KR20150007272A - 인삼 열매 추출물을 함유하는 혈행촉진, 혈관신생촉진, 및 허혈성 심질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈행촉진용 조성물, 혈관노화방지용 조성물, 혈관염증치료용 조성물, 혈관생성촉진용 조성물, 허혈성 심질환 치료용 조성물 및 국부 혈류부족 개선 및 치료용 조성물에 관한 발명으로서, 더욱 상세하게는, 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하여 혈관내피세포에서 일산화질소(NO)생성을 촉진시키고, 혈관내피세포의 생존을 증진시키며, 혈관내피세포의 이동성 증가와 혈관튜브생성을 통한 혈관신생을 촉진시키는 조성물에 관한 발명이다.

Description

인삼 열매 추출물을 함유하는 혈행촉진, 혈관신생촉진, 및 허혈성 심질환 치료용 조성물 {Composition for treatment of ischemic heart disease, facilitation of blood circulation and angiogenesis}

본 발명은 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈행촉진용 조성물, 혈관노화방지용 조성물, 혈관염증치료용 조성물, 혈관생성촉진용 조성물, 허혈성 심질환 치료용 조성물 및 국부 혈류부족 개선 및 치료용 조성물에 관한 발명으로서, 더욱 상세하게는, 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하여 혈관내피세포에서 일산화질소(NO)생성을 촉진시키고, 혈관내피세포의 생존을 증진시키며, 혈관내피세포의 이동성 증가와 혈관튜브생성을통한 혈관신생을 촉진시키는 조성물에 관한 발명이다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약으로, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔으며, 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다(최신고려인삼 '성분 및 효능편', 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996).

인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼근(뿌리), 인삼엽 및 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다(Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999). 그 중에서도 인삼 열매는 인삼근(뿌리)과 다른 진세노사이드 성분 함량과 성분을 바탕으로 항당뇨 효능에 있어서 인삼근 보다 우수한 결과를 나타내는 것으로 보고되었다(Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003).

또한 인삼 열매는 예로부터 인삼보다도 귀하게 여겨지는 것으로서 종자 획득을 목적으로 선별되고 수확되어 왔다. 인삼 열매는 인삼의 재배기간 중 4년생에 한해서 1회만 채종하게 되며, 3년생에서 채종하면 종자가 너무 작기 때문에 좋은 묘삼을 생산하기가 어렵고 5년생 이상에서 채종하면 종자는 충실하고 좋으나 인삼뿌리의 비대발육을 억제할 뿐만 아니라 조직이 치밀하지 못하여 홍삼을 제조할 때 홍삼품질이 크게 저하될 수 있다. 또 채종횟수를 재배기간 중에 2회 이상 채종하면 수량 및 홍삼품질이 크게 저하된다(최신고려인삼 '재배편', 한국인삼연초연구원, 130-131, 1996).

한편, 혈액순환에 있어 특히 말초혈액순환은모세혈관의 확장이 필수적이라 할 수 있다. 즉, 혈관에서의 혈류 증가는 반드시 혈관의 확장을 필요로 하는 기작이며, 혈관을 확장시키기 위해서는 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 작용에 의한 NO(nitric oxide)가 관여하게 된다. 따라서 고혈압의 경우에는 NO생성이 감소하는 것이 사실이다(Forete, P. et al., Basal nitric acid synthesis in essential hypertension. Lancet. 1997;349:837-842). 그리고 인간의 노화, 흡연, 고지혈증, 당뇨와 같은 요인들은 혈관에서의 NO생성을 감소시키는 원인으로 작용하게 된다(Crossman, DC. More problems with wndothelium. Q J Med. 1997; 90:157-160).

혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 만들어지는 일련의 과정으로, 혈관을 구성하고 있는 내피세포의 이동(migraition)과 세포간 장벽인 세포외기질(ECM)를 통과하는 침윤(invasion), 증식(proliferation), 혈관으로의분화(tube 생성)의 과정으로 통하여 진행된다(Folkman, J. et al., Angiogenesis. The Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(16), 10931-10934).

