JP2019218271A

JP2019218271A - 組織治癒剤

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Publication number: JP2019218271A
Application number: JP2018114800A
Authority: JP
Inventors: 晃文松山; Akibumi Matsuyama; 華雪大倉; Hanayuki Okura
Original assignee: REGENE PHARM KK; Osaka Air Machine Service Ltd; Regene Pharm Co Ltd
Current assignee: REGENE PHARM KK; Osaka Air Machine Service Ltd; Regene Pharm Co Ltd
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2019-12-26
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: EP3808356A4; EP3808356A1; WO2019240296A1; JP6923137B2; CA3101965A1; US20210244766A1

Abstract

【課題】間葉系組織由来細胞の組織治癒能をさらに向上させる。【解決手段】生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清、および医薬上許容される担体を含む、組織治癒のための医薬組成物、ならびに該医薬組成物の製造方法。

Description

本発明は、組織治癒のための医薬組成物およびその製造方法に関する。詳細には、薬剤処理された間葉系組織由来接着細胞またはその培養上清を含む組織治癒剤およびその製造方法に関する。

間葉系組織由来細胞が組織治癒に有用であることが示されている。なかでも間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は再生医療への臨床応用に向けて盛んに研究が行われている。例えば脂肪組織は幹細胞（ＡＳＣ）の供給源とされており（非特許文献１）、ＡＳＣが様々な領域において治療効果があることが知られている（非特許文献２）。また、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）も肝疾患の治療に効果的であることが示されている（特許文献１）。

このように、間葉系組織由来細胞が組織治癒を包含する再生医療において有用であることが示されているが、その治癒能のさらなる向上が望まれている。

国際公開公報ＷＯ２００８／１５３１７９

Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 2002; 13: 4279-4295. Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy, Vol. 59, No. 3: 450-456, 2013

間葉系組織由来細胞の組織治癒能をさらに向上させることが課題であった。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳ（リポ多糖）で処理された間葉系組織由来の接着細胞またはその培養上清の組織治癒能が極めて高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清、および医薬上許容される担体を含む、組織治癒のための医薬組成物。
（２）生理活性ポリペプチドが、炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子、ケモカイン、ホルモンおよびインターフェロンからなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである（１）記載の医薬組成物。
（３）生理活性ポリペプチドが、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである（１）または（２）記載の医薬組成物。
（４）間葉系組織由来の接着性細胞が間葉系組織由来幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、胎盤組織に由来する細胞、臍帯組織に由来する細胞、胞衣組織に由来する細胞、骨髄組織または滑膜組織に由来する細胞である（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）組織治癒が組織保護、組織・細胞傷害の修復、組織を構成する細胞の増殖促進、組織の炎症抑制または組織形状の再構築である（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）組織治癒が慢性期の疾患における組織治癒である（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）組織治癒のための医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）間葉系組織由来の接着性細胞を生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理し、次いで、
（ｂ）工程（ａ）にて処理された細胞またはその培養上清を医薬上許容される担体と混合する
を含む方法。
（８）生理活性ポリペプチドが、炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子、ケモカイン、ホルモンおよびインターフェロンからなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである請求項７記載の方法。
（９）生理活性ポリペプチドが、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである（７）または（８）記載の方法。
（１０）間葉系組織由来の接着性細胞が間葉系組織由来幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、胎盤組織に由来する細胞、臍帯組織に由来する細胞、胞衣組織に由来する細胞、骨髄組織または滑膜組織に由来する細胞である（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）組織治癒が組織保護、組織・細胞傷害の修復、組織を構成する細胞の増殖促進、組織の炎症抑制または組織形状の再構築である（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）組織治癒が慢性期の疾患における組織治癒である（７）〜（１１）のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、極めて組織治癒能の高い医薬組成物が得られる。本発明の医薬組成物は、慢性期の組織傷害等における組織治癒に有用である。

図１は、ＩＬ−１βで処理された脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）のアディポネクチン産生量（左）と、ＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣのアディポネクチン産生量（右）を比較した図である。縦軸はアディポネクチンの産生量を示す。図１は、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣの幹細胞増殖因子（ＨＧＦ）産生量（左）と、ＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣのＨＧＦ産生量（右）を比較した図である。縦軸はＨＧＦの産生量を示す。図３は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおけるＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣによる肝臓内線維の減少を示すシリウスレッド染色組織切片像である。左が担体投与群、中がＩＬ−１β処理していないＡＤＭＰＣ投与群、右がＩＬ−１β処理したＡＤＭＰＣ投与群の結果である。倍率は５０倍である。図４は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおけるＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣによる肝組織の傷害の軽減を示すＨＥ染色組織切片像である。左が担体投与群、中がＩＬ−１β処理していないＡＤＭＰＣ投与群、右がＩＬ−１β処理したＡＤＭＰＣ投与群の結果である。上段の倍率は５０倍、下段の倍率は２００倍である。図５は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおける、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣおよびＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣによる肝組織の傷害の軽減を、NAFLD Activity Scoreを用いて比較した図である。ｐ値はMann-Whitney's U検定による。図６は、重症心筋梗塞モデル動物（ブタ）における、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣおよびＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣによる左室駆出率の改善を示す図である。縦軸（ΔＥＦ％）は細胞投与前後の左室駆出率の変化（％）を示す。白棒は細胞を投与しなかったコントロール群、斜線棒はＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣを投与した群、黒棒はＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣを投与した群を示す。図７は、慢性肝炎モデル動物（ラット）における、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ＋）、胎盤由来細胞（ＡＭ＋）および骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ＋）、ならびにＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ−）、胎盤由来細胞（ＡＭ−）および骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−）による、肝組織の傷害の軽減を調べた結果を示すグラフである。縦軸はシリウスレッド染色領域（線維化領域）の面積を示す。ｐ値は以下のとおりである：ＡＤＭＰＣ−対ＡＤＭＰＣ＋０．０１８、ＢＭ−対ＢＭ＋０．０１６、ＡＭ−対ＡＭ＋０．０３２、コントロ−ル対ＡＤＭＰＣ− ０．００８、コントロール対ＢＭ− 有意差なし、コントロール対ＡＭ− ０．０２２、コントロール対ＡＤＭＰＣ＋０．００４、コントロール対ＢＭ＋０．０５６、コントロール対ＡＭ＋０．０１２。図８は、重症心筋梗塞モデル動物（ヌードラット）における、ＩＬ−１βで処理された骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ＋）およびＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ＋）、ならびにＩＬ−１βで処理されていない骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−）およびＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ−）による、心組織の治癒効果を調べた結果を示すグラフである。縦軸は心筋梗塞後の心筋厚みを示す。ｐ値は以下のとおりである：コントロール対ＢＭ− ０．０２２４７９、コントロール対ＢＭ＋０．００８１１３、ＢＭ−対ＢＭ＋０．０４５３２８、コントロール対ＡＤＭＰＣ− ０．００８１１３、コントロール対ＡＤＭＰＣ＋０．０１９９６４、ＡＤＭＰＣ−対ＡＤＭＰＣ＋０．０１４２１４。図９は、実施例８におけるホルマリン固定した肺の切断部位を示す図である。図１０は、肺線維症モデル動物（マウス）における、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣおよびその培養上清ならびに生理食塩水による、肺組織の治癒効果を調べた結果を示すグラフである。縦軸は肺線維化のスコアである。

