KR20140141729A - 항분비 단백질의 추가적 의학 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지질 라프트(lipid rafts), 수용체 및/또는 카베올라(caveolae)의 기능장애, 예컨대, 비정상적인 기능, 기능저하 또는 기능항진의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물 및/또는 의료 식품의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염의 용도에 관한 것이다. 지질 라프트, 수용체 및/또는 카베올라의 기능장애는 본 발명에 또한 포함되는 다른 다양한 증상, 예컨대, 혈관 및 폐 기능장애, 및/또는 내분비 장애, 예를 들어, 당뇨병 및 관련 장애에 의해 야기될 수 있거나 상기 증상의 원인일 수 있다. 또한, 본 발명은 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 예방이 필요한 포유동물에서의 그러한 기능장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.

Description

항분비 단백질의 추가적 의학 용도{FURTHER MEDICAL USES OF ANTISECRETORY PROTEIN}
본 발명은 세포막 내의 지질 라프트(raft) 및/또는 카베올라(caveolae) 뿐만 아니라 지질 라프트 및 카베올라와 관련된 결합 단백질, 수용체, 신경전달물질, 이온 채널, 물 채널, 세포골격 및 G-단백질 시스템의 구조적 붕괴 및 기능장애(화합물의 흡수 및 방출을 포함함)의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 기능적 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염의 용도에 관한 것이다. 본원에서 상기 약학 조성물은 막 내에서의 지질 라프트, 수용체 및/또는 카베올라의 구조, 분포 및 다수의 기능을 모니터링하고/하거나 상기 구조, 분포 및 다수의 기능에 유리하게 영향을 미치는 데 사용된다. 이러한 유리한 영향의 예로는 기능저하 또는 기능항진과 같은 비정상적인 기능을 저해하는 것, 지질 라프트, 수용체 및/또는 카베올라를 구조적 및 기능적으로 복구시키고/시키거나 정상화시키는 것, 및 질환, 손상, 복구 과정 및 다른 기능장애에서 생존 및/또는 회복을 개선시키는 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명은 세포 생성물의 세포내 수송 및 방출의 모니터링 및 조직 성분들의 분포의 정상화를 위한 상기 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
지질 라프트는 세포막 내에서 전문화된 영역을 형성하는 동적인 불균질한 마이크로도메인이고, 콜레스테롤 및 당지질, 가장 명백하게는 GMl와 같은 스핑고지질(sphingolipid)이 풍부하다(Ross & Pawlina, 2006; Pollard & Earnshaw, 2002). 시험관 내의 지질 라프트는 희석되고 냉각된 상태로 사용된 세제 트리톤(Triton) X-100을 사용한 추출 후 불용성 상태로 남아있는 것으로서 정의된다. 이러한 내세제성(detergent resistant) 막 분획은 부유 구배에 의해 단리된 저밀도 밴드로서 회수된다. 지질 라프트의 존재 정도는 세포막 내의 콜레스테롤의 고갈 또는 붕괴에 의해 감소된다. 지질 라프트는 세포골격과 밀접하게 관련되어 있고 연결되어 있으며 세포 분극화에 관여한다. 지질 라프트는 모든 연령에서, 예컨대, 배아 및 태아뿐만 아니라 어린 개체, 성체 및 노년 개체에서 세포 및 조직 내의 막 내에 풍부하게 분포하는 전문화된 마이크로도메인을 구성한다.
점착 및 신호 전달도입에 핵심적으로 중요한 단백질들, 예컨대, 수용체, 세포 부착 단백질, 이온 수송자 및, 예컨대, 아쿠아포린(aquaporine)을 비롯한 이온 채널 결합체(complex) 뿐만 아니라 케모카인 수용체, 신경전달물질 수용체, 호르몬 수용체 및 성장인자 수용체가 지질 라프트에 풍부하다. 이 단백질들 및 단백질 결합체들은 예컨대, 수용체에 의해 제공받은 메세지를 세포의 세포질 및 핵으로 전달하는 세포내 G 단백질 시스템과 상호작용한다(Dermine et al., 2001; Ross & Pawlina, 2006; Pollard & Earnshaw, 2002; Helms & Zurzolo, 2004; Chini & Parenti, 2004; Head et al., 2006; Mahmutefendic et al., 2007). 세포 활성을 모니터링하는 데 있어서의 핵심 이온인 Ca2+의 분포 및 농도는 지질 라프트 및 카베올라와 밀접하게 관련되어 있는 것으로 입증되어 있다. 컨넥신(connexin), CD38, CD19, Thy-1 및 CD59와 같은 추가적 단백질들은 통상적으로 이 단백질들이 세포 기능과 상호작용할 수 있게 하는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)에 고정된 단백질 및 수용체를 통해 지질 라프트에 고정된다. 콜레라 독소에 대한 표적이며 강글리오사이드 GMl로 예시되는 스핑고지질은 지질 라프트에 풍부하며 지질 라프트의 특징이다. 또한, 신경전달물질 수용체, 및 시냅스 및 신경 과정의 다른 성분들 뿐만 아니라 성장 인자 수용체도 예를 들어, 신경과 같은 고도로 전문화된 세포 내의 지질 라프트 내에 풍부하게 분포하는 광범위한 단백질들에 속한다. 세포 기능 및 상호작용을 조절하는 데 있어서 핵심적으로 중요한 칼슘 이온 채널 및 수송자는 대부분 지질 라프트에 국한되어 있다(A Spat, 2007). 이것은 지질 라프트의 파괴가 세포 내에서 이동하는 Ca2+ 흐름을 증가시키는 세포의 능력을 방해하거나 심지어 막는다는 관찰결과에 의해 설명될 수 있다. 추가로, 칼슘 이온 폭증(burst)은 정상적인 세포 및 생리학적으로 변경된 세포, 예컨대, 세포 분열, 세포 생존 및 세포 사멸에서 핵심적인 기능에 유의하게 영향을 미친다.
또한, 지질 라프트는 세포내 단백질 운반(trafficking), 수용체 및 지질 동역학에 있어서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 간주된다. 이들 모든 수용 및 수송 단백질들에 의한 메세지 및 작용은 G-결합 단백질 시스템을 통해, 효소 시스템을 통해 또는 세포골격의 도움을 받아 세포의 내부로 전달된다(Triantafilou & Triantafilou, 2004). 예를 들어, 지질 라프트의 물리학적 상태는 다수의 단백질의 이동을 집중시키거나 구속함으로써 예를 들어, 유능한 신호 전달 결합체의 동적인 조립을 촉진하는 데 기여하는 것으로 공지되어 있다.
더욱이, 지질 라프트는 세포골격의 활성화, 신호 전달 및 재배열을 조절하는 능력을 가지며, 이 능력으로 인해 방향성 이동을 비롯한 세포 이동을 제어하는 기작뿐만 아니라 세포의 형태 및 크기, 및 관련된 수송을 유지하는 데 있어서 결정적으로 중요한 것으로 간주된다. 또한, 세포골격은 세포 성분들의 세포내 운반, 및 세포에 대한 동적 및 정적 하중을 감지하는 데 있어서 핵심적으로 중요하다.
따라서, 지질 라프트는 통상적으로 편차 범위가 상당하지만 약 5 내지 50 nm의 직경을 가진 동적인 구조체이다. 예를 들어, 콜레라 독소에 대한 친화성이 매우 높은 GMl의 면역조직화학적 및 면역화학적 입증에 의해 지질 라프트의 존재를 입증하는 다수의 방법이 존재한다. 지질 라프트의 존재 및 위치를 입증하는 또 다른 방법은 통상적으로 이용가능한 세포 생물학 교재에 기재된 바와 같이 세포를 파괴한 후 소정의 온도에서 내세제성 분획을 단리한 후 세포막을 단리하는 방법이다. 플로틸린(flotillin), 카베올린 및 레기(reggie)를 사용하여 지질 라프트를 면역조직화학적으로 확인할 수 있다. 이 단백질들 중 플로틸린은 지질 소적과도 관련되어 있을 수 있다. 원자력 현미경 및 관련 방법이 상기 기법과 함께 사용되어 지질 라프트를 가시화할 수 있다. 막으로부터의 콜레스테롤의 고갈을 초래하는 사이클로덱스트린 및 이의 변이체에 세포를 노출하는 것도 지질 라프트의 풍부한 분포를 입증하는 별법을 구성한다.
카베올라는 콜레스테롤 및 스핑고지질이 막 내에 집중적으로 풍부하게 분포한다는 점, 환경과 세포의 내부 사이에 신호를 전달한다는 점 및 세포골격에 연결되어 있다는 점을 특징으로 하는 동적인 구조체인 지질 라프트의 한 전문화된 유형을 구성한다. 다른 지질 라프트와 대조적으로, 카베올라는 더 크고 통상적으로 세포막 내의 플라스크형 오목부(pit) 또는 함몰부 및 소포낭(vesicle)으로서 보인다(Kurzchalia & Parton, 1999). 카베올라의 크기는 편차가 상당하지만 약 0.1 ㎛이다. 카베올라는 극히 다양한 빈도로 존재하지만 예를 들어, 심근세포, 평활근세포, 내피세포, 대식세포 및 지방세포, 즉 사실상 모든 포유동물 세포 내에 풍부하게 분포한다.
