KR20150004416A - 면역 반응의 조절 - Google Patents

면역 반응의 조절 Download PDF

Info

Publication number
KR20150004416A
KR20150004416A KR20147033632A KR20147033632A KR20150004416A KR 20150004416 A KR20150004416 A KR 20150004416A KR 20147033632 A KR20147033632 A KR 20147033632A KR 20147033632 A KR20147033632 A KR 20147033632A KR 20150004416 A KR20150004416 A KR 20150004416A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sting
cells
dna
nucleic acid
trex1
Prior art date
Application number
KR20147033632A
Other languages
English (en)
Inventor
글렌 엔. 바버
Original Assignee
글렌 엔. 바버
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/460,408 external-priority patent/US20130039933A1/en
Application filed by 글렌 엔. 바버 filed Critical 글렌 엔. 바버
Publication of KR20150004416A publication Critical patent/KR20150004416A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

STING의 조절제는 면역 반응을 상향조절하거나 하향조절할 수 있다. 이러한 조절제의 투여는 대상체에서 직접적으로 또는 다른 제제와 조합하여 질환 또는 다른 원치 않는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

면역 반응의 조절{MODULATING IMMUNE RESPONSES}
정부 권리
본원에 기술된 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인번호 R01A1079336에 따라 미국 정부의 지지로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 가진다.
본 발명의 구현예는 대상체에서 선천성 및 후천성 면역을 조절하기 위한 방법 및 조성물 및/또는 면역 관련 장애, 암, 자가면역의 치료, 감염의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
병원균 침입에 대한 세포성 숙주 방어 반응은 주로 항 병원균 유전자의 유도를 초래하는 병원균 연관 분자 패턴(pathogen associated molecular pattern, PAMP), 예를 들면, 바이러스 핵산 또는 박테리아 세포 벽 구성요소(리포다당류 또는 편모 단백질을 포함함)의 검출을 포함한다. 예를 들어, 바이러스 RNA는 소포체(ER) 및/또는 엔도솜에 존재하는 막에 결합된 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)(예컨대, TLR 3 및 7/8)에 의해서 또는 TLR 독립적인 세포내 DExD/H 박스 RNA 헬리카제(레티노산 유도성 유전자 1(retinoic acid inducible gene 1, RIG-I) 또는 (또한, IFIH1 및 헬리카드(helicard)로도 불리는) 멜라노마 분화 연관 항원 5(melanoma differentiation associated antigen 5, MDA5)이라고 불림)에 의해 검출될 수 있다. 이러한 사건은 결국 상당수가 알려지지 않은 채로 남아있는 하류 신호전달 사건의 활성화에 이르고, I형 IFN을 포함하는 IRF3/7-의존성 유전자 및 NF-κB의 전사를 야기한다.
본 발명의 목적은 면역 반응의 조절하는 방법은 제공하는 것이다.
선천성 면역 반응에서 주요한 역할을 수행하는 분자인 인터페론 유전자의 자극인자(STING)는 주로 소포체(ER) 내에 존재하는 5개의 추정적인 막관통(TM) 영역을 포함하며, I 형 IFG을 유도하고, 발현 후 강력한 항 바이러스 상태를 발휘하는 NF-κB 및 IRF3 전사 경로를 활성화할 수 있다. 미국 특허 출원 일련번호 제13/057,662호 및 PCT/US2009/052767을 참조한다. STING의 소실은 폴리IC가 I형 IFN을 활성화시키는 능력을 감소시키고, 표적화된 상동 재조합에 의해 생성된 STING이 결여되고, 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV) 감염에 걸리기 쉬운 뮤라인 배아 섬유아세포(-/- MEF)를 제공한다. STING의 부재 시, DNA-매개 I형 IFN 반응은 저해되며, STING이 바이러스, 박테리아 및 세포를 감염시킬 수 있는 다른 병원균들로부터 DNA를 인식하는데 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다. 효모 이중 혼성화 및 공동면역침전 연구는 STING이 RIG-I 및 Ssr2/TRAPβ(번역 후 ER 막을 가로지르는 단백질 이동에 요구되는 트랜스로콘-결합 단백질(translocon-associated protein, TRAP) 복합체의 구성원)와 상호작용한다는 것을 나타내었다. TRAPβ의 RNAi 제거는 STING 기능을 저해하고, 폴리IC에 반응한 I형 IFN의 생성을 방해하였다.
추가의 실험은 STING 자체가, 예를 들면 병원균 또는 세포사멸성 DNA로부터의 단일 및 이중 가닥 DNA를 포함하는 핵산에 결합하고, DNA 매개 관절염 및 암과 같은 염증성 병태에서의 전염증성 유전자 발현을 조절하는 데 중심 역할을 수행한다는 것을 보여주었다. STING 발현 또는 기능을 상향조절하는 다양한 새로운 방법 및 STING 발현 또는 기능을 상향조절하기 위한 다양한 새로운 조성물들이 STING과 상호작용하는 다른 세포성 분자들의 추가적인 특성분석과 함께 본원에 기술된다. 이러한 발견은 면역계 및 다른 시스템들을 조절하기 위한 새로운 어쥬번트, 백신 및 치료요법을 설계할 수 있게 한다.
이상 STING 기능과 연관된 장애 또는 질환을 가지는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 방법이 본원에 기술된다. 이러한 방법은 STING 기능을 조절하는 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 임의의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 약학적 조성물의 양은 대상체에서 이상 STING 기능을 개선하는데 유효하다. 제제는 STING 기능을 증가시키거나 감소시키는 소분자 또는 세포내 조건 하에 STING에 결합하는 핵산 분자일 수 있다. STING-결합 핵산 분자는 길이가 40 내지 150 염기쌍인 단일 가닥 DNA 또는 길이가 40 내지 150, 60 내지 120, 80 내지 100 또는 85 내지 95 염기쌍 이상의 이중 가닥 DNA일 수 있다. STING-결합 핵산 분자는, 예컨대, 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드로 제조된 뉴클레아제 저항성일 수 있다. STING-결합 핵산 분자는, 또한, 막관통 수송을 촉진하는 분자와 결합할 수 있다. 이러한 방법에서, 질환 또는 장애는 DNA-의존성 염증성 질환일 수 있다.
또한, 염증성 면역 세포가 침투된 암성 종양을 가지는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 기술된다. 이러한 방법은 STING 기능 또는 발현을 하향조절하는 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 임의의 양을 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 약학적 조성물의 양은 암성 종양에 침투된 염증성 면역 세포의 수를 적어도 50%(예컨대, 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90%, 또는 염증성 세포 침투의 감소가 조직학 또는 스캐닝에 의해 검출가능하게 감소될 때까지) 낮추는데 유효하다.
도 1a 내지 g는 STING 의존성 선천성 면역 신호절단을 나타낸 것이다. 도 1a: 인간 텔로머라제 섬유아세포(hTERT-BJ1)에 다양한 뉴클레오티드(3 μg/ml)를 16시간 동안 형질감염시켰다. 내인성 IFNβ 수준을 측정하였다. hTERT-BJ1 세포에 FITC 접합 dsDNA90를 형질감염시켰고 효율적인 형질감염을 보장하기 위해 형광 현미경으로 검증하였다. 도 1b: hTERT-BJ1 세포에 거짓(mock), 무작위 또는 2종의 독립적인 인간 STING siRNA(siRNA 3 또는 4)를 3일간 형질감염시킨 후, 16시간 동안 dsDNA90 형질감염(3 μg/ml)이 이어졌다. 내인성 IFNβ 수준을 측정하였다. hSTING 단백질의 침묵(silencing)은 면역블롯팅에 의해 입증되었고, β-액틴은 대조군으로서의 역할을 하였다. 도 36c: 1차 STING+/+, STING-/-, STAT1+/+ 또는 STAT1-/- MEF를 3시간 동안 dsDNA90(3 μg/ml)를 이용하거나 이용하지 않고 형질감염시켰다. 유전자 발현에 대한 총 RNA를 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 version 2)로 정제하고 검증하였다. 도 1d: hTERT-BJ1 세포에 NS 또는 STING siRNA를 처리하였다. 3일 후, 세포에 dsDNA90, ssDNA90 또는 ssDNA45(3 μg/ml)를 처리하였다. IFNβ mRNA 수준을 16시간 후에 실시간 RT-PCR로 측정하였다. 도 1e: hTERT-BJ1 세포에 NS 또는 STING siRNA를 처리하였다. 3일 후, 세포에 dsDNA90, ssDNA90 또는 ssDNA45(3 μg/ml)를 처리하였다. 내인성 IFNβ수준을 16시간 후에 측정하였다. 도 1f: 1차 STING+/+, 또는 STING-/- MEF를 dsDNA90(3 μg/ml)를 이용하거나 이용하지 않고 형질감염시켰다. 3 시간 후, 도 1c에서와 동일하다. 도 1g: hTERT-BJ1 세포를 3시간 동안 dsDNA90(3 μg/ml)를 이용하거나 이용하지 않고 처리하였고, 항 HA 항체 및 ER 마커인 칼레티쿨린으로 염색하였다.