생리적 상태의 혈관신생은 태아의 발생, 여성의 월경 및 국소의 산소부족에 따라 한시적으로 일어날 수 있으며, 허혈성 질환이나 골절 등에서는 혈류의 공급이 원활하지 못하여 치료성 혈관신생이 활용되고 있다. 또한 동맥경화에 의한 허혈성 심혈관질환으로 인한 사망률은 전세계적으로 수위를 차지하고 있으며, 최근 국내에서도 급속하게 늘어나고 있다(정진옥 외, 혈관신생 치료법. 대한혈관외과학회지. 2000. 16(2), 265-269).

Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999

본 발명의 목적은 인삼 열매 추출물을 이용하여 혈행을 촉진시키고, 혈관내피세포의 생존을 증진시키며, 혈관내피세포의 이동성을 촉진하여, 혈관내피세포의 관형성을 촉진시켜 혈관 신생을 촉진시키는 조성물을 제공하는 것이다.

이에, 상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 인삼의 지상부인 인삼 열매를 이용한 혈행촉진, 혈관노화억제, 혈관 신생효과를 연구하던 중 인삼 열매 추출물이 일반적인 인삼근 및 홍삼근과는 다른 성분과 조성에 의한 혈관에서의 효능이 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 인삼열매 추출물 함유 조성물을 활용하면, 혈관을 확장시킴으로써 혈행을 촉진하고, 혈관노화를 억제하며, 혈관염증치료, 혈관생성촉진으로 동맥경화, 협심증 및 심근경색과 같은 허혈성 심질환 치료에 이용할 수 있고, 관절염 또는 골절로 인한 국부 혈류부족 개선 및 치료에 이용할 수 있다.

도 1a는 혈관내피세포를 공초점 레이저 현미경으로 찍은 사진이고, 1b는 형광의 밝기를 분석하여 무처리군 대비 형광의 강도로 나타낸 그래프이다.
도 2a는 생존한 혈관내피세포가 증식한 것을 촬영한 것이며, 도 2b는 염색된 혈관내피세포의 흡광도를 측정하여 비교한 것이다.
도 3a는 염색된 혈관내피세포의 이동성을 촬영한 사진이고, 3b는 세포수를 무처리군 대비 이동성으로 나타낸 그래프이다.
도 4a는 고정 염색된 혈관내피세포의 사진이고, 4b는 형성된 관의 길이를 무처리군 대비 관 형성도로 나타낸 그래프이다.
도 5a는 대동맥 혈관주변으로 모세혈관 형태의 새로운 혈관이 뻗어나가는 것을 광학현미경을 이용하여 관찰한 사진이고, 5b는 새롭게 발아, 형성된 혈관의 길이와 개수로 혈관발아(Vessel Sprouting) 촉진효과를 평가한 후 점수로 표기한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 마우스 내에서 혈관신생 모습을 인트라바이탈 형광현미경(intravital fluorescence microscopy)으로 관찰하여 실시간으로 찍은 사진이고, 6b는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 혈관의 변화를 분석하여 변화가 가장 적은 0에서부터 가장 많은 5까지의 점수로 나타낸 그래프이다.
도 7은 LPS로 유도시킨 NO 를 저해하는 효과를 비교하기 위하여 NO 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 마우스 혈액으로부터 NO생성량, 염증인자인 PGE2, TNF-α, IL1-β의 생성량을 확인하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈행촉진용 조성물, 혈관노화방지용 조성물, 혈관염증치료용 조성물, 혈관생성촉진용 조성물, 허혈성 심질환 치료용 조성물 및 국부 혈류부족 개선 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 허혈성 심질환 치료용 조성물에 있어서, 상기 허혈성 심질환은 동맥경화, 협심증 또는 심근경색인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 인삼열매 추출물은, 인삼열매 건조물에 에탄올을 가하여 환류추출, 여과, 농축하고, 지용성 성분을 제거한 후 부탄올을 가하여 추출, 농축하여 제조된 것임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 유효성분으로서 인삼열매 추출물을 함유하며, 혈관내피세포에서의 NO생성을 촉진하여 혈액순환을 원활하게 하고, 혈관내피세포의 생존을 증진시키며, 혈관내피세포의 분화와 이동을 촉진하여, 신혈관 생성을 촉진시키는 조성물을 제공한다.