本発明は、１の態様において、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清、および医薬上許容される担体を含む、組織治癒のための医薬組成物を提供する。ここで、生理活性ポリペプチドは、生体の特定の生理的調節機能に対して作用するポリペプチドである。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸残基がペプチド結合を介して結合した物質をいう。ＬＰＳは様々な種類のものが知られており、いずれのＬＰＳを用いてもよい。

本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、その変異体も包含する。生理活性ポリペプチドの変異体は、間葉系組織由来接着細胞に作用させた場合に本発明の組織治癒に使用できる間葉系組織由来接着細胞またはその培養上清を得ることができる活性を有するものである。

変異体は、元のペプチドと比較して、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基が置換、欠失または付加されているポリペプチドをいう。置換、欠失または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されない。例えば、置換、欠失または付加されるアミノ酸残基は１個〜数個であってもよい。また例えば、変異体ポリペプチドは、元のポリペプチドに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、例えば９５％以上９７％以上または９９％以上のものであってもよい。さらに生理活性ポリペプチドの変異体は、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基が修飾されているものであってもよい。修飾はあらゆる種類の標識であってよい。メチル化、ハロゲン化、配糖体化などの化学修飾であってもよく、蛍光標識や放射性標識などの標識付加であってもよい。また、生理活性ポリペプチドの変異体は、一部のアミノ酸残基がペプチド結合以外によって結合されているものであってもよい。

本発明で用いられる生理活性ポリペプチドはいずれのものであってもよい。本発明で用いられる好ましい生理活性ポリペプチドとしては、サイトカイン、とりわけ炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子、ホルモンおよびインターフェロンからなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドが好ましい。炎症性サイトカインは、炎症の病態形成に関与しているサイトカインである。炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、炎症性サイトカインの量を増加させる、あるいはその活性を高める作用を有するポリペプチドである。増殖因子は、生体内の特定の細胞の増殖や分化を促進するポリペプチドである。ケモカインは、Ｇタンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タンパク質であり、サイトカインの一群である。ホルモンは、生体内で生成され、体液を通じて輸送され、特定の細胞、組織または器官の活動に影響する物質である。インターフェロンは、生体内でのウイルスや病原体、腫瘍細胞といった異物の侵入に応答して産生される一群のサイトカインである。様々な炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子およびインターフェロンは公知であり、いずれのものを用いてもよい。

サイトカインとしては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２〜ＩＬ−３５、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬなどが挙げられるが、これらに限定されない。炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦαなどが挙げられるが、これらに限定されない。

炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドとしては、ＩＬ−１７Ａなどが挙げられるが、これらに限定されない。

増殖因子としては、アクチビンＡ、ＡＮＧＰＴＬ５、ＢＡＦＦ、ＢＤ−２、ＢＤ−３、ＢＮＤＦ、ＢＭＰ−１〜７、ＤＫＫ１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−１〜２１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、Ｒ−スポンジン−１〜３、ＳＣＦ、ガレクチン−１〜３、ＧＤＦ−１１、ＧＤＮＦ、プレイオトロフィン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、ＴＳＬＰ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

ケモカインとしては、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１０などが挙げられるが、これらに限定されない。

ホルモンとしては、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、Ｐａｒａｔｈｏｒｍｏｎｅ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｌｅｐｔｉｎ、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、Ｏｘｙｔｏｃｉｎ、Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）、ＣＲＨ（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）、ＧＲＨ（性腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＳＯＭ（ソマトスタチン）、ＧＲＨ（成長ホルモン放出ホルモン）、ＧＨ（成長ホルモン）、ＰＲＨ（プロラクチン放出ホルモン）、ＰＩＨ（プロラクチン抑制ホルモン）、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ（プロラクチン）などが挙げられるが、これらに限定されない。

インターフェロンとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＮＦ−Ｉ、などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明で用いられる好ましい生理活性ペプチドは、炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子およびインターフェロンであり、これらのうちで好ましいものとしては、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦα、ＴＮＦ−β、ＩＮＦ−Ｉ、ＴＧＦβ、ＥＧＦおよびＦＧＦなどが例示されるが、これらに限定されない。

組織の治癒は、組織を正常な状態に戻す、あるいは正常な状態に近づけることをいい、組織保護、組織・細胞傷害の修復、組織を構成する細胞の増殖促進、組織の炎症抑制、創傷治癒、組織形状の再構築などを包含する。本発明の医薬組成物中の細胞またはその培養上清は、組織保護や組織を構成する細胞の増殖促進などに有用であることから、本発明の医薬組成物は、慢性期の疾患における組織治癒に好ましく用いられる。

本発明の医薬組成物によって治癒される組織は、動物のあらゆる組織であり、特に限定されない。組織の例としては、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、骨、軟骨、骨髄、胃、腸、血液、神経、皮膚、粘膜、心臓、肺、毛髪などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物によって治癒される好ましい組織は肝臓、神経、皮膚、粘膜、心臓、肺などである。したがって、本発明の医薬組成物は、例えば肝硬変、肝炎、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）などの治療に好ましく用いられ、しかも慢性期の疾患に効果的である。

本発明の医薬組成物の有効成分である細胞またはその培養上清は、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清である。

本発明の医薬組成物を、有効成分である細胞または培養上清が由来する動物種と同種の対象に投与してもよく、異種の対象に投与してもよい。例えば、炎症性サイトカイン誘導剤で処理されたヒト由来の間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清を含む本発明の医薬組成物をヒト対象に投与してもよい。本発明の医薬組成物中の細胞またはその培養上清は、投与される対象と同一人に由来するものであってもよく、投与される対象とは異なる人に由来するものであってもよい。

間葉系組織由来の接着性細胞であればいずれの細胞であっても本発明に用いることができる。間葉系組織由来の接着性細胞は市販されているものであってもよく、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国）、ＮＩＴＥ（日本）などの機関から分譲されるものであってもよい。あるいは、間葉系組織由来の接着性細胞を間葉系組織から得てもよい。間葉系組織からの間葉系組織由来の接着性細胞の取得手段・方法は公知である。