도 2a 내지 j는 STING이 DNA에 결합한다는 것을 보여준다. 도 2a: 293T 세포에 지시된 플라스미드를 형질감염시켰다. 세포 용해물을 비오틴-dsDNA90 아가로스로 침전시키고, 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 2b: STING 돌연변이체의 개략도. 도 2c: 도 2a와 동일하다. 도 2d: 도 2a와 동일하다. DNA에 결합할 수 없는 STING 변이체는 적색으로 표지되었다. 도 2e: hTERT-BJ1 세포에 비오틴 접합 dsDNA90(B-dsDNA90; 3 μg/ml)를 6시간 동안 형질감염시키고, DSS로 처리하였다. 용해물을 스트렙트아비딘 아가로스를 사용하여 침전시키고, 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 2f: STING을 293T 세포에 발현시키고, 36시간 후에 용해물을 경쟁자 dsDNA90, 폴리(I:C), B-DNA 또는 ssDNA90 존재 하에 dsDNA90 아가로스와 항온배양하고, 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 2g: 293T 세포에 HA 택이 달린 STING, GFP 또는 TREX1를 형질감염시켰다. 세포를 용해하고, 비오틴 표지된 ssDNA 또는 dsDNA를 스트렙트아비딘 아가로스 비드와 함께 첨가하였다. 침전물을 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 2h: 293T 세포에 IFNβ-루시퍼라제 및 STING-변이체를 형질감염시켰고, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 2i: hTERT-BJ1 세포에 dsDNA90를 형질감염시키고 포름알데하이드로 가교결합시켰다. STING을 침전시키고 결합된 DNA는 dsDNA90 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 검출되었다. NC: 음성 대조군. PC: 양성 대조군, dsDNA90. 도 2j: STING+/+ 또는 STING-/- MEF에 dsDNA90를 형질감염시켰고, 그 다음은 도 2i와 동일하다. 오차 막대는 표준 편차(s.d)를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 3a 내지 3h는 TREX1가 STING 신호전달의 음성 조절인자라는 것을 보여준다. 도 3a: siRNA 처리된 hTERT-BJ1 세포에서 STING 및/또는 TREX1 녹다운을 확인하는 면역블롯. 도 3b: siRNA 처리된 hTERT-BJ1 세포에 dsDNA90(3 μg/ml)을 형질감염시켰다. 내인성 IFNβ 수준을 16시간 후에 측정하였다. *P<0.05. 도 3c: siRNA 처리된 hTERT-BJ1 세포에 HSV-1(m.o.i=1)을 감염시켰고, 바이러스 역가를 측정하였다. *P<0.05. 도 38d: siRNA 처리된 hTERT-BJ1 세포에 γ34.5 결실 HSV 를 감염시켰고, 바이러스 역가를 측정하였다. *P<0.05. 도 3e: STING 녹다운을 확인하는 NS 또는 STING siRNA 처리 TREX1+/+ 또는 TREX1-/- MEF의 면역블롯. 도 3f: siRNA 처리된 TREX1+/+ 또는 TREX1-/- MEF를 dsDNA90으로 처리하였고, IFNβ 수준을 16시간 후에 측정하였다. *P<0.05. 도 3g: siRNA 처리된 TREX1+/+ 또는 TREX1-/- MEF에 HSV-1(m.o.i=1)을 감염시켰고, 바이러스 역가를 측정하였다. *P<0.05. 도 3h: dsDNA90을 이용하거나 이용하지 않고 형질감염된 hTERT-BJ1 세포의 항 TREX1 또는 항 STING 항체를 사용한 면역형광 분석. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 4a 내지 j: 올리고사카릴 트랜스퍼라제 복합체와 결합된 TREX1를 나타낸다. 도 4a는 TREX1의 개략도를 나타낸 것이다. 적색은 RPN1 결합 자리를 나타낸다. 도 4b는 STING의 개략도를 나타낸 것이다. 적색은 DAD1 결합 자리를 나타낸다. 도 4c: 효모 이중 혼성화 분석에서 RPN1은 TREX1와 상호작용한다(1.pGBKT7, 2.pGBKT7-NFAR M9, 3.pGBKT7-TREX1, 4.pGBKT7-STING 전장, 5.pGBKT7-STING C-말단). 도 4d: 293T 세포에 TREX1-tGFP 및 RPN1-Myc을 공동 형질감염시켰다. 용해물을 항 Myc 항체를 사용하여 면역침전시켰고, 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 4h: hTERT-BJ1 세포를 dsDNA90(3 μg/ml)을 처리하거나 처리하지 않았다. 형질감염 6시간 후에, 세포를 항 STING 또는 항 DAD1 항체를 사용한 면역형광으로 검증하였다. 도 4i: 수크로오스 구배 원심분리 후 지시된 항체를 사용한 마이크로솜 분획의 면역블롯 분석. I: 투입. 도 4j: hTERT-BJ1 세포를 TREX1, Sec61A1, TRAPβ, NS 또는 STING siRNA로 처리하였다. 72시간 후, 세포를 dsDNA90(3 μg/ml)로 16시간 동안 처리한 다음, 내인성 IFNβ수준을 측정하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 5a 내지 g는 세포질 DNA가 hTERT-BJ1 세포에서 STING 의존성 유전자를 유도한다는 것을 보여준다. 도 5a: hTERT-BJ1 세포에 STING siRNA를 처리하였다. 3일 후, 세포에 3시간 동안 dsDNA90를 처리하거나 처리하지 않았다. 유전자 발현에 대하여 인간 HT-12_V4_Bead Chip을 사용하여 총 RNA를 정제하고 검증하였다. 도 5b 내지 g: hTERT-BJ1 세포를 도 5a에서와 같이 처리하였다. 총 RNA를 IFNβ(도 5b), PMAIP1(도 5c), IFIT1(도 5d), IFIT2(도 5e), IFIT3(도 5f) 및 PTGER4(도 5g)에 대한 실시간 PCR로 검증하였다. 실시간 PCR을 TaqMan 유전자 발현 검정(Applied Biosystem)을 사용하여 수행하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 6a 내지 h는 STING 의존성 유전자가 MEF에서 세포질 DNA에 의해 유도된다는 것을 보여준다. 1차 STAT1+/+ 또는 STAT1-/- MEF에 dsDNA90, IFNα 또는 dsDNA90를 IFNα와 함께 처리하였다. 총 RNA를 정제하였고, IFNβ(도 6a), IFIT1(도 6b), IFIT2(도 6c), IFIT3(도 6d), CXCL 10(도 6e), GBP1(도 6f), RSAD2(도 6g) 및 CCL5(도 6h)에 대하여 실시간 PCR로 검증하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 7a 내지 h는 세포질 DNA가 MEF에서 STING 의존성 유전자를 유도한다는 것을 보여준다. 도 7a 내지 h에서, STING+/+ 또는 STING-/- MEF에 3시간 동안 dsDNA45, dsDNA90, ssDNA45 또는 ssDNA90를 처리하거나 처리하지 않았다. 총 RNA를 정제하였고, IFNβ(도 7a), IFIT1(도 7b), IFIT2(도 7c), IFIT3(도 7d), CCL5(도 7e), CXCL γ 10(도 7f), RSAD2(도 7g) 또는 GBP1(도 7h)에 대하여 실시간 PCR로 검증하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 8a 내지 d는 STING 국소화 및 이량체화를 보여준다. 도 8a: 안정적으로 STING-HA를 발현하는 MEF에 ssDNA45, dsDNA45, ssDNA90 또는 dsDNA90을 처리하였다. 3시간 후, 세포를 항 HA 또는 항 칼레티쿨린 항체를 사용하여 염색하였다. 도 8b: 293T 세포에 STING-HA 및 Myc-STING을 형질감염시켰다. 용해물을 항 Myc 항체로 침전시키고, 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 8c. hTERT-BJ 1 세포에 가교 결합제 DSS를 처리하거나 처리하지 않았다. 세포 용해물은 항 STING 항체를 사용한 면역블롯을 거쳤다. 도 8d: 293T 세포를 지시된 플라스미드로 형질감염시키고, DSS를 처리하였다. 세포 용해물을 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다.
도 9a 내지 i는 DNA 바이러스가 MEF에서 STING 의존성 유전자를 유도한다는 것을 보여준다. 도 9a: MEF는 γ34.5 결실 HSV(m.o.i.= 1)로 3시간 동안 감염되었다. 유전자 발현에 대한 총 RNA를 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 version 2)를 사용하여 정제하고 검증하였다. 도 9b 내지 i: STING+/+, STING-/- 또는 STAT-/-/STING+/+ MEF를 dsDNA90, HSV 또는 γ34.5 결실 HSV로 3시간동안 처리하거나 처리하지 않았다. 총 RNA를 정제하였고, IFNβ(도 9b), IFIT1(도 9c), IFIT2(도 9d), IFIT3(도 9e), CCL5(도 9f), CXCL 10(도 9g), RSAD2(도 9h) 또는 GBP1(도 9i)에 대하여 실시간 PCR로 검증하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 10a 내지 f는 STING이 IRF3/7 및 NFκ-B와 상호작용한다는 것을 나타낸다. 도 10a: STING 의존성 dsDNA90 자극 유전자의 프로모터 영역 내 IRF7 결합 자리. 도 10b 내지 d: 핵산 추출물이 거짓(mock) 처리 또는 dsDNA90 처리 STING+/+ 또는 STING-/- MEF로부터 단리되었고, 제조자의 지침에 따라 IRF3(도 10b), IRF7(도 10c) 및 NF-κB (도 10d) 활성화에 대하여 검증되었다. 핵산 추출 키트, TransAM IRF3, TransAM IRF7 및 TransAMNFκB 패밀리 Elisa 키트는 Active Motif로부터 왔다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다. 도 10e: STING+/+ 또는 STING-/- MEF를 폴리(I:C)로 처리하였다. dsDNA90 또는 HSV1 및 세포를 항 IRF3 항체로 염색하였다. 도 10f. STING+/+ 또는 STING-/- MEF를 dsDNA90 또는 HSV1으로 처리하였고, 세포를 항 p65 항체로 염색하였다. STING의 소실은 폴리(I:C) 매개 선천성 면역 신호전달에 영향을 미치지 않았다.
도 11a 내지 f는 시험관 내에서 STING이 DNA에 결합한다는 것을 보여준다. 도 11a: 시험관 내 번역 생성물을 비오틴 접합 dsDNA90으로 침전시키고 항 HA 항체로 면역블롯팅하였다. 도 11b: STING 변이체의 개략도. 도 11c, 11d: 도 11a와 동일하다. 아미노산 242 내지 341(적색)이 결여된 STING 변이체는 DNA에 결합하는데 실패하였다. 도 11e 및 f: 시험관 내 번역 생성물을 비오틴 접합 ssDNA90으로 침전시키고 항 HA 항체로 면역블롯팅하였다.
도 12a 내지 g는 생체 내 및 시험관 내에서 STING이 DNA에 결합한다는 것을 보여준다. hTERT BJ1 세포에 비오틴-dsDNA90을 형질감염시키고 UV에 의해 가교결합시켰다. 세포를 용해하고 스트렙트아비딘 아가로스로 침전시키고, 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 12b 및 c hTERT-BJ1 세포를 IFI16(도 12b) 또는 STING(도 12c) siRNA로 처리한 다음, 도 12a에서와 동일하게 하였다. 도 12d: STING+/+ 또는 STING-/- MEF를 도 12a에서와 같이 처리하였다. 도 12e: STING-Flag을 발현하는 293T 세포를 비오틴- dsDNA90로 처리하거나 처리하지 않고, DSS에 의해 가교결합시켰다. 용해물을 침전시키고 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 12f: 293T 세포에 dsDNA90 또는 ssDNA90을 형질감염시키고 UV 또는 DSS로 가교결합시킨 다음, 침전시키고 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 12g: STING-Flag 발현 293T 세포를 용해하였고 ds0NA90 또는 Poly(I:C) 및 비오틴-dsDNA90 아가로스와 함께 항온배양하였고, 그 다음은 도 12e와 동일하다.
도 13a 내지 c는 STING이 바이러스 DNA에 결합한다는 것을 보여준다. 도 13a: HSV, 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 아데노바이러스(ADV)의 올리고뉴클레오티드 서열. 도 13b 및 c: 293T 세포에 지시된 플라스미드를 형질감염시켰다. 세포 용해물을 비오틴-dsDNA90, 비오틴-HSV DNA 120 머(mer), 비오틴-ADV DNA 120 머 또는 비오틴-CMV DNA 120 머 아가로스로 침전시켰고, 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다.
도 14a 내지 c는 STING이 DNA에 결합한다는 것을 보여준다. 도 14a: STING ELISA의 개략도. 도 14b: STING ELISA의 일 구현예의 과정. 도 14c: dsDNA90의 결합능을 ELISA로 측정하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 15a 내지 d는 TREX1가 STING 신호전달의 음성 조절인자라는 것을 보여준다. 도 15a: hTERT-BJ1 세포에 TREX1, STING 또는 STING 및 TREX1 siRNA를 처리하였다. 3일 후, 세포에 HSV-Luc(m.o.i=1)를 48시간 동안 감염시켰다. 용해물의 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 15b: 1차 TREX1+/+ 또는 TREX-/- MEF에 NS 또는 STING siRNA를 형질감염시켰다. 3일 후, 세포에 HSV-Luc(m.o.i =1)를 48시간 동안 감염시켰다. 용해물을 측정하였다. 도 15c: 1차 TREX1+/+ 또는 TREX1-/-MEF에 야생형 TREX1을 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포에 HSV를 감염시켰고, HSV 복제를 측정하였다. TREX1 발현을 면역블롯팅으로 확인하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다. 도 15d: STING+/+, 또는 STING-/- MEF에 3시간 동안 dsDNA90를 처리하거나 처리하지 않았다. 유전자 발현에 대한 총 RNA를 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 version 2)로 정제하고 검증하였다.