지질 라프트 및 카베올라는 NO(산화질소) 발생 시스템을 보유하고 상기 시스템에 영향을 미치는 것으로 개시되어 있다. 세포로의 신호 전달 및 세포로부터의 신호 전달 이외에, 카베올라는 세포로의 유체 및 다양한 화합물의 운반, 세포로부터의 유체 및 다양한 화합물의 운반, 세포내이입(endocytosis) 및 조절, 세포 및 이의 환경 내에서의 지방산 및 콜레스테롤의 운반, 유출 및 유지에 관여한다(Pohl et al., 2004; Rajendran et al., 2007). 카베올라 성분 및 지질 라프트는 주로 알쯔하이머병과 관련되어 있지만 다른 신경퇴행성 장애 및 신경외상과도 관련되어 있는 단백질인 β 아밀로이드 전구체 단백질(βAPP) 및 아밀로이드 β(Aβ)의 프로세싱에도 관여한다(Graham & Lantos, 2002).
종양 세포는 지질 라프트뿐만 아니라 카베올라도 가진 것으로 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 이 구조체를 파괴하거나 다양한 정도로 붕괴시킴으로써 종양 세포의 성장 및 이동을 손상시킬 수 있다(Marquez, D C et al., 2006; Freeman et al., 2007).
지질 라프트 및 카베올라의 중요성은 유전적으로 변형된 동물에서 더 밝혀져 있다. 카베올린이 결핍된 넉아웃(knockout) 마우스는 확장형 심근병증 및 폐 고혈압을 발생시킨다(Mathew et al., 2004). 또한, 지질 라프트 및 카베올라는 인슐린에 의해 자극되는 수송자 시스템, 예컨대, 스테로이드 호르몬 수송 시스템과 관련되어 있다.
밀접하게 관련되어 있지만 일부 측면에서는 상이한, 고도로 동적인 구조체를 구성하는 지질 라프트 및 카베올라는 포유동물 세포 내에서 풍부하게 분포되어 있고 많은 중요한 기능을 발휘한다는 결론이 도출된다. 현재 이용가능한 방법은 지질 라프트 및 카베올라의 파괴 또는 고갈을 가능하게 하지만, 지질 라프트, 및 지질 라프트 내에 조직화되어 있는 신호 전달 및 물질 전달 단백질의 구조, 분포, 빈도 및/또는 기능을 복구시키고/시키거나 정상화시키는 방법은 공지되어 있지 않다.
항분비 단백질(antisecretory protein)은 원래 설사병 및 장 염증으로부터의 보호를 제공하는 것으로 보고되어 있는 41 kDa 단백질이다(문헌(Lange and Lonnroth, 2001) 검토). 항분비 단백질은 시퀀싱되어 있고 그의 cDNA는 클로닝되어 있다. 동등한 활성은 항분비 단백질 서열의 위치 35와 50 사이에 위치된 펩티드에 의해 주로 발휘되는 것으로 보인다. 면역화학적 및 면역조직화학적 조사는 항분비 단백질이 존재하고 체내의 대부분의 조직 및 기관에 의해 합성될 수도 있다는 것을 보여주었다. 지사 효과를 발휘하는 서열을 포함하는 합성 펩티드는 그 특징이 규명되어 있다(국제특허공보 제WO 97/08202호 및 제WO 05/030246호). 항분비 인자는 콜레라 독소를 사용한 항원 투여 후에 예컨대, 장 및 중추신경계의 맥락막총에서 병리학적 유체 수송 및/또는 염증 반응을 정상화시키는 것으로 이미 개시되어 있다(국제특허공보 제WO 97/08202호). 그러므로, 식품 및 사료에 있어서 천연 항분비 인자의 사용은 국제특허공보 제WO 97/08202호에서 부종, 설사, 탈수 및 염증의 치료에 유용한 것으로 제안되어 있다. 국제특허공보 제WO 98/21978호는 항분비 단백질의 형성을 유도하는 식품의 제조를 위한 효소 활성을 가진 생성물의 용도를 개시한다. 국제특허공보 제WO 00/038535호도 상기와 같은 견지에서 항분비 단백질이 풍부한 식품을 개시한다.
또한, 항분비 단백질 및 이의 단편은 세포의 상실 및/또는 획득과 관련된 증상의 치료에 있어서 복구 또는 신경 조직을 개선시키고 줄기세포 및 원시세포 및 이들로부터 유래된 세포의 증식, 아폽토시스, 분화 및/또는 이동을 개선시키는 것으로 밝혀져 있다(국제특허공보 제WO 05/030246호).
국제특허공보 제WO 97/08202호에 상세히 기재된 바와 같이 항분비 인자(AF), 특히 단백질 및 펩티드는 장 내에서의 과분비 증상 및 질환, 예컨대, 설사를 없애는 데 효과적이다. 과분비 증상과 관련하여 AF의 효과와 관련된 다른 예로는 예를 들어, 염증성 장 질환, 뇌 부종, 녹내장, 상승된 두개내 압력, 모어부스 메니에르(Morbus Meniere) 및 유선염을 들 수 있다. AF는 녹내장의 치료에 사용될 수도 있는 것으로 간주된다(국제특허공보 제WO 97/08202호).
최근에, 비정상적인 세포 기능, 과도한 또는 비정상적인 하중 또는 감염으로 인해 또는 독성 화합물 또는 약물에 의해 변경된 지질 라프트의 구조, 존재 정도, 분포 및 기능이 모니터링될 수 있고 심지어 일부 특정 단백질 및 관련 화합물의 도움을 받아 정상화될 수 있다는 것이 인식되어 있다.
매우 놀랍게도, 본 발명자들은 단백질 항분비 인자(Antisecretory Factor; AF) 및 이로부터 유래된 펩티드, 예컨대, AF-16 및 AF-8이 지질 라프트에 국한된 또는 지질 라프트와 관련된 기능 및 카베올라의 기능을 처음으로 모니터링하고/하거나, 조절하고/하거나 심지어 정상화시킬 수 있는 방식으로 세포, 조직 및/또는 기관에서 비정상적인 세포 기능, 과도한 또는 비정상적인 하중 또는 감염으로 인해 또는 독성 화합물 또는 약물에 의해 변경된 지질 라프트의 구조, 존재 정도, 분포 및 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것을 입증할 수 있었다.
본 발명은 세포막 내의 지질 라프트, 수용체 및/또는 카베올라의 기능장애, 예컨대, 비정상적인 기능, 불충분한 기능, 기능저하 및/또는 기능항진의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 항분비 단백질, 항분비 및/또는 동등한 기능적 및/또는 유사한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 지질 라프트, 수용체 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련된 다양한 증상, 예컨대, 혈관 기능장애, 심혈관 기능장애, 폐 기능장애, 세포 및 조직의 과다형성증 및/또는 비대증, 심혈관 기능장애, 심근병증 및 폐 고혈압, 상흔 조직의 형성, 과잉 조직의 반응성 형성 및 진성 당뇨병, 예컨대, I형 및/또는 II형 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 증상의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 및/또는 유사한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련된 다양한 증상의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것으로, 상기 약학 조성물은 예컨대, 세포벽을 통한 성분들의 전달, 조직 및 기관의 복구, 과잉 조직의 반응성 형성 및/또는 상피세포 외층(covering)의 복구 및 재생에 유리하게 영향을 미칠 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 알쯔하이머병, 임의의 다른 신경퇴행성 장애 및 신경외상으로 이루어진 군으로부터 선택된, 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련된 다양한 증상의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 기능적 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 항분비 단백질은 하기 식에 따른 서열로 구성된다:
X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,
상기 식에서,
X1은 I이거나, 서열번호 6의 아미노산 1 내지 35이거나, 존재하지 않고, X2는 H, R 또는 K이며, X3은 S 또는 L이고, X4는 T 또는 A이며, X5는 서열번호 6의 아미노산 43 내지 46, 43 내지 51, 43 내지 80 또는 43 내지 163이거나 존재하지 않는다.
나아가, 본 발명은 항분비 단백질, 동등한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 전술한 바와 같은 지질 라프트, 수용체 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련된 의학적 증상의 치료 및/또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 의학적 증상의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 의도한 치료 목적뿐만 아니라 환자의 연령, 성별, 증상 등에 적합한 다양한 투여량 및 투여 경로에 관한 것이다.
더욱이, 상기 약학 조성물은 둘 이상의 항분비 단백질을 포함할 수 있을 뿐만 아니라 약학적으로 허용가능한 부형제도 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 상기 약학 조성물은 안내, 비강내, 경구, 국소, 피하 및/또는 전신 투여를 위해 제제화되고, 예를 들어, 스프레이로서 투여, 에어로졸로서 투여, 흡입기에 의한 투여 또는 분무기에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있다. 혈액으로의 전신 투여하기 위해 제제화되는 경우, 상기 조성물은 바람직하게는 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 0.1 ㎍ 내지 10 mg의 투여량, 예컨대, 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 0.1 ㎍ 내지 1 mg, 바람직하게는 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 500 ㎍, 예컨대, 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 50 ㎍의 투여량으로 제제화된다. 이러한 투여는 단회 투여량으로서 또는 1일 다회 적용으로서 수행될 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련된 다양한 증상의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 이들의 약학적 활성 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 카베올라 및 지질 라프트, 즉 전문화된 마이크로도메인의 구조, 분포 및 기능을 모니터링하고 정상화시키는 데, 예컨대, 상기 마이크로도메인을 구조적 및 기능적으로 복구시키고, 질환, 손상, 복구 과정 및 다른 기능장애에서 생존 및 회복을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 세포 생성물의 세포내 수송 및 방출의 모니터링을 가능하게 할 뿐만 아니라 다양한 질환에서 조직 성분들의 분포의 정상화를 가능하게 하고/하거나, 반응성 세포 및 조직의 형성의 모니터링뿐만 아니라 비정상적인 조직 및 기관 연결을 비롯한 상흔 조직의 형성의 감소를 가능하게 한다. 또한, 상기 조성물은 독성 물질에 의해 발휘되는 효과의 치료를 가능하게 하고 상기 독성 물질의 장기간 효과를 모니터링하는 데 사용될 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 증상은 포유동물 체내에서 세포, 조직 및 기관의 외상, 중독, 감염, 기형, 퇴행 및 또 다른 기능장애 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 범위를 특정한 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 항분비 단백질, 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 본 발명의 조성물은 세포막 내의 카베올라 및/또는 지질 라프트의 구조, 분포 및/또는 기능의 정상화에 대한 그의 유리한 영향을 통해 그의 효과를 발휘할 수 있는 것으로 추정된다.