好ましい間葉系組織由来の接着性細胞としては、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）などの間葉系組織由来幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、Ｍｕｓｅ細胞、骨髄組織、胎盤組織、臍帯組織、羊膜組織、軟骨組織、骨膜組織、滑膜組織、骨格筋組織、胞衣組織に由来する細胞、幹細胞および間質細胞、ならびに経血細胞などが例示されるが、これらに限定されない。

細胞を間葉系組織から得る場合は、いずれの間葉系組織から単離してもよい。間葉系組織としては、脂肪組織、骨髄組織、胎盤組織、臍帯組織、羊膜組織、軟骨組織、骨膜組織、滑膜組織、骨格筋組織、胞衣組織、経血などが例示されるが、これらに限定されない。好ましい間葉系組織としては脂肪組織、骨髄組織、滑膜組織、胎盤組織、臍帯組織、胞衣組織が挙げられ、特に脂肪組織は体内に含まれる量が多く、細胞を多く取り出せる点で好ましい。

体内から間葉系組織を取り出して、培養容器中に組織を入れて培養し、容器に付着する細胞を選択的に取得することにより、接着性細胞を得ることができる。間葉系組織は、切除や吸引といった公知の手段・方法を用いて取り出すことができる。取り出した間葉系組織をそのまま培養してもよく、必要に応じて、取り出した間葉系組織を刻んだり、解したりした後、赤血球を除去し、得られた細胞集団を培養してもよい。これらの処理方法および手段、ならびに細胞培養手段・方法は公知であり、適宜選択することができる。間葉系組織由来の接着性細胞は、例えば培養容器に付着した細胞をトリプシンなどの酵素で処理することによって得てもよい。

生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳでの間葉系組織由来の接着性細胞の処理は、細胞とサイトカインを公知の方法にて接触させることによって行うことができる。典型的には、適当濃度の生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳを含む培地にて、間葉系組織由来の接着性細胞を一定時間培養することにより、この処理を行うことができる。通常は、数ナノグラム／ｍｌ〜数百ナノグラム／ｍｌの炎症性サイトカインまたは炎症性サイトカインを添加した培地にて間葉系組織由来の接着性細胞を培養する。培養に使用する培地は公知のものでよい。培養時間、培養温度も適宜選択することができる。必要に応じて、間葉系組織由来の接着性細胞を培養して細胞数を増加させた後、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理してもよい。間葉系組織由来の接着性細胞の集団から所望の亜集団を得て、必要に応じて亜集団を培養して細胞数を増加させた後、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理してもよい。

間葉系組織由来の接着性細胞を処理するために用いられる生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳは１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。

生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞は組織修復に寄与する１種またはそれ以上の因子（組織治癒に関与するポリペプチド、成長因子、および／または酵素など）の発現および産生を増加させ、あるいはこれらを発現および産生するようになる。かかる因子としてはアディポネクチン、ＨＧＦ、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＬＩＦ、ＭＭＰファミリーの因子、ＦＧＦファミリーの因子、ＡＤＡＭファミリーの因子、アンジオポエチン様タンパク質ファミリーの因子、プレイオトロフィン、Ｒ−スポンジンファミリーの因子、ＶＥＧＦファミリーの因子などが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＳＦ２やＣＳＦ３は、造血幹細胞の活性化のみならず、脳、心臓、肺、肝臓を含む多くの組織・臓器・器官で幹細胞増殖および/または血管新生にも関与することで組織修復に寄与しているので、これらの因子を多く発現および産生する細胞が好ましい。上記因子の発現や産生の増加は、処理前と比較して例えば１０倍以上、好ましくは３０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上であってもよい。

生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞の培養上清を、以下の方法により得てもよい。
（１）生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳを含む培地にて間葉系組織由来の接着性細胞を培養し、その培養上清を得る。
（２）生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳを含む培地にて間葉系組織由来の接着性細胞を培養し、得られた細胞を別の培地に移して培養し、その培養上清を得る。
生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳを含む培地における培養は、上で説明した生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳでの処理と同様にして行ってもよい。培地組成、培養時間、培養温度などの細胞の培養条件は、細胞の種類、必要数、用途などに応じて、適宜選択、変更することができる。遠心法、フィルター濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法、乾燥凍結法などの公知の濃縮方法を用いて、培養上清を濃縮してもよい。

本発明の医薬組成物は、上記のごとく生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理した間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清を医薬上許容される担体と混合することにより製造することができる。医薬上許容される担体は様々なものが公知であり、適宜選択して使用できる。例えば、本発明の医薬組成物を注射剤として用いる場合は、精製水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの担体に細胞を懸濁してもよい。本発明の培養上清を含む医薬組成物は、投与された場合、血管や注射針に細胞が詰まる等の事象がない点で好ましい。

本発明の医薬組成物の剤形は特に限定されず、液剤、半固形剤、固形剤であってよい。本発明の医薬組成物の投与方法も限定されず、局所注射、静脈注射、輸液などにより行ってもよく、患部に塗布する等であってもよく、カテーテルにより患部に投与してもよく、外科的手法により肝臓などの組織に直接移植してもよい。本発明の医薬組成物を細胞シート、細胞塊、重層化細胞シートなどの形態として移植してもよい。

本発明の医薬組成物の投与経路および投与量は、治癒すべき組織の種類や部位、疾患の程度、対象の状態などを考慮して適宜決定することができる。

本発明の医薬組成物は、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理した間葉系組織由来の接着性細胞以外の細胞を含んでいてもよい。また本発明の医薬組成物は、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理した間葉系組織由来の接着性細胞の培養上清以外の成分を含んでいてもよい。

本発明は、さらなる態様において、組織治癒のための薬剤の製造のための、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清の使用を提供する。

本発明は、さらなる態様において、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清の、組織治癒のための使用を提供する。

本発明は、さらなる態様において、生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清を対象に投与することを含む、組織治癒必要とする対象における組織治癒方法を提供する。

本発明は、さらにもう１つの態様において、
組織治癒のための医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）間葉系組織由来の接着性細胞を生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理し、次いで、
（ｂ）工程（ａ）にて処理された細胞またはその培養上清を医薬上許容される担体と混合する
を含む方法
を提供する。

本発明は、さらにもう１つの態様において、間葉系組織由来の接着性細胞を生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理することを含む、組織治癒のための細胞を製造する方法を提供する。本発明は、さらにもう１つの態様において、間葉系組織由来の接着性細胞を生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理し、次いで培養上清を得ることを含む、組織治癒のための細胞の培養上清を製造する方法を提供する。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。