도 16은 STING이 TREX-/- MEF에서 ssDNA90 매개 IFNβ 생성을 조절한다는 것을 보여준다. siRNA 처리된 TREX1+/+ 또는 TREX1-/- MEF에 ssDNA45 또는 ssDNA90을 처리하였고, IFNβ 수준을 16시간 후에 측정하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 17a 내지 h는 TREX1가 STING 의존성 유전자의 음성 조절인자가 아니라는 것을 보여준다. 도 17a: TREX1+/+ 또는 TREX1-/- MEF에 HSV1, IFNα, dsDNA90, 삼인산화 RNA(TPRNA) 및 VSV를 처리하였다. TPRNA 및 VSV는 IFN 유도 유전자를 약하게 활성화시켰다. 유전자 발현에 대한 총 RNA를 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 version 2)로 정제하고 검증하였다. 도 17b 내지 h: IFNβ(도 17b), IFIT1(도 17c), IFIT2(도 17d), IFIT3(도 17e), CCL5(도 17f), CXCL 10(도 17g), RSAD2(도 17h)에 대하여 총 RNA를 실시간 PCR로 검증하였다. TREX1 결여 세포에서 IFN 유도 유전자에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 18a 내지 d는 TREX1이 올리고사카릴 트랜스퍼라제 복합체와 결합된다는 것을 나타낸다. IFN 처리된 hTERT cDNA 라이브러리를 효모 이중 혼성 라이브러리(AH109)를 개발하기 위해 사용하였다. 전장 TREX 1를 라이브러리를 선별하기 위한 미끼로 사용하였다. 대략 5백만종의 cDNA를 발현하는 효모를 선별하였다(Clontech). 3회의 독립적인 효모 메이팅 절차로부터 44개의 클론을 단리하였다. RPN1은 총 8회 단리되었다(선별 1에서 3회, 선별 2에서 2회 및 선별 3에서 3회). RPN1 이외에, 대다수의 클론은 재시험 후 IREX1과 상호작용하는 데 실패하였다. 이러한 8개의 RPN1 단리 클론 중, 4개의 클론은 아미노산 258 내지 397, 2개의 클론은 아미노산 220 내지 390 및 2개의 클론은 아미노산 240 내지 367을 암호화하였다. TREX1 변이체를 생성하였고, TREX1(아미노산 241 내지 369) 및 RPN 1(아미노산 256 내지 397) 사이의 상호작용을 맵핑하였다. DAD1을 단리하기 위해, STING의 C 말단 영역(아미노산 173 내지 379)을 사용하여 동일한 라이브러리를 선별하였다. 24개의 클론이 단리되었고, 전장 DAD I이 2회 발견되었다. DAD1 이외에, 대다수의 클론은 재확인 연구 후 STING과 상호작용하는 데 실패하였다. 전장 DAD1은 STING의 242 내지 310 영역에 결합하는 것으로 나타났다. 도 18a: TREX1 돌연변이체의 개략도. 도 18b: 효모 이중 혼성화 선별에서 TREX1 또는 TREX1 내지 4에 융합된 GAL4 결합 도메인은 GAL4 활성화 도메인에 융합된 RPN1과 상호작용한다. 도 18c: STING 돌연변이체의 개략도. 도 18d. 효모 이중 혼성화 선별에서 STING-C-말단 또는 STING-C2에 융합된 GAL4 결합 도메인은 GAL4 활성화 도메인에 융합된 DAD1과 상호작용한다.
도 19a 내지 c는 TREX1 및 STING이 올리고사카릴 트랜스퍼라제 복합체와 결합한다는 것을 나타낸다. 도 19a: 293T 세포에 TREX1-tGFP 및 RPN1-Myc을 공동 형질감염시켰다. 용해물을 항 tGFP 항체 또는 IgG 대조군으로 면역침전시켰고, 지시된 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 19b: 293T 세포에 Myc-STING 또는 GFP-DAD1를 공동 형질감염시켰고 세포를 용해하였다. 용해물을 항 Myc 항체 또는 IgG 대조군으로 면역침전시켰고, 항 GFP를 사용한 면역블롯팅하였다. 도 19c: 293T 세포에 TREX1-tGFP 및 RPN1-Myc, GFP-DAD1 또는 STING-HA를 공동 형질감염시켰다. 용해물을 항 tGFP 항체 또는 IgG 대조군으로 면역침전시켰고, 항 tGFP, 항 Myc, 항 GFP 또는 항 HA 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다.
도 20은 TREX1이 소포체에 국소화된다는 것을 보여준다. hTERT-BJ1 세포에 RPN1-Myc을 형질전환시켰다. 48시간 후, 세포를 항 TREX1 항체(적색), 항 Myc 항체(녹색) 또는 소포체 마커로서 항 칼레티쿨린 항체(청색)를 사용한 면역형광으로 검증하였다.
도 21a 내지 h는 293T 세포에 외인성으로 발현된 STING이 dsDNA90 반응을 재구성한다는 것을 나타낸다. 도 21a: 293T 세포에 대조군 렌티바이러스 또는 hSTING 렌티바이러스를 감염시켰다. 감염 1일 후, 세포에 dsDNA90을 처리하였다. 6시간 후, 세포를 항 STING 또는 항 칼레티쿨린 항체를 사용하여 염색하였다. 도 21b: (도 56a로부터) 세포 용해물은 항 STING 항체를 사용한 면역블롯을 거쳤다. 도 21c 및 d: 렌티바이러스가 감염된 293T 세포를 6시간 동안 dsDNA90으로 자극하였다. 총 RNA를 정제하였고, IFNβ(도21c) 또는 IFIT2(도 21d)에 대하여 실시간 PCR로 검증하였다. 도 21e: 대조군 또는 hSTING 렌티바이러스로 안정적으로 형질도입된 293T 세포는 순서도에 나타낸 바와 같은 Brefeldin A(BFA) 실험을 거쳤다. 도 21f: (도 21e로부터의) 세포 용해물은 항 STING 항체를 사용한 면역블롯을 거쳤다. 도 21g: (도 21e로부터의) 세포 용해물의 IFNβ 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 21h: 1차 STING-/- MEF에 대조군 또는 mSTING를 안정적으로 형질도입시켰다. 세포에 dsDNA90을 처리하였고, 내인성 IFNβ 수준을 ELISA로 측정하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 22는 트랜스로콘 구성원이 HSV1 복제를 조절한다는 것을 나타낸다. hTERT-BJ1 세포에 TREX1, Sec61A1, TRAPβ, NS 또는 STING siRNA를 처리하였다.
도 23a 내지 c는 hTER-BJ1 세포에서 dsDNA90에 의한 IFN 생성에 IFI16가 요구되지 않는다는 것을 보여준다. 도 23a: hTERT-BJt 세포에 NS, IFI16, STING 또는 TREX1 siRNA를 처리하였다. 3일 후, 세포를 용해하였고, 면역블롯팅으로 발현 수준을 확인하였다. 도 23b: siRNA 처리된 hTERT-BJ1 세포를 dsDNA90으로 자극하였고, IFNβ 생성을 ELISA로 측정하였다. 도 23c: siRNA 처리된 hTERT-BJ1 세포에 HSV-루시퍼라제(m.o.i=0.1)를 감염시켰다. 감염 2일 후, 세포를 용해하였고, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. *P<0.05, 스튜던트 티 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 적어도 2번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 24는 STING 세포 기반 검정의 일 구현예를 나타낸 것이다.
도 25는 약물 "A"가 STING 이송을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 26은 약물 "X"가 IFNβ mRNA 생성을 저해한다는 것을 나타낸 것이다.
도 27은 STING이 세포질 DNA에 반응하여 인산화된다는 것을 보여주는 개략도이다. hTERT-BJ1 세포에 4 μg/ml의 ISD를 6시간 동안 형질감염시켰다. 세포 용해물을 TNE 완충액 내에 준비한 다음 항 STING 항체로의 면역침전을 거친 후 SDS-PAGE가 이어졌다. 겔을 CBB로 염색한 다음 STING를 포함하는 밴드를 mLC/MS/MS로 하버드 질량 분석 및 프로테오믹스 자원 실험실(Harvard Mass Spectrometry and Proteomics Resource Laboratory)에서 분석하였다. 상이한 종으로부터의 STING 아미노산 서열의 정렬 및 질량 분석에 의해 식별된 인산화 자리. 세린 345, 358, 366, 및 379가 질량 분석에 의해 식별되었다. 세린 358 및 S366은 STING 기능에 중요하다.
도 28은 STING의 세린 366(S366)이 세포질 DNA 경로에서 IFNβ 생성에 중요하다는 것을 나타낸다. 293T 세포에 돌연변이 STING을 암호화하는 플라스미드 및 리포터 플라스미드를 형질감염시켰다. 36시간 후, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. STING-/- MEF 세포를 돌연변이 STING으로 재구성한 다음, 배양 배지 내 IFNβ의 양을 ELISA로 측정하였다. S366은 STING에 의한 IFN 생성에 중요하고, S358도 또한 중요한 역할을 수행할 수 있다.
도 29a 내지 d는 STING 결핍 마우스가 DMBA 유도 염증 및 피부 종양형성에 저항성이라는 것을 나타낸다: STING+/+ 및 STING-/- 마우스의 면도된 등에 20주간 매주 아세톤으로 거짓 처리하거나 10 μg의 DMBA를 처리하였다. 도 29a: STING 결핍 동물은 피부 암을 유발하는 DNA 손상제에 대하여 저항성이다. 피부 종양이 없는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 곡선으로 나타냈다. 도 29b: 각 치료군의 대표적인 마우스의 사진을 나타내었다. 도 29c: 조직병리학적 검증을 거짓 또는 DMBA 처리된 피부/피부 종양 생검에 대하여 H&E 염색으로 수행하였다. 영상은 20X 배율로 취득되었다. 도 29d: 발암물질에 노출된 STING 발현 마우스에서의 사이토카인 상향조절. 거짓 또는 DMBA 처리된 피부/피부 종양 생검으로부터 추출된 RNA를 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 version 2)으로 2회 분석하였다. 총 유전자 발현을 분석하였다. 대부분의 가변 유전자를 선택하였다. 행은 개별적인 유전자를 나타내고; 열은 개별적인 시료를 나타낸다. 의사 색채(pseudo-color)는 평균보다 낮거나, 동일하거나, 높은 전사 수준(각각, 녹색, 흑색 및 적색)을 나타낸다. 유전자 발현; 10로그 스케일로 -5 내지 5 사이의 배수 변화. STING 결핍 동물의 피부에서 어떠한 사이토카인도 관찰되지 않았다.
이상 STING 기능과 연관된 장애 또는 질환을 가지는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기술된다. 하기에 기술된 바람직한 구현예들은 이러한 조성물들 및 방법들의 적응을 예시한 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 구현예의 설명으로부터, 하기에 제공된 설명에 기반하여 본 발명의 다른 양태들이 만들어질 수 있고/있거나 실시될 수 있다.
이상 STING 기능과 연관된 장애 또는 질환을 가지는 대상체(예컨대, 인간 개체, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 돼지 등)에서 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 조성물은 STING 기능을 조절하는 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함하되, 약학적 조성물의 양은 대상체에서 이상 STING 기능을 개선하는데 유효하다.