상기 인삼열매 추출물은 조성물의 형태에 따라 0.01%~100% 비율로 혼합되고, 본 발명의 인삼열매 추출물 함유 조성물은 식품, 의약품의 첨가제로 이용할 수 있다.

의약품에 적용할 경우에는 본 발명에 따른 인삼열매 추출물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화할 수 있다.

경구투여을 위한 제재로서는 정제 (錠劑), 환제 (丸劑), 과립제 (顆粒劑), 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제 (乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 (坐劑) 등을 들 수가 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 활성성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다.

기능성 식품에 적용할 경우에는 본 발명에 따른 인삼열매 추출물을 유효성분으로 하여 당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 적의 선정하여, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제, 과립제, 음료(드링크제), 다이어트바, 쵸콜렛, 카라멜 제형 또는 과자류 제형 등으로 제형화하여 사용할 수 있다. 또한 건강식품에 적합한 기능성원료를 부가적으로 적절하게 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 인삼 열매 추출물 제조

1) 인삼 열매 전처리: 생(生)인삼 열매를 수확하여 종자를 분리하고 제거한 후 인삼 열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 열풍건조를 통하여 인삼 열매 건조원료를 제조하였다.

2) 인삼 열매 추출물 제조: 인삼 열매 건조물 1kg에 에탄올3L를 가하여 환류 추출한 다음 여과한 후 40~45℃에서 감압농축하여 인삼 열매 추출물 300g을 얻었다.

[실시예 2] 인삼 열매 추출물 제조

1) 실시예1에서 얻은 인삼열매 추출물 100g을 물 1L에 용해시키고, 디에틸에테르 500ml을 가하여 분획깔때기를 이용해서 지용성 성분을 제거한다. 그리고 남은 물층에 다시 물포화부탄올 500ml을 가하여 부탄올 층을 3회 반복하여 얻은 후 감압농축하여 인삼열매 추출물(조사포닌)을 60g을 얻었다.

[비교예 1] 인삼근 추출물 제조

상기 실시예 1에서 인삼 열매 대신에 홍삼근(뿌리)을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

[시험예 1] 인삼 열매 추출물과 인삼근의 성분비교

1. 진세노사이드(인삼사포닌)성분 분석

실시예 1 및 비교예 1에서 각각 인삼 열매와 인삼근 추출물을 제조한 다음 이들 추출물에 에테르(ether)를 처리하여 지용성 성분을 제거한 후 부탄올(BuOH)로 조사포닌(crude saponin)을 추출, 농축을 하였다. HPLC를 이용하여 추출된 조사포닌 중 진세노사이드(인삼사포닌) 의 성분분석을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	실시예 1	비교예 1
조사포닌함량 (인삼사포닌 총량) (건조중량)	33.42%	16.70%
PD/PT 비율	0.73	3.23

실시예 1에서 제조한 인삼 열매 추출물은 비교예 1에서 제조한 인삼근 추출물보다 약 2배의 조사포닌 함량을 가진다. 진세노사이드를 PD(Protopanaxadiol)계(진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd) 및 PT(Protopanaxatriol)계(진세노사이드 Re, Rg1 및 Rg2)의 비율로 구분하였을 때에도 각각 0.73과 3.23으로 그 조성에 있어서 인삼 열매와 인삼근은 뚜렷한 차이 및 특징을 나타내었다.

2. 인삼 열매 추출물의 미네랄 성분분석

실시예 1에서 제조한 인삼 열매 추출물은 인삼근과는 다른 '과실'로서, 인삼근에는 거의 함유되어 있지 않은 비타민 및 미네랄 성분을 함유할 것이라고 생각하고 성분분석을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

성분	함량	성분	함량
칼륨(mg/100g)	5865.57	마그네슘(mg/100g)	354.38
칼슘(mg/100g)	819.26	아연(mg/100g)	178.49
철(mg/100g)	59.31	비타민 A (μg/100g, RE )	213.11
인(mg/100g)	187.17	비타민 B1(mg/100g)	12.29
비타민 B2(mg/100g)	8.45	비타민 B6(mg/100g)	10.50
비타민 C(mg/100g)	4.91	비타민 E (mg/100g, α-TE)	23.61
비타민 K(μg/100g)	232.12	나이아신 (mg/100g, NE)	5.76
판토텐산(mg/100g)	5.87	엽산(μg/100g)	349.97

이상과 같이 본 발명에서 사용하는 인삼 열매는 인삼근보다 많은 인삼사포닌을 함유함과 동시에 사포닌 조성의 성질이 매우 다르고, 또한 인삼근과 달리 열매로서 비타민과 미네랄 16 종의 함량이 풍부함을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 혈관에서의 효능에 대한 하기 실험들을 진행하였다.