実施例１．ＩＬ−ＩβによるＡＤＭＰＣの処理効果
（１）実験方法
（ｉ）ヒト対象からの脂肪組織の採取
インフォームドコンセントを受けた女性６人から脂肪吸引手術中に廃棄される余分な脂肪組織の提供を受けた。プロトコールは、Kobe University Graduate School of Medicine Review Boards for Human Researchに準ずるものであった。

（ｉｉ）ＡＤＭＰＣの単離および培養
脂肪組織を刻み、次に、０．００８％リベレース（Roch Lifescience）含有ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）中、３７℃のウォーターバスにて振盪しながら１時間消化した。消化産物をCell Strainer（BD Bioscience）で濾過し、８００ｘｇにて１０分間遠心した。リンパ球分離液（ｄ＝１．０７７）（Nacalai tesque）を用い、比重法により赤血球を除去し、得られたＡＤＭＰＣを含む細胞集団を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）を含むＤＭＥＭ中に細胞を播種して細胞を付着させた後、洗浄し、ＥＤＴＡで処理して、ＡＤＭＰＣを得た。次に、ＡＤＭＰＣを、培地（６０％ＤＭＥＭ−低グルコース、４０％ＭＣＤＢ２０１、１０μｇ／ｍＬＥＧＦ、１ｎＭデキサメサゾン、１００μＭアスコルビン酸、および５％ＦＢＳ）にてヒトフィブロネクチンコートディッシュに播種し、３から８継代し、培養ＡＤＭＰＣを得た。

（ｉｉｉ）ＩＬ−１β処理
ＩＬ−１βを１０ｎｇ／ｍｌとなるように、培地（６０％ＤＭＥＭ−低グルコース、４０％ＭＣＤＢ２０１、１０μｇ／ｍＬＥＧＦ、１ｎＭデキサメサゾン、１００μＭアスコルビン酸、および５％ＦＢＳ）に添加した。上の２．で得られた培養ＡＤＭＰＣを、上記ＩＬ−１β含有培地にて７２時間培養し、培地中に産生されたアディポネクチンおよび肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を測定した。アディポネクチンの測定はabcam社のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ab99968）を用いて行った。ＨＧＦの測定はR&D System社のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号DHG00）を用いて行った。コントロール系では、ＩＬ−１βを添加しない上記培地でＡＤＭＰＣを培養した。

（２）実験結果
アディポネクチン産生量の測定結果を図１に示す。ＩＬ−１β処理されなかったＡＤＭＰＣからのアディポネクチン産生は認められなかったのに対し、ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣからアディポネクチンが産生されることが確認された。

ＨＧＦ産生量の測定結果を図２に示す。ＩＬ−１β処理されなかったＡＤＭＰＣからのＨＧＦ産生量と比べて、ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣからのＨＧＦ産生量は約１．７倍に増加していた。

実施例２．ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣのインビボでの組織治癒効果−肝組織傷害の軽減
（１）実験方法
ヒト対象からの脂肪組織の採取、ＡＤＭＰＣの単離および培養、およびＩＬ−１β処理を実施例１と同様にして行ったが、培地中のＩＬ−１β濃度を５ｎｇ／ｍｌとした。

ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣを担体に懸濁し、１．２ｘ１０^５個／ｍｌとした。これをＮＡＳＨモデルマウス（ＳＴＡＭ（登録商標）マウス）に尾静脈投与し、肝組織の治癒について調べた。動物を以下の３群に分けた：ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ投与群（ｎ＝９）、ＩＬ−１βで処理していないＡＤＭＰＣ投与群（ｎ＝９）、および担体投与群（ｎ＝１０）。試験開始時に各群の動物にストレプトゾトシンを皮内投与し、通常食を与え、４週目から９週目にかけて高脂肪食を与え、９週目に安楽死させた。ＡＤＭＰＣ（３ｘ１０^５個／ｋｇ）および担体の投与は６週目に１回行った。得られた肝組織切片をシリウスレッド染色およびヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色に供した。

（２）実験結果
（ｉ）肝組織切片のシリウスレッド染色
試験開始９週目に得たマウスの肝組織切片のシリウスレッド染色の結果を図３に示す。担体を投与したマウスおよびＩＬ−１βで処理していないＡＤＭＰＣを投与したマウスの肝臓と比較して、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣを投与したマウスの肝臓において、シリウスレッドにて染色される肝臓内線維の沈着が減少したことが確認された。

（ｉｉ）肝組織切片のＨＥ染色
試験開始９週目に得たマウスの肝組織切片のＨＥ染色の結果を図４に示す。担体を投与したマウスおよびＩＬ−１βで処理していないＡＤＭＰＣを投与したマウスの肝臓と比較して、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣを投与したマウスの肝臓において、空胞化に代表される肝組織の傷害が軽減されたことが確認された。

（ｉｉｉ）NAFLED activity score（E. M. Brunt et al. Hepatology. 2011 March; 53(3): 810-820）による肝組織治癒効果の評価
試験開始９週目に得たマウスの肝組織の傷害の程度を、NAFLED activity scoreに従って評価した。NAFLED activity scoreの評価方法を表１に示す。

結果を図５に示す。担体を投与したマウスおよびＩＬ−１βで処理していないＡＤＭＰＣを投与したマウスの肝臓と比較して、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣを投与したマウスの肝臓のNAFLD Activity scoreは有意に低く、空胞化、炎症、脂肪化に代表される肝組織の傷害が大幅に軽減されたことが確認された。

これらの結果から、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣは、傷害を受けた組織の治癒に効果的であり、組織の保護、組織・細胞傷害の修復、組織の炎症抑制、組織を構成する細胞の増殖促進に資するものであることがわかった。これらの組織治癒が行われることによって、組織形状の再構築や創傷治癒が可能になると考えられる。しかも、これらの効果は、ストレプトゾトシンおよび高脂肪食により肝障害を誘発されたマウスにおいて見られたことから、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣは、慢性期の疾患における組織治癒に効果的であるといえる。

実施例３．ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣのインビボでの組織治癒効果−心機能の改善
（１）実験方法
２段階塞栓・再還流法にて８週齢のブタを用いて重症心筋梗塞モデルを作製した。具体的には、大腿動脈から経皮経管的に６Ｆのガイドカテーテルを左冠動脈入口部にかけ、そこからガイドワイヤーを第１対角枝（ＡＨＡ分類の＃９）に挿入し、ガイド下にてバルーニング（閉塞再開通）でプレコンディショニングを行った。１週間後、ガイドワイヤーを左冠動脈前下降枝（ＡＨＡ分類の＃６〜＃８）に挿入し、左冠動脈回旋枝分岐部直下の左前下降枝（ＡＨＡ分類の＃６）にてバルーニング（閉塞再開通）を行い、心筋虚血流域を得た。その４週間後（最初の閉塞再開通からは５週間後）に心臓超音波検査にて心駆出率が４０％以下の個体を重症心不全モデルとして試験に供することとした。