이상 STING 기능에 연관된 장애 또는 질환은 결핍된 STING 기능 또는 발현을 가지는 세포가 질환 또는 장애의 신체적 증상을 유발하거나 악화시키는 임의의 경우가 될 수 있다. 흔히, 이러한 질환 또는 장애, 예컨대, 염증성 병태, 자가면역 병태, 암(예컨대, 유방, 결장, 전립선, 난소, 백혈병, 폐, 자궁 내막 또는 간암), 죽상동맥경화증, 관절염(예컨대, 골관절염, 또는 류마티스성 관절염), 염증성 창자병(예컨대, 궤양대장염, 또는 크론병), 말초 혈관 질환, 뇌혈관 사고(발작), 만성 염증성 질환이 존재하는 곳, 염증성 세포 침투를 가지는 병변을 특징으로 하는 곳, 뇌의 아밀로이드-플라크가 존재하는 곳(예컨대, 알츠하이머 질환), 에이카르디-고우티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres syndrome), 소아 관절염, 골다공증, 근위축측삭경화증, 또는 다발성 경화증은 면역계 세포에 의해 매개된다.
제제는 STING 기능 또는 발현을 증가시키거나 낮추는 소분자(즉, 500, 1000 또는 2000 달톤 미만의 분자량을 가지는 유기 또는 무기 분자) 또는 세포 내 조건 하에 (즉, STING이 보통 국소화되는 세포 내 조건 하에) STING에 결합하는 핵산 분자일 수 있다. 제제는 또한 단일 가닥(ss) 또는 이중 가닥(ds) RNA 또는 DNA일 수 있는 STING에 결합된 핵산 분자일 수 있다. 바람직하게, 핵산은 길이가 40 내지 150, 60 내지 120, 80 내지 100, 또는 85 내지 95 염기쌍 이상이다. STING-결합 핵산 분자는, 예컨대, 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드로 제조되거나 환형 디뉴클레오티드 형태인 뉴클레아제 저항성일 수 있다. STING-결합 핵산 분자는, 또한, 막관통 수송을 촉진하는 분자와 결합할 수 있다.
염증성 면역 세포가 침투된 암성 종양을 가지는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물은 STING 기능 또는 발현을 하향조절하는 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함하되, 약학적 조성물의 양은 암성 종양에 침투된 염증성 면역 세포의 수를 적어도 50%(예컨대, 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90%, 또는 염증성 세포 침투의 감소가 조직학 또는 스캐닝에 의해 검출가능하게 감소될 때까지) 낮추는데 유효하다.
본원에 기술된 조성물은 경구, 직장, 질, 국소, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 흡입, 척추강내 및 비강 내 투여를 포함하는 다양한 경로로 투여될 수 있는 약학적 조성물을 제조하기 위해 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 제형은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed (1985))에 밝혀져 있다.
유효 성분(들)은 부형제와 혼합되고/되거나, 부형제에 의해 희석되고/되거나 캡슐, 사세(sachet), 종이 또는 다른 용기의 형태일 수 있는 담체 안에 동봉될 수 있다. 부형제가 희석제로서의 역할을 할 때, 부형제는 유효 성분에 대한 비히클, 담체, 또는 매질로서 작용할 수 있는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 조성물은 정제, 알약, 분말, 당과(lozenge), 사세, 카시에(cachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, (고체 또는 액체 매질 내) 에어로졸, 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 멸균 주사 용액, 비강 내 투여를 위한 멸균 액체(예컨대, 스프레이 디바이스), 또는 멸균 포장된 분말의 형태일 수 있다. 제형은 추가적으로 다음을 포함할 수 있다: 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 유화제 및 현탁제; 메틸- 및 프로필하이드록시-벤조에이트와 같은 보존제; 감미제; 및 향미제. 본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 절차들을 채용함으로써 환자에게 투여 후 유효 성분의 빠르거나, 지속되거나 지연되는 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
정제와 같은 고체 제형을 제조하기 위해, 조성물은 약학적 부형제와 혼합되어 화합물의 균일한 혼합물을 함유하는 고체 전제형 조성물을 형성할 수 있다. 정제 또는 알약은 코팅되거나 아니면 화합되어 장기적인 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 하나의 내부 투여 및 하나의 외부 투여 구성요소를 포함할 수 있고, 후자는 전자를 둘러싸는 외피의 형태이다. 2개의 구성요소는 장용층에 의해 분리될 수 있고, 장용층은 위에서는 분해에 대한 저항성을 제공하고, 내부 구성요소가 완전한 상태로 십이지장을 통과하거나 방출이 지연되도록 할 수 있다. 이러한 장용층 또는 코팅을 위해 다양한 물질들이 사용될 수 있는데, 이러한 물질들은 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 이러한 물질들(셀락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트)의 혼합물을 포함한다.
액체 형태의 제형은 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 혈청 반감기를 향상시키기 위해, 제형이 캡슐화되거나, 리포솜의 루멘 내로 도입되거나, 콜로이드로 제조되거나, 리포솜의 층 내에 혼입될 수 있다. 예컨대, 각각이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호(Szoka, et al.)등에 기술된 바와 같은 리포솜을 제조하기 위한 다양한 방법들이 사용가능하다.
조성물은 바람직하게는 유효 성분(들)의 단위 투여 형태로 제형화된다. 환자에게 투여되는 양은, 무엇이 투여될 것인지, 투여의 목적(예를 들면, 예방 또는 치료), 환자의 상태, 투여의 방식 등에 따라 달라질 것이고, 이러한 모든 것은 자격 있는 의사 또는 약사의 기술 내이다. 치료적 적용에서, 조성물은 이미 질환으로 고통 받고 있는 환자에게 질환 및 그 합병증의 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 중지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 용도에 유효한 양은 치료될 질환의 병태뿐만 아니라 증상의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 일반적인 병태 등과 같은 인자들에 따른 담당 임상의의 판단에 의존할 것이다.
본원에 언급된 모든 문헌들은 참조로서 본원에 포함된다. 본 출원에서 인용된 모든 간행물들 및 특허 문헌들은 개별적인 간행물 또는 특허 문헌들이 참조로서 포함되도록 개별적으로 나타낸 것과 같은 정도로 사실상 참조로서 포함된다. 본 문헌에서 다양한 참조들의 인용에 의해, 출원인들이 임의의 특정한 참조를 그들의 발명에 대한 "선행 기술”로 인정하는 것은 아니다. 본 발명의 조성물들 및 방법들의 구현예들이 하기 실시예에 예시된다.
실시예
실시예 1: 트랜스로콘에 결합된 STING은 선천성 면역을 조절하기 위해 세포질 DNA와 복합체를 이룬다
이전에, 섬유아세포, 대식세포 및 수지상세포(DC)에서 세포질 dsDNA뿐만 아니라 DNA 바이러스 및 세포내 박테리아에 대한 I형 IFN의 생성에 필수적인 것으로 입증된 소포체(ER)의 새로운 막관통 구성요소(인터페론 유전자의 자극인자(STING)로 불림)의 단리가 기술되어 있다(미국 특허 출원 일련번호 제13/057,662호 및 PCT/US2009/052767을 참조한다). 뮤라인 세포에서 STING 의존성 I형 IFN 신호전달의 활성화에 요구되는 dsDNA의 최소 크기는 뮤라인 세포에서 대략 45 염기 쌍인 것으로 알려져 있다. 그러나, 정상 인간 세포(hTERT)에서는, 대략 90 염기 쌍의 dsDNA(본원에서, 인터페론 자극 dsDNA90으로 지칭됨)가 I형 IFN을 완전히 활성화시키기 위해 요구되었다. RNAi 녹다운 절차를 사용하여, STING이 실제로 hTERT에서 I형 IFN의 생성에 필수적이라는 것을 추가적으로 확인하였다(도 1b). mRNA 발현을 측정하기 위해 마이크로어레이 절차를 사용한 추가의 분석은 세포질 dsDNA가 hTERT 세포에서 I형 IFN에 더하여 다수의 선천성 면역 유전자를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다(도 5a 내지 g). IFIT 패밀리의 구성원을 포함하는 이러한 선천성 분자의 유도는 STING 의존성인 것으로 보이는데, 이는 hTERT에서 STING의 RNAi 녹다운이 세포질 dsDNA에 의한 그들의 자극을 상당히 제거하기 때문이다(도 5a 내지 g). STING 의존 방식으로 세포질 dsDNA로 유도된 다양한 선천성 면역 유전자들을 STING+/+ 또는 -/- 뮤라인 배아 섬유아세포(MEF)를 사용하여 확인하였다(도 1c). 이러한 mRNA 유도는 STING 의존성 유전자(SDG)로, I형 IFN 의존성 자가분비 또는 측분비 신호전달을 통해 자극되는 것이 아니라는 것을 확인하기 위해, I형 IFN 신호전달이 결손된 STAT1-/- MEF에 dsDNA를 유사하게 처리하고, SDG의 생성량이 영향 받지 않은 채로 남아있다는 것을 확인하였다(도 1c). 역전사효소(RT)-PCR 분석은 어레이 결과를 확인하였다(도 6a 내지 h 및 7a 내지 h). 45개의 뉴클레오티드의 ssDNA(ssDNA45)는 hTERTS에서 선천성 면역 유전자 생성량을 약하게 유도하였고, MEF에서는 더 약하게 유도하였다는 것을 알게 되었다. 그러나, 90개의 뉴클레오티드를 포함하는 형질감염된 ssDNA(ssDNA90)가 hTERT 세포에서 I형 IFN을 포함하는 다수의 유전자를 더욱 강하게 활성화시키는 것이 관찰되었다(도 1d, 1e). 이러한 STING 의존 방식으로 세포질 ssDNA90으로 유도된 선천성 면역 유전자들의 생성량은 유사하게 STING +/+ 또는 -/- 뮤라인 배아 섬유아세포(MEF)를 사용하여 확인하였다(도 1f 및 7a 내지 h). STING은 인간 및 뮤라인 세포의 ER에 동형이량체로서 존재하고, I형 IFN 의존성 전사 인자를 활성화시키기 위해 세포질 ssDNA 또는 dsDNA 리간드의 존재 하에 ER로부터 핵주위 영역으로 이동할 수 있다는 것이 관찰되었다(도 1g 및 8a 내지 8e). HSV1도 유사하게 STING 의존 방식으로 선천성 면역 유전자 생성을 활성화시키는 것으로 관찰되었다(도 9a 내지 i). SDG 중 다수가 IRF7 결합 자리를 그들의 프로모터 영역 내에 함유한다는 것을 확인하였다(도 10a 내지 f). 따라서, 형질감염된 플라스미드 DNA를 포함하는 세포질 ssDNA 또는 dsDNA는 STING 의존성인 다수의 선천성 면역 관련 유전자의 전사를 강하게 유도할 수 있다.