도 1은 결함 GABA 수용체를 가진 세포에서 세포막에 걸친 전위의 차이를 보여준다. 히스타민 또는 AF-16이 첨가되고 이 화합물들의 효과가 I/Io에서 측정된 세포막의 전위에 대해 측정된다.
정의 및 약어
약어
BP: 혈압; CSF: 뇌척수액; CNS: 중추신경계, 즉 뇌 및 척수; IFP: 간질액 압력; PH: 폐 고혈압; PBS: 인산염 완충 식염수; AF: 항분비 인자; AF-16: 아미노산 VCHSKTRSNPENNVGL로 구성된 펩티드; 옥타 펩티드 IVCHSKTR; 셉타 펩티드 VCHSKTR; 헥사 펩티드 CHSKTR; 펜타 펩티드 HSKTR.
정의
단백질은 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 아미노산 잔기들로 구성된 생물학적 거대분자이다. 아미노산의 선형 중합체인 단백질은 폴리펩티드로도 지칭된다. 전형적으로, 단백질은 50 내지 800개 아미노산 잔기들을 가지므로 약 6,000 내지 약 수십만 달톤 이상의 분자량을 가진다. 작은 단백질은 펩티드 또는 올리고펩티드로 지칭된다. 용어 "단백질" 및 "펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 "약학 조성물"은 경우에 따라 약학적 활성 부형제, 예컨대, 담체 또는 비히클과 함께 치료 활성량의 항분비 단백질을 포함하는 조성물을 지칭한다. 상기 약학 조성물은 환자의 증상뿐만 아니라 다른 인자들, 예컨대, 연령 또는 바람직한 선택에 따라 달라질 수 있는 적절한 투여 경로용으로 제제화된다. 항분비 단백질을 포함하는 약학 조성물은 약물 전달 시스템으로서 기능한다. 투여 시 상기 약학 조성물은 활성 물질을 인간 또는 동물의 체내에 제공한다. 상기 약학 조성물은 예컨대, 정제, 환제, 로젠지, 캡슐, 좌제, 겔, 용액 등의 형태일 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
용어 "약학적 활성 염"은 소위 호프메이저(Hofmeiser)의 시리즈를 기초로 하여, 항분비 단백질로부터 유도된 임의의 염일 수 있는 항분비 단백질의 염을 지칭한다. 약학적 활성 염의 다른 예는 트리플루오로아세테이트, 아세트테이트 및 라이신 클로라이드를 포함하지만, 본 발명은 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 용어 "항분비"는 분비, 특히 장 분비를 억제하거나 감소시키는 것을 지칭한다. 따라서, 용어 "항분비 단백질"은 체 내에서 분비를 억제할 수 있거나 감소시킬 수 있는 단백질을 지칭한다.
본원에서 "의료 식품"은 항분비 단백질을 가진 조성물로 제조된 식품을 지칭한다. 상기 식품은 유체 또는 고체 형태의 임의의 적절한 식품, 예컨대, 액체 또는 분말, 또는 임의의 다른 적절한 식품일 수 있다. 이러한 식품의 예는 국제특허공보 제WO 0038535호에서 찾을 수 있다. 또한, 상기 성분은 항분비 단백질의 흡수, 형성 및 방출을 유도할 수도 있다.
본원에서 "항분비 단백질" 또는 이의 유사체, 유도체 또는 단편은 국제특허공보 제WO 97/08202호에 정의된 용어 "항분비 인자" 또는 "항분비 인자 단백질"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 항분비 단백질 또는 펩티드, 또는 항분비 및/또는 동등한 기능적 및/또는 유사한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편을 지칭한다. 따라서, 본원에서 "항분비 인자", "항분비 인자 단백질", "항분비 펩티드", "항분비 단편" 또는 "항분비 단백질"은 이의 유도체, 유사체 또는 단편을 지칭할 수도 있음을 이해할 것이다. 이 용어들 모두는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 나아가, 본원에서 용어 "항분비 인자"는 "AF"로 약칭될 수 있다. 또한, 본원에서 항분비 단백질은 국제특허공보 제WO 97/08202호 및 제WO 00/38535호에 이미 정의되어 있는 항분비 성질을 가진 단백질을 지칭한다. 항분비 인자는 예를 들어, 국제특허공보 제WO 05/030246호에도 개시되어 있다. 용어 항분비 인자는 아래에 더 기재되어 있는 스웨덴 특허 제SE 900028-2호 및 국제특허공보 제WO 00/38535호에 개시된, 항분비 인자가 풍부한 난황도 포함한다.
본원에서 "분무기"는 액체 약물을 분무의 형태로 기도로 전달하는 의료용 장치를 지칭한다. "분무기"의 압축기는 관내운반(tubing)을 통해 공기를 액체 약물로 채워진 약물 컵 내로 강제 주입시킨다. 공기의 강제 주입은 액체를 기도 내로 깊이 흡입될 수 있는 작은 분무-유사 입자로 분해한다.
본원에서 용어 "에어로졸"은 미세한 고체 또는 액체 입자의 기체 현탁액을 지칭한다.
발명의 상세한 설명
현재 적절한 요법이 이용가능하지 않기 때문에 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련된 의학적 증상의 약리학적 치료를 목적으로 하는 새로운 약물이 필요하다. 항분비 단백질은 하기 내용에서 예시된 유리한 효과를 발휘한다.
본 발명은 세포막에 풍부하게 분포하는 지질 라프트 및 관련 구조체인 카베올라의 구조 및 기능의 모니터링 및 조절에 관한 것이다. 지질 라프트는 콜레스테롤이 풍부하며, 예를 들어, 이온의 스핑고지질 수송, 예컨대, 이온의 GMl 수송, 세포 부착, 성장, 신호 전달 및 세포골격에의 부착에 중요한 단백질들이 국한되어 있는 막 마이크로도메인으로서 정의된다. 카베올라는 예를 들어, 내피세포, 평활근세포, 상피세포, 섬유모세포 및 심근세포를 비롯한 심폐 및 혈관 시스템의 세포에 풍부하며 지질 라프트 성분들의 하나 이상의 응집물에 의해 형성된 소포낭형 또는 플라스크형 구조체이다. 단독으로 사용되거나 병용되는 관련 추가적 단백질은 플로틸린, 카베올린 및 레기이고, 이들 각각의 여러 변이체가 존재한다.
카베올라는 예를 들어, 심장세포, 평활근세포, 내피세포, 대식세포 및 지방세포에 풍부하게 존재하고, 콜레스테롤 및 스핑고지질이 막 내에 집중적으로 풍부하다는 점, 환경과 세포 내부 사이에 신호를 전달한다는 점 및 세포골격에 연결되어 있다는 점을 특징으로 하는 동적인 구조체인 지질 라프트의 전문화된 형태이다. 다른 지질 라프트와 대조적으로, 카베올라는 더 크고 통상적으로 세포막 내의 플라스크형 오목부 또는 함몰부 및 소포낭로서 보인다. 카베올라의 크기는 편차가 상당하지만 약 0.1 ㎛이다. 또한, 글리코포스파티딜이노시톨-결합 단백질 및 이의 변이체는 상기 구조체에 부착되어 상기 구조체와 상호작용하는 고정 단백질을 구성한다. 혈관 기능을 매개하는 효소도 상기 구조체에 편재되어 있는 것으로 밝혀져 있다. 이 동적인 막 성분들은 G-단백질 시스템 및 효소 시스템뿐만 아니라 세포골격을 통해 세포의 내부에 연결됨으로써 이 구조체들이 세포 기능에 영향을 미치고 세포 기능을 조절할 수 있게 한다. 따라서, 지질 라프트 및 카베올라는 세포의 구조 및 기능에 핵심적으로 중요한 것으로 밝혀져 있다. 신호 전달 및 물질 전달 단백질을 비롯한 상기 막 구조체의 안정화 및 정상화를 모니터링할 수 있게 하는 공지된 방법이 없다.