２回目の塞栓・再還流から４週間後に、対象コントロール（細胞非投与）群、活性化していない細胞（ＡＤＭＰＣ）、ＩＬ−１βにて活性化した細胞（７２時間培養）（ＩＬ−１β活性化ＡＤＭＰＣ）を３×１０^５個／体重ｋｇ、カテーテルにて経冠動脈に投与した。ＡＤＭＰＣおよびＩＬ−１β活性化ＡＤＭＰＣの調製は実施例１と同様にして行った。投与直前、投与後３カ月にて心臓ＭＲＩを施行し（Signa EXCITE XI TwinSpeed 1.5T Ver.11.1, GE Healthcare）、解析ソフトとしてCardiac Vx （GE Healthcare）を用い、拡張末期左室容積と収縮末期左室容積を計測した。
下式：
左室駆出率＝１００ｘ（拡張末期左室容積−収縮末期左室容積）／（拡張末期左室容積）
を用いて左室駆出率（％ＥＦ）を算出し、投与後３か月値と投与直前値との差をΔＥＦ（％）として表した（図６）。

（２）実験結果
図６に示す通り、対照群では左室駆出率が減少したのに対して、細胞を投与した２群では左室駆出率は改善しており、特にＩＬ−１βにて活性化した細胞を投与し場合、左室駆出率が著しく改善した。

これらの結果は、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣは、重症の心筋梗塞によって傷害を受けた心組織を治癒し、心機能を著しく改善することを示すものである。

実施例４．ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来細胞のインビボでの組織治癒効果−肝組織線維化の軽減
（１）実験方法
（ｉ）ヒト対象からの脂肪組織の採取
インフォームドコンセントを受けた女性６人から脂肪吸引手術中に廃棄される余分な脂肪組織の提供を受けた。プロトコールは、Kobe University Graduate School of Medicine Review Boards for Human Researchに準ずるものであった。なお、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来細胞はLonza社より購入した。

骨髄由来間葉系幹細胞および胎盤由来細胞は、培地（６０％ＤＭＥＭ−低グルコース、４０％ＭＣＤＢ２０１、１０μｇ／ｍＬＥＧＦ、１ｎＭデキサメサゾン、１００μＭアスコルビン酸、および５％ＦＢＳ）にてヒトフィブロネクチンコートディッシュに播種し、３継代し実験に供した。

（ｉｉｉ）ＩＬ−１β処理
ＩＬ−１βを５ｎｇ／ｍｌとなるように、培地（６０％ＤＭＥＭ−低グルコース、４０％ＭＣＤＢ２０１、１０μｇ／ｍＬＥＧＦ、１ｎＭデキサメサゾン、１００μＭアスコルビン酸、および５％ＦＢＳ）に添加した。上の２．で得られた培養ＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞および胎盤由来細胞を、上記ＩＬ−１β含有培地にて７２時間培養した。コントロール系では、ＩＬ−１βを添加しない上記培地でＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞および胎盤由来細胞を培養した。

ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞および胎盤由来細胞を担体に懸濁し、１．２ｘ１０^５個／ｍｌとした。これを肝炎誘発薬剤投与による慢性肝炎モデル動物に投与し、肝組織の治癒について調べた。動物を以下の７群に分けた：ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ投与群（ｎ＝６）、ＩＬ−１βで処理していないＡＤＭＰＣ投与群（ｎ＝５）、ＩＬ−１βで処理した骨髄由来間葉系幹細胞投与群（ｎ＝５）、ＩＬ−１βで処理していない骨髄由来間葉系幹細胞投与群（ｎ＝４）、ＩＬ−１βで処理した胎盤由来細胞投与群（ｎ＝５）、ＩＬ−１βで処理していない胎盤由来細胞投与群（ｎ＝５）、および担体投与群（ｎ＝５）。

肝炎誘発薬剤投与による慢性肝炎モデル動物は、８週齢のＦ３４４ラットに対し、四塩化炭素を３００μＬ／ｋｇずつ、毎週２回、４週間にわたり腹腔内注射し、慢性肝炎モデルラットを得た。これらラットに対して、ＩＬ−１β処理・非処理のＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞あるいは胎盤由来細胞（３ｘ１０^５個／ｋｇ）および担体を経尾静脈的に投与した。細胞投与１週間後（試験開始後５週目）、深麻酔下にて安楽死させて肝臓を摘出、１０％中性緩衝ホルマリンにて固定した。これら肝臓試料をパラフィン包埋し、薄切切片を得、得られた肝組織切片をシリウスレッド染色に供した。

（２）実験結果
（ｉ）肝組織切片のシリウスレッド染色
試験開始５週目に得たラットの肝組織切片のシリウスレッド染色の結果を図７に示す。ＩＬ−１βで処理していないＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞あるいは胎盤由来細胞を投与したラットの肝臓と比較して、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞あるいは胎盤由来細胞を投与したラットの肝臓において、シリウスレッドにて染色される肝臓内線維の沈着が減少したことが確認された。

これらの結果から、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞あるいは胎盤由来細胞は、傷害を受けた組織の治癒に効果的であることがわかった。これらの組織治癒が行われることによって、組織形状の再構築や創傷治癒が可能になると考えられる。しかも、これらの効果は、肝炎誘発薬剤投与による慢性肝炎モデル動物において見られたことから、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ、骨髄由来間葉系幹細胞あるいは胎盤由来細胞は、慢性期の疾患における組織治癒に効果的であるといえる。

実施例５．ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣあるいは骨髄由来間葉系幹細胞のインビボでの組織治癒効果−心臓組織の改善
（１）実験方法
全身麻酔薬で深麻酔した８週齢のヌードラットを開胸して心臓を露出させ、冠状動脈下行枝を完全結紮して急性心筋梗塞モデルを作製した。２週間後、心筋梗塞モデルラットを使い、全身麻酔下、左肋間開胸にてＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣあるいは骨髄由来間葉系幹細胞シートを各々２枚左室壁に移植した。移植後４週間後に犠牲死させて心臓を摘出、１０％中性緩衝ホルマリンにて固定した。これら心臓試料を輪切りにしてパラフィン包埋し、薄切切片を得、ＨＥ染色したのち、心筋梗塞作出部位である左壁前壁の厚みを測定した。