STING 그 자체가 DNA 종들과 결합될 수 있는 가능성을 추가로 평가하기 위해, 293T 세포에 STING을 형질감염시키고, 세포 용해 후, STING의 C-말단 영역(아미노산 181 내지 349)이 비오틴 표지된 dsDNA90을 이용하여 침전될 수 있다는 것을 관찰하였다(도 2a). STING의 N 말단 영역(아미노산 1 내지 195) 및 3종의 유사한 HA 택이 달린 대조군(GFP, NFAR1 및 IPS1)은 dsDNA90과 결합하지 않았다. DNA 결합 엑소뉴클라제 TREX1은 양성 대조군 역할을 하였다. 일련의 추가의 집중 연구는 STING의 아미노산 영역 242 내지 341이 dsDNA 결합에 책임이 있을 수 있다는 것을 나타내는데, 이는 이러한 영역이 결여된 STING 변이체가 핵산과 결합하는데 실패하였기 때문이다(도 2b 내지 d). (유사하게 242 내지 341 영역이 결여된 변이체들을 제외하고) 시험관 내에서 발현된 STING도 또한 고염 및 높은 세제 조건 하에 dsDNA에 결합하였다(도 11a 내지 f). 이량체처럼 STING이 dsDNA와 복합체를 형성할 수 있다는 추가적인 증거가 비오틴으로 표지된 dsDNA90을 hTERT에 형질감염시키고 이러한 세포를 가역적인 가교결합제(DSS) 또는 UV 빛으로 처리함으로써 얻어졌다. 두 가지의 처리 사례 모두에서 STING은 세포 용해 후 DNA와의 결합을 유지하는 것으로 관찰되었다(도 2e 및 도 12a 내지 g). hTERT 세포에서 STING의 RNAi 녹다운은 관찰된 결합을 제거하였고, STING-DNA 복합체는 또한 야생형 MEF(+/+)에서만 관찰되었고, STING(-/-) 결여된 MEF에서는 관찰되지 않았다(도 12a 내지 g). 유사하게, HSV1, 사이토메갈로바이러스(CMV) 뿐만 아니라 아데노바이러스(ADV) 관련 dsDNA 경쟁 실험은 STING이 또한 dsDNA뿐만 아니라 ssDNA(ssDNA90)에도 결합할 수 있지만 dsRNA에는 결합하지 않는다는 것을 시사한다는 것을 확인하였다(도 2f). 이는 STING을 시험관 내에서 발현시키고 ssDNA90과의 결합을 관찰함으로써 확인되었다(도 2g). 293T 세포에서 분석된 모든 STING 변이체들은 IFN 프로모터 유형을 활성화시키는 능력이 결여되었다(도 2h). dsDNA는 또한 hTERT 또는 MEF 세포에 형질감염되었고, 세포성 단백질을 핵산에 가교결합시키기 위해 포름알데하이드를 처리하였다. STING 풀 다운(pull down) 후 이어지는 CHIP 분석에서, dsDNA90 특이적 프라이머를 사용하여 결정된 바와 같이 형질감염된 DNA가 STING과 직접적으로 결합할 수 있다는 것을 추가로 확인하였다(도 2i 및 2j). ELISA 검정에서 STING이 비오틴으로 표지된 DNA에 결합할 수 있다는 것을 관찰하였다(도 14a 내지 c). 데이터는 ssDNA 및 dsDNA 매개 선천성 신호전달 사건이 STING에 의존한다는 것 및 STING 그 자체가 이러한 사건의 유발을 돕기 위해 핵산 구조체들과 복합체를 이룰 수 있다는 증거를 나타낸다.
3'→5' DNA 엑소뉴클라제인 TREX1도 또한 ER 결합 분자이고, 그렇지 않으면 면역계를 활성화시킬 수 있는 체크포인트로 활성화된 ssDNA 종을 분해하는데 중요하다. hTERT 세포에서 TREX1을 침묵시키기 위해 사용된 RNAi는 STING-의존성, I형 IFN의 dsDNA90에 의한 생성을 유의하게 증가시켰다(도 3a 및 3b). 부수적으로, dsDNA 바이러스 HSV1의 복제는 TREX1가 결여된 hTERT 세포에서 상당히 감소하였는데, 이는 I형 IFN 및 항바이러스성 IFN 자극 유전자(ISG)의 생성의 상승으로 인한 것일 것이다(도 3c 및 d). 루시퍼라제 유전자를 발현하는 재조합 HSV로부터의 루시퍼라제 발현이 또한 TREX1을 침묵시키기 위해 RNAi이 처리된 hTERT 감염 세포에서 유의하게 낮았다(도 15a 내지 d). 이러한 관찰은 유사하게 세포질 dsDNA 의존성 유전자 유도가 TREX1의 부재 하에 상당히 상승하고, HSV1 복제가 유의하게 감소된다는 것을 나타내는 TREX1 결핍 MEF를 사용하여 확대되었다(도 3e 내지 g). STING이 TREX1의 부재 시 관찰된 I형 IFN의 생성의 상승에 책임이 있는지는 결정하기 위해, TREX1 결여 hTERT 또는 TREX1 -/- MEF에서 STING을 침묵시키고, 이러한 세포들을 세포질 dsDNA 또는 HSV1으로 처리하였다. 결과는 STING이 결여된 TREX1 결핍 세포(hTERT 및 MEF)에서의 상당히 감소된 I형 IFN 생성을 나타내었고, 이는 TREX1 부재 시 관찰된 I형 IFN의 수준의 상승이 STING 의존성이라는 것을 나타낸다(도 3a 내지 f). 유사하게, TREX -/- MEF에서 STING의 RNAi 녹다운이 또한 ssDNA90 매개 I형 IFN 생성 및 선천성 유전자 자극을 제거한다는 것을 알게 되었다(도 16). 공초점 분석에서는 TREX1 및 STING ER 내에 공동국소화된다는 것을 확인하였다(도 3h). 그러나, 세포질 dsDNA는 STING과 유사한 TREX1의 ER로부터의 핵주위 영역으로의 이송을 강력하게 유도하지 않았다(도 3h). 따라서, 공동면역침전 분석에 의해 결정된 바와 같이, STING 및 TREX1이 강하게 상호작용하는 것은 관찰되지 않았다. 비자극 조건 하에 TREX1 +/+ 또는 -/- MEF 내 STING 의존성 유전자의 발현에서 급격한 차이는 인지되지 않았다(도 17a 내지 h). 그러나, TREX1은 dsDNA 유도된 유전자로서 확인되었고 STING 의존 방식으로 상향조절될 수 있다(도 17a 내지 h). 따라서, dsDNA 종들이 STING 및 보조(accessory) 분자와 복합체를 이뤄서, TREX1을 포함하는 1차 선천성 면역 유전자의 유도의 원인이 되는 전사 인자인 IRF3/7 및 NF-κB를 활성화시키는 하류 신호전달 사건 및 이송을 매개한다는 것이 타당하다. 증거는 STING으로 활성화된 TREX1이 ER 영역 내에 잔존하여 활성인자 dsDNA를 분해하고, 세포질 dsDNA 신호전달을 음성 되먹임 방식으로 억제한다는 것을 나타낸다. 따라서, TREX1은 STING의 음성 조절인자이다.
본원의 데이터는 STING이 트랜스로콘 결합 단백질 β(TRAPβ)와 결합하는 트랜스로콘 복합체의 일부로서 ER 내에 잔존한다는 것을 보여준다. 트랜스로콘 복합체는 리보솜에 부착될 수 있는 TRAP α β, γ 및 δ에 연결된 Sec61αβ 및 γ를 포함한다. 분비성 및 막 단백질은 배출되기 전에 적절한 접힘(folding) 및 당화를 위해 ER내로 이동된다. TREX1 결합 파트너를 식별하기 위해, 전장 TREX1을 효모 이종 혼성화 선별에서 미끼로 사용하였다. 결과는 TREX1이 올리고사카릴 트랜스퍼라제(oligosaccharyltransferase, OST) 복합체의 구성원이고, 68 kDa의 I형 막관통 단백질인 리보포린 I(Ribophorin I, RPN1)으로 지칭되는 단백질과 반복적으로 상호작용한다는 것을 나타내었다(도 4a 내지 e, 도 18a 내지 d). OST 복합체는 트랜스로콘을 통하여 ER로 들어가면서 만노오스 올리고당의 초기 폴리펩티드 아스파라긴 잔기로의 전달에 대한 촉매작용을 한다. 적어도 7개의 단백질이 RPN1, RPN2, OST48, OST4, STT3A/B, TUSC3 및 DAD1를 포함하는 OST 복합체를 포함한다. 중요하게는, STING를 미끼로 사용한 유사한 선별에서 STING이 또한 16 kDa 막관통 단백질인 DAD1(세포사멸성 세포 사멸에 대한 방어자)과도 결합할 수 있다는 것이 결정되었다(도 14f 내지 h). 효모 이종 혼성화 접근법을 사용한 이러한 결합의 추가의 분석은 막관통 영역을 포함하는 TREX1의 C 말단 영역(아미노산 241 내지 369)이 RPN1의 아미노산 258 내지 397에 결합에 대한 책임이 있다는 것을 나타낸다(도 18a 내지 d). 또한, STING의 아미노산 242 내지 310은 전장 DAD1과의 결합에 대한 책임이 있다(도 18a 내지 d). 공동면역침전 연구에 의해 이러한 분자들의 상호작용을 확인하였다(도 4d 및 4g 및 도 29a 내지 c). 추가의 공동 면역침전 실험은 TREX1의 DAD1과의 결합을 나타낸다(도 19a 내지 c). 공초점 분석은 TREX1 및 RPN1이 세포질 dsDNA에 반응하여 이동하지는 않지만 세포 내에 공동 국소화된다는 것을 확인하였다(도 4e 및 도 20). 유사하게, STING 및 DAD1이 세포의 ER 내에 공동국소화되었지만, DAD1 분자는 세포질 dsDNA 존재 하에 엔도좀 구획으로 STING과 동행하지는 않았다(도 4h). ER을 포함하는 세포성 마이크로솜 구획을 분획화에 의해 단리하였고, 수크로오스 구배 분석에 의해 검증하였다. 이러한 연구는 TREX1 및 STING이 ER 마커인 RPN1 및 RPN2, DAD1 및 칼레티쿨린과 공동분획화되었지만 핵 히스톤 H3과는 공동분획화되지 않는다는 것을 나타내어, TREX1 및 STING의 세포내 국소화가 트랜스로콘/OST 복합체의 구성요소로부터 구분가능하지 않다는 것을 확인하였다(도 4i). 따라서, 비록 TREX1의 TM영역이 TREX1의 ER로의 국소화에 관련된다고 밝혀졌지만, TREX1은 ER의 STING을 포함하는 OST/트랜스로콘 복합체에 표적화되고, 이러한 결합은 RPN1과의 결합을 통해 발생한다. OST, TRAP 또는 신호 인식 펩티드(SRP) 복합체의 구성원이 dsDNA 의존성 신호전달에 영향을 미쳤는지를 알아보기 위해, RNAi 선별이 수행되어 이러한 구성요소들의 발현을 침묵시켰다. 그러나, I형 IFN 생성을 상당히 상승시키는 STING(DNA 매개 I형 IFN 생성에 필수적, 도 21a 내지 h) 및 TREX1의 억제 이외에, Sec61 α 및 TRAPβ 침묵만이 신호전달 및 HSV1 복제에 유의하게 영향을 미쳐서, 이러한 경로의 제어에서의 이들 트랜스로콘 구성원의 역할을 증명하였다(도 4j 및 도 22). 세포질 DNA 감지에도 또한 연루된 IFI16의 침묵은 적어도 hTERT 세포에서 dsDNA 의존성 신호전달을 강하게 억제하지 않는다는 것이 관찰되었다(도 23a 내지 c). IFI16의 소실은 STING의 소실과 유사하게 TREX1의 부재 시 dsDNA에 의한 증가된 IFN 생성을 구제하지 못했다(도 23a 내지 c). 그러나, 감소된 IFI16은 더욱 숙련된 HSV1 유전자 발현을 가능하게 하여, 바이러스 복제에 대한 영향에서 IFI16 분자의 중요한 역할을 확인하였다. RPN1 또는 2의 침묵은 또한 HSV1 유전자 발현에서의 증가를 야기하지만 I형 IFN 생성에는 유의한 영향을 미치지 않아, OST의 이러한 구성요소들이 N-당화에 주로 관여할 수 있다는 것을 입증하였다.
