출현율이 훨씬 높은 것으로 나타났다.

또한, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 조원 및 대서 감자 품종 모두에서 1~2회 계대 배양한 실험군이 4회 이상 계대 배양한 실험군에 비해 잎 및 줄기 모두가 월등히 높은 형질전환율을 보이는 것으로 나타났다.

또한, 결과적으로 잎 절편에서 약 3.1%의 증가된 형질전환 효율을 나타내었다. 또한 줄기의 경우에는 0.5%로 일부 형질전환체를 확인할 수 있었다. 물론 조원(잎은 25%, 줄기는 17%)에 비하면 아직까지 아주 낮은 효율을 보이지만 일부 수정과 보완을 통하여 지속적으로 개선하면 더욱더 높일 수 있을 것으로 보인다(하기 표 4 참조).

신초의 계대 배양의 빈도가 감자의 재분화 및 형질전환 효율에 미치는 영향

품종	계대배양 횟수	조직	재분화 식물체 (개체수)	PPT(1.0mg/L) 저항성 식물(%)	형질전환체(PCR) (%)
조원	Fresh (1-2회)	잎	126	65.8	25.5
	Fresh (1-2회)	줄기	132	51.2	17.8
	Old (4회 이상)	잎	138	54.0	18.4
	Old (4회 이상)	줄기	52	44.2	16.3
대서	Fresh (1-2회)	잎	71.7	11.2	4.3
	Fresh (1-2회)	줄기	205	8.3	2.5
	Old (4회 이상)	잎	9.3	1.1	0.5
	Old (4회 이상)	줄기	0	0	0

< 실시예 5>

형질전환체 확인 및 발현 분석

재분화된 감자식물체(대서 품종)에서 어린잎을 채취하여 DNeasy plant mini kit (Qiagen)를 이용하여 메뉴얼에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. Bar 유전자의 형질전환 여부를 확인하기 위하여, Bar 유전자 특이 프라이머 세트 (5'-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3')와 (5'-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3')를 이용하여 PCR을 실시하였다. 게놈 DNA를 추출한 후 50ng 게놈 DNA를 PCR의 주형으로 사용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초간 반응 후 55℃에서 30초간 어닐링반응, 72℃에서 30초간의 중합반응의 일련의 반응을 30회 실시한 후 72℃에서 7분간의 중합반응을 실시한 후 PCR 산물을 아가로스 젤에서 전기영동하여 형질전환 식물체를 확인하였다(도 4A 참조).

형질전환 감자 식물체에서 도입된 Bar 유전자의 발현을 분석하기 위해 일부 기내에서 자란 어린잎을 사용하여 RNeasy Plant Mini KitTM (Quiagen)를 사용하여 전체 RNA를 추출하여 RT-PCR 분석에 이용하였다. 전체 RNA (1 μg)을 Transcriptor first-strand cDNA synthesis kit (Roche)를 사용하여 first strand cDNA를 합성한 후 30μl TE에 희석하여 PCR에 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초간 반응 후 58℃에서 30초간 어닐링반응, 72℃에서 30초간의 중합반응의 일련의 반응을 35회 실시한 후 72℃에서 7분간의 마지막 중합반응을 실시하였다. PCR 산물을 아가로스 젤에 전기영동하여 발현양을 확인하였다.

분석 결과, RT-PCR 결과에 의해 야생형에서는 없었던 bar의 발현을 확인할 수 있었으며(도 4B 참조), 이를 통해 최종적으로 이들 개체들은 외부에서 도입된 bar 유전자가 안전하게 식물체의 게놈에 삽입되어 정상적으로 발현됨을 확인하였다.

