KR20150016036A - 핵산 증폭 방법 - Google Patents

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KR20150016036A
KR20150016036A KR1020130092249A KR20130092249A KR20150016036A KR 20150016036 A KR20150016036 A KR 20150016036A KR 1020130092249 A KR1020130092249 A KR 1020130092249A KR 20130092249 A KR20130092249 A KR 20130092249A KR 20150016036 A KR20150016036 A KR 20150016036A
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김연정
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Abstract

고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포를 용해시켜 세포의 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다. 이에 의하면, 고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포 또는 그의 핵산을 별도로 분리하는 과정 없이, 고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포로부터 핵산을 증폭시킬 수 있다.

Description

핵산 증폭 방법{Method for amplifying nucleic acids}
고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포를 용해시켜 세포의 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
핵산 증폭 기술은 다양한 생물학적 시료로부터 빠르고 정확한 감염성 질환의 진단을 위해 이용되고 있으며, 그 중요성이 점점 커지고 있는 추세이다. 분리된 세포는 별도의 정제 과정 없이 단순히 세포를 용해시킨 후 PCR에 의한 증폭이 가능하다.
그러나 항체 고정 입자를 사용하여 세포를 부착시킨 후에는 별도의 정제 과정 없이 계면활성제 및 단백질 분해 효소를 처리하는 기존의 세포 용해 과정만으로는 PCR 증폭이 효율적으로 일어나지 않는다. 종래 기술에 의하면, 항체 고정 입자에 결합된 세포는 항체 고정 입자로부터 세포를 분리하는 것과 같은 별도의 정제 과정이 필요하다.
따라서, 항체 고정 입자에 부착된 세포를 단순한 세포 용해 과정만으로도 효율적으로 핵산을 증폭시키는 방법이 요구된다.
고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포를 용해시켜 핵산을 증폭하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.
고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포에 초음파를 가하여 세포를 용해시키는 단계;
상기 고체 지지체로부터 세포를 용해시킨 산물을 분리하는 단계;
상기 분리된 산물에 단백질 분해 효소를 첨가하고 인큐베이션시키는 단계;
상기 인큐베이션시킨 산물을 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법이 제공된다.
상기 방법은 고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포에 초음파를 가하여 세포를 용해시키는 단계를 포함한다.
상기 고체 지지체는 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 예를 들면 세포의 표면 단백질, 지질, 또는 당에 결합할 수 있는 물질일 수 있다. 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 예를 들면, 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성(pleckstrin homology: PH) 도메인을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다. 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 것으로, 예를 들면 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab'또는 scFv일 수 있다. 세포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 예를 들면 친지성 모이어티, 양친매성 모이어티, 양쪽성 이온 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함하는 물질일 수 있다. 친지성 모이어티는 예를 들면, 지방산, 스테롤, 또는 글리세리드일 수 있다. 양친매성 모이어티는 예를 들면, 인지질 또는 스핑고리피드일 수 있다. 양쪽성 이온 모이어티는 예를 들면, 술포베타인, 카르복시베타인, 또는 포스포릴콜린일 수 있다. 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 세포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 고체 지지체와 결합한 것일 수 있다.
상기 고체 지지체는 구형, 다각면체, 플레이트, 선형 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 세포는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 분리하고자 하는 세포일 수 있다. 상기 개체는 예를 들면 인간을 포함한 포유 동물일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 생물학적 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 세포는 신경 세포, 상피 세포, 생식 세포, 면역 세포, 근육 세포, 암 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 암 세포는 예를 들면 혈중 종양 세포(circulating tumor cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell)일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종, 카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 또는 종양 세포일 수 있다.
상기 초음파는 주파수 16 kHz 이상의 음파를 말한다. 예를 들면, 16 kHz 내지 20 kHz일 수 있다. 세포 용액 또는 현탁액을 초음파 수조에 위치한 챔버 내에서 초음파를 가할 수 있다. 초음파는 상온, 또는 얼음 위에서 가할 수 있다. 초음파를 가하는 시간은 당업계에 알려진 바에 따라 조정할 수 있다. 초음파에 의해 세포막이 파괴되어 세포가 용해될 수 있다.