（ｉ）細胞シートの作成
ＡＤＭＣＰあるいは骨髄由来間葉系幹細胞を、ＩＬ−１βを５ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培地中、温度感受性培養皿（株式会社セルシード）中３７℃にて７２時間培養した。２０℃以下にて３０分間インキュベーションすることにより、細胞を剥離させ、細胞シートを得た。得られたシートを以下の移植実験に用いた。

（ｉｉ）心筋梗塞モデルラットへのシートの移植
ヌードラットの冠動脈を結紮することにより、心筋梗塞モデルラットを作成した。２週間後再度開胸し、傷害領域にＡＤＭＰＣあるいは骨髄由来間葉系幹細胞をＩＬ−１β添加あるいは非添加にて培養した細胞シートを各々２枚移植した。コントロール群では開胸のみ行うｓｈａｍ手術を行った。

（ｉｉｉ）シートを移植した心臓の組織解析
移植後４週間にラットを安楽死させて、心臓を摘出した。摘出した心臓を４％パラホルムアルデヒド液で固定した後、７０％エタノールに置換した。固定した心臓を数ミリ幅に切り出し、パラフィンで固めてブロックを作製した。得られたパラフィンブロックを、ミクロトームを用いて３μｍに薄切し、スライドガラスに張り付け、乾燥させた。得られた薄切片についてヘマトキシリン・エオジン染色を以下の通り行った。

（ｉｖ）ヘマトキシリン・エオジン染色
薄切片を脱パラフィンし、水で洗浄した。ヘマトキシリン液で１０分間染色し、ぬるま湯で３分間色だしした。水洗後、エオジンで５分間染色した。アルコールで分別、脱水した。キシレンで透徹後封入し、顕微鏡にて観察した。梗塞領域である左室前壁の壁厚を評価した。

（２）実験結果
図６に示す通り、ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣあるいは骨髄由来間葉系幹細胞シート移植群では、ＩＬ−１β非処理のＡＤＭＰＣあるいは骨髄由来間葉系幹細胞シートと比較して左室壁厚は改善した。

これらの結果は、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣあるいは骨髄由来間葉系幹細胞は、重症の心筋梗塞によって傷害を受けた心組織を治癒し、心機能を著しく改善することを示すものである。

実施例６．各種生理活性ポリペプチドによる各種間葉系組織由来の接着性細胞の処理効果
（１）実験方法
試供細胞として、臍帯由来間葉系幹細胞（臍帯由来ＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、膝軟骨滑膜由来間葉系幹細胞（滑膜由来ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、胞衣由来間葉系幹細胞（胞衣由来ＭＳＣ）および骨髄由来間葉系幹細胞（骨髄由来ＭＳＣ）を用いた。生理活性ポリペプチドとしては各種のサイトカイン、ケモカイン、成長因子およびホルモンを用いた。

試供細胞としてＡＤＭＰＣを用いる場合は、生理活性ポリペプチドとしてサイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ３〜ＩＬ３５、オンコスタチンＭ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ケモカイン（ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１０）、成長因子（ＡｖｉｎＡ、ＡＮＧＰＬＴ５、ＢＤ−２、ＢＤ−３、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−７、ＤＫＫ１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２１、Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、Ｒ−スポンジン−１、Ｒ−スポンジン−２、Ｒ−スポンジン−３、ＳＣＦ、ガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ＧＤＦ−１１、ＧＤＮＦ、プレイオトロフィン、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＴＰＯ、ＴＳＬＰ、ＶＥＧＦ）およびホルモン（カルシトニン、パラスロモン、グルカゴン、エリスロポイエチン、レプチン、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、オキシトシン、バソプレッシン、ＴＧＨ、ＴＳＨ、ＣＲＨ、ＡＣＴＨ、ＧＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＳＯＭ、ＧＲＨ、ＧＨ、ＰＲＨ、プロラクチン）を用いた。試供細胞としてＡＤＳＣ、胞衣由来ＭＳＣ、滑膜由来ＭＳＣ、骨髄由来ＭＳＣ、臍帯由来ＭＳＣを用いる場合は、生理活性ポリペプチドとしてＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ１５を用いた。以下、生理活性ポリペプチドを「薬剤」という。
試供細胞を、薬剤添加培地（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）および薬剤非添加培地（コントロール）にて培地交換を行い、更に３日間（７２時間）継続培養を行った。培地交換７２時間後にＲＬＴＢｕｆｆｅｒ６００ｕＬを添加して回収、ＲＮＡ抽出した。
ＲＬＴＢｕｆｆｅｒサンプルは、RNeasy Mini Kit / QIAGENを用いて全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡを１００ｎｇ／ｕＬになるように調製後、１アレイ当たり全ＲＮＡ１５０ｎｇからラベルされたｃＲＮＡを合成した。合成したラベルされたｃＲＮＡは濃度・収量・Ｃｙ３取込率を算出し、合成サイズ（２００−２０００ｎｔを増幅）を測定した。ラベルされたｃＲＮＡ６００ｎｇを６０℃でフラグメンテーションを形成させ、６５℃、１７時間でハイブリダイゼーションを行い、アレイを洗浄してスキャンした。
コントロールサンプルと薬剤添加サンプル（１種類）のどちらかの条件で測定値の信頼できるプローブを抽出し、コントロールサンプルと比較して、発現差１５倍以上のプローブを抽出した。

（２）実験結果
薬剤での処理後に、処理前と比較して発現が１５倍以上上昇したｍＲＮＡとその上昇倍率を表２〜表７に示す。

いずれの実験においても、生理活性ポリペプチドで処理された間葉系組織由来の接着性細胞において組織治癒に関与するポリペプチド、成長因子、および／または酵素の発現が高まったことが確認された。生理活性ポリペプチドと間葉系組織由来の接着性細胞の多くの組み合わせにおいて、ＣＳＦ２および／またはＣＳＦ３が発現し、しかも高発現する傾向が見られた。これらの結果から、本発明において、広範な種類の生理活性ポリペプチドおよび間葉系組織由来の接着性細胞を使用できることがわかった。

実施例７．ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣの培養上清のインビボでの組織治癒効果−肝組織傷害の軽減
（１）実験方法
ヒト対象からの脂肪組織の採取、ＡＤＭＰＣの単離および培養、およびＩＬ−１β処理を実施例２と同様にして行った。

ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣの培養上清を、アミコンウルトラ−１５遠心式フィルターユニットの３，０００ＮＭＷＬを使用し、３０分遠心することにより濃縮し、これをＮＡＳＨモデルマウス（ＳＴＡＭ（登録商標）マウス）に個体あたり５０μＬ尾静脈投与し、肝組織の治癒について調べた。動物を以下の２群に分けた：ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ培養上清投与群（ｎ＝１０）、および担体投与群（ｎ＝９）。試験開始時に各群の動物にストレプトゾトシンを皮内投与し、通常食を与え、４週目から９週目にかけて高脂肪食を与え、９週目に安楽死させた。ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ培養上清および担体の投与は６週目に１回行った。得られた肝組織切片をシリウスレッド染色およびヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色に供した。

（２）実験結果
（ｉ）肝組織切片のシリウスレッド染色
試験開始９週目に得たマウスの肝組織切片のシリウスレッド染色領域の結果を表８に示す。担体を投与したマウスと比較して、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ培養上清を投与したマウスの肝臓において、シリウスレッドにて染色される肝臓内線維の沈着が減少したことが確認された。

（ｉｉ）NAFLED activity score（E. M. Brunt et al. Hepatology. 2011 March; 53(3): 810-820）による肝組織治癒効果の評価
試験開始９週目に得たマウスの肝組織の傷害の程度を、NAFLED activity scoreに従って評価した。スコアの評価方法は実施例２の表１に示したものと同じである。

結果を表９に示す。担体を投与したマウスと比較して、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ培養上清を投与したマウスの肝臓のNAFLD Activity scoreは有意に低く、空胞化、炎症、脂肪化に代表される肝組織の傷害が大幅に軽減されたことが確認された。

これらの結果から、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ培養上清は、傷害を受けた組織の治癒に効果的であり、組織の保護、組織・細胞傷害の修復、組織の炎症抑制、組織を構成する細胞の増殖促進に資するものであることがわかった。これらの組織治癒が行われることによって、組織形状の再構築や創傷治癒が可能になると考えられる。しかも、これらの効果は、ストレプトゾトシンおよび高脂肪食により肝障害を誘発されたマウスにおいて見られたことから、ＩＬ−１βで処理したＡＤＭＰＣ培養上清は、慢性期の疾患における組織治癒に効果的であるといえる。

実施例８．ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣおよびその培養上清のインビボでの組織治癒効果−肺組織傷害の軽減
（１）実験方法
ヒト対象からの脂肪組織の採取、ＡＤＭＰＣの単離および培養、およびＩＬ−１β処理を実施例２と同様にして行った。

ブレオマイシン（ＢＬＭ）を用いてマウス肺に線維化を誘発した。ＢＬＭ溶液をマウス気管内投与した。具体的には、ＢＬＭ溶液投与日に３種（塩酸メデトミジン０．３ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム４ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール５ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔薬３ｍＬ／ｋｇの皮下投与麻酔下でマウスの頸部を切開し、気管を露出させた。次いで、液体気管内投与器具（ＩＡ−１Ｃ、ＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙ社）のノズルを口から挿入し、気管内に入っていることを確認したのち、ＢＬＭ溶液（１４μｇ／２５μＬ／ｌｕｎｇ）を噴射した。その後、切開部を縫合し、α２アドレナリン受容体拮抗薬（塩酸アチパメゾール２ｍｇ／ｋｇ）３ｍＬ／ｋｇを皮下投与した。
ＢＬＭ投与２１日目（ＢＬＭ投与日を投与１日と起算）に、対照コントロールには生理的食塩水、試験群にはＩＬ−１β処理ＡＤＭＰＣ、およびＩＬ−１β処理ＡＤＭＰＣ培養上清を経尾静脈的に投与した。
ＢＬＭ投与３５日目にイソフルラン麻酔下で腹大動脈から放血させることにより安楽死させたのち、肺を摘出した。摘出した肺は、１０％中性緩衝ホルマリンで２０ｃｍ水柱圧にて拡張固定後、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定保管した。
ホルマリン固定した肺を図９のように切り出し、ＭａｓｓｏｎＴｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ｍ．Ｔ．）染色標本を作製し、肺の各葉ごとに下記評価基準にて程度を分類することで線維化のスコア化を行った。肺線維化の評価基準を表１０に示す。

左肺および右肺前葉、中葉、後葉、副葉の標本から得られた肺線維化スコアは、加重平均することで当該動物の肺線維化スコアとした。図１０に示す肺線維化スコアを以下の式を用いて算出した。

式１

加重平均した個体の肺線維化スコア＝
［左肺スコア＋（右肺前葉スコア＋右肺中葉スコア＋右肺後葉スコア＋右肺副葉スコア）／４］／２

（２）実験結果
図１０に示すように、ＩＬ−１β処理されたＡＤＭＰＣおよびその培養上清は、肺の組織治癒に効果があることが確認された。

本発明は、組織治癒のための医薬品の分野および組織治癒を必要とする疾病の研究分野などにおいて有用である。

すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清、および医薬上許容される担体を含む、組織治癒のための医薬組成物。
（２）生理活性ポリペプチドが、炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子、ケモカイン、ホルモンおよびインターフェロンからなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである（１）記載の医薬組成物。
（３）生理活性ポリペプチドが、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである（１）または（２）記載の医薬組成物。
（４）間葉系組織由来の接着性細胞が間葉系組織由来幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、胎盤組織に由来する細胞、臍帯組織に由来する細胞、胞衣組織に由来する細胞、骨髄組織または滑膜組織に由来する細胞である（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）組織治癒が組織保護、組織・細胞傷害の修復、組織を構成する細胞の増殖促進、組織の炎症抑制、創傷治癒または組織形状の再構築である（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）組織治癒が慢性期の疾患における組織治癒である（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）組織治癒のための医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）間葉系組織由来の接着性細胞を生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理し、次いで、
（ｂ）工程（ａ）にて処理された細胞またはその培養上清を医薬上許容される担体と混合する
を含む方法。
（８）生理活性ポリペプチドが、炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子、ケモカイン、ホルモンおよびインターフェロンからなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである（７）記載の方法。
（９）生理活性ポリペプチドが、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである（７）または（８）記載の方法。
（１０）間葉系組織由来の接着性細胞が間葉系組織由来幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、胎盤組織に由来する細胞、臍帯組織に由来する細胞、胞衣組織に由来する細胞、骨髄組織または滑膜組織に由来する細胞である（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）組織治癒が組織保護、組織・細胞傷害の修復、組織を構成する細胞の増殖促進、組織の炎症抑制、創傷治癒または組織形状の再構築である（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）組織治癒が慢性期の疾患における組織治癒である（７）〜（１１）のいずれかに記載の方法。