데이터는 STING이 플라스미드 기반 DNA 및 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있는 세포질 세포내 ssDNA 및 dsDNA와 복합체를 이룰 수 있고, 다수의 선천성 면역 유전자(예를 들면, I형 IFN, IFIT 패밀리, 및 항바이러스 활성 및 후천성 면역 반응의 개시에 중요한 다양한 케모카인)의 유도를 조절할 수 있다는 것을 입증한다. STING 활성화는 완전히 밝혀진 기전에 의해 IRF3/7을 타당하게 활성화시키기 위해 TBK1을 클라트린으로 피복된 엔도좀 구획으로 에스코트하는 것을 촉진한다. TREX1는 세포 내에 낮은 수준으로 존재하는 것으로 보이며, 그 자체가 STING에 의해 유도가능하다. 번역 후, TREX1은 미활성화 STING과 인접하여 OST 복합체로 국소화되고 (또는 OST/트랜스로콘 복합체 내에 잔류하고) 여기서 추측건대 TREX1은 그렇지 않으면 STING 작용을 일으킬 수 있는 DNA 종을 분해한다. 이제 STING 및 TREX1과 연관된 트랜스로콘/OST 복합체의 구성요소는 세포질 ssDNA 및 dsDNA 매개 선천성 면역 신호전달을 조절한다. TREX1의 소실은 상승된 I형 IFN 생성을 통한 자가면역 장애를 나타내기 때문에, 이러한 질환들이 STING 활성화를 통해 유도될 가능성이 있다.
실시예 2: STING 조절인자
STING 발현, 기능, 활성 등을 조절하는 제제를 식별하기 위해 약물 라이브러리를 선별하였다. 도 24는 STING 세포 기반 검정의 단계들을 나타낸 것이다.
라이브러리는 500개 표적의 공지된 Bioactives Library인 BioMol ICCB; 약학적으로 활성인 화합물의 LOPAC1280™ 라이브러리; 33개의 공지된 포스파타제 저해제의 Screen-Well™ 포스파타제 저해제 라이브러리(Enzo Life Sciences)를 포함한다;
50% 약물 구성요소, 30% 천연물, 20% 다른 바이오활성 구성요소인 MicroSource Spectrum Collection 2000 구성요소(EMD); InhibitorSelect™ 96-웰 단백질 키나제 저해제 라이브러리 I, InhibitorSelect™ 96-웰 단백질 키나제 저해제 라이브러리 II, InhibitorSelect™ 96-웰 단백질 키나제 저해제 라이브러리 IIIa; 키나제 라이브러리 B 키나제 TrueClone collection; 키나제 결핍 TrueClone collection.
결과는 ('약물 A'로 명명된) 하나의 약물이 STING 이송을 유도하는 것을 보여주었다(도 60). ("약물 X"로 명명된) 다른 약물은 IFNβ mRNA 생성을 저해하였다(도 61).
하기 표 2에 기재된 것들은 STING 저해제로 식별되었다.
명칭 화학명 설명
디클로페낙 나트륨 2-[(2,6-디클로로페닐)아미노]벤젠아세트산 나트륨 사이클로옥시게나제 저해제; 항염증
R(-)-2,10,11-트리하이드록시아포르핀 하이브로(hybro)브로마이드 R(-)-2-하이드록시아포모르핀 하이드로브로마이드 D2 도파민 수용체 작용제
디프로필도파민 하이드로브로마이드 도파민 수용체 작용제
2,2'-비피리딜 알파,알파'-비피리딜 메탈로프로테아제 저해제
(±) 트랜스-U-50488 메탄술포네이트 트랜스-(±)-3,4-디클로로-N-메틸-N-[2-(1-피롤리디닐)-사이클로헥실]-벤젠아세트아미드 메탄술포네이트 선택적인 카파 오포이드 수용체 작용제
SP600125 안트라피라졸론(Anthrapyrazolone); 1,9-피라졸로안트론 선택적인 c-Jun N-말단 키나제(c-JNK) 저해제
독사조신 메실레이트 1-(4-아미노-6,7-디메톡시-2-퀴나졸리닐)-4-[4-(1,4-벤조디옥산-2-일)카피페라진-1-일)]-6,7-디메톡시퀴나졸린 메실레이트 알파1 아드레날린 수용체 차단제
미톡산트론 1,4-디하이드록시-5,8-비스([2-([2-하이드록시에틸]아미노) 에틸]아미노)-9,10-안트라센디온 DNA 합성 저해제
MRS 2159 P2X1 수용체 길항제
네마디핀-A 1,4-디하이드로-2,6-디메틸-4-(펜타플루오로페닐)-3,5-피리딘디카복실산 디에틸 에스테르 L-형 칼슘 채널 알파1-서브유닛 길항제.
(±)-PPHT 하이드로클로라이드 (±)-2-(N-페닐에틸)-N-프로필)아미노-5-하이드록시테트랄린 하이드로클로라이드 강력한 D2 도파민 수용체 작용제
SMER28 6-브로모-N-2-프로페닐-4-퀴나졸린아민 포유동물 자식(autopahge)의 소분자 조절제
퀴닌 술페이트 K+ 채널 차단제; 항말라리아성, 항콜린성, 항고혈압성 및 혈당강하 제제; 남미 나무의 기나 나무과의 줄기껍질로부터 단리된 알칼로이드
(+)-퀴스퀄산 L(+)-알파-아미노-3,5-디옥소-1,2,4-옥사디아졸리딘-2-프로판 산 퀴스퀄산의 활성 거울상 이성질체; 글루타메이트 수용체에서의 흥분성 아미노 산; 구충제(anthelmentic agent)
STING의 활성인자에는 디하이드로오우아바인(dihydroouabain) 및 BNTX 말레이트 염 수화물이 포함된다.
실시예 3: STING은 자가 DNA 의존성 염증성 질환을 나타낸다
골수 세포 유래 대식세포(BMDM)를 Sting+/+ 및 Sting -/- 마우스로부터 수득하였고, 90 염기 쌍 dsDNA(dsDNA90)로 형질감염시켜서 STING 경로를 활성화하거나, 덱사메타손(Dex) 처리된 흉선세포로부터 유래한 세포사멸성 DNA(aDNA)로 형질감염시켰다. 양 유형의 DNA가 BMDM 및 상업적인 수지상세포(BMDC)에서 STING 의존 방식으로 IFNβ의 생성을 강력하게 유도하는 것이 관찰되었다. DNA 마이크로어레이 실험에서 aDNA가 BMDM에서 다수의 선천성 면역 및 염증 관련 사이토카인(예를 들면, IFNβ 및 TNFα의 STING 의존성 생성을 유발한다는 것을 확인하였다(표 3). 이러한 데이터는 aDNA로 처리된 Sting+/+ 또는 Sting-/- BMDM에서 사이토카인 생성을 측정함으로써 확인하였다. 따라서, STING은 BMDM뿐 아니라 BMDC에서 세포사멸성 DNA 매개 전염증성 유전자 생성을 촉진할 수 있다.
표 3은 세포사멸성 DNA(aDNA)가 처리된 BMDM 내 높게 발현된 유전자의 유전자 발현을 나타낸 것이다.
Figure pct00001
STING이 DNase II 관련 염증성 질환에서 역할을 수행하는지를 결정하기 위해, STING 및/또는 DNase II를 THP1 세포 또는 BMDM에서 RNAi를 이용하여 녹다운시켰고, DNase II의 소실이 aDNA에 반응하여 STING 의존 방식으로 I형 IFN을 포함하는 사이토카인의 상향조절을 촉진한다는 것을 알게 되었다. DNase II -/- 마우스가 보통 출생 이전에 죽기 때문에, 17일 배아(E17일)의 DNase II -/- , Sting -/- , 또는 Sting -/- DNase II -/- DKO를 분석하였다. RT-PCR을 포함하는 유전자형 분석 및 면역블롯으로 배아에 Sting, DNase II 또는 두개의 기능성 유전자 모두가 결여되었다는 것을 확인하였다. DNase II -/- 배아는 전술된 바와 같이 이러한 표현형이 현저히 결여된 대조군 또는 Sting -/- DNase II -/- DKO 배아에 비하여 유의한 빈혈증을 나타내는 것이 관찰되었다. 치명적인 빈혈증은 발달 중의 적혈구 생성의 I형 IFN 저해에 의한 것으로 보고되어 있다. 이어서 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 DNase II -/- 배아의 간이 높은 수준의 사이토카인의 생성에 책임이 있는 포식된 세포사멸성 세포로 가득 찬 다수의 침투성 대식세포를 함유한다는 것을 관찰하였다. 대조군 마우스와는 반대로, Sting -/- DNase II -/- 배아의 간은 유사한 표현형을 나타내었다. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP 비오틴 닉 말단 표지(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP biotin nick end-labeling, TUNEL)에 의한 태아 간의 분석은 (야생형 태아 간이 아닌) Sting -/- DNase II -/- 배아 및 DNase II-결핍체가 다수의 많은 부적절하게 소화된 죽은 세포를 함유한다는 것을 확인하였다. 시험관 내 분석은 야생형 또는 DNase II -/- 마우스로의 배아로부터의 대식세포가 세포사멸성 세포를 적절하게 포식한다는 것을 나타낸다. 그러나, 포식된 세포사멸성 세포의 DNA가 야생형 대식세포의 리소좀에서는 효율적으로 분해되는 반면, DNase II-/- 대식세포는 포식된 핵을 축적하고 DNA를 소화할 수 없었다. 이러한 사건은 선천성 면역 신호전달 경로의 자극 및 자가면역 관련 사이토카인의 생성을 야기한다. 이를 고려하여, DNase II 및 STING 모두 결여된 대식세포로부터 유래된 배아 간의 능력을 세포사멸성 세포를 포식하고 DNA를 소화하는지에 관해 평가하였다. DNase II-/- 대식세포와 유사하게, Sting-/- DNase II-/- 대식세포는 야생형 또는 Sting-/- 마우스로부터 취득된 대조 대식세포와 비교하여 덱사데타손 처리된 세포사멸성 흉선세포로부터의 핵을 포식하고 소화할 수 없었다. 따라서, Sting-/- DNase II-/- 배아 마우스의 간으로부터 수확된 대식세포는 유사하게 DNase II-/- 대식세포와 비슷하게 포식된 세포사멸성 세포를 소화할 수 없었다.