상기 세포를 용해시키는 단계는 양이온을 포함하는 용액의 존재 하에 세포를 용해시키는 것일 수 있다. 상기 양이온(cation)은 전기적으로 양성으로 하전한 원자 또는 원자단을 말한다. 상기 양이온은 1가 양이온 또는 2가 양이온일 수 있다. 상기 양이온은 K+, Na+, Mg2 +, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 양이온은 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 180 mM, 50 mM 내지 160 mM, 50 mM 내지 140 mM, 50 mM 내지 120 mM, 또는 50 mM 내지 100 mM일 수 있다. 상기 용액은 계면활성제를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제일 수 있다. 상기 비-이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 폴리옥시프로필렌 글리콜 알킬 에테르, 글루코시드 알킬 에테르, 폴리옥시에틸린 글리콜 오틸페놀 에테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르, 글리세롤 알킬 에스테르, 폴리소르베이트, 소르비탄 알킬 에스테르, 코카미드, 도데실디메틸아민 옥시드, POEA(polyethoxylated tallow amine), 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, 트리톤(Triton) X-100 또는 트윈(Tween) 20일 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따라 고체 지지체로부터 세포를 용해시킨 산물을 분리하는 단계를 포함한다.
상기 산물은 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 예를 들면, 게놈 DNA, 메신저 RNA(messenger RNA: mRNA), 리보좀 RNA(ribosomal RNA: rRNA), tRNA 또는 이들의 단편일 수 있다.
상기 고체 지지체로부터 세포를 용해시킨 산물을 분리하는 단계는 원심분리에 의한 분리, 자석에 의한 분리, 여과에 의한 분리, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 고체 지지체로부터 세포를 용해시킨 산물을 분리하는 단계는 상기 고체 지지체를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 세척은 상온 또는 얼음 위에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따라 분리된 산물에 단백질 분해 효소를 첨가하고 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
상기 단백질 분해 효소는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 세린 프로테아제는 예를 들면 프로테이나제 K일 수 있다.
상기 인큐베이션은 15℃ 내지 65℃의 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들면 20℃ 내지 60℃, 25℃ 내지 55℃, 또는 30℃ 내지 50℃일 수 있다. 단백질 분해 효소가 활성을 유지하는 시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따라 인큐베이션시킨 산물을 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다.
상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. DNA 폴리머라제는 예를 들면 Taq DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, Tfi DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, 핫 스타트(hot start) 폴리머라제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 RNA 폴리머라제는 예를 들면 T7 RNA 폴리머라제, 또는 SP6 RNA 폴리머라제일 수 있다. 역전사 효소는 예를 들면 MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사 효소, HIV(Human Immunodeficiency Virus) 역전사 효소, 또는 AMV(Avian Myeloblastosis Virus) 역전사 효소일 수 있다.
상기 용어 "증폭 (amplification)"은 핵산의 카피 수를 증가시키는 것을 의미하며, RNA로부터 DNA를 생성시키는 것을 포함한다. 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(thermal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 증폭 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification: SDA), 다중치환 증폭(multiple displacement amplification; MDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭은 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 신장(elongation)의 단계를 반복한다. 상기 용어 "어닐링(annealing)"은 용어 "혼성화(hybridization)"와 혼용될 수 있다. 또한, 증폭 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 핵산 증폭은 예를 들면 실시간 핵산 증폭일 수 있다. 상기 용어 "실시간 핵산 증폭(Real-Time PCR, RT-PCR)"은 PCR 산물의 증가를 PCR의 매 사이클마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 산물과 반응하는 형광물질의 검출 및 정량에 의해 시료를 분석하는 방법이다.
상기 핵산 증폭은 전체 게놈 핵산(whole genome) 증폭 또는 표적 핵산 증폭일 수 있다.