본 발명은 세포막 내의 지질 라프트 및 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물 및/또는 의료 식품의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 지질 라프트 및 카베올라의 기능장애와 관련된 다양한 증상, 예컨대, 세포벽을 통한 성분들의 전달, 조직 및 기관의 복구, 세포 및 조직의 과다형성증 및/또는 비대증, 심혈관 기능, 상흔 조직의 형성, 과잉 조직의 반응성 형성, 및 상피세포 외층의 복구 및 재생의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 항분비 단백질, 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물 및/또는 의료 식품의 치료 유효량을 전술한 바와 같은 지질 라프트 및 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 정상화가 필요한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 기능장애의 치료 및/또는 정상화 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 의도한 치료 목적뿐만 아니라 환자의 연령, 성별, 상태 등에 적합한 다양한 투여량 및 투여 경로에 관한 것이다.
본 발명에 따른 치료는 지질 라프트 및 카베올라의 기능장애 또는 병원성 물질의 흡수 또는 방출을 발생시키거나 앓을 위험이 있는 환자에게 가장 유용할 것이다. 또한, 이러한 치료는 세포 및 세포외 매트릭스 성분의 비정상적인 전환을 특징으로 하는 다른 증상에도 유리하다.
항분비 단백질 및 펩티드가 세포막 내에서 지질 라프트에 대해 효과를 발휘할 것임을 입증하는 현재 발견된 증거는 당업자에게 정말로 놀라운 것이다. 평균 크기가 ㎛보다 훨씬 더 작고 지질 라프트로 불리며 고농도의 콜레스테롤 및 스핑고미엘린을 특징으로 하는 많은 수의 도메인이 존재한다. 지질 라프트는 물질 전달 및 세포 신호 전달에 관여하는 다양한 내재 막 단백질 및 표재 막 단백질을 함유한다. 이러한 신호 전달 플랫폼은 막 내에서 부유하고, 수용체, 커플링 인자, 이펙터(effector) 효소 및 화합물, 및 기질로서의 적절한 기능에 필수적인 요소들을 구비하고 있음으로써 특정 이온, 분자 및 신호를 받고 전달할 수 있다. 또한, 이 도메인들은 예를 들어, 세포골격과 상호작용하고, 추가로 간질액의 조성 및 전환뿐만 아니라 이의 압력에도 영향을 미친다. 또한, 지질 라프트는 카베올라의 전환과 관련되어 있고, 예를 들어, 바이러스의 방출 및 내부이입과 관련되어 있다. 매 순간마다 주요 기능과 관련된 동적인 변화를 겪는 지질 라프트와 성장 인자 수용체, 염증 신호 수용체, 이온 채널 및 수송자의 응집물이 세포막 내에 존재한다.
항분비 단백질 및 펩티드(AF)의 용도는 실시예에 기재된 조직, 기관 및 해부학적 구조체로 한정되지 않고, 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애, 비정상적인 기능, 기능저하 또는 기능항진을 특징으로 하는 추가적 증상 및 질환도 포함한다.
항분비 단백질, 펩티드, 유도체 및 유사체는 물질 전달 및 신호 전달에 관여하는 지질 라프트 및 단백질의 기능을 모니터링하고 심지어 정상화시키는 능력을 가진다. 이용되는 매우 광범위한 유효량 섭생법은 부작용 및 예상치 않은 합병증에 대한 위험이 최소한임을 암시한다. 따라서, 지질 라프트 및 카베올라와 관련된 구조 및 기능을 모니터링하고 조절하는 데 이용된 방법은 세포 및 조직에 대한 과도한 하중의 치료를 가능하게 할 뿐만 아니라 개개의 반응 및 질병의 심각도 및/또는 불편함에 따라 조절된 광범위한 투여량으로 환자를 치료할 수 있게 한다.
한 측면에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 국부 투여, 원위치(in situ) 국소 투여, 경구 투여, 비강내 투여, 피하 투여 및/또는 혈관 또는 호흡관을 통한 전신 투여에 의해 투여될 수 있다.
항분비 인자는 체내에서 천연적으로 발생하는 단백질 부류이다. 인간 항분비 인자 단백질은 뇌하수체로부터 단리된 경우 382개의 아미노산을 포함하는 41 kDa 단백질이다. 본 발명에 따른 카베올라의 지질 라프트 정상화 및/또는 모니터링에 대한 유리한 효과와 관련된 활성 부위는 단백질의 N-말단에 가까운 영역 내에서 단백질에 편재되어 있을 수 있거나, 서열번호 6의 아미노산 1 내지 163에 편재되어 있을 수 있거나, 이 영역의 단편에 편재되어 있을 수 있다.
본 발명자들은 항분비 인자가 모든 세포 내에 풍부하게 분포하는 성분인 26S 프로테아좀(proteasome), 보다 구체적으로 19 S/PA 700 캡(cap)의 서브유니트(subunit)를 구성하는 Rpn10으로도 불리는 단백질 S5a와 어느 정도 유사하다는 것을 밝혔다. 본 발명에서, 항분비 단백질은 동일한 기능적 성질을 가진 유사체 단백질의 부류로서 정의된다. 프로테아좀은 과잉 단백질뿐만 아니라 수명이 짧은 원치않는 단백질, 변성된 단백질, 잘못 폴딩된 단백질 및 다른 비정상적인 단백질의 분해와 관련된 다수의 기능을 가진다. 또한, 항분비 인자/S5a/Rpn10은 세포 성분, 가장 명백하게는 단백질의 분포 및 수송에 관여한다.
본 발명에 따른 항분비 단백질 및/또는 펩티드의 유사체, 유도체 및 단편 모두는 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조뿐만 아니라 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련된 증상의 치료 방법에서도 사용될 수 있는 유사한 생물학적 활성을 가진다. 본원에서 유사체, 유도체 및 단편은 본 발명과 관련된 증상의 치료 및/또는 예방에 있어서 항분비 인자의 생물학적 활성을 최적화하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변경함으로써 추가로 변형될 수 있는 천연 발생 항분비 단백질의 4개 이상의 아미노산을 포함한다.
일반적으로, 항분비 단백질의 단편은 제제 중의 단백질의 90% 초과, 예컨대, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 본 발명의 단백질, 펩티드 및/또는 단편인 제제 중에 상기 펩티드/아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함할 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따른 항분비 단백질, 펩티드, 유사체, 유도체 및/또는 단편의 아미노산 서열과 70% 이상 예컨대, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 임의의 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 본원에서 용어 "유사성"과 "동일성"은 상호교환적으로 사용된다. 즉, 또 다른 아미노산 서열과 특정된 정도의 동일성을 가진 아미노산 서열은 특정된 아미노산 서열과 동일한 정도의 유사성을 가진다.
유도체는 본원에서 정의된 항분비 인자와 동등한 활성 및/또는 동등한 기능적 활성을 가진 단백질로서, 다른 물질로부터 직접적으로 유도되거나 또는 변형 또는 부분 치환(이때 하나 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있는 또 다른 아미노산으로 치환됨)에 의해 유도된 단백질을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항분비 인자 유도체는 N-말단 및/또는 C-말단 보호 기를 포함할 수 있다. N-말단 보호 기의 한 예로는 아세틸을 들 수 있다. C-말단 보호 기의 한 예로는 아미드를 들 수 있다.
기준 아미노산 서열과 예를 들어, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질, 이의 유사체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은 상기 아미노산 서열이 기준 아미노산 서열의 100개 아미노산당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고 예를 들어, 펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해, 기준 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 5% 이하의 아미노산이 결실될 수 있거나 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 기준 서열 내의 총 아미노산의 5% 이하의 많은 아미노산이 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 위치 또는 카르복시 말단 위치 또는 상기 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 아미노산들 사이에 개별적으로 흩어져 있을 수 있거나 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 기들에 흩어져 있을 수 있다.
본 발명에서 국소 알고리즘 프로그램은 동일성을 측정하기에 가장 적합하게 잘 맞춰져 있다. 국소 알고리즘 프로그램(예컨대, 스미스 워터맨(Smith Waterman))은 한 서열 내의 하위서열(subsequence)을 제2 서열 내의 하위서열과 비교하여, 상기 하위서열들의 조합 및 상기 하위서열들의 정렬을 발견함으로써 최대 총 유사성 점수를 산출한다. 허용되는 경우, 내부 갭(gap)에 벌점을 부과한다. 국소 알고리즘은 단일 도메인 또는 결합 부위만을 공유하는 2개의 다중도메인 단백질들을 비교하는 데 매우 적합하다.
동일성 및 유사성을 측정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 프로그램으로 체계적으로 정리되어 있다. 2개의 서열들 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(Devereux, J et al. (1994)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S. F. et al. (1990))를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급처로부터 공개적으로 이용가능하다(BLAST Manual, Altschul, S. F. et al., Altschul, S. F. et al. (1990)). 각각의 서열 분석 프로그램은 디폴트(default) 점수부여 매트릭스 및 디폴트 갭 벌점을 가진다. 일반적으로, 분자생물학자는 사용되는 소프트웨어 프로그램에 의해 확립된 디폴트 셋팅을 이용할 것으로 예상된다.