위의 분석은 배아 마우스의 간에서 mRNA 발현 수준을 분석하여 보강되었다. 이러한 연구는 야생형 또는 Sting-/- 배아의 간에서 매우 적은 염증성 유전자 생성을 나타내었다. 그러나, DNase II-/- 배아의 간은 비정상적으로 높은 수준의 사이토카인 관련 mRNA를 함유하는 것으로 관찰되었다. 중요하게, Sting-/- DNase II-/- 마우스의 간은 DNase II-/- 마우스와 비교하여 급격하게 감소한 수준의 선천성 면역 유전자 발현 활성을 가졌다. 이러한 결과는 RT-PCR로 배아 간의 선택된 선천성 면역 유전자의 mRNA 발현 수준을 분석함으로써 확인되었다. 예를 들어, IFNβ 생성은 DNase II-/- 마우스에 비교하여 Sting-/- DNase II-/- 마우스에서 수배 감소하였다. 2'-5' 올리고아데닐레이트 신타제(OAS), 테트라트리코펩티드 반복을 가지는 인터페론 유도 단백질(IFIT) 인터페론 유도성 단백질 27(IFI27) 및 유비퀴틴 유사 조절제(ISG15)와 같은 주요 인터페론 자극 유전자(ISG)의 생성이 또한 급격하게 감소하였다. TNFα 및 IL1β와 같은 전염증성 사이토카인이 또한 DNase II-/- 마우스와 비교하여 Sting-/- 및 Sting-/- DNase II-/-의 배아 간에서 감소하였다. 선천성 면역 유전자의 생성은 STING의 부재 시 급격히 억제되었지만, Sting-/- DNase II-/- 마우스에서 일부 유전자의 존재가 비록 어레이 분석에 의해 결정된 바와 같이 낮은 수준일지라도 약간 상승된 상태로 잔존하였는데, 이는 분석된 동물 사이의 mRNA 발현의 차이에 기인할 수 있거나 아마도 다른 경로의 자극으로 인한 것일 수 있다. 이러한 유전자들 중 다수는 NF-κB 및 인터페론 조절 인자(IRF) 경로에 의해 조절된다. 따라서, 이러한 전사 인자의 기능을 Sting-/- DNase II-/- 또는 대조군 뮤라인 배아 섬유아세포(MEF)(14일 배아(E14일)로부터 발달됨)에서 평가하였다. 주로, Sting-/- DNase II-/- MEF에서 세포질 DNA에 노출되었을 때 결함은 NF-κB 활성(p65 인산화)에서 관찰되었다. 동일한 결함이 Sting -/- DNase II -/- BMDM에서 세포질 DNA뿐 아니라 세포사멸성 DNA에 노출되었을 때 얻어졌다. 이는 IRF3뿐 아니라 NF-κB도 또한 dsDNA에 노출된 후 대조군 MEF에서는 그렇지 않지만 Sting -/- DNase II -/- MEF에서는 이동에 실패하였다는 것에 주목함으로써 확인하였다. 따라서, STING이 치명적인 배아 적혈구생성 유발에 책임이 있는 자가 DNA 유도 염증성 사이토카인의 생성에 대한 책임이 있을 수 있다.
자가 DNA 촉진 치명적 적혈구생성의 매개에서의 STING의 중요성의 연장으로, DNase II -/- 마우스가 STING 부재 하에 태어날 수 있는지를 평가하였다. 중요하게, Sting-/- 배경에 교차시겼을 때, DNase II -/- 마우스가 명백한 멘델 빈도로 태어난 것이 관찰되었다. PCR 유전자형분석, 노던 블롯, RT-PCR 및 면역블롯 분석이 자손 마우스에서 DNase II 및 STING 결핍을 확인하였다. Sting -/- DNase II -/- 이중 녹다운 마우스(DKO)는 정상적으로 성장하는 것으로 나타났고, 대조군 마우스에 비교할 때 유사한 크기와 체중을 나타냈지만, Sting -/- 마우스는 명백하게 밝혀지지 않은 이유로 약간 더 컸다. 예비 면역학적 평가도 또한 비록 DKO가 노화하면서 비장비대증이 발달되는 것으로 알려졌지만, Sting -/- DNase II -/- DKO 동물이 Sting -/- 및 야생형 마우스와 유사한 유사 CD4+/CD8+ 프로파일을 공유한다는 것을 나타내었다. 비장비대증은 I형 IFN 신호전달이 결여된 생존한 DNase II 결핍 마우스(DNase II -/- Ifnar1 -/- 마우스)에서도 또한 나타났고, 적색 수질의 비대로 인한 것으로 보고되었다. 그러나, Sting -/- DNase II -/- 마우스로부터의 혈청 분석에서는 8주령의 대조군 마우스와 비교하여 검출가능한 비정상 사이토카인 생성이 나타나지 않았는데, 이는 일반적으로 낮은 측정불가능한 수준의 사이토카인 생성으로 인한 것이다. 이러한 연구를 통해, 시험관 내에서, DNase II -/- 대식세포와 유사하게, Sting -/- DNase II -/- 대식세포는 야생형 또는 Sting-/- 마우스로부터 취득된 대조 대식세포와 비교하여 세포사멸성 흉선세포(Dex+)로부터 포식한 핵을 소화할 수 없다는 것을 나타내었다. DNase II-/- Sting-/- 대식세포에서 소화되지 않은 DNA의 축적은 WT 흉선세포가 표적으로서 사용되었을 때(Dex-) 덜 현저하였다. 따라서, DNase II -/- BMDM과는 대조적으로 염증성 사이토카인 반응을 생성하지는 않지만, Sting -/- DNase II -/- 마우스로부터 유래한 BMDM도 또한 세포사멸성 세포로부터의 DNA를 소화시킬 수 없다.
DNase II 매개 배아 치사는 DNase II +/- 마우스를 I형 IFN 결손 Ifnar1 -/- 마우스와 교배함으로써 피할 수 있지만, 자손은 출생 대략 8주 후 중증 다발성관절염(관절염 점수 2)으로 고통받는데, 이는 소화되지 않은 DNA가 선천성 면역 신호전달 경로를 활성화시키고 TNFα와 같은 염증성 사이토카인의 생성을 유발하기 때문이다. 중요하게는, Sting-/- DNase II-/- 마우스가 출생 후 다발성관절염의 어떠한 징후도 나타내지 않았다는 것을 알게 되었다. 유사한 기간 후 최대 7까지의 관절염 점수를 나타낸 보고된 DNase II -/- Ifnar1 -/- 마우스와는 대조적으로 Sting -/- DNase II -/- 에서 관절염 점수는 12 월령까지 대략 0(점수 없음)으로 유지되었다. DNase II -/- Sting -/- 마우스의 비장 및 흉선 조직의 H&E 및 TUNEL 염색은 세포사멸성 DNA도 또한 함유하는 침투성 대식세포의 존재를 예시하였지만, 6월령의 Sting -/- DNase II -/- 마우스의 관절의 조직학에서는 정상적인 뼈(B) 활막 관절(S) 및 연골(C) 구조가 나타났고 관절 구조로의 판누스 침투의 증거가 없었다. Sting -/- DNase II -/- 마우스의 혈청으로부터의 TNFα IL1β 및 IL6의 수준은 STING 이 결여된 BMDM의 어레이 분석으로부터 예측된 바와 같이 낮은 수준으로 남아있었다(표 3). Sting -/- DNase II -/- 마우스의 관절 내로의 CD4, CD68 또는 TRAP 양성 세포 침투의 증거도 없었다. Sting -/- DNase II -/- 마우스의 혈청의 분석은 또한 류마티스 인자(RF), 항 dsDNA 항체 또는 MMP3의 수준의 상승이 없음을 나타내었다. 따라서, STING의 소실은 자가 DNA 매개 다발성관절염에 책임이 있는 전염증성 사이토카인 생성을 제거한다.
STING은 예를 들어, 에이카르디-고우티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres syndrome, AGS)과 같은 염증성 질환의 원인이다. AGS는 유전적으로 결정된 뇌병증으로 기저핵 및 백색질의 석회화, 탈수초를 특징으로 한다. 뇌척수액 내 림프구 및 I형 IFN의 높은 수준. 이러한 특징들은 만성 감염을 모사한다. I형 IFN의 혈청 수준은 또한 자가면역 증후군 전신성 루푸스 적혈구종증(SLE)에서 증가한다. AGS는 3'-5' DNA 엑소뉴클라제 TREX1에서의 돌연변이에 의해 유발된다. TREX1 기능 소실 DNA 종은 세포의 ER 내에 축적되고, 세포질 DNA 감지인자(STING)를 활성화시킨다. TREX1은 선천성 면역 유전자 활성화를 방지하기 위해 DNA 공급원을 소화한다(하우스키핑 기능).
STING이 세포자멸사가 결핍된 마우스의 염증성 질환에 대한 책임이 있는 것으로 보인다는 것을 고려하여, 다른 유형의 자가 DNA 유발 질환이 STING 경로의 활성화를 통해 발생하는지를 다음으로 평가하였다. 예를 들어, 3' 복구 엑소뉴클라제 1(Trex1)이 결손된 환자는 뇌척수액에 존재하는 높은 수준의 I형 IFN 생성을 특징으로 하는 치명적인 뇌염을 유발하는 에이카르디-고우티에레스 증후군(AGS)로 고통받는다. Trex1-결핍 마우스는 대략 10주의 수명 중앙값을 나타내는데, 이는 아직 특징분석되지 않은 자가 DNA(추정컨대 보통 Trex1에 의해 소화됨)가 사이토카인 생성을 유발하고 치명적인 염증성 악성 심근염을 유발하는 세포내 DNA 감지인자를 활성화시키기 때문이다. 최근의 데이터는 STING의 소실이 비록 원인은 아직 알려지지 않았지만 Trex1 -/- 마우스의 수명을 연장할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 연구들이 연장되었고, dsDNA90에 노출된 Trex1 결핍 BMDC(Trex1 -/- BMDC)에 약간 상승된 수준의 I형 IFN 생성이 존재한다는 것을 알게 되었다. 중요하게는, STING(Sting -/- Trex1 -/- BMDC)의 소실은 DNA가 BMDM의 Trex1 결핍에서 I형 IFN 생성을 증가시키는 능력을 제거하였다. 흥미롭게도, Trex1 -/- 마우스와 비교하여 Sting -/- Trex1 -/- , Sting -/+ Trex1 -/- 의 심장의 크기 감소가 관찰되었다. 심근염의 증거 또한 Trex1 -/- 단독과 비교하여 Sting -/- Trex1 -/- 에서 급격히 감소한 것을 알게 되었다. 또한, Trex1 -/- 마우스의 혈청에서 매우 우세하게 관찰되는 항 핵 자가항체(ANA)가 Sting -/- Trex1 -/- 마우스의 혈청에서는 거의 완전히 부재하였다. 마이크로어레이 분석은 Trex1-/- 마우스와 비교하여 Sting-/- Trex1-/-, Sting-/+ Trex1-/- 의 심장 내에서 급격히 감소된 수준의 전염증성 유전자를 나타내었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 STING가 Trex1 결핍 마우스 및 타당하게는 AGS에서 전염증성 유전자 유도에 대한 책임이 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4: STING의 S366에 대한 키나제의 선별
217 단백질 키나제 표적의 활성을 기질로서 2종의 펩티드(A366 및 S366)에 대하여 평가하였다. 단백질 키나제를 각각의 펩티드 및 33P-ATP와 혼합한 다음, 활성(CPM)을 측정하였다. 하기의 키나제가 STING에서 S366을 인산화하는 것으로 식별되었다. 이러한 세린을 표적으로 하는 키나제의 식별은 약물 발견을 위한 진입로를 연다. 이러한 결합을 표적으로 하는 약물들은 STING 활성을 저해할 수 있고 STING 활성을 저해하여 치료 목적으로 사용될 수 있다. STING 과 활성은 암을 악화시킬 수 있는 염증성 질환을 야기할 수 있다.