일 구체예에 따른 핵산 증폭 방법에 의하면, 세포 또는 세포의 핵산을 별도로 분리하는 과정 없이, 고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포로부터 핵산을 증폭시킬 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시료의 준비
QIAamp DNA mini 키트(Qiagen)를 사용하여 건강한 사람의 백혈구로부터 추출된 게놈 DNA, 또는 분리된 HCC827 세포주를 준비하였다. 한편, 분리된 세포주를 EpCAM 항체가 결합되어 있는 비드(DynaBeads Epithelial Enrich from Life Technologies)와 인큐베이션 시킨 후 인큐베이션시켜 비드에 캡쳐된 세포를 준비하였다.
실시예 2. 비드에 캡쳐된 세포를 용해시킨 세포 용해물의 폴리머라제 연쇄 반응 효과
실시예 1에서 준비한 시료를 인큐베이션시키고, 별도의 정제 과정 없이 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(quantitative polymerase chain reaction: qPCR)을 수행하였다.
실시예 1에서 준비된 60 pg의 게놈 DNA, 10개의 분리된 세포, 및 비드에 캡쳐된 10개의 세포를 세포 용해 버퍼 2(50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 및 10 mM Tris-HCl(pH8.3)) 및/또는 1 ㎍의 프로테이나제(proteinase) K(Sigma)의 존재 하에 55℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 한편, 실시예 1에서 준비된 분리된 세포 및 비드에 캡쳐된 세포를 4 ㎕의 PBS 버퍼와 혼합하고, 혼합물에 3 ㎕의 알칼리 용액 (400mM KOH)을 첨가하고 상온에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 3 ㎕의 10 mM Tris-HCl(pH8.3)을 첨가하여 반응액을 중화시켰다.
qPCR에 사용된 제1 qPCR용 정방향 프라이머, 제1 qPCR용 역방향 프라이머, 제2 qPCR용 정방향 프라이머, 및 제2 qPCR용 역방향 프라이머는 표 1에 기재된 바와 같다.
qPCR 프라이머 뉴클레오티드 서열
제1 qPCR 제1 정방향 프라이머 5'-CTGGCATGAACATGACCCTG-3' (서열번호 1)
제1 역방향 프라이머 5'-CTGACCTAAAGCCACCTCCTT-3' (서열번호 2)
제2 qPCR 제2 정방향 프라이머 5'-AGCCAGGAACGTACTGGTGA-3' (서열번호 3)
제2 역방향 프라이머 5'-GCCTCCTTCTGCATGGTATT-3' (서열번호 4)
상기 인큐베이션시킨 반응물 또는 상기 알칼리 용해 후 중화시킨 반응물, 250 nM의 제1 정방향 프라이머, 250 nM의 제1 역방향 프라이머, 및 qPCR Premix(Exiqon)를 혼합하였다. 혼합물을 95℃에서 10 분 동안 인큐베이션시키고, 95℃에서 10 초 및 63℃에서 60 초를 1 사이클로 하여 총 28 사이클을 반복하여 제1 qPCR을 수행하였다.
제1 qPCR 생성물, 50 nM의 제2 정방향 프라이머, 50 nM의 제2 역방향 프라이머, 및 qPCR Premix(Exiqon)를 혼합하였다. 혼합물을 95℃에서 10 분 동안 인큐베이션시키고, 95℃에서 10 초 및 63℃에서 60 초를 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 반복하여 제2 qPCR을 수행하였다.
qPCR은 3회 반복하고 각각의 qPCR의 Cp(crossing point)를 결정하고, 평균 Cp를 산출하였다. 평균 Cp를 표 2에 나타내었다.
시료 용해 방법 평균 Cp
게놈 DNA 60pg 세포 용해 버퍼 2 10.7
세포 용해 버퍼 2 및 프로테이나제 K 10.9
분리된 10개의 세포 세포 용해 버퍼 2 20.3
세포 용해 버퍼 2 및 프로테이나제 K 13.5
알칼리 용해 후 중화 37.4
비드에 캡쳐된 10개의 세포 세포 용해 버퍼 2 및 프로테이나제 K 35.7
알칼리 용해 후 중화 38.5
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 분리된 세포에 대해 세포 용해 버퍼 2 및 프로테이나제 K의 처리는 별도의 정제 과정이 없어도 qPCR 수행시 낮은 Cp를 가졌으나, 비드에 캡쳐된 세포에 대해 세포 용해 버퍼 2 및 프로테이나제 K의 처리는 qPCR 수행시 높은 Cp를 가졌다. 따라서, qPCR에 사용하기 위해 비드에 캡쳐된 세포를 세포 용해 버퍼 2 및 프로테이나제 K의 처리는 qPCR의 증폭 효율이 낮음을 확인하였다.