결론적으로, 본 발명자들은 상기의 실험을 통해 감자의 형질전환율을 향상시키기 위한 방법으로, 기내 배양을 통해 감자로부터 소괴경을 유기시키고, 유기된 소괴경으로부터 생성된 식물체를 2회 이하 계대 배양하여 수득한 잎 또는 줄기 절편을 아그로박테리아로 형질전환 시킬 경우, 감자의 형질전환율을 향상시킬 수 있다는 것을 알 수 있었고, 또한 아그로박테라이로 형질전환 시킬 때 초기 4주 동안은 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하고 이후에는 글루코스를 포함하는 배지에서 배양할 경우, 감자의 형질전환을 극대화할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 소괴경으로부터 출현한 새로운 신초로부터 자란 식물체 또는 2회 이하 계대 배양한 식물체로부터 채취한 절편을 사용한 경우, 재분화율도 높게 나타났으며, 10% 이상 재분화식물체가 형질전환 되었음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(a) 감자의 소괴경을 유도하는 단계;
(b) 상기 소괴경으로부터 신초 생성 후 신초로부터 절편체를 채취하는 단계;
(c) 절편체를 배지에서 하루 동안 광 상태에서 전배양하는 단계;
(d) 상기 전배양된 절편체에 아그로박테리움 튜머파시엔스 균을 감염시킨 후 공동배양하는 단계;
(e) 감염된 절편체에서 균을 제거한 후 재분화 배지로 옮겨 계대배양하는 단계; 및
(f) 상기 재분화 배지에서 배양 후 5주부터 글루코오스 함유 배지에서 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양시키는 단계를 포함하는 형질전환 감자식물체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 절편체는 감자의 소괴경으로부터 출현한 식물체로부터 채취한 잎 또는 줄기의 조직 절편; 또는 상기 식물체를 1회 또는 2회 계대배양하여 증식시킨 식물체의 잎 또는 줄기의 조직 절편인 것을 특징으로 하는 형질전환 감자식물체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계는 MS 기본배지에 BA 10 mg/L, NAA 10 mg/L, NH₄NO₃ 147 mg/L, CaCl₂ 80 mg/L, 수크로오스 30 g/L를 포함하는 액체배지에서 절편체를 하루 동안 광 상태에서 전배양(pre-culture)을 수행하는 것을 특징으로 하는 형질전환 감자식물체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (d) 단계는 전배양(pre-culture)을 통해 준비된 절편체에 목적 유전자가 도입된 벡터를 함유한 아그로박테리움 튜머파시엔스 균 배양물을 침지시켜 감염시킨 후, 2 mg/L의 2,4-디클로로펙녹시아세트산과 30 g/L의 수크로오스를 포함하는 MS배지에서 공동배양하는 것을 특징으로 하는 형질전환 감자식물체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (e) 단계는 감염된 절편체에서 여분의 균을 제거하고 MS 기본배지에 NAA 0.01㎎/ℓ, Zeatin 2.0㎎/ℓ, GA₃ 0.1㎎/ℓ, 카르베니실린 500㎎/ℓ 및 PPT 0.5 mg/L가 첨가된 재분화 배지로 옮겨 2주 간격으로 새로운 배지로 계대 배양하는 것을 특징으로 하는 형질전환 감자식물체 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 (f) 단계는 상기 (e)단계를 통해 재분화 배지로 옮겨진 감염된 절편체를 배양 후 5주부터 MS 기본배지에 16 g/L 글루코오스, 0.02 mg/L NAA, 0.15 mg/L GA₃, 0.75 mg/L PPT 및 500 mg/L 카르베니실린이 첨가된 배지로 옮겨 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 감자식물체 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 감자의 품종은 조원, 추백, 남서, 조풍, 자심 및 대서로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 감자식물체 제조방법.
a) 감자의 소괴경으로부터 신초 생산 후, 신초의 절편체를 아그로박테리움 튜머파시엔스 균으로 감염시킨 후 공동배양하는 단계; 및
b) 아그로박테리움 튜머파시엔스 균으로 감염된 절편체를 재분화 배지를 이용하여 계대배양하면서 계대 배양 5주부터는 수크로스 대신 글루코스 함유 배지로 계대배양하는 단계를 포함하는, 감자의 형질전환 효율을 증가시키는 방법.
제8항에 있어서,
상기 a) 단계의 절편체는 감자의 소괴경으로부터 생산된 새로운 식물체를 2회 이하 계대배양하여 생성된 식물체의 잎 또는 줄기 절편인 것을 특징으로 하는 감자의 형질전환 효율을 증가시키는 방법.
제8항에 있어서,
상기 b) 단계의 계대배양은 재분화 배지로 옮겨진 감염된 절편체를 배양 후 5주부터 MS 기본배지에 16 g/L 글루코오스, 0.02 mg/L NAA, 0.15 mg/L GA₃, 0.75 mg/L PPT 및 500 mg/L 카르베니실린이 첨가된 배지로 옮겨 신초가 출현하고 뿌리가 유기될 때까지 배양시키는 것을 특징으로 하는 감자의 형질전환 효율을 증가시키는 방법.