[시험예 2] 인삼 열매 추출물의 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)에서의 NO생성능

사람의 혈관내피세포에는 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)가 존재하며, 그 활성이 증가하는 것으로 NO(산화질소)를 생성시켜 혈관을 확장시키고, 혈행을 촉진하는 역할을 하게 된다. 사람의 혈관내피세포를 배양한 후 인삼 열매 추출물(실시에 1, 2)과 일반홍삼근 추출물(비교예 1)을 배지에 처리하여 생성되는 NO의 양을 비교하였다.

혈관내피세포는 젤라틴 코팅된 24웰 플레이트에 2.5 x 10⁴ cells/웰의 밀도로 부착시킨다. 세포는 성장배지에서 12시간동안 배양한다. 혈관내피세포는 인삼열매추출물과 일반홍삼근추출물을 처리한 군(실시예 1, 2, 비교예 1), 무처리군으로 12시간동안 전처리한다. 그 후 37℃에서 FBS가 없는 M199 배지에서 10 μmol/L DAF-FM 디아세테이트(Molecular Probe, OR)로 30분동안 처리한다. 이후 혈관내피세포를 FBS가 없는 M199 배지로 3번 씻어준 후, 패럴랠 플레이트 플로우 챔버(parallel plate flow chamber)에 넣고 수은등으로부터분리된 빛으로 자극한다. 여기(excitation) 파장은 488 nm이고 DAF에 NO가 결합되면 515 nm에서 형광을 낸다. 도 1a는 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscope, Atto Bioscience, USA)으로 찍은 사진이고, 1b는 Image-Pro Plus v4.5 소프트웨어(Media Cybernetics, San Diego, CA, USA)로 분석한 형광의 밝기를 무처리군 대비 형광의 강도로 나타낸 그래프이다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 실시예 1, 실시예2의 인삼 열매 추출물은 100 ug/ml 농도에서 무처리군 대비 1300%~2000%의 NO생성정도를 나타내었고, 비교예 1의 일반홍삼근 추출물은 동일한 100 ug/ml 농도에서 100~200%의 NO생성정도를 나타내었다. 특히, 실시예 2의 추출물은 더욱 많은 NO를 생성시켰다. 따라서 인삼열매 추출물은 일반홍삼근추출물에 비하여 혈관내피세포에서의 NO생성능이 월등히 우수하다는 것을 알 수 있다. 실시예 1, 실시예2의 인삼 열매 추출물의 위와 같은 뛰어난NO(산화질소) 생성능은 결국 혈관을 확장시키고 혈액순환을 촉진시키는 효과를 나타낸다.

[시험예 3] 혈관내피세포 생존율 조절효과(cell viability)

혈관의 노화를 억제하고, 혈관을 신생시키는데 있어서 가장 기본적인 단계가 혈관내피세포의 활성을 촉진시키는 것이라 할 수 있다. 양성대조군(VEGF; Vescular endothelial growth factor)과 비교하여 인삼열매 추출물(실시예 1, 2) 처리군에서 혈관내피세포의 생존율이 얼마나 증진되는지를 비교하였다.

혈관내피세포의 생존율은 크리스탈 바이올렛 염색약을 이용하여 측정하였다. 먼저 혈관내피세포를 24 웰에 5 x 10⁴의 세포수로 부착시킨 뒤에 성장배지에서12시간 배양하였다. 다음 1% 혈청이 들어있는 M199 배양액으로 6시간 처리하여 세포분열기를 동일하게 유도하며, 실시예 1, 2를 각각 25, 50, 100μg/mL로 처리하고, 양성대조군을 처리하였다. 그리고 18-24 시간 뒤에 배양액을 걷어내고 살아있는 혈관내피세포만을 염색시키기 위하여 크리스탈 바이올렛 염색약을 300 ㎕ 넣고 30분 정도 상온에서 방치하였다. 그 후 생리활성 완충액 (PBS)으로 2-3 번 씻은 뒤에 1% SDS 용액으로 세포를 분쇄하고 550 nm의 흡광값으로 측정하여 양성대조군과 실시예1, 2를 처리한 군을 비교함으로써 세포의 생존율을 확인하였다.