실시예 3. 소니케이션 또는 가온, 비드의 분리 및 그 다음 프로테이나제 K의 처리에 의한 qPCR 효과
3-1. 소니케이션 , 비드의 분리 및 그 다음 프로테이나제 K의 처리에 의한 qPCR 효과
비드에 캡쳐된 세포를 별도의 정제 과정 없이 qPCR에 사용하기 위하여, 소니케이션, 비드의 분리 및 그 다음 프로테이나제 K의 순서로 처리한 후, qPCR을 수행하였다.
실시예 1에서 준비된 분리된 10개의 세포 또는 비드에 캡쳐된 10개의 세포에 세포 용해 버퍼 2(50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 및 10 mM Tris-HCl(pH8.3)) 또는 세포 용해 버퍼 3(100 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 및 10 mM Tris-HCl(pH8.3))를 첨가하여 최종 부피 10 ㎕로 맞추었다. 혼합물을 상온에서 1 분 동안 소니케이션(sonorex super RK255H, BANDELIN)시켰다. 10 ㎕의 증류수를 소니케이션시킨 반응물에 첨가한 후, 자석을 사용하여 소니케이션시킨 시료로부터 비드를 분리하고, 반응물을 수득하였다. 20 ㎕의 수득된 반응물에 1 ㎍의 프로테이나제 K(Sigma)를 첨가 또는 첨가하지 않고 55℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 음성 대조군으로 세포를 포함하지 않는 시료를 사용하였다.
인큐베이션시킨 반응물을 실시예 2에 기재된 바와 같이 3회 반복하여 qPCR을 수행하고 각각의 qPCR의 Cp를 결정하였다. Cp를 표 3에 나타내었다.
시료 세포 용해 버퍼 프로테이나제 K의 존재 여부 Cp
qPCR 1 qPCR 2 qPCR 3
음성 대조군 세포 용해 버퍼 3 - 34.5
분리된 10개의 세포 세포 용해 버퍼 3 ○ 7.9 8.9 8.9
비드에 캡쳐된 10개의 세포 세포 용해 버퍼 3 ○ 11.3 10.5 10.1
세포 용해 버퍼 2 ○ 16.9 12.8 20.5
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 비드에 캡쳐된 세포에 대해 세포 용해 버퍼 3의 존재 하에서 소니케이션, 비드 분리, 및 프로테이나제 K의 순서로 처리한 반응물은 qPCR을 수행하면 Cp가 낮으므로, 증폭 효율이 우수함을 확인하였다. 따라서, 소니케이션, 비드 분리 및 프로테이나제 K의 순서로 처리하는 방법을 사용하면 qPCR의 증폭 효율이 우수함을 확인하였다.
3-2. 가온, 비드의 분리 및 그 다음 프로테이나제 K의 처리에 의한 qPCR 효과
실시예 3-1과 별도의 방법으로, 가온, 비드의 분리 및 그 다음 프로테이나제 K의 순서로 처리한 후, qPCR을 수행하였다.
실시예 1에서 준비된 비드에 캡쳐된 10개의 세포에 세포 용해 버퍼 3(100 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 및 10 mM Tris-HCl(pH8.3))를 첨가하고, 상온에서 10분, 소니케이션, 50℃에서 10 분, 75℃에서 10 분, 또는 99℃에서 10 분 동안 인큐베이션시켰다. 10 ㎕의 증류수를 반응물에 첨가한 후, 자석을 사용하여 인큐베이션시킨 시료로부터 비드를 분리하고, 반응물을 수득하였다. 20 ㎕의 수득된 반응물에 1 ㎍의 프로테이나제 K(Sigma)를 첨가 또는 첨가하지 않고 55℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 음성 대조군으로 세포를 포함하지 않는 시료를 사용하였다.
