KR20140147493A - Interferon-beta를 도입한 인간골수유래의 MSC 세포(IFNβ-hBM-MSCs)의 다발성경화증 치료제 - Google Patents
Interferon-beta를 도입한 인간골수유래의 MSC 세포(IFNβ-hBM-MSCs)의 다발성경화증 치료제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20140147493A KR20140147493A KR20130070854A KR20130070854A KR20140147493A KR 20140147493 A KR20140147493 A KR 20140147493A KR 20130070854 A KR20130070854 A KR 20130070854A KR 20130070854 A KR20130070854 A KR 20130070854A KR 20140147493 A KR20140147493 A KR 20140147493A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ifn
- mscs
- beta
- multiple sclerosis
- bone marrow
- Prior art date
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 51
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 38
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 title claims description 25
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 claims abstract description 21
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 43
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 abstract description 3
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 66
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 55
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 17
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 17
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 13
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 13
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 12
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 10
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 10
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 10
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 10
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 10
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 10
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 10
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 10
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 9
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 8
- 210000005230 lumbar spinal cord Anatomy 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 4
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- LUWJPTVQOMUZLW-UHFFFAOYSA-N Luxol fast blue MBS Chemical compound [Cu++].Cc1ccccc1N\C(N)=N\c1ccccc1C.Cc1ccccc1N\C(N)=N\c1ccccc1C.OS(=O)(=O)c1cccc2c3nc(nc4nc([n-]c5[n-]c(nc6nc(n3)c3ccccc63)c3c(cccc53)S(O)(=O)=O)c3ccccc43)c12 LUWJPTVQOMUZLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108010072051 Glatiramer Acetate Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 2
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 2
- FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N acetic acid;(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound CC(O)=O.C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 208000018254 acute transverse myelitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229960003776 glatiramer acetate Drugs 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 208000009174 transverse myelitis Diseases 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- IVYQODXBAVAAMS-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[2-[[6-amino-2-[[6-amino-2-[[2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino] Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O IVYQODXBAVAAMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010084938 adenovirus receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007470 bone biopsy Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003118 histopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/215—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 유효성분으로 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 본 발명의 IFNβ-hBM-MSCs는 혈장에서 Th1 사이토카인은 감소시키고 Th2 사이토카인은 증가시키는 면역조절기능뿐만 아니라, 신경세포의 탈수초화방지(demyelination), 신경보호효과(neuroprotective effect), 염증성침윤(Inflammatory infiltration)억제 또는 BBB(bloodbrain barrier)통행을 억제하는 효과를 통해 다발성경화증, 뇌척수염의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 다발성경화증, 뇌척수염의 예방 및 치료에 관한 유전자치료제 및 그 치료제를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 IFN-β유전자를 도입한 인간 골수유래의 MSC 세포를 자가이식하여 염증의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.
다발성경화증은 자가면역과 관련된 염증성 질환으로서, CNS(central nervous system)의 액손(Axon)주위 미엘린수초(myelin sheath)에 손상이 생겨 탈수초화되고 뉴런의 손실이 발생한다. 다발성경화증은 완화와 증세회복 이후에 악화 등과 같은 다양한 징후와 증상에 의해서 특징지어 지며, 다발성경화증환자의 생존율을 개선하기 위해서 많은 실험적인 치료법이 개발되었다.
glatiramer acetate나 mitoxantrone 같은 다발성경화증의 치료를 위해 몇몇의 방법이 있으며, 이러한 약제는 면역학적인 면을 주 타겟으로 한다. 그럼에도 불구하고 몇몇의 승인된 다발성경화증의 치료법이 존재함에도 불구하고 많은 환자들은 이러한 약제에 적절하게 반응하지 않는다. 따라서 다발성경화증을 위한 더욱 효과적인 치료를 위한 프로토콜이 필요한 실정이다. 다발성경화증은 장기치료가 요구되는 만성염증질환이며, 재조합 IFN-β는 현재 다발성경화증의 가장 흔한 치료법이다. 현재 FN-β1b과 IFN-β1a 두 가지의 IFN-β 약제가 다발성경화증의 치료제로 승인되었으며, 투여방법은 매일 IFN-β1b 250mg 피하주입 또는 일주일에 3회의 IFN-β1a 22 mg 피하주입과 일주일에 한번의 IFN-β1a 30mg을 근육주사한다. rIFN-β 처방은 생물학적 반감기에 의해서 특별히 peak and trough 기작과 관련 있다. IFN-β는 혈장 내에서 매우 짧은 반감기를 갖으며, 더욱이 장기적으로 반복되는 rIFN-β 주사는 우울증, 염증, 간독성 등 심각한 임상적 부작용과 관련되어 있다.
EAE 모델은 인간의 다발성경화증 모델에 널리 사용되며, EAE(실험적알러지성뇌척수염)은 CNS 자가면역질병에 대한 질환동물모델이며 특정 CNS 항원에 면역이 뒤따른다. 많은 임상 및 조직병리학에서 인간의 다발성경화증과 유사하다고 보고되어 다발성경화증의 기작 및 치료효과 등을 연구하기 위한 동물모델로서 가장 보편적으로 사용된다.
척수염은 감염 등에 의해 발생하는 일반적인 척수의 염증을 말한다. 과거 영상학적 검사가 개발되기 이전에 이 질환은 척수의 한 단면을 횡(가로)으로 침범하는 염증이라고 생각되었고, 따라서 급성횡단성척수염이라는 이름이 붙여졌다. 그 후 의학의 발전에 따라 척수에 발생하는 염증이 척수의 길이 방향(세로 방향)으로 발생할 수 있다는 것이 알려졌다. 척수염의 원인은 매우 다양하지만 급성횡단성척수염은 주로 면역매개반응(immune-mediated reaction)에 의해 발생하는 것을 말하며, 원인이 밝혀지지 않은 경우와 다른 전신 질환과 동반되는 경우로 나누어진다.