본원에서 정의된 바와 같이, 항분비 단백질 또는 펩티드, 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 및/또는 단편은 4개 이상의 아미노산, 예컨대, 5 내지 16개의 아미노산 예컨대, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항분비 인자는 42, 43, 45, 46, 51, 80, 128, 129 또는 163개의 아미노산으로 구성되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 항분비 인자는 5, 6, 7, 8 또는 16개의 아미노산으로 구성되어 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항분비 단백질 또는 펩티드, 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유사체, 유도체 또는 단편은 하기 식에 따른 서열로 구성된다:
X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5
상기 식에서,
X1은 I이거나, 서열번호 6의 아미노산 1 내지 35이거나, 존재하지 않고, X2는 H, R 또는 K이며, X3은 S 또는 L이고, X4는 T 또는 A이며, X5는 서열번호 6의 아미노산 43 내지 46, 43 내지 51, 43 내지 80 또는 43 내지 163이거나 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 항분비 인자는 생체내 또는 시험관내에서 예를 들어, 재조합, 합성 및/또는 화학적 합성을 통해 제조될 수 있고/있거나, 항분비 인자의 천연 발생 공급원, 예컨대, 돼지 뇌하수체 또는 새의 알로부터 단리될 수 있다. 제조 후, 항분비 인자는 예컨대, 화학적 또는 효소적 절단에 의해 더 작은 항분비 활성 단편으로 더 프로세싱될 수 있거나 아미노산의 변형에 의해 더 프로세싱될 수 있다. 현재, 항분비 인자를 정제에 의해 순수한 형태로 수득할 수 없다. 그러나, 국제특허공보 제WO 97/08202호 및 제WO 05/030246호에 이미 개시된 바와 같이 생물학적 활성 항분비 인자 단백질을 재조합 또는 합성을 통해 제조할 수 있다. 국제특허공보 제WO 97/08202호는 7 내지 80개의 아미노산으로 구성된, 상기 단백질의 생물학적 활성 단편의 제조를 개시한다.
본 발명에 따른 항분비 인자는 N-말단 및/또는 C-말단 보호 기를 추가로 포함할 수 있다. N-말단 보호 기의 한 예로는 아세틸을 들 수 있다. C-말단 보호 기의 한 예로는 아미드를 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항분비 인자는 아미노산에 대해 공통된 1 문자 약어를 사용하는 서열번호 1 내지 6, 즉 VCHSKTRSNPENNVGL(본원에서 AF-16으로도 지칭되는 서열번호 1), IVCHSKTR(서열번호 2), VCHSKTR(서열번호 3), CHSKTR(서열번호 4), HSKTR(서열번호 5) 및 서열번호 6에 따른 항분비 단백질의 아미노산 서열 중에서 선택된다. 서열번호 1, 2 및 3은 예를 들어, 국제특허공보 제WO 05/030246호에 이미 개시되어 있다. 첨부된 서열목록에 특정되어 있는 바와 같이, 상기 특정된 서열 내의 아미노산들 중 일부는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 단락 중 하기에서, 특정 아미노산 서열 내의 특정 아미노산의 위치는 그 특정 서열 내에서 위치 1에 있는 최외각 N-말단 아미노산을 표시하는 좌측부터 계산된다. 하기에 특정된 임의의 아미노산 치환(들)은 그 서열 내의 임의의 다른 아미노산 치환(들)과는 독립적으로 수행될 수 있다. 서열번호 1에서, 위치 2에 있는 C는 S로 치환될 수 있고/있거나, 위치 3에 있는 H는 R 또는 K로 치환될 수 있고/있거나, 위치 4에 있는 S는 L로 치환될 수 있고/있거나, 위치 6에 있는 T는 A로 치환될 수 있다. 서열번호 2에서, 위치 3에 있는 C는 S로 치환될 수 있고/있거나, 위치 4에 있는 H는 R 또는 K로 치환될 수 있고/있거나, 위치 5에 있는 S는 L로 치환될 수 있고/있거나, 위치 7에 있는 T는 A로 치환될 수 있다. 서열번호 3에서, 위치 2에 있는 C는 S로 치환될 수 있고/있거나, 위치 3에 있는 H는 R 또는 K로 치환될 수 있고/있거나, 위치 4에 있는 S는 L로 치환될 수 있고/있거나, 위치 6에 있는 T는 A로 치환될 수 있다. 서열번호 4에서, 위치 1에 있는 C는 S로 치환될 수 있고/있거나, 위치 2에 있는 H는 R 또는 K로 치환될 수 있고/있거나, 위치 3에 있는 S는 L로 치환될 수 있고/있거나, 위치 5에 있는 T는 A로 치환될 수 있다. 서열번호 5에서, 위치 1에 있는 H는 R 또는 K로 치환될 수 있고/있거나, 위치 2에 있는 S는 L로 치환될 수 있고/있거나, 위치 4에 있는 T는 A로 치환될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 6에 따른 2개 이상의 임의의 단편의 조합물도 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 선택 및 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 부형제의 최적 농도는 실험에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 부형제는 용매, 완충제, 보존제, 킬레이트화제, 항산화제 및 안정화제, 유화제, 현탁화제 및/또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 예를 들어, 문헌("Remington: The science and practice of pharmacy", 21st edition, ISBN 0-7817-4673-6) 또는 문헌("Encyclopedia of pharmaceutical technology", 2nd edition, ed. Swarbrick J., ISBN: 0-8247-2152-7)에 따라 통상적인 약학 관행에 따라 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 조성물이 투여될 개체에 실질적으로 무해한 물질이다. 이러한 부형제는 통상적으로 국립 보건부에 의해 제공된 요건을 충족시킨다. 공인된 약전, 예컨대, 영국 약전, 미국 약전 및 유럽 약전은 약학적으로 허용가능한 부형제에 대한 기준을 제시한다.
하기 설명은 본 발명에 따른 약학 조성물에서 경우에 따라 사용될 관련 조성물들에 대한 검토이다. 이 검토는 특정 투여 경로를 기초로 한 것이다. 그러나, 약학적으로 허용가능한 부형제가 다양한 제형 또는 조성물에서 사용될 수 있는 경우, 약학적으로 허용가능한 특정 부형제의 적용은 특정 제형 또는 부형제의 특정 기능으로 한정되지 않는다는 것이 인식된다. 본 발명은 하기 설명에서 언급된 조성물의 용도로 한정되지 않는다는 것이 강조되어야 한다.
비경구 조성물:
전신 투여를 위해, 본 발명에 따른 조성물은 미소구(micorsphere) 및 리포좀을 비롯한 통상의 무독성 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 조성물은 모든 종류의 고체, 반고체 및 유체 조성물을 포함할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 부형제는 용매, 완충제, 보존제, 킬레이트화제, 항산화제 및 안정화제, 유화제, 현탁화제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 이 다양한 물질의 예는 아래에 기재되어 있다.
다양한 물질의 예:
용매의 예로는 물, 알코올, 혈액, 혈장, 척수액, 복수액 및 림프액을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
완충제의 예로는 구연산, 아세트산, 타르타르산, 젖산, 수소 인산, 중탄산염, 인산염, 디에틸아미드 등을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
킬레이트화제의 예로는 EDTA 및 구연산을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
항산화제의 예로는 부틸화된 히드록실 애니솔(BHA; butylated hydroxyl anisole), 아스코르브산 및 이의 유도체, 토코페롤 및 이의 유도체, 시스테인 및 이들의 혼합물을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
희석제 및 붕해제의 예로는 락토스, 사카로스, 엠덱스(emdex), 인산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, 만니톨, 전분 및 미세결정질 셀룰로스를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
결합제의 예로는 사카로스, 소르비톨, 검 아카시아, 알긴산나트륨, 젤라틴, 키토산, 전분, 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 국소 투여될 수 있거나, 환자 내로의 정맥내 말초 주입 또는 근육내 또는 피하 주사를 통해 투여될 수 있거나, 협측, 폐, 비강, 피부 또는 경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 약학 조성물을 외과수술에 의해 삽입된 션트(shunt)를 통해 환자의 뇌실 내로 투여할 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 약학 조성물은 안내, 국소, 비강내, 경구, 피하 및/또는 전신 투여를 위해 제제화된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 현탁액으로서 적용에 의해, 또는 훨씬 더 바람직하게는 스프레이, 에어로졸, 흡입기 또는 분무기를 사용하여 코 및/또는 호흡관으로 흡입하기 위한 산제로서 적용에 의해 투여된다.
항분비 인자를 포함하는 산제의 투여는 안정성 및 투여량의 관점에서 추가적 이점을 가진다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 안내, 비강내, 경구 또는 피하 투여를 통해 국소 투여될 수 있고/있거나 혈관을 통해 전신 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥내, 근육내, 국소, 경구 또는 비강 투여를 위해 제제화된다. 전형적으로, 눈에의 국부 투여를 위해 사용되는 경우, 본 발명의 조성물에서 적용된 농도는, 1일당 단회 투여량으로서 적용 또는 1일 당 반복된 수회 적용(다회 투여량)으로서, 1회 적용당 1 ㎍ 내지 1 mg, 바람직하게는 50 내지 250 ㎍이지만 이로 한정되지 않는다.
혈액으로 전신 투여를 위해 사용되는 경우, 투여량은, 1일당 단회 투여량으로서 또는 1일당 반복된 수회 적용으로서, 체중 1 kg 및 1회 적용당 0.1 ㎍ 내지 10 mg, 예컨대, 체중 1 kg 및 1회 적용당 0.1 ㎍ 내지 1 mg, 바람직하게는 체중 1 kg당 1 내지 500 ㎍, 보다 바람직하게는 체중 1 kg당 1 내지 50 ㎍의 범위 내에 있다. 항분비 인자가 풍부한 난황이 본 발명에 따라 사용되는 경우, 이 제제는 바람직하게는 경구 투여된다.