도 2a는 생존한 혈관내피세포를 촬영한 것이며, 도 2b는 염색된 혈관내피세포의 흡광도를 측정하여 비교한 것이다. 도 2a의 사진결과 및 도 2b의 흡광도값에 의하면, 인삼열매 추출물(실시예 1, 2) 처리군은 무처리군에 비하여 혈관내피세포의생존율을 증진시키고, 살아있는 세포의 증식을 촉진시키는 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 2의 경우 양성대조군인 VEGF보다도 혈관내피세포의 생존을 증진시키고 증식을 촉진시키는 것으로 나타났다. 따라서 인삼열매추출물은 혈관내피세포의 생존율을 증진시키고 증식을 촉진시킴으로써 혈관의 노화를 억제하고 혈관신생을 촉진한다는 것을 알 수 있다.

[시험예 4] 혈관내피세포 이동성 촉진효과 (HUVECs migration)

혈관신생을 측정하는 일반적인 방법 중 하나인 세포 이동성을 측정하고 분석하였다. 세포의 이동성 분석은 Boyden's chamber(트랜스웰)를 이용하였다. 24 웰 플레이트에 각각 600 ul의 혈청이 없는 M199배양액을 넣고, 배양액에 인삼열매추출물(실시예 1, 2를 각각 25, 50, 100μg/mL) 및 양성대조군을 처리한 후, 트랜스웰의 아래쪽 면에 젤라틴(1mg/ml)을 도말하고 위쪽 면에 2x10⁴개의 세포를 부착시켰다. 약 4시간정도의 시간이 경과한 후 위쪽 면에 세포를 면봉을 이용하여 제거하고 아래쪽 면으로 이동한 세포를 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 염색하여 염색된 세포수를 모두 새었다. 도 3a는 염색된 혈관내피세포의 이동성을 촬영한 사진을 나타내고, 3b는 세포수를 무처리군 대비 이동성으로 나타낸 그래프이다.

도 3과 같이 실시예 1, 2는 혈관내피세포의 이동성을 촉진시키는 효과를 나타냈으며, 특히 실시예2의 효과는 양성대조군인 VEGF보다도 우수한 결과를 보였다. 따라서 인삼열매추출물은 혈관신생의 주요 기작인 혈관세포의 이동성을 촉진시킨다고 할 수 있다.

[시험예 5] 혈관내피세포의 관 형성(Tube-formation) 촉진효과

혈관신생 조절을 측정하는 방법으로서 세포가 관 형성을 유도하는 정도를 실험하였다. 일반적으로 세포들의 관 형성능력은 매트리겔(matrigel)을 이용한다. 24 웰 플레이트에 매트리겔 250ul을 도말한 다음 2.5x10⁴개의 세포를 매트리겔 위에 부착시킨다. 일정 시간 간격을 두고 무처리군, 양성대조군(VEGF), 인삼열매추출물 처리군(실시예 1, 2)의 관 형성이 일어나는 것을 관찰하고 적정한 시점에서 세포를 고정 염색하여 관 형성이 일어난 정도를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석하였다. 도 4a는 고정 염색된 세포의 사진이고, 4b는 형성된 관의 길이를 무처리군 대비 관 형성도로 나타낸 그래프이다.

도 4와 같이 실시예 1, 2는 혈관신생의 주요 기작인 세포의 관형성을 촉진시키는 결과를 나타냈으며, 특히 실시에 2는 양성대조군보다도 우수한 효과를 나타내었다.