혈액뇌장벽(Blood-Brain Barrier)은 뇌척수액과 혈액을 분리시키는 장벽으로 높은 선택적 투과성을 갖고 있어 몸의 주요 조절중추를 세균 등과 같은 혈액으로 운반될 수 있는 병원체와 혈액 내의 잠재적인 위험물질로부터 격리시키는 역할을 한다.
MSC(Mesenchymal stem cells)는 성체 다능성 세포로서 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등 중간엽계열로 분화된다. 현재 MSC는 MSC의 자기재생능력과 다양한 계열과 면역억제능력 때문에 예비임상적(preclinical) 현장과 임상현장에서 연구되어 졌다. 더욱이 MSC는 상처부위로 이동할 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 유효성분으로 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 인간 골수로부터 수득한 중간엽줄기세포(MSC)를 IFN-β유전자가 도입된 아데노바이러스 벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료효과를 갖는 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs) 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 시험관 내에서(In vitro) IFN-β유전자가 도입된 인간 골수유래 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 동물에서 수득한 혈장에 혼합하여 Th1 사이토카인(proinflammatory cytokine)은 감소시키거나 또는 Th2 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)은 증가시키는 사이토카인발현의 조절방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 유효성분으로 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인간 골수는 다발성경화증 또는 뇌척수염이 발병한 환자로부터 수득한 자가골수(autologous bone marrow)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)는 Th1 사이토카인은 감소시키거나 또는 Th2 사이토카인은 증가시키는 면역조절기능에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다발성경화증 또는 뇌척수염은 탈수초화방지(demyelination), 신경보호효과(neuroprotective effect), 염증성침윤(Inflammatory infiltration)의 억제효과 또는 혈액뇌장벽(bloodbrain barrier)의 투과성(permeability)을 감소시키는 것일 수 있다.
인간 골수로부터 수득한 중간엽줄기세포(MSC)를 IFN-β유전자가 도입된 아데노바이러스 벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료효과를 갖는 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs) 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인간 골수는 다발성경화증 또는 뇌척수염이 발생한 환자로부터 수득한 골수일 수 있다.
또한, 시험관 내에서(In vitro) IFN-β유전자가 도입된 인간 골수유래 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 동물에서 수득한 혈장에 혼합하여 Th1 사이토카인(proinflammatory cytokine)은 감소시키거나 또는 Th2 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)은 증가시키는 사이토카인발현의 조절방법을 제공한다.
본 발명은 다발성경화증 또는 뇌척수염에 있어서 hBM-MSCs가 새로운 IFN-β을 위한 전달체로 사용되는 용도를 제공한다. MSCs-IFNβ가 염증세포의 유입을 감소시키며, 탈수초화를 억제하고, Th1 사이토카인이 Th2 사이토카인으로 균형이동을 유도하여 면역반응을 조절하는 효과가 있고, BBB를 안정화시키며, EAE 마우스에서 질병의 진행을 방지함으로써 강력한 치료적 효과를 보여준다. 또한 hBM-MSCs의 단일투여는 단백질 전달에 비해서 투여횟수를 줄이며, 단백질의 장기발현, 치료효율이 증가하는 반면 부작용을 최소화할 수 있다.
도 1은 MSCs-IFNβ의 발현을 in vivo 및 in vitro에서 측정한 것을 도시한 것이다.
도 2는 MSCs-IFNβ가 처리된 EAE 마우스에서 임상적인 강도(Clinical severity)를 도시한 것이다.
도 3은 EAE 마우스의 척수에서 감소된 염증침윤과 탈수초화를 도시한 것이다.
도 4는 EAE 마우스에서 MSCs-IFNβ가 면역반응을 조절하는 것을 도시한 것이다.
도 5는 MSCs-IFNβ는 EAE 마우스의 대뇌피질에서 neurotrophin의 유도를 도시한 것이다.
도 6은 EAE 마우스에서 MSCs-IFNβ의 효과로서 이동성능과 BBB 통과성능을 도시한 것이다.
도 7은 IFNβ유전자를 MSCs에 도입하기 위해 사용한 벡터를 도시한 것이다.
도 2는 MSCs-IFNβ가 처리된 EAE 마우스에서 임상적인 강도(Clinical severity)를 도시한 것이다.
도 3은 EAE 마우스의 척수에서 감소된 염증침윤과 탈수초화를 도시한 것이다.
도 4는 EAE 마우스에서 MSCs-IFNβ가 면역반응을 조절하는 것을 도시한 것이다.
도 5는 MSCs-IFNβ는 EAE 마우스의 대뇌피질에서 neurotrophin의 유도를 도시한 것이다.
도 6은 EAE 마우스에서 MSCs-IFNβ의 효과로서 이동성능과 BBB 통과성능을 도시한 것이다.
도 7은 IFNβ유전자를 MSCs에 도입하기 위해 사용한 벡터를 도시한 것이다.
본 발명에서는 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 유효성분으로 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것에 그 특징이 있다.
인터페론 베타(Interferon-beta: IFN-β)는 가장 널리 사용되는 다발성경화증에 대한 치료제로서 임상적인 효과에 대한 입증을 받았으며, 당해 발명에서는 인간골수 유래의 MSC(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: hBM-MSCs)를 인터페론 베타의 병변특이적인 유전자 전달체로서 사용하였다.
본 발명자는 IFN-β 를 분비하는 hBM-MSCs를 제조하기 위해 아데노바이러스를 이용하였으며 ELISA assay를 통해서 MSCs-IFNβ의 IFN-β의 분비능력을 확인하였다.
MSCs-IFNβ이 처리된 마우스는 EAE(experimental autoimmune encephalomyelitis)의 저해능력을 보였으며, 각 그룹의 MSCs-IFNβ이 처리된 마우스는 MSCs-GFP가 처리된 마우스에 비해 면역지수의 최대치 및 평균치가 모두 현저히 낮았다.
MSCs-IFNβ가 처리된 EAE 마우스의 경우 PBS 또는 MSCs-GFP가 처리된 마우스에 비해, 요추척수(lumbar spinal cord)에서 염증침윤(Inflammatory infiltration)과 탈수초화(demyelination)가 현저히 줄어들었다.