図１は、ＩＬ−１βで処理された脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）のアディポネクチン産生量（左）と、ＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣのアディポネクチン産生量（右）を比較した図である。縦軸はアディポネクチンの産生量を示す。図２は、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）産生量（左）と、ＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣのＨＧＦ産生量（右）を比較した図である。縦軸はＨＧＦの産生量を示す。図３は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおけるＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣによる肝臓内線維の減少を示すシリウスレッド染色組織切片像である。左が担体投与群、中がＩＬ−１β処理していないＡＤＭＰＣ投与群、右がＩＬ−１β処理したＡＤＭＰＣ投与群の結果である。倍率は５０倍である。図４は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおけるＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣによる肝組織の傷害の軽減を示すＨＥ染色組織切片像である。左が担体投与群、中がＩＬ−１β処理していないＡＤＭＰＣ投与群、右がＩＬ−１β処理したＡＤＭＰＣ投与群の結果である。上段の倍率は５０倍、下段の倍率は２００倍である。図５は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおける、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣおよびＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣによる肝組織の傷害の軽減を、NAFLD Activity Scoreを用いて比較した図である。ｐ値はMann-Whitney's U検定による。図６は、重症心筋梗塞モデル動物（ブタ）における、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣおよびＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣによる左室駆出率の改善を示す図である。縦軸（ΔＥＦ％）は細胞投与前後の左室駆出率の変化（％）を示す。白棒は細胞を投与しなかったコントロール群、斜線棒はＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣを投与した群、黒棒はＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣを投与した群を示す。図７は、慢性肝炎モデル動物（ラット）における、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ＋）、胎盤由来細胞（ＡＭ＋）および骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ＋）、ならびにＩＬ−１βで処理されていないＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ−）、胎盤由来細胞（ＡＭ−）および骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−）による、肝組織の傷害の軽減を調べた結果を示すグラフである。縦軸はシリウスレッド染色領域（線維化領域）の面積を示す。ｐ値は以下のとおりである：ＡＤＭＰＣ−対ＡＤＭＰＣ＋０．０１８、ＢＭ−対ＢＭ＋０．０１６、ＡＭ−対ＡＭ＋０．０３２、コントロ−ル対ＡＤＭＰＣ− ０．００８、コントロール対ＢＭ− 有意差なし、コントロール対ＡＭ− ０．０２２、コントロール対ＡＤＭＰＣ＋０．００４、コントロール対ＢＭ＋０．０５６、コントロール対ＡＭ＋０．０１２。図８は、重症心筋梗塞モデル動物（ヌードラット）における、ＩＬ−１βで処理された骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ＋）およびＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ＋）、ならびにＩＬ−１βで処理されていない骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−）およびＡＤＭＰＣ（ＡＤＭＰＣ−）による、心組織の治癒効果を調べた結果を示すグラフである。縦軸は心筋梗塞後の心筋厚みを示す。ｐ値は以下のとおりである：コントロール対ＢＭ− ０．０２２４７９、コントロール対ＢＭ＋０．００８１１３、ＢＭ−対ＢＭ＋０．０４５３２８、コントロール対ＡＤＭＰＣ− ０．００８１１３、コントロール対ＡＤＭＰＣ＋０．０１９９６４、ＡＤＭＰＣ−対ＡＤＭＰＣ＋０．０１４２１４。図９は、実施例８におけるホルマリン固定した肺の切断部位を示す図である。図１０は、肺線維症モデル動物（マウス）における、ＩＬ−１βで処理されたＡＤＭＰＣおよびその培養上清ならびに生理食塩水による、肺組織の治癒効果を調べた結果を示すグラフである。縦軸は肺線維化のスコアである。

２回目の塞栓・再還流から４週間後に、動物を対象コントロール（細胞非投与）群、活性化していない細胞（ＡＤＭＰＣ）投与群、ＩＬ−１βにて活性化した細胞（７２時間培養）（ＩＬ−１β活性化ＡＤＭＰＣ）投与群に分け、細胞投与群に３×１０^５個／体重ｋｇの細胞を、カテーテルにて経冠動脈に投与した。ＡＤＭＰＣおよびＩＬ−１β活性化ＡＤＭＰＣの調製は実施例１と同様にして行った。投与直前、投与後３カ月にて心臓ＭＲＩを施行し（Signa EXCITE XI TwinSpeed 1.5T Ver.11.1, GE Healthcare）、解析ソフトとしてCardiac Vx （GE Healthcare）を用い、拡張末期左室容積と収縮末期左室容積を計測した。
下式：
左室駆出率＝１００ｘ（拡張末期左室容積−収縮末期左室容積）／（拡張末期左室容積）
を用いて左室駆出率（％ＥＦ）を算出し、投与後３か月値と投与直前値との差をΔＥＦ（％）として表した（図６）。

Claims

生理活性ポリペプチドまたはリポ多糖（ＬＰＳ）で処理された間葉系組織由来の接着性細胞またはその培養上清、および医薬上許容される担体を含む、組織治癒のための医薬組成物。
生理活性ポリペプチドが、炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子、ケモカイン、ホルモンおよびインターフェロンからなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである請求項１記載の医薬組成物。
生理活性ポリペプチドが、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである請求項１または２記載の医薬組成物。
間葉系組織由来の接着性細胞が間葉系組織由来幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、胎盤組織に由来する細胞、臍帯組織に由来する細胞、胞衣組織に由来する細胞、骨髄組織または滑膜組織に由来する細胞である請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
組織治癒が組織保護、組織・細胞傷害の修復、組織を構成する細胞の増殖促進、組織の炎症抑制または組織形状の再構築である請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。
組織治癒が慢性期の疾患における組織治癒である請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
組織治癒のための医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）間葉系組織由来の接着性細胞を生理活性ポリペプチドまたはＬＰＳで処理し、次いで、
（ｂ）工程（ａ）にて処理された細胞またはその培養上清を医薬上許容される担体と混合する
を含む方法。
生理活性ポリペプチドが、炎症性サイトカイン、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド、増殖因子、ケモカイン、ホルモン、およびインターフェロンからなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである請求項７記載の方法。
生理活性ポリペプチドが、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、Ｉ型インターフェロン（ＩＮＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される１種またはそれ以上のポリペプチドである請求項７または８記載の方法。
間葉系組織由来の接着性細胞が間葉系組織由来幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）、胎盤組織に由来する細胞、臍帯組織に由来する細胞、胞衣組織に由来する細胞、骨髄組織または滑膜組織に由来する細胞である請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
組織治癒が組織保護、組織・細胞傷害の修復、組織を構成する細胞の増殖促進、組織の炎症抑制または組織形状の再構築である請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
組織治癒が慢性期の疾患における組織治癒である請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。