하기 표 4는 STING의 S366에 대한 키나제의 선별을 보여준다.
Figure pct00002
실시예 5: STING은 염증 연관 암에 대한 책임이 있다
STING WT 및 STING -/- 동물을 DNA 손상제로 처리하였고, STING가 결여된 마우스는 종양 형성에 저항성이었다. 이는 수지상 세포, 대식세포 등과 같은 침투성 면역 세포가 세포 괴사 또는 세포자멸사를 거치는 손상된 세포를 섭취하고, 이러한 세포로부터의 DNA 또는 다른 리간드들이 STING 및 종양 형성을 촉진하는 사이토카인의 생성을 활성화시키기 때문이다. STING은 다양한 종류의 기타 암들에서 종양 진행을 촉진하는데 관여할 수 있다.
도 29a 내지 d는 STING 결핍 마우스가 DMBA 유도 염증 및 피부 종양형성에 저항성이라는 것을 나타낸다. STING+/+ 및 STING-/- 마우스의 면도된 등에 20주간 매주 아세톤으로 거짓(mock) 처리하거나 10 μg의 DMBA를 처리하였다. 도 29a: STING 결핍 동물은 피부 암을 유발하는 DNA 손상제에 대하여 저항성이다. 피부 종양이 없는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 곡선으로 나타냈다. 도 29b: 각 치료군의 대표적인 마우스의 사진을 나타내었다. 도 29c: 조직병리학적 검증을 거짓 또는 DMBA 처리된 피부/피부 종양 생검에 대하여 H&E 염색으로 수행하였다. 영상은 20X 배율로 취득되었다. 도 29d: 발암물질에 노출된 STING 발현 마우스에서의 사이토카인 상향조절. 거짓, 또는 DMBA 처리된 피부/피부 종양 생검으로부터 추출된 RNA를 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 version 2)로 두번 분석하였다. 총 유전자 발현을 분석하였다. 대부분의 가변 유전자를 선택하였다. 행은 개별적인 유전자를 나타내고; 열은 개별적인 시료를 나타낸다. 의사 색채는 평균보다 낮거나, 동일하거나 높은 전사 수준을 나타낸다. 유전자 발현; 10로그 스케일로 -5 내지 5 사이의 배수 변화. STING 결핍 동물의 피부에서 어떠한 사이토카인도 관찰되지 않았다.

Claims (13)

  1. 이상 STING 기능과 연관된 장애 또는 질환을 가지는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 방법으로서, STING 기능을 조절하는 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 임의의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 약학적 조성물의 양은 상기 대상체에서 상기 이상 STING 기능을 개선하는데 유효한 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 STING 기능을 증가시키는 소분자인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제제는 STING 기능을 감소시키는 소분자인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 세포내 조건 하에 STING에 결합하는 핵산 분자인, 방법.
  5. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 길이가 40 내지 150 염기 쌍인 단일 가닥 DNA인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 길이가 40 내지 150 염기 쌍인 이중 가닥 DNA인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 길이가 60 내지 120 염기 쌍인 이중 가닥 DNA인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 길이가 80 내지 100 염기 쌍인 이중 가닥 DNA인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 길이가 85 내지 95 염기 쌍인 이중 가닥 DNA인 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 핵산 분자는 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 핵산 분자의 막관통 수송을 촉진하는 분자와 결합하는 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 DNA-의존성 염증성 질환인, 방법.
  13. 염증성 면역 세포가 침투된 암성 종양을 가지는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법으로서, STING 기능 또는 발현을 하향조절하는 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 임의의 양을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 약학적 조성물의 양은 상기 암성 종양에 침투된 염증성 면역 세포의 수를 적어도 50% 낮추는데 유효한 것인, 방법.
KR20147033632A 2012-04-30 2013-04-30 면역 반응의 조절 KR20150004416A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/460,408 2012-04-30
US13/460,408 US20130039933A1 (en) 2008-08-04 2012-04-30 Sting (stimulator of interferon genes), a regulator of innate immune responses
PCT/US2013/038840 WO2013166000A1 (en) 2012-04-30 2013-04-30 Modulating immune responses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150004416A true KR20150004416A (ko) 2015-01-12

Family

ID=49514802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20147033632A KR20150004416A (ko) 2012-04-30 2013-04-30 면역 반응의 조절

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP2844756A4 (ko)
JP (1) JP2015516989A (ko)
KR (1) KR20150004416A (ko)
CN (1) CN104540945A (ko)
AU (1) AU2013256468A1 (ko)
CA (1) CA2907616A1 (ko)
WO (1) WO2013166000A1 (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2014MN02492A (ko) 2012-06-08 2015-07-17 Aduro Biotech
AU2013358892B2 (en) 2012-12-13 2018-06-21 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
ES2678194T3 (es) 2012-12-19 2018-08-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Determinación farmacéutica de una vía de señalización de dinucleótido cíclico de mamífero
SG10201708821RA (en) 2013-04-29 2017-12-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for altering second messenger signaling
WO2014179760A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 The Regents Of The University Of California Cyclic di-nucleotide induction of type i interferon
AP2015008700A0 (en) 2013-05-18 2015-08-31 Univ California Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
EP3027227A4 (en) 2013-07-31 2018-05-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Sting crystals and modulators
JP6462006B2 (ja) 2014-06-04 2019-01-30 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｓｔｉｎｇのモジュレーターとしての環式ジヌクレオチド
GB201501462D0 (en) 2015-01-29 2015-03-18 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compounds
JO3746B1 (ar) 2015-03-10 2021-01-31 Aduro Biotech Inc تركيبات وطرق لتنشيط الإشارات المعتمدة على "منبه أو تحفيز جين انترفيرون"
AU2016362697B2 (en) 2015-12-03 2018-07-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Cyclic purine dinucleotides as modulators of STING
CN106540260A (zh) * 2015-12-09 2017-03-29 聊城市奥润生物医药科技有限公司 干扰素基因刺激蛋白（sting）激动剂在抗阿尔兹海默症中的应用
NZ746112A (en) 2016-03-18 2023-01-27 Immune Sensor Llc Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use
CN106539757A (zh) * 2016-03-20 2017-03-29 聊城市奥润生物医药科技有限公司 环二核苷酸cGAMP-脂质体在抗肿瘤中的应用
JP2019510802A (ja) 2016-04-07 2019-04-18 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ タンパク質調節物質として有用な複素環アミド
SI3440076T1 (sl) 2016-04-07 2022-09-30 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterociklični amidi uporabni kot proteinski modulatorji
EP3507367A4 (en) 2016-07-05 2020-03-25 Aduro BioTech, Inc. CYCLIC DINUCLEOTID COMPOUNDS WITH INCLUDED NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF
CA3051252A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Modernatx, Inc. Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
CN106667914B (zh) * 2017-03-13 2022-02-01 杭州星鳌生物科技有限公司 靶向脂质体-环二核苷酸的组成、制备方法及其在抗肿瘤中的应用
JP7262451B2 (ja) 2017-10-05 2023-04-21 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド Ｓｔｉｎｇアゴニストの投与方法
CA3077337A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modulators of stimulator of interferon genes (sting)
EP3692033A1 (en) 2017-10-05 2020-08-12 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Modulators of stimulator of interferon genes (sting) useful in treating hiv
GB201807924D0 (en) 2018-05-16 2018-06-27 Ctxt Pty Ltd Compounds
KR20210025016A (ko) 2018-06-28 2021-03-08 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 접합 삼중고리형 헤테로사이클 화합물과 그 치료 용도
TW202104214A (zh) 2019-04-05 2021-02-01 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司 化合物
GB201910305D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
GB201910304D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
US11897888B1 (en) 2020-04-30 2024-02-13 Stinginn Llc Small molecular inhibitors of sting signaling compositions and methods of use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010017248A2 (en) * 2008-08-04 2010-02-11 University Of Miami Sting (stimulator of interferon genes), a regulator of innate immune responses

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013166000A1 (en) 2013-11-07
JP2015516989A (ja) 2015-06-18
AU2013256468A1 (en) 2014-12-04
CA2907616A1 (en) 2013-11-07
EP2844756A4 (en) 2016-02-24
CN104540945A (zh) 2015-04-22
EP2844756A1 (en) 2015-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150004416A (ko) 면역 반응의 조절
US20200392492A1 (en) Modulating Immune Responses
Hesse et al. Sclerostin inhibition alleviates breast cancer–induced bone metastases and muscle weakness
Fox et al. p53 and ATF4 mediate distinct and additive pathways to skeletal muscle atrophy during limb immobilization
Zhang et al. Sirtuin 6 inhibits myofibroblast differentiation via inactivating transforming growth factor‐β1/Smad2 and nuclear factor‐κB signaling pathways in human fetal lung fibroblasts
Zheng et al. LncRNA MALAT1 inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in osteoporosis rats through MAPK signaling pathway.
JP2022521454A (ja) 加齢関連炎症および障害を治療する、予防するまたは逆転させるための組成物および方法
Pan et al. Inhibition of Ctsk alleviates periodontitis and comorbid rheumatoid arthritis via downregulation of the TLR9 signalling pathway
Li et al. Wortmannin reduces metastasis and angiogenesis of human breast cancer cells via nuclear factor-κB-dependent matrix metalloproteinase-9 and interleukin-8 pathways
Li et al. Inhibition of histone deacetylation by MS-275 alleviates colitis by activating the vitamin D receptor
Tao et al. KPNA2 interacts with P65 to modulate catabolic events in osteoarthritis
Furrer et al. Absent in Melanoma 2 (AIM2) limits pro-inflammatory cytokine transcription in cardiomyocytes by inhibiting STAT1 phosphorylation
Graca et al. The myokine Fibcd1 is an endogenous determinant of myofiber size and mitigates cancer-induced myofiber atrophy
US9845471B2 (en) Compositions and methods for treating pancreatic cancer
US9814741B2 (en) Methods relating to DNA-sensing pathway related conditions
Zhang et al. Targeting KAT2A inhibits inflammatory macrophage activation and rheumatoid arthritis through epigenetic and metabolic reprogramming
Wang et al. Clearance of senescent cells from injured muscle abrogates heterotopic ossification in mouse models of fibrodysplasia ossificans progressiva
EP3187191B1 (en) Antibody for recognizing specific motif of wls protein, and pharmaceutical composition containing same
Mutti et al. Cobalamin deficiency-induced changes of epidermal growth factor (EGF)-receptor expression and EGF levels in rat spinal cord
Tang et al. p53 peptide prevents LITAF-induced TNF-alpha-mediated mouse lung lesions and endotoxic shock
WO2022137964A1 (ja) 軟骨・骨・関節疾患の予防または治療用医薬組成物および軟骨・骨・関節疾患の予防または治療用薬剤のスクリーニング方法
Samakkarnthai et al. In vitro and in vivo effects of zoledronate on senescence and senescence-associated secretory phenotype markers
Suzuki et al. Manipulating histone acetylation leads to antitumor effects in hemangiosarcoma cells
Culbert et al. Fibrodysplasia (myositis) ossificans progressiva
JP6659250B2 (ja) 癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、抗癌剤及び抗癌剤のスクリーニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application