게다가 MSCs-IFNβ 처리는 염증전 사이토카인인 IFN-β, TNF-β를 억제하며, 또한, 역으로 항염증 사이토카인인 IL-4, IL-10를 증가시켜 면역조절효과를 강화한다.
보다 중요하게는 투입된 hBM-MSCs 염증이 발생한 CNS로 이동하였으며, EAE 마우스에서 BBB(blood-brain barrier: 혈액뇌장벽)투과성에 의한 추가적인 피해를 현저한 감소시켰다.
따라서 본 발명의 결과로 hBM-MSCs을 유전자 전달제로 이용하여 다발성경화증의 치료효과를 강화하는 새로운 치료방법의 프로토콜을 제공하는 것에 그 특징이 있다.
MSC의 pathotropism은 손상된 조직의 재생 및 치료유전자를 특정 병변부위로 전달할 수 있는 능력에 관한 유용성을 제공한다.
최근에 인간 자가MSC는 자가면역 질환치료방법으로 제안되어지고 있다. 예를 들면, hBM-MSCs는 만성적 또는 relapsing remitting(재발이장성) EAE마우스모델에서 기능적인 회복을 향상시킨다. 또한 hBM-MSCs의 손상된 CNS로 이동이 탐지되었으며, 질환개선능력과 숙주 면역반응을 완화하는 능력이 분석되어 졌다.
또한, 인간 골수의 기조직세포(stromal cell) 치료가 EAE 마우스에서 기능회복을 향상시키는 것으로 확인되었으며, 이는 염증침윤의 감소, 탈수초화가 일어난 부위의 감소, oligodendrogenesis활성화의 감소 그리고 BDNF 발현의 증가로부터 기인한 것으로 확인되었다.
이러한 데이터는 hBM-MSCs가 EAE에 대한 치료 유전자전달체로서 유망하다는 것을 나타내며, 다발성경화증 치료를 위해 사용되는 IFN-β이 재발이장성 다발성경화증의 치료에도 유망함이 입증되었다.
IFN-β치료는 다발성경화증의 재발을 18-38%정도 감소시키는 효과가 있으며, 다발성경화증에 따른 장애의 진행속도를 늦출 수 있음을 보여준다.
이러한 다발성경화증의 치료에 대한 정확한 기작은 알려져 있지 않으나, 아마도 T 세포의 활성화조절, 면역세포의 증식을 조절, 자기활성화 T 세포의 apoptosis조절, IFN-β 길항작용 조절, Th1/Th2 cytokine의 조절 그리고 BBB 에 기인하는 것으로 알려져 있다.
다발성경화증에 관한 실험적인 연구의 인상적인 치료효과에도 불구하고 IFN-β치료를 통한 임상시도의 결과는 좋지 못하다. 이러한 이유 중의 하나는 재조합 IFN-β의 치료효과가 충분히 지속되지 않으며, in-vivo에서 짧은 반감기와 CNS에 대한 접근성이 낮기 때문이다. 두 번째 문제는 BBB의 존재이다. BBB는 뇌 또는 척수에 접근하는 것부터 CNS질환을 치료하는 것까지 많은 치료제의 접근을 방해하며, 주로 분자량이 크거나 또는 이온화된 분자에 영향을 크게 미친다.
이러한 문제를 극복하기 위해서 본 발명자는 IFN-β유전자의 전달제로서 CNS 특이적인 이동능력를 가진 hBM-MSCs를 사용하였으며, EAE에서 IFN-β를 분비하는 hBM-MSCs의 치료효과를 측정하였다.
많은 연구에서 다양한 세포치료의 효율 및 안전성을 확인하기위한 시도가 행해졌으며, hBM-MSCs 자가이식은 면역조절 특징 때문에 면역거부를 최소화할 수 있어, 줄기세포치료의 최초 성공사례중 하나이다. 또한 이러한 MSC 이식은 임상실험에 있어서 일반적으로 기형종을 형성시키지 않는다. 또한 쉽게 기형종을 유발하는 ESCs(embryonic stem cells) 및 iPSCs(induced pluripotent stem cells)과 비교 했을 때 상대적으로 안전하다.
최근 MSC 기반의 치료는 다양한 퇴행성신경질환의 치료효과에 있어서 안전성과 다양한 수준에서 평가되어져 왔다. 그러나 다발성경화증에 있어서 줄기세포 기반의 치료의 진정한 효과와 정확한 메카니즘에 대한 많은 질문이 남아있으며, 인간에 있어서 MSC기반 치료의 치료적 효과와 안정성 확인하기 위해 추가적인 임상실험이 필요할 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실험예
>
1.
MSC
배양과
Adenovirus
감염
인간 골수로부터 유래한 MSC는 Lonza (Walkersville, Maryland, USA)로부터 구매하였으며, MSC는 MSC성장배지(Lonza)에서 5X104 cells/cm2 로 계대배양 되었으며, 5계대에서 8계대를 실험에 사용하였다.
EGFP (Ad-GFP)와 mouse IFN-β(Ad-IFN-β)를 코딩하는 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터가 제작되었으며, 제조사(Quantum Biotechnologies, Carlsbad, CA, USA)의 지침에 따라 Ad-Easy 벡터시스템을 사용해서 만들어졌다.
아데노바이러스 벡터를 사용한 이유는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스보다 변형에 안정적이기 때문에 장기적으로 안정하게 IFN-β 유전자의 발현을 유도할 수 있기 때문이다. 도면 7에 도시한 아데노바이러스 벡터를 이용하여 아데노바이러스-IFN-β를 제작한 후에 인간유래의 골수 중간엽줄기세포에 감염시켰으며, 실험결과 IFN-β가 벡터에 도입된 것을 확인하였고 안정적으로 IFN-β가 발현되는 것을 확인하였다. 이 때 Quantum사의 pAdEasy-1을 이용하였으며,infection을 위하여 MSCs는 1x106개로 배양 하였으며 바이러스를 50 MOI(multiplicity of infection: 감염다중도)로 사용하였음. 또한 아데노바이러스의 세포 내 도입은 CAR(Coxakievirus and Adenovirus receptor)의 발현에 의존적 인데, 사용 줄기세포에 CAR 발현이 낮을 경우, 세포투과성 펩타이드 PTD (Protein Transduction Domain) 또는 양이온 Fe3+ 를 이용하여 CAR 비의존적으로 줄기세포 내로 치료유전자인 IFN-β의 이입효율을 높였다.