따라서, 본 발명은 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물 및/또는 의료 식품의 제조를 위한, 항분비 단백질 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염의 용도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 항분비 단백질은 하기 식에 따른 서열로 구성된다:
X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,
상기 식에서,
상기 식에서,
X1은 I이거나, 서열번호 6의 아미노산 1 내지 35이거나, 존재하지 않고, X2는 H, R 또는 K이며, X3은 S 또는 L이고, X4는 T 또는 A이며, X5는 서열번호 6의 아미노산 43 내지 46, 43 내지 51, 43 내지 80 또는 43 내지 163이거나 존재하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항분비 단백질의 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항분비 단백질의 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항분비 단백질의 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항분비 단백질의 용도에 관한 것이다. 추가적 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항분비 단백질의 용도에 관한 것이다.
나아가, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 가진 단백질인 항분비 단백질, 또는 서열번호 6의 아미노산 38 내지 42를 포함하는 상기 항분비 단백질의 유사체, 유도체 및/또는 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 6에 개시된 단백질들로부터 선택된 2 이상의 항분비 단백질, 서열번호 6의 아미노산 38 내지 42을 포함하는 상기 항분비 단백질의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 본원에 기재된 일반 식으로 표시된 서열을 가진 항분비 단백질을 포함하는 본원에 개시된 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 서열은 본 발명에서 사용하기에 모두 동등하게 바람직하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 이러한 부형제는 특정 목적에 적합하도록 선택된 임의의 바람직한 부형제일 수 있다. 부형제의 예는 본원에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 안내, 비강내, 경구, 국소, 피하 및/또는 전신 투여를 위해 제제화된다. 선택되는 투여 경로는 치료받을 환자의 상태 및 환자의 연령 및 성별 등에 따라 달라질 것이다.
또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 스프레이로서 투여, 에어로졸로서 투여, 또는 분무기 또는 흡입기에 의한 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 0.1 ㎍ 내지 10 mg, 예컨대, 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 0.1 ㎍ 내지 1 mg, 바람직하게는 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 500 ㎍, 보다 바람직하게는 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 50 ㎍의 투여량으로 혈액에 전신 투여하기 위해 제제화된 약학 조성물 및/또는 의료 식품에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 투여량은 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 1000 ㎍, 예컨대, 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 100 ㎍이다. 물론 상기 약학 조성물이 필요한 환자에게 공급되는 약학 조성물의 양은 치료받을 환자에 따라 달라질 것이고, 각각의 경우 당업자, 예컨대, 의사에 의해 결정될 것이다. 이러한 투여는 단회 투여 또는 다회 매일 투여로서 수행될 수 있다.
지난 수년에 걸쳐, 지질 라프트, 카베올라 및 카베올린이 여러 인간 질환 상태, 예컨대, 근이영양증(예를 들어, 지대형근이영양증), 세포내 콜레스테롤의 불균형(예컨대, 니에만-피크 타입 C(Niemann-Pick type C)), 및/또는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 아밀로이드 펩티드의 발생에서의 기능장애(예를 들어, 알쯔하이머병)(이들 질환 상태로 한정되지 않음)에 관여한다는 것이 점차 명백해졌다. 따라서, 본 발명은 한 실시양태에서 근이영양증, 세포내 콜레스테롤의 불균형, 및/또는 아밀로이드 전구체 단백질로부터 아밀로이드 펩티드의 발생에서의 기능장애를 예방하고/하거나 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 약학 조성물의 용도를 제공한다.
지질 라프트는 세포 도메인의 한 유형을 대표하는데, 이때 특정 화학구조를 가진 지질은 서로 동적으로 결합하여 막 단백질 분류, 및 물질 전달 및 신호 전달 결합체의 구축에 중요한 플랫폼을 형성할 수 있다.
여러 세포 수용체가 세포막의 지질 라프트 및/또는 카베올라에 존재하는 것으로 공지되어 있는데, 예를 들어, 라프트는 그의 수명주기의 모든 단계에서, 즉 세포외유출 경로, 원형질막, 세포내이입 경로에서 GPCR의 조절에 있어서 중요하다는 것이 입증되어 있다. 지질 라프트 및/또는 카베올라는 수용체 안정성의 조절, 신호 전달 조절 및 임의의 특정 GPCR의 운반에 관여하는 것으로 밝혀져 있다. 수용체, 이온 채널 및 물 채널 단백질 및 다른 신호 전달도입제의 빠른 전환도 모니터링될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 수용체 안정성의 조절, 신호 전달 조절 및/또는 세포막 내에 편재한 하나 이상의 수용체의 운반을 위한 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
많은 수용체가 3 내지 5시간 이하의 평균 수명을 가진다. 따라서, 신규 수용체 단백질의 일정한 제조는 제조된 수용체 단백질이 확실하고 정확하게 안내되어 세포막 내의 적절한 위치에 고정될 것을 요구한다. 본 발명은 세포막 내에서의 이러한 수용체 위치선정(positioning)을 개선시키고/시키거나 촉진하기 위한 본 발명에 따른 약학 조성물의 잠재적인 용도를 개시한다.
더욱이, 최근 발견은 종래의 스테로이드 호르몬 수용체가 세포막 내의 지질 라프트 및/카베올라에 존재함으로써 이 구조체들 내에서 이 구조체들의 도움을 받아 작용할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 수용체의 예로는 수용체 티로신 키나제, 즉 EGFR 및 안드로겐 수용체 신호 전달 경로, Akt1, IL-6, STAT3, 에스트로겐 수용체(ER)를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 스테로이드 호르몬 수용체의 기능장애와 관련된 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도도 제공한다.
생리학적 수준의 인슐린에 반응하는 세포 또는 조직의 감소된 능력으로서 정의되는 인슐린 내성은 II형 당뇨병의 병리생리학적 면에서의 주요한 결함인 것으로 생각된다. TNFα는 다른 사이토카인 및 림포카인과 마찬가지로 인슐린 내성에 있어서 주요한 역할을 수행하는 것으로 공지되어 있다. 현재, 호르몬의 독특한 작용은 세포막 내의 지질 라프트 내에서의 신호 전달 분자의 구획화와 밀접하게 연관되어 있다는 것이 분명해졌다. 따라서, 지질 라프트의 적절한 기능은 예를 들어, 지방세포에서의 인슐린 신호 전달의 적절한 구획화에 매우 중요한 것으로 밝혀져 있다. 그러므로, 지질 라프트 조직화 및/또는 기능의 파괴는 아마도 적어도 부분적으로는 글리코스핑고지질의 비정상적인 발현으로 인해 인슐린 대사 신호 전달의 억제 및/또는 파괴를 야기한다. 따라서, 본 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인슐린 대사 신호 전달의 정상화를 위한, 항분비 단백질 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 결과적으로, 상기 실시양태에서, 본 발명은 진성 당뇨병, 예를 들어, II형 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다.
지질 라프트 및 카베올라는 신호 전달도입을 위한 조직화된 중심으로서 작용한다. 인슐린 수용체 및 TC10 둘다 지질 라프트에 존재한다. TC10이 비-지질 라프트 도메인으로 잘못 표적화되면 인슐린에 의한 그의 활성화가 저해되고 인슐린 작용이 차단된다. 다수의 연구가 지질 라프트가 지방세포에서의 인슐린 신호 전달을 위한 조직화 센터로서 작용한다는 것을 입증하였다. 활성화된 인슐린 수용체는 카베올린 및 CbI를 비롯한 지질 라프트 내의 일부 단백질의 티로신 인산화에 특이적 촉매 작용을 발휘한다. 인슐린 수용체, 플로틸린 및 TC10의 일부 또는 전부를 비롯한 인슐린 신호 전달의 성분들은 지질 라프트 내에 구성적으로 편재되어 있다.
인슐린은 촉진성 글루코스 수송자 Glut4가 세포내 부위로부터 원형질막으로 전위되는 조절된 소포낭 재순환 과정을 통해 지방 및 근육 세포 내에서 글루코스 수송을 자극한다. 자극받지 않는 세포에서, Glut4는 내포낭(endosome) 내로의 세포내이입을 겪은 후, 인슐린 수용체의 활성화 후 원형질막으로 운반되는 전문화된 저장 소포낭 내로 분류된다. 그 다음, 상기 소포낭은 막의 특정 부위에 도킹하여 융합됨으로써 수송자의 세포외 노출을 일으킨다. 인슐린 수용체로부터의 신호 전달 캐스케이드는 다수의 세포내 기질의 티로신 인산화, PI3-키나제 경로의 활성화 및 G-단백질의 활성화(이 활성화 후, G-단백질은 엑소시스트(exocyst) 단백질 Exo70을 비롯한 다수의 이펙터에 결합함)를 수반한다.
더욱이, Exo70, Sec6 및 Sec8을 포함하는 엑소시스트 결합체는 예를 들어, 지방세포의 세포막 내에서 지질 라프트 도메인에서의 Glut4-함유 소포낭의 구획화에 관여한다. 엑소시스트 결합체의 일부는 인슐린에 의한 활성화 후 G-단백질에 의해 모집되고 세포 내에서 인슐린에 의해 자극된 글루코스 흡수에 필수적이다. 뿐만 아니라, 지질 라프트로의 엑소시스트 결합체의 표적화가 글루코스 흡수 및 원형질막에의 Glut4 도킹에 요구된다는 것이 최근에 밝혀졌다. 흥미롭게도, 이 결합체는 지질 라프트로의 전위 시 상기 결합체에 결합하는 PDZ 도메인 단백질도 요구한다. 지질 라프트에서의 엑소시스트 조립은 인슐린에 의한 세포의 자극 시 이 마이크로도메인들과 일시적으로 결합하는 Glut4 소포낭에 대한 표적 부위를 확립한다.