[시험에 6] 혈관발아(Vessel Sprouting) 촉진효과

혈관신생 조절을 측정하는 방법으로서 혈관으로부터 주위로 발아되는 것을 확인하였다. SD 랫을 사용하여 무처리군, VEGF(vescular endothelial growth factor)처리군, 실시예1, 실시예2 인삼열매 추출물 처리군으로 구분하였다. 랫의 가슴부위를 절개하여 대동맥혈관(Arotic ring)을 얻고 무혈청 DMEM 배지에 보관한 후 각 대동맥 혈관에 대하여 배지에 VEGF와 인삼열매 추출물(실시예 1, 2)을 각각 처리하고 37℃에서 약7일 간 배양하며 혈관이 주변으로 발아되는 것을 관찰하였다. 도 5a는 대동맥 혈관주변으로 모세혈관 형태의 새로운 혈관이 뻗어나가는 것을 광학현미경을 이용하여 관찰한 사진이고, 5b는 새롭게 발아, 형성된 혈관의 길이와 개수로 혈관발아(Vessel Sprouting) 촉진효과를 평가한 후 점수로 표기한 것이다.

도 5와 같이 인삼열매 추출물(실시예 1, 2)은 혈관의 발아를 촉진시키는 효능을 나타내었으며, 특히 실시에 2는 양성대조군보다도 우수한 효과를 나타내었다. 이는 혈관 신성에 대한 효능을 뒷받침하는 결과라고 할 수 있다.

[시험예 7] 혈관신생(Angiogenesis) 촉진효과

1.5% 이소플루란(isoflurane) 용액과 O₂/N₂O를 혼합한 것을 사용하여 약 6~8 주령된 수컷 BALB/c 쥐를 마취시킨다. 마우스의 배부분에 티타늄 재질의 윈도우(직경 19 mm, 내측 직경 14 mm, 두께 0.7 mm)를 단다. 대조군으로서 VEGF 20 ng, 인삼열매추출물(실시예 1, 2)을 각각 매트리겔에 섞은 뒤 윈도우안쪽 조직 안에 삽입하고 커버슬립을 덮고 스냅링으로 고정한다. 혈관신생 정도를 지켜보기 위해 인트라바이탈 형광현미경(intravital fluorescence microscopy)를 이용하여 실시간으로 지켜본다. 4일이 지난 후에 혈관신생 정도를 확인하기 위하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)로 라벨링된 덱스트란(MW 250,000 Sigma Chemical, St. Louis, Missouri)을 25 ㎎/㎖의 농도로 50 ㎕씩 꼬리 정맥으로 주입한다. 도 6a는 인트라바이탈 형광현미경(intravital fluorescence microscopy)인Zeiss Axiovert 200M microscopy (Oberkocchen, Germany)로 블루라이트(440-475 nm, 여기파장 530-550 nm, 방출파장)에서 일렉트론-멀티플라잉CCD 카메라(Photon Max 512; Princeton Instruments, Trenton, NJ)를 이용하여 실시간으로 찍은 사진을 나타내고, 6b는 MetaMorph (Universal Imaging Corp., Downingtown, PA)라는 프로그램을 이용하여 변화를 분석한 것으로서, 변화가 가장 적은 0에서부터 가장 많은 5까지의 점수로 나타낸 것이다.

도 6과 같이 인삼 열매 추출물(실시예 1, 2)은 동물의 새로운 혈관을 생성시키는 효능을 나타내었으며, 특히 실시예2의 경우 양성대조군보다 혈관 신성에서 우수한 효능을 보였다. 이로써 인삼열매 추출물은 혈관 신성을 촉진시키고 결국 허혈성 심혈관 질환, 국부 혈류 개선, 만성혈관염증의 빠른치유에 효과적임을 알 수 있다.

[시험예 8] 인삼열매추출물의 혈관염증조절 효과

1. 대식세포(Macrophage)에 대하여LPS로 유도시킨 NO(산화질소)를 억제하는 효과(in vitro)

인삼 열매 추출물의 항 혈관염증효과를 알아보기 위하여 대식세포(Macrophage)에 대하여 LPS로 유도시킨 NO(산화질소)를 억제하는 실험을 진행하였다.