2.
EAE
유도 및 처치
EAE는 MOG35-55를 사용하여 10주령의 C57BL/6 암컷 마우스(Charles River Laboratories)에 유도되었다.
MOG35-55는 6 mg/ml의 마이코박테리아 폐결핵(Mycobactrium tuberculosis)를 포함하고 있는 CFA(complete Freund's adjuvant)에 현탁하였으며, 각각의 마우스 2부분에 총 200ng의 MOG35-55를 피하주사 하였다. MOG35-55 주사 2시간 경과 후 및 24시간 경과 후에 각각의 마우스는 100ng의 Bordetella pertussis(백일해균)을 복강내에 투여했다.
마우스는 다음과 같은 임상증상의 점수(Score)로 환산되어졌다. 임상적인 증상이 없으면 0점, 늘어진 꼬리가 나타나면 1점, 뒷다리에 부분적인 마비가 나타나면 2점, 뒷다리에 완전한 마비가 나타나면 3점, 뒷다리에 완전한 마비와 앞다리에 완전한 마비가 나타나면 4점, 빈사상태 또는 사망에 이르면 5점이다.
마우스는 무작위적으로 다음의 세 그룹으로 나뉘어졌으며, 면역조치 후 7일째에 정맥주사로 투입되었다.
제1그룹: PBS (n=7), 제2그룹:MSCs-GFP (n=7, 1 x 106 cells /each mouse), 제3그룹:MSCs-IFNβ (n=7, 1 x 106 cells /each mouse).
3.
탈수초화
및 염증침윤에 대한 조직학적 분석
면역처리 후 37일된 EAE마우스의 요추척수를 4% paraformaldehyde로 고정되며 O.C.T로 포매한 다음 조직학적 평가를 수행하였으며, 각각의 냉동된 부위는 염증침윤과 탈수초화를 측정하기위해 LFB(Luxol fast blue)와 H&E(hematoxylin-eosin)로 염색하였다.
각각의 그룹마다 4개의 개체를 3부위씩 정량평가가 수행되었으며, 침윤세포는 동물의 상태를 모르는 검사자에 의해서 카운트되었다
침윤세포의 수와 엑손의 탈수초화 정도의 평균값은 무작위적으로 선택되어지는 부위에서 결정되었으며, 이러한 부위는 각 그룹의 4개체 마다 동일 요추의 최소 3부분에서 얻어진 손상부위 내에서 선택되었다.
모든 이미지는 MetaMorph software(Molecular Devices, Downingtown, PA, USA)를 사용하는 컴퓨터를 이용하여 측정되었다.
4.
ELISA
와
ELISPOT
를 통한 사이토카인 결정
혈장은 면역조치 후 37일째에 처치된 그룹 중에서 3개체로부터 수득되었으며, IFN-β, TNF-β, IL-4 및 IL-10농도를 측정하기 위해 Quantikine immunoassay키트(R&D systems; Minneapolis, MN)를 사용하여 ELISA를 수행하였다.
IFN-β와 IL-4를 측정하기 위해서 R&D systems로부터 ELISPOT(Enzyme-linked immunospot ) Kit를 구매하였다.
1% BSA를 포함하는 살균한 PBS로 플레이트를 1시간 동안 차단되었으며, 살균한 PBS로 3번씩 세척하였으며, 지라세포는 각각의 처리된 그룹에서 분리되었으며, MOG35-55를 10 μg/ml 농도로 포함하는 배지에서 48시간동안 37℃ 항온배양한 후 세척하였다
IFN-β과 IL-4의 분비를 검출하기 위해 바이오틴결합항체(Biotinylated antibody), Streptavidin-AP, NBT/5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate substrate (Vector Labs, Burlingame)가 사용되었으며, Zeiss Microscopy (Oberkochen, Germany)를 사용하여 spot을 측정하였다.
5.
RT
-
PCR
모든 RNA는 제조사의 지침서에 따라 TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY)을 사용하는 cerebral cortex에서 준비되었다.
2μg RNA, oligo(dT) primer, Superscript II polymerase을 사용하는 R-PCR(Invitrogen)를 통해서 cDNA가 합성되었다
PCR 증폭은 총 32회의 denaturation(94℃, 30 sec), annealing(54℃, 30 sec), extension(72℃, 1 min)으로 이루어졌으며, 최초 denaturation은 94℃에서 7분 동안 하며, 최후 extension은 72℃에서 7분 동안 이루어 진다.
사용된 타겟 primer는 다음과 같다.
BDNF forward: 5＼-TGTG ACAGTAT TAGCGAGT GGGT-3';
BDNF reverse: 5＼-ACGATTGGGTAGTTCGGCATT-3',
NGF forward: 5＼-ACTCTGTCCCTGAAGCCCACTG-3＼;
NGF reverse 5＼-TGTTGCGGGTCTGCCCTGTC-3＼
GAPDH forward: 5＼-TCCATGACAACTTTGGTATCG-3＼,
GAPDH reverse: 5＼-TGTAGCCAAATTCGTTG TCA-3＼.
6.
In
vivo
형광 이미지분석
각 동물조직에서 표지된 세포가 탐지될 수 있도록 NIR(Near Infrared)가 표지된 hBM-MSCs가 정맥주사 되고, CRi Maestro in vivo imaging system(CRI, Inc., Woburn, MA)를 사용하여 추적하였으며, 1.5% isoflurane 가스로 마우스를 마취한 후에 통기하고, 그후에 이미지를 촬영했다.