본원의 실험 단락에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 항분비 인자가 화학적으로 유도된 진성 당뇨병에서 증상의 발달에 유리한 영향을 발휘한다는 것을 입증할 수 있었다. 구체적으로, 스트렙토조신을 사용한 처리에 의해 유발된 실험적으로 유도된 진성 당뇨병은 이 당뇨병이 AF-16을 사용한 처리에 의해 유리하게 영향을 받는 지에 대해 조사되었다. 따라서, 본 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 진성 당뇨병 및/또는 진성 당뇨병 관련 합병증, 예컨대 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병으로부터 선택된 당뇨병과 관련되어 있는 환자에서 의학적 증상을 치료하고/하거나 예방하기 위한, 항분비 단백질 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 근육세포, 내피세포, 지방세포 및/또는 적혈구세포 내에서의 지질 라프트 형성 및/또는 기능을 정상화시키는 데 사용되고, 상기 세포 내에서의 Glu4 및/또는 엑소시스트 조립의 기능장애를 치료하고/하거나 예방하는 데 사용된다. 따라서, 상기 약학 조성물은 본원에서 진성 당뇨병 및/또는 진성 당뇨병 관련 합병증, 예컨대 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병으로부터 선택된 당뇨병을 치료하고/하거나 예방하는 데 사용된다.
카베올라는 세포 내로의 용액의 수용체-매개 흡수 및 세포를 통한 세포내이입 둘다에 관여하는 세포질 소포낭을 형성하는, 원형질막으로부터 떨어져 나올 수 있는 동적인 구조체이다. 카베올라가 많은 세포 유형에서 발견된다 하더라도, 카베올라는 특히 지방세포 내에 풍부하게 존재하는데, 이때 카베올라는 종종 액틴 필라멘트와 연결되어 있는 링-유사 구조체(카베올라 로제트(rosettes))로 응집될 수 있다. 카베올라는 지방산 흡수뿐만 아니라 세포의 지방산 수송 및/또는 지방산 결합에도 관여한다. 나아가, 카베올라 및 카베올린-1은 세포 표면으로의 콜레스테롤 수송에 관여하고 세포 내의 콜레스테롤 수준에 의해 조절되는 것으로 잘 규명되어 있다. 따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명은 또한 지방산 흡수, 지방산 수송, 지방산 결합 및/또는 콜레스테롤 수준에서의 기능장애와 관련되어 있는 환자에서 의학적 증상을 치료하고/하거나 예방하기 위한, 항분비 단백질 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
카베올라 기능장애는 여러 인간 질환과 관련되어 있다. 예를 들어, 카베올린-1(CAV1)-무기능(null) 세포는 증가한 증식을 보이고, CAV의 상실은 종양발생을 가속화한다. 여러 유방암에서, CAV1은 하강 조절되고, CAV1에서의 다수의 산발적 돌연변이가 에스트로겐-수용체-알파-양성 상태와 구체적으로 상호관련되어 있는 인간 유방암의 샘플에서 검출된다. 근육-특이적 카베올린 이소폼(isoform)인 CAV3도 질환과 밀접하게 관련되어 있다. CAV3에서의 많은 돌연변이가 많은 인간 근육 장애와 관련되어 있다.
또 다른 동등하게 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 고혈압의 방지 및/또는 안정화가 필요한 환자에서 고혈압을 방지하고/하거나 안정화시키기 위해 카베올라의 구축 및/또는 기능을 정상화시키는 데 사용된다. 실험 단락에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 약학 조성물을 사용한 포유동물의 처리는 포유동물 신체의 소순환계 및 대순환계 둘다에서의 긴장항진으로 인한 합병증을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 심장 발작, 고혈압, 폐 질환, 플라크 형성 및/또는 혈관계, 예컨대, 심장 및 폐의 외상적 손상뿐만 아니라 호르몬 기능장애 및 조절장애를 치료하고/하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항분비 단백질 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 예방이 필요한 포유동물에서 상기 기능장애를 치료하고/하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 상기 항분비 단백질이 하기 식에 따른 서열로 구성된 것인 방법에 관한 것이다:
X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5
상기 식에서,
X1은 I이거나 서열번호 6의 아미노산 1 내지 35이거나 존재하지 않고, X2는 H, R 또는 K이며, X3은 S 또는 L이고, X4는 T 또는 A이며, X5는 서열번호 6의 아미노산 43 내지 46, 43 내지 51, 43 내지 80 또는 43 내지 163이거나 존재하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 항분비 단백질이 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 항분비 단백질이 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 항분비 단백질이 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항분비 단백질이 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 항분비 단백질이 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 항분비 단백질이 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 가진 단백질, 또는 서열번호 6의 아미노산 38 내지 42를 포함하는 상기 단백질의 유사체, 유도체 및/또는 단편인 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 상기 약학 조성물이 서열번호 1 내지 및 서열번호 6에 기재된 단백질들로부터 선택된 2 이상의 항분비 단백질, 서열번호 6의 아미노산 38 내지 42를 포함하는 상기 항분비 단백질의 유사체, 유도체 및/또는 단편, 또는 본원에 기재된 일반 식으로 표시된 서열을 가진 항분비 단백질을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 안내, 비강내, 경구, 국소, 피하 및/또는 전신 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약학 조성물 및/또는 의료 식품은 스프레이로서 투여, 에어로졸로서 투여, 또는 분무기 또는 흡입기에 의한 투여를 위해 제제화된다. 또한, 본 발명의 한 실시양태는 약학 조성물이 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 0.1 ㎍ 내지 10 mg의 투여량, 예컨대, 1일, 체중 1 kg 및 회 적용당 0.1 ㎍ 내지 1 mg, 바람직하게는 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 500 ㎍, 보다 바람직하게는, 1일, 체중 1 kg 및 1회 적용당 1 내지 50 ㎍의 투여량으로 혈액에 전신 투여하기 위해 제제화된 것인 방법을 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 투여는 단회 투여량으로서 또는 1일 다회 적용으로서 수행된다. 또한, 본 발명은 항분비 단백질 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 예방이 필요한 포유동물에서 상기 기능장애를 치료하고/하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 항분비 단백질 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애의 치료 및/또는 예방이 필요한 포유동물에서 상기 기능장애를 치료하고/하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
나아가, 약학 조성물의 유효량을 이것이 필요한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법, 및/또는 가진 항분비 단백질 또는 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염을 포함하는 본 발명에 따른 약학 조성물의 제2 의학 용도가 지질 라프트 및/또는 카베올라의 기능장애와 관련되어 본원에 기재된 모든 증상에 관한 것임이 이해되고 분명해질 것이다.
실험 단락
실시예 1
체중이 150 내지 300 g이고 수컷 또는 암컷인 미성숙 및 성숙 래트를 폐 고혈압 및 폐에서의 반응성 변화가 유도되도록 실험적으로 처리하였다. 폐 고혈압(PH)은 약 20 mmHg, 통상적으로 30 내지 40 mmHg 범위 내의 정상적인 폐 동맥압을 초과하는 압력을 가진 것으로서 정의된다. 폐 고혈압은 인간 및 동물에서 높은 이환률 및 사망률을 가진 진행성 질환이다. 실험 모델은 개시 기작의 조사를 가능하게 할 수 있다. 모노크로탈린(monocrotaline)을 사용한 래트의 단회 처리는 PH의 유도에 대한 확립된 방법이다(문헌(Mathew et al., 2004) 참조). 이 식물 알칼로이드는 간에서 단지 수초의 수명을 가진 피롤산 대사물질로 활성화되므로 폐 동맥 내피에 주로 영향을 미쳐 내피세포 손상 및 폐 혈관 누출을 야기한다. 이로부터 수일 내에 폐 동맥 내피세포 DNA 합성 및 비대증의 현저한 자극이 뒤따른다. 이 내피 세포들은 인접한 평활근세포의 이동 및 반응성 변화에 기여하는 성장 및 이동 촉진 인자를 분비하는 것으로 생각된다. 2주 내에, 우측 심실은 폐 혈관계에서의 크로탈린-유도 변화로부터 비롯된 상승된 하중으로 인해 비대해진다.
스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 래트로 이루어진 군에게 크로탈린(체중 1 kg당 60 mg; 시그마(Sigma))을 복강내로 단회 주사하였다. 절반의 동물은 그의 등에 피하 이식된 알제트(Alzet) 삼투압 미니펌프(타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 20 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 따라서, 상기 펌프는 10일 이상 동안 시간당 약 20 ㎍의 AF-16을 전달하고 있었다. 한 실험에서, 알제트 2001 펌프를 가진 래트에게 이식 시에 2 mg의 AF-16도 단회 근육내 주사하였다. 비교를 위해, 나머지 절반의 동물은 크로탈린 주사 시에 비히클, 즉 15% 에탄올을 가진 PBS로 채워진 이식된 알제트 2001 펌프를 가졌다. 체중이 일치하는 래트로 이루어진 추가적 군은 AF-16 또는 비히클로 채워진 펌프만 가졌고 크로탈린은 제공받지 않았다.