인큐베이션시킨 반응물을 실시예 2에 기재된 바와 같이 3회 반복하여 qPCR을 수행하고 각각의 qPCR의 Cp를 결정하였다. 결정된 Cp를 표 4에 나타내었다.
시료 비드 분리 전 처리 프로테이나제 K의 존재 여부 Cp
qPCR 1 qPCR 2 qPCR 3
음성 대조군 상온에서 10분 - 37.0 39.6 36.6
비드에 캡쳐된 10개의 세포 소니케이션 ○ 11.0 9.6 10.3
상온에서 10분 ○ 21.6 18.3 36.6
50℃에서 10분 ○ 35.8 21.5 37.9
75℃에서 10분 ○ 37.8 38.3 37.7
99℃에서 10분 ○ 18.9 38.0 36.6
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 비드에 캡쳐된 세포에 대해 가온, 비드 분리, 및 프로테이나제 K의 순서로 처리한 반응물이 소니케이션시킨 반응물에 비하여 Cp가 높으므로, qPCR의 증폭 효율이 낮음을 확인하였다.
실시예 4. 소니케이션 , 비드의 분리 및 그 다음 프로테이나제 K의 처리의 재현 성 확인
실시예 3-1에 기재된 바와 같이 비드에 캡쳐된 10개의 세포에 대해 소니케이션, 비드의 분리 및 그 다음 프로테이나제 K의 처리하고, qPCR을 수행하였다. 3개의동일한 시료를 4회 qPCR을 수행하여 각각의 qPCR의 Cp를 결정하였다. 결정된 Cp를 표 5에 나타내었다.
시료 Cp
qPCR 번호 qPCR 1 qPCR 2 qPCR 3 qPCR 4
음성 대조군 34.5 37.7 35.0 32.8
비드에 캡쳐된 10개의 세포 반복 1 11.3 11.0 11.7 12.2
반복 2 10.5 9.6 11.0 11.2
반복 3 10.1 10.3 12.2 10.5
평균 Cp 10.6 10.3 11.7 11.3
표준 편차 0.6 0.7 0.6 0.8
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 소니케이션, 비드의 분리, 및 그 다음 프로테이나제 K의 처리에 의한 qPCR은 표준 편차가 낮아 재현성이 우수한 것으로 확인되었다.
<110> SAM SUNG ELECTRONICS <120> Method for amplifying nucleic acids <130> PN101339 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ctggcatgaa catgaccctg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ctgacctaaa gccacctcct t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 agccaggaac gtactggtga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gcctccttct gcatggtatt 20

Claims (15)

  1. 고체 지지체에 특이적으로 결합한 세포에 초음파를 가하여 세포를 용해시키는 단계;
    상기 고체 지지체로부터 세포를 용해시킨 산물을 분리하는 단계;
    상기 분리된 산물에 단백질 분해 효소를 첨가하고 인큐베이션시키는 단계; 및
    상기 인큐베이션시킨 산물을 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포를 용해시키는 단계는 양이온을 포함하는 용액의 존재 하에 세포를 용해시키는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 양이온은 K+, Na+, Mg2 +,또는 이들의 조합인 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 양이온은 50 mM 내지 200 mM인 것인 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 용액은 비-이온성 계면활성제를 더 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 폴리옥시프로필렌 글리콜 알킬 에테르, 글루코시드 알킬 에테르, 폴리옥시에틸린 글리콜 오틸페놀 에테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르, 글리세롤 알킬 에스테르, 폴리소르베이트, 소르비탄 알킬 에스테르, 코카미드, 도데실디메틸아민 옥시드, POEA(polyethoxylated tallow amine), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 지지체는 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 접합된 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당(sugar), 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성(pleckstrin homology: PH) 도메인을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 프로테이나제 K인 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 인큐베이션시키는 단계는 15 내지 65℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA), 또는 이들의 조합에 의한 증폭인 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 증폭은 전체 게놈 핵산 증폭 또는 표적 핵산 증폭인 것인 방법.
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