마우스에서 방출되는 형광신호(photons/sec)는 고감도 고체촬상소자카메라(charge-coupled device camera: CCD)를 통해서 포착하였으며, Maestro software를 통해서 분석되었다. fluorescein과 자가형광(autofluorescence)의 불혼화(unmixing) 영상을 얻기 위해 분광불혼화 알고리즘(Spectral unmixing algorithm)을 적용하였다
이 방법의 특이성과 감도를 입증하기 위해 뇌와 척수의 NIR이 표지된 MSC-FN-β을 anti-hNA (human nuclear antigen)의 다중클론성항체(Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용한 면역형광염색법을 사용하여 검출하였으며, Alexa 488(Molecular Probes)과 항토끼 2차 항체가 결합된 것으로 검출하였다.
7.
Evans
blue
염색을 통한 형광검출
EB(Evans blue) 추적표지가 주변에서 대뇌와 척추조직으로 흡수되었는지는 분광광도계를 이용하여 측정하였으며, 컨트롤 그룹의 각 마우스 꼬리정맥에 4%의 EB가 정맥주사로 주입되었다. 또한 임상질환의 피크에 있는 개별 마우스는 실험적 EAE 그룹으로 식별된다.
4시간 후 마우스는 PBS로 관류고정하여 도살하였다. 척수는 제거되고, 0.5% TritonX-100과 함께 분쇄하였다.
상등액은 100 μl/well로 flat-bottom 96 well plate에 분주되었고 형광은 마이크로플레이트 형광리더(PerkinElmer, Wellesley, MA, USA)를 사용하여 정량하였다(excitation: 620 nm, emission: 680 nm). 데이터 값은 형광의 강도로 제시되며, 각 그룹마다 최소 3개체의 평균값을 나타낸다
모든 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내며, 다른 실험 조건과에 통계적 차이는 T-검정으로 결정하며, 0.05 미만의 확률치는 유효치로 고려된다
<
실시예
1>
EAE
가 유도된 마우스에
IFN
-β를 분비하는
MSC
를 이식한 후 임상적 상태.
본 발명에서 발명자는 다발성경화증 치료를 위한 IFN-β유전자를 전달하기 위해 hBM-MSCs을 최초로 사용하였으며, hBM-MSCs은 다른 줄기세포보다 많은 이점을 가지고 있다. 골생검을 통해 인간척수로부터 쉽게 획득할 수 있으며 in vitro에서 활용할 수 있고, 세포분열의 정지를 유도하여 T세포, B세포, 수지상세포의 증식을 저해한다.
hBM-MSCs는 또한 natural killer 세포의 증식을 저해할 수 있으며, 항원제시기능을 약화시킨다. 더욱이 인간의 자가 MSC은 GVHD(acute graft-versus-host disease)의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 hBM-MSCs의 면역조절기능이 EAE의 상승적 치료효과를 제공할 수 있다.
본 발명에서는 IFN-β의 유전자가 도입된 MSCs-IFN-β이 장기적인 치료적 농도의 IFN-β을 장기적 발현을 제공할 수 있다.
in vitro에서 MSCs-IFNβ이 IFN-β를 분비할 수 있는지 또는 MSCs-IFNβ가 치료에 필요한 충분한 기간 동안 in vivo에서 살아남을 수 있는지 확인하기 위해서, 본 발명자는 EAE 마우스 혈장에서 IFN-β 단백질의 수준과 수명을 측정하였다.
MSCs-IFN-β의 상등액에서 IFN-β는 3일에 검출되었고, 40일 동안 지속되었으며, GFP가 도입된 MSCs (MSCs-GFP)에서는 IFN-β이 검출되지 않았다.(도 1(a) 참조)
EAE모델에서 MSCs-IFN-β처치 후 다른 날 측정한 ELISA분석은 혈장내 IFN-β 단백질의 발현이 7일에 최고치이며, 13일 이후에는 감소하며, 3주간 지속되었다.(도 1(b)참조)
부가적으로 MSCs-IFNβ이 이식된 마우스에서 혈장내 IFN-β 단백질은 MSCs-GFP이 이식된 마우스에서 발현보다 더 높은 것이 나타났다.
대조군으로 MSCs-GFP이 이식된 마우스의 혈장에서 낮은 수준의 IFN-β 단백질이 발현되는 것은 MSC가 숙주세포의 사이토카인 분비를 유도하기 때문으로 추측된다.
따라서 hBM-MSCs의 단일투여는 단백질 전달에 비해서 투여횟수를 줄이며, 단백질의 장기발현, 치료효율의 증가하며, 반면에 부작용을 최소화 할 수 있는 점 등 현저한 이점을 줄 수 있다.
치료는 면역처리 후 7일에 첫 개체가 신경 증상이 나타난 때로부터 시작했으며, 각 그룹의 평균 면역점수는 도 2(a)에 나타내었다.
면역처리 후 0일부터 40일 사이에 각 개체의 평균 최대치와 평균점수를 분석하였으며, 본 발명자는 MSCs-IFNβ 투여 후 1일부터 14일까지 관찰하였다.
신경학적 후유증은 안정되었으며, MSCs-GFP가 처리된 EAE 마우스와 비교하여 MSCs-IFNβ가 처리된 각 그룹의 모든 마우스에 대한 면역점수의 최고치 및 평균치가 현저하게 낮아졌다.(도 2 (b) 참조)
이러한 결과들을 종합하면 MSCs가 유망한 IFN-β의 전달체로 사용될 수 있음을 나타내며, 또한 MSCs-IFNβ가 EAE에서 IFN-β를 장기적으로 분비하여 강력한 치료효과를 보인다.