10% 농도의 혈청을 첨가한 배지에서 5% CO₂ 조건 하에 대식세포(Raw 264.7 cell)를 배양하였다. 96 공 평판배양기에 2x10⁵개의 농도로 자라게 하고, LPS(1 ug/ml)로 자극한 후 실시예1, 실시예2의 인삼 열매 추출물, 및 비교예 1의 홍삼근 추출물을 각각 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 보관한 후 NO생성정도를 측정하여 LPS로 유도시킨 NO 를 저해하는 효과를 비교하였다. NO생성량의 측정은 Griess 반응법(Minghetti, L. et al., 1991, Glia 19. 152-160)을 이용하였고, 그 결과는 도 7에 나타나 있다.

도 7에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 의한 인삼 열매 추출물(실시예 1, 2)은 염증유발인자(Cytokine)로서의 NO생성을 효과적으로 억제하였으며, 그 효과가 홍삼근 추출물(비교예 1)보다 월등히 우수하였다. 특히 실시예 1이 더 우수한 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 의한 실시예 1, 실시예2의 인삼 열매 추출물은 염증반응 조절을 통한 혈관염증완화와 혈관염증으로 인한 협심증과 같은 허혈성 질환에 효과적이라 할 수 있다.

2. 인삼열매 추출물의 혈관염증조절효과 실험(in vivo)

세포수준에서의결과를 바탕으로 동물모델에서 인삼열매추출물의 혈관염증조절 효능에 대하여 실험하였다. 마우스를 실험군당 5마리씩 분류하여, 무처리군, LPS유도군, 실시예1, 실시예2의 인삼열매추출물 처리군으로 구성하였다.

실시예1과 실시예2의 인삼열매 추출물에 대하여 마우스 체중 1kg당 100 mg (1.5 mg/15g 마우스)을 샐라인 용액(0.9% NaCl) 1 mL에 희석한 것을 제1일부터 제 3일까지 3회 복강으로 주사하였다. 제 3일째 주사하고 2시간 뒤 LPS에 대하여 마우스 체중 1kg당 4mg 수준으로 샐라인 용액1mL에 희석한 것을 복강으로 주사하여 염증인자들을 유발시켰다. 약 12시간 뒤 복개 수술하여 심장의 동맥을 절단하여 혈액을 채취하고 -40 ℃에 보관하였다. 혈액은 다시 30분동안 상온에 방치한 후 4 ℃3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 -20 ℃에 보관하였다. 혈액으로부터 NO생성량을 측정하며, 염증인자인 PGE2, TNF-α, IL1-β는 전기영동하여 웨스턴 블랏으로 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8과 같이 인삼열매 추출물(실시예1, 실시예2)은 LPS로 유도되는 염증인자의 생성을 억제하는 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 1이 더 우수한 효과를 나타내었다. 이는 인삼열매 추출물이 혈관염증을 억제하고 허혈성 질환에서의 혈관염증을 조절하는 효과를 나타냄을 뒷받침하는 것이다.

하기에 상기 조성물의 제형예를 설명하나, 이는 발명을 한정하고자 함이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 주사제

실시예 1의 인삼열매 추출물 50 mg, 주사용 멸균 증류수 적량, pH 조절제 적량을 혼합하고, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

[제형예 2] 액제

실시예 2의 인삼열매 추출물 100 mg, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g, 정제수적량을 혼합하고, 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

[제형예3] 연질캅셀제

실시예 1의 인삼열매 추출물 50mg, L-카르니틴 80~140mg, 대두유 180mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 6mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1캡슐당 400mg씩 충진하여 연질캅셀을 제조하였다.

[제형예4] 정제

실시예 2의 인삼열매 추출물 50mg, 갈락토올리고당200mg, 유당 60mg 및 맥아당 140mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester)를 6mg을 첨가하여 타정기로 타정하여 정제를 제조하였다.

[제형예5] 과립제

실시예 2의 인삼열매 추출물 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다.

[제형예6] 드링크제

실시예 1의 인삼열매 추출물 50mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 충진한다. 병에 충진한 후 130℃ 에서 4∼5 초간 살균하여 음료를 제조하였다.

Claims (3)

1. 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하며 NO 레벨을 감소시킴에 따라 허혈성 심질환을 치료하는, 허혈성 심질환 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 인삼열매 추출물은 인삼열매의 에탄올 추출물인, 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 허혈성 심질환은 협심증 또는 심근경색인, 조성물.

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