18일 후 래트를 마취시키고 이들의 체중을 측정하였다. 크로탈린으로 처리된 래트는 그들의 연령과 비교하였을 때 야위었고 작았으며, 비처리된 정상 대조군과 비교하였을 때 덜 활동적이고 거친 털을 가졌으며 체중이 적었다. 크로탈린으로 처리되고 미니펌프를 통해 AF를 관주받은 래트는 건강해 보였으며 대조군과 거의 동일한 체중 및 외관을 가졌다. 우심실 내의 압력은 우측 경정맥을 통해 삽입된 섬유 광학 소형 변환기 시스템(삼바 시스템 3200 & 삼바 프레클린 420 센서(Samba System 3200 & Samba Preclin 420 sensor); 스웨덴 프롤룬다(Frolunda) 소재의 삼바 센서스 에이비, 브이.(Samba Sensors AB, V.))를 이용하여 평가하였다. 평균 폐 동맥 혈압은 비히클로 처리된 래트 또는 AF-16으로 처리된 래트에서 약 20 mmHg이었다. 대조적으로, 크로탈린(단회 복강내 주사; 체중 1 kg당 60 mg; PBS 중에 용해된 크로탈린) 및 알제트 펌프에 의해 전달된 비히클로 처리된 래트는 이 래트의 습윤 중량을 비처리된 정상 래트의 좌심실의 습윤 중량 및 상응하는 구조체의 중량과 비교하였을 때 18일 동안 30 mmHg를 초과하는 폐 동맥압 및 우심실 비대증을 가졌다. 크로탈린으로 처리된 래트를 AF-16으로 처리하자 우심실 혈압 및 폐 동맥 혈압이 정상에 가깝게 돌아갔고, 정상 비처리 래트와 비교하였을 때 우심실의 유의한 비대증이 전혀 없었다. 이 결과는 반복 수행되었을 때 일정하게 얻어졌기 때문에 재현가능하였다. 크로탈린으로부터 유도된 화합물은 예를 들어, 단백질 카베올린의 파괴를 야기하여, 카베올라 및 지질 라프트의 해체를 초래하고, 이 효과로 인해 이 PH 모델에서의 내피세포 신호 전달이 변경된다고 공지되어 있다(Mathew R, et al., 2004).
본 발명자들은 AF-16을 사용한 처리가 폐 혈관계의 재구축을 방해함으로써 크로탈린을 사용한 처리 후 증명된 폐 기형 및 우측 심장 비대증의 발달을 방해한다고 결론지었다. 따라서, 내피 및 혈관 평활근세포 내의 지질 라프트 및 카베올라에 유도된 손상 및 후속 반응성 변화는 AF-16을 사용한 처리에 의해 감소하였고 예상된 혈관 기형 또는 우측 심실 비대증 중 어느 것도 초래하지 않았다.
실시예 2
제2 실험에서, 폐 고혈압의 발달을 방해하는 것으로 앞서 입증된 투여량의 AF-16의 투여가 손상된 동맥의 치유 과정에 영향을 미치는 지를 조사하였다.
마취된 성숙 래트는 그의 등에 피하 이식된 삼투압 미니펌프(알제트 타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 10 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 추가로, 이식 직후 1 mg의 AF-16을 근육내로 주사하였다. 그 후, 우측 사타구니의 피부를 면도하고 절개하여 우측 대퇴부 및 총장골동맥을 단리하였다. 핀(Pean)의 집게를 동맥 주위에 위치시키고 1회당 15초씩 3회 봉합한 후 제거하였다. 혈관 또는 임의의 인접 구조체에 구멍을 내지 않도록 매우 조심하였다. 적절한 혈액 순환이 보장되도록 대퇴부 및 장골 동맥 및 정맥의 견고함을 확인하였다. 이어서, 상처의 가장자리를 적절하게 처리하고 봉합하였다. 동시에, 추가적 래트의 우측 대퇴부 및 장골 동맥을 조였고 상기 추가적 래트에게 비히클, 즉 활성 물질 대신에 15% 에탄올을 함유하는 PBS를 관주하였다.
10일 후, 동물을 1회 이상 마취하고, PBS 중에 용해된, 2% 에반스 블루(Evans blue)와 3% 알부민(소 혈청 알부민: 시그마)의 혼합물을 체중 1 kg당 1 ㎖의 양으로 관주하였다. 15분 후, 헤파린이 첨가된 PBS를 사용한 초기 헹굼(rinse) 후 완충된 포르말린-식염수 용액을 사용한 경심장(transcardial) 관류로 동물을 고정시켰다. 우측 및 좌측 장골 및 대퇴부 동맥을 조심스럽게 단리하고 그들의 말단에서 부착시키고 PBS 중의 포르말린 용액에 함침하였다. 1시간 후, 미세한 가위를 이용하여 혈관을 세로방향으로 개방하고 동맥벽의 관강(luminal) 표면의 청색 염색이 풍부하게 존재하는 지를 관찰하였다. 건드리지 않은 동맥은 그의 관강 표면의 염색을 전혀 보이지 않았다. 대조적으로, 외상을 입고 비히클로 처리된 우측 장골 및 대퇴부 동맥을 가진 동물은 경계가 꽤 분명한, 전체 손상된 혈관벽의 연속적인 뚜렷한 강한 청색 염색을 보였다. 손상 이후 AF-16으로 처리된, 제3 동물 군의 외상을 입은 장골 및 대퇴부 동맥은 손상된 혈관 대역 내의 외관상 염색되지 않은 영역에 의해 분리된, 청색으로 염색된 점-유사 도트(dot) 및 불규칙한 형태의 불연속적인 영역을 가졌다. 시각적으로 판단할 때, 손상된 대역 내에 있는 상기 영역의 절반을 초과하는 영역이 AF-16으로 처리된 동물에서 염색되지 않았다. 이것은 AF-16이 초기에 노출된 혈관 내벽의 복구를 촉진시켜 상기 내벽이 세포에 의해 덮이게 한다는 것을 의미한다. 또한, 비히클로 처리된 동물에서 손상된 혈관과 비교하였을 때 관찰된 가시적 응괴가 더 적었다. 손상된 영역의 광학 현미경 관찰은 손상된 조직 상 및 손상된 조직 내부의 백혈구, 혈소판, 대식세포 및 포말세포의 수가 비히클로 처리된 후와 비교하였을 때 AF-16으로 처리된 후 더 적음을 보여주었다. 또한, 표면에 부착된 단핵세포가 더 적었다. 비히클로 처리된 후와 비교하였을 때 AF-16으로 처리된 후 평활근세포에서 침윤하는 애들루미날(adluminal) 층이 더 적은 정도로 인식되었다. 내피세포, 섬유모세포 및 평활근세포는 그들의 원형질막에서 및 원형질막 내에서 풍부한 카베올라 및 소포낭을 가짐을 특징으로 하는 정상 환경 하에 놓여져 있다. 이 표면 구조체들은 혈관에의 기계적 외상 시 및 후에 흐트러져 있고 10일 이상, 즉 제공된 실험에서 조사된 기간 동안 상당한 정도로 그 상태로 남아있다.
그러나, 비히클로 처리된 동물에서 우세한 상태와 비교하였을 때 AF-16으로 처리된 동물에서는 현저한 정상화 경향이 있다. 전술된 세포 유형에 대한 신호 전달도입은 지질 라프트 및 카베올라를 통해 주로 매개되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, AF-16을 사용한 처리는 손상된 혈관에서의 염증 및 반응성 변경을 감소시키고 이러한 영역에서 세포의 구조 및 기능을 상당한 정도로 정상화시킨다는 결론이 도출된다. AF-16은 지질 라프트 및 카베올라를 저해함으로써 그의 유리한 효과를 발휘한다.
실시예 3
본 실험에서는 모델 시스템으로서 래트 귀에 대한 동결-해동 손상을 사용하여 AF-16의 투여가 손상된 피부 및 연골의 치유 과정에 영향을 미치는 지를 조사하였다.
마취된 성숙 래트는 그의 등에 피하 이식된 삼투압 미니펌프(알제트 타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 20 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 추가로, 상기 펌프의 이식 직후 1 mg의 AF-16을 근육내로 주사하였다. 그 후, 액체 질소 중에 냉각된 핀의 집게를 사용하여 표준화된 방식으로 귀를 압착함으로써 동결-해동 손상을 가하였다. 비교를 위해, 동일한 방식으로 동시에 추가적 래트를 펩티드 없이 비히클, 즉 15% 에탄올을 함유하는 PBS로만 처리하였다. 또한, 임의의 동결-해동 손상에 노출되지 않은 정상 래트는 이식된 AF-16을 함유하는 펌프를 가진 비-손상 래트이었기 때문에 기준용으로 사용되었다.
동결-손상 후 AF-16으로 2주 동안 처리한 래트는 손상되었지만 비히클로 처리된 래트와 비교하였을 때 부종 및 염증을 덜 보였다. 귀에서 손상된 탄성 연골에 접하는 한 측면 상에서 새로운 유리질(hyaline) 연골의 형성이 있었다. 2주가 되는 시점에서, AF-16으로 처리된 래트는 남은 탄성 연골에서의 보다 적은 남은 괴사, 둘러싸는 유리질 연골의 보다 덜 현저한 형성, 및 보다 덜한 부종 및 보다 덜한 염증세포의 침윤을 가졌다. 콜라겐의 양 및 염증세포의 밀도는 비히클로 처리된 동물과 비교하였을 때 AF-16으로 처리된 동물에서 감소되었다. 비히클