도 1은 MSCs-IFNβ의 발현을 in vivo 및 in vitro에서 측정한 것을 도시한 것이다. (a) IFN-β 단백질 생산은 IFN-β이 형질도입된 MSC의 경우 상등액에서 ELISA를 통해서 검출하였으며, MSCs-GFP는 비교군으로 사용되었다. (b) EAE에서 분비된 IFN-β의 발현량과 발현기간을 측정하기 위해서 혈장은 치료 후 다른 날에 분리되고 ELISA를 통해서 분석하였으며, 결과는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 2는 MSCs-IFNβ가 처리된 EAE 마우스에서 임상적인 강도(Clinical severity)를 도시한 것이다. (a) EAE는 MOG 35-55에 의해서 암컷 C57 BL/6 마우스를 대상으로 유발되었고, 면역처치된 마우스는 7일 후에 각각 PBS, MSCs-GFP, 또는 MSCs-IFNβ처리되었으며, 임상적 증상의 현저한 향상을 초래했다. (b) PBS-, MSCs-GFP 및 MSCs-IFNβ처치된 모든 EAE 마우스에서 60일 동안 면역점수의 최대치 및 평균치를 나타낸 것으로, 결과는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다 (n=7/each group). Columns, mean; bars, SE. * P < 0.05, ** P < 0.01,
<
실시예
2>
MSCs
-
IFN
β에 의한
EAE
마우스의 요추 척수에서 염증 및
탈수초화
감소
다발성경화증의 전형적인 특징은 CNS에서 다초점 혈관주위의 단핵 염증 침윤, oligodendrocyte와 탈수초화이다.
EAE모델에서 가장 중요한 조직병리학적 변화는 요추 척수에서 나타나며, H&E 염색에 의해 PBS- 또는 MSCs-GFP처리된 EAE 마우스의 경우 요추 척수의 백질에서 백혈구의 분명한 침윤을 나타내나 MSC-IFNβ의 경우 염증성 침윤이 현저히 감소되었다(도 3(a) 참조).
각각의 처리군에서 선별된 3개체 마다 3부위의 침윤된 세포수가 카운트되었다
EAE 마우스에서 PBS 와 MSCs-GFP가 처리된 그룹에 비해 MSCs-IFNβ처리된 그룹은 척수의 침윤된 세포에서 통계적으로 현저한 감소가 확인되었으며, 다음으로 LFB 염색을 통해 탈수초화 존재를 측정하였으며, 염증성 침윤의 결과와 부합하여 MSCs-IFNβ은 EAE 마우스 척수의 백질에서 탈수초화를 현저하게 저해한다(도 3(b) 참조).
이러한 결과들은 MSCs-IFNβ가 EAE에서 탈수초화와 염증성침윤의 감소를 통해서 효과적으로 병리학적 결과 면에서 개선될 수 있음을 제시한다.
도 3은 EAE 마우스의 척수에서 감소된 염증침윤과 탈수초화를 도시한 것이다. (a) 각각의 처치에 의해서 EAE마우스의 요추 척수에서 염증침윤을 나타낸다. T(n=4/each group). 통계적결과는 PBS 또는 MSCs-GFP처리에 비해서 MSCs-IFNβ처리가 침윤세포의 현저한 감소한 결과를 보여주며,
(b) 각각의 처치에 의해서 EAE마우스의 요추 척수에서 탈수초화을 나타낸다 Tn=4/each group). 통계적결과는 PBS 또는 MSCs-GFP처리에 비해서 MSCs-IFNβ 처리가 탈수초화의 현저한 감소한 결과를 보여주며, 사각형은 탈수초화 및 침윤이 나타난 지역을 나타낸다.
<
실시예
3>
MSCs
-
IFN
β
modulated
the
levels
of
Th1
and
Th2
cytokines
in
the
serum
of
EAE
mice
EAE에서 MSCs-IFNβ가 면역조절효과가 있는지를 결정하기 위해서 본 발명자는 EAE유도 이후 30일인 재발단계에서 MSCs-IFNβ처치 후 Th1계열 사이토카인(IFN-β, TNF-β)관 Th2계열 사이토카인(IL-4, IL-10) 수준을 측정하였다.
MSCs-IFNβ가 처리된 EAE마우스는 PBS- 또는 MSCs-GFP가 처리된 마우스에 비해서 IFN-β와 TNF-β의 사이토카인 수준은 현저하게 감소하였으며, 반면 IL-4과 IL-10의 수준은 현저하게 증가하였다(도 4(a) 참조).
또한 본 발명자는 항MOG35-55로 자극된 지라세포에서 MSCs-IFNβ 처리 후에 IFN-β와 IL-4가 생산된 것을 확인하였다.
지라세포에서 MOG특이적인 IFN-β/IL-4의 생산량은 ELISPOT에 의해서 결정하였다.
입체학적 분석에 의해, MSCs-IFNβ가 처리된 그룹은 PBS 또는 MSCs-GFP가 처리된 그룹과 비교하여 IFN-β는 현저히 감소한 반면, IL-4 분비는 증가하였다(도 4(b) 참조).
이러한 결과에 의해 MSCs-IFNβ가 질병의 반응기(effector phase)에 조직적으로 영향을 미치기 때문인 것으로 나타났다.
공통적으로, PBS 또는 MSCs-GFP가 처리된 그룹과 비교하여 MSCs-IFNβ가 처리된 EAE 마우스에서 사이토카인의 균형이 Th1 사이토카인에서 Th2 사이토카인으로 현저한 이동이 있음이 밝혀졌다.
도 4는 EAE 마우스에서 MSCs-IFNβ가 면역반응을 조절하는 것을 도시한 것이다. (a) PBS-, MSCs-GFP 및 MSCs-IFNβ처치 후 30일된 3그룹의 EAE 마우스에서 혈장을 채취하였다. (n=3/each group). 혈장에서 Th1 (IFN-γ, TNF-α) 과 Th2 (IL-4, IL-10)의 사이토카인 수준을 ELISA를 이용하여 정량한 것이다. (b) 면역처리 후 37일된 EAE 마우스에서 지라세포를 채취하였으며(5×105/well), 그런 다음 세포를 MOG35-55로 자극하였다
MOG 특이적인 IFN-γ/IL-4를 생산하는 지라세포의 수는 ELISPOT assay로 결정하였다. (n=3/each group) IFN-γ/IL-4 생산하는 위치를 보인 것이다. Magnification, ×1. Columns, mean; bars, SE. * P < 0.05; ** P < 0.01, Student's t test. 이 결과는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
<
실시예
4>
MSCs
-
IFN
β
induced
neurotrophins
in
the
brain
of
EAE
mice
MSCs-IFNβ 처리의 또 하나의 유익한 효과는 면역조절기능에 기여하는 것 뿐만 아니라, 신경보호효과도 발생한다는 점이다. 염증으로부터 신경보호효과가 확인되었고, 이는 뉴트로핀(neurotrophin)이 관여한다고 생각되어진다.
BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 또는 NGF(nerve growth factor)과 같은 뉴트로핀은 EAE에서 감소된다고 알려져 있으며, 또한 뉴런 또는 oligodendrocyte의 생존, 엑손재생 또는 재수초화(remyelination)를 자극하는 극적인 효과를 보여주었다. 더욱이 IFN-β 또는 glatiramer acetate 같은 몇몇 다발성경화증에 대한 승인된 치료법은 EAE마우스에서 이러한 2종의 NTs에 영향을 미침으로써 유효한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 대한 가능성을 다루기 위해서 MSCs-IFNβ처치된 EAE 마우스의 뇌에서 BDNF와 NGF의 mRNA발현을 조사하였으며, PBS 또는 MSCs-GFP가 처리된 그룹과 비교하여 MSCs-IFNβ가 처리된 EAE 마우스에서 BDNF와 NGF의 발현량은 극적으로 높았다(도 5 참조).
IFN-β는 성상교세포에 의해 NGF를 생산하는 강력한 프로모터였으며, 다발성경화증환자의 PBMC(peripheral blood mononuclear cell: 말초혈 단핵세포)에서 BDNF의 생산을 유도할 수 있음이 보고되었다.
더욱이 만성진행형 EAE와 재발이장성 EAE에서 Th1/Th2 면역편위(immune deviation)가 중추적 역할을 하는 동안 NGF는 Th1 사이토카인과 Th2 사이토카인 사이에서 면역조절역할을 한다. 따라서 MSCs-IFNβ에서 IFN-β의 분비는 EAE에서 NTs를 유도하여 pro-inflammatory (Th1)와 anti-inflammatory (Th2) 사이토카인의 균형을 효과적으로 조절할 수 있다.
도 5는 MSCs-IFNβ는 EAE 마우스의 대뇌피질에서 neurotrophin을 유도를 도시한 것이다. (a) PBS-, MSCs-GFP 및 MSCs-IFNβ처치 후 EAE 마우스의 대뇌피질에서 BDNF와 NGF를 위한 RT-PCR 분석한 것이다.(n=3/each group).
(b) PBS-, MSCs-GFP 처치된 그룹과 비교하여 MSCs-IFNβ처치된 그룹의 뇌에서 BDNF와 NGF의 mRNA 발현이 현저하게 유도되었다(n=3/each group). Columns, mean; bars, SE. * P < 0.05; ** P < 0.01,
<
실시예
5>
MSCs
-
IFN
β
migrates
inflamed
brain
and
spinal
cord
,
and
regulates
BBB
permeability
본 발명자들은 MSCs가 상처부위로 강한 이전능력(migratory capacity)을 밝혔으며, 또한 유전적으로 조작된 MSCs가 상처부위에 tropism을 갖으며, 신경퇴행성질환에서 신경기능회복을 상승시킨다는 사실을 확인하였다.
MSCs-IFNβ를 테스트하기 위해서 in vivo image 분석시스템을 이용하여 in vivo migration assay를 하였다.
정상의 동물에서 MSCs-IFNβ 정맥주사한 결과 폐와 간에서 축적되었다. 반면 EAE 마우스에서는 뇌와 요추에 상응하는 부위에서의 biofluorescence 신호가 나타났으며, EAE마우스에서 조직부분 MSCs-IFNβ 처치후 7일째 immunohistochemistry에 의해서 확인되었다
양자의 방출은 Maestro in vivo 이미지 시스템에 의해 검출되었으며, 뇌와 요추 내부의 hNA양성요소(녹색)를 검출에 의해서 입증된 것처럼 조직내부의 NIR표지된 MSCs의 존재로부터 발생하였다(도 6(a) 참조).
이러한 결과는 MSCs-IFNβ가 염증이 발생한 CNS로 이동특성까지 갖으며, BBB를 통과할 수 있음을 증명하며, 염증, 탈수초화, BBB장애는 다발성경화증의 가장 일반적인 작용이다.
본 발명에서는 처치 후 7일째 EB 함량을 측정하여 다른 처치 동물에서 BBB 통과능력이 확인되었으며, PBS가 처리된 EAE마우스는 정상 마우스와 비교하여 뇌와 요추척수에 EB 함량이 현저히 증가하였음을 보여 준다.
강화된 BBB 통과능력과 CNS로 많은 양의 림프구를 침투시키는 능력은 다발성경화증과 EAE의 발달과 진전에 중요한 역할을 한다. 그러나 MSCs-GFP처치된 EAE마우스와 비교하여 MSCs-IFNβ처리된 EAE 마우스에서 뇌와 요추에서 EB 함량이 현저히 감소한 것으로 나타났다(도 6(b) 참조).
이러한 결과는 MSCs-IFNβ 치료에 의해 BBB통과능력의 추가적인 피해를 방지할 수 있다는 것을 보여준다.
감소된 BBB통과능력은 CNS로 림프구 침투가 감소되며 결과적으로 CNS 염증과 탈수초화가 감소할 수 있는 가능성을 보여준다. 또한 MSCs-IFNβ처치된 EAE마우스에서 행한 조직학적 평가결과와 일치한다.
도 6은 EAE 마우스에서 MSCs-IFNβ의 효과로서 이동성능과 BBB 통과성능을 도시한 것이다. (a) 처치 후 7일에 정상 마우스 및 EAE 마우스의 뇌와 척수에서 NIR 표지된 MSCs-IFN-β가 검출되었다. (n=3/each group)
사진은 마우스의 뇌와 척수에서 biofluorescence 신호를 검출한 것을 나타내며, biofluorescence 신호는 초당 발생하는 광자로 주어지며, 뇌와 요추조직에서 NIR 양성 세포(적색)를 탐지하기 위해서 EAE 마우스의 동결절편은 hNA에 의해서 염색되었다. hNA에 양성인 핵은 녹색으로 염색되었으며, DAPI로 대비염색이 행해졌다.
(b) 다른 처리된 동물의 BBB 무결성은 처치 후 7일에 EB 함량으로 정량되었다. Columns, mean; bars, SE. * P < 0.05; ** P < 0.01, 뇌와 요추조직에서 EB의 강도는 spectrofluorometer(620nm)를 이용하여 측정되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 유효성분으로 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 인간 골수는 염증질환이 발병한 환자로부터 수득한 자가골수(autologous bone marrow)인 것을 특징으로 하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 상기 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)는 Th1 사이토카인은 감소시키거나 또는 Th2 사이토카인은 증가시키는 면역조절기능에 의한 것을 특징으로 하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료는 탈수초화방지(demyelination), 신경보호효과(neuroprotective effect), 염증성침윤(Inflammatory infiltration)의 억제효과 또는 혈액뇌장벽(bloodbrain barrier)의 투과성(permeability)을 감소시키는 것을 특징으로 하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 인간 골수로부터 수득한 중간엽줄기세포(MSC)를 IFN-β유전자가 도입된 아데노바이러스 벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는 다발성경화증 또는 뇌척수염의 예방 또는 치료효과를 갖는 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs) 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 인간 골수는 다발성경화증 또는 뇌척수염이 발생한 환자로부터 수득한 골수인 것을 특징으로 하는 IFN-β유전자가 도입된 인간 골수 유래의 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs) 제조방법. - 시험관 내에서(In vitro) IFN-β유전자가 도입된 인간 골수유래 중간엽줄기세포(IFNβ-hBM-MSCs)를 동물에서 수득한 혈장에 혼합하여 Th1 사이토카인(proinflammatory cytokine)은 감소시키거나 또는 Th2 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)은 증가시키는 사이토카인발현의 조절방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130070854A KR20140147493A (ko) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Interferon-beta를 도입한 인간골수유래의 MSC 세포(IFNβ-hBM-MSCs)의 다발성경화증 치료제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130070854A KR20140147493A (ko) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Interferon-beta를 도입한 인간골수유래의 MSC 세포(IFNβ-hBM-MSCs)의 다발성경화증 치료제 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140147493A true KR20140147493A (ko) | 2014-12-30 |
Family
ID=52676265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR20130070854A KR20140147493A (ko) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Interferon-beta를 도입한 인간골수유래의 MSC 세포(IFNβ-hBM-MSCs)의 다발성경화증 치료제 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20140147493A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019218271A (ja) * | 2018-06-15 | 2019-12-26 | 有限会社大阪空気機械サービス | 組織治癒剤 |
-
2013
- 2013-06-20 KR KR20130070854A patent/KR20140147493A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019218271A (ja) * | 2018-06-15 | 2019-12-26 | 有限会社大阪空気機械サービス | 組織治癒剤 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | Novel therapeutic strategy for stroke in rats by bone marrow stromal cells and ex vivo HGF gene transfer with HSV-1 vector | |
| Russi et al. | The meninges: new therapeutic targets for multiple sclerosis | |
| Gama et al. | Conditioned medium of bone marrow‐derived mesenchymal stromal cells as a therapeutic approach to neuropathic pain: A preclinical evaluation | |
| Manservigi et al. | HSV recombinant vectors for gene therapy | |
| Ryu et al. | Gene therapy of intracranial glioma using interleukin 12–secreting human umbilical cord blood–derived mesenchymal stem cells | |
| Shyu et al. | Homing genes, cell therapy and stroke | |
| Ding et al. | Silencing IFN-γ binding/signaling in astrocytes versus microglia leads to opposite effects on central nervous system autoimmunity | |
| Costa-Ferro et al. | Transplantation of bone marrow mononuclear cells decreases seizure incidence, mitigates neuronal loss and modulates pro-inflammatory cytokine production in epileptic rats | |
| Lu et al. | Overexpression of CNTF in Mesenchymal Stem Cells reduces demyelination and induces clinical recovery in experimental autoimmune encephalomyelitis mice | |
| JP5294635B2 (ja) | コポリマー１と組み合わせた、神経発生の誘発及び幹細胞治療 | |
| Currier et al. | VEGF blockade enables oncolytic cancer virotherapy in part by modulating intratumoral myeloid cells | |
| Wang et al. | CXCR4+ CD45− BMMNC subpopulation is superior to unfractionated BMMNCs for protection after ischemic stroke in mice | |
| Bao et al. | Blockade of interleukin-7 receptor shapes macrophage alternative activation and promotes functional recovery after spinal cord injury | |
| Gan et al. | Antibody to α4 integrin suppresses natural killer cells infiltration in central nervous system in experimental autoimmune encephalomyelitis | |
| Hou et al. | Interferon β-secreting mesenchymal stem cells combined with minocycline attenuate experimental autoimmune encephalomyelitis | |
| Cho et al. | Combination therapy of human bone marrow–derived mesenchymal stem cells and minocycline improves neuronal function in a rat middle cerebral artery occlusion model | |
| Li et al. | Functional recovery after acute intravenous administration of human umbilical cord mesenchymal stem cells in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury | |
| Martino et al. | Cytokine therapy in immune-mediated demyelinating diseases of the central nervous system: a novel gene therapy approach | |
| US20230026342A1 (en) | New generation regulatable fusogenic oncolytic herpes simplex virus type 1 virus and methods of use | |
| Gärtner et al. | Interleukin-4 as a therapeutic target | |
| Wang et al. | Intracerebroventricular administration of lupus serum induces microglia activation and leukocyte adhesion in the cerebromicrovasculature of mice | |
| Qi et al. | VEGFR-3 signaling restrains the neuron-macrophage crosstalk during neurotropic viral infection | |
| KR20140147493A (ko) | Interferon-beta를 도입한 인간골수유래의 MSC 세포(IFNβ-hBM-MSCs)의 다발성경화증 치료제 | |
| US20190106709A1 (en) | Hsv vectors with enhanced replication in cancer cells | |
| US20230321152A1 (en) | Cytokine storm suppressor, method for using cytokine storm suppressor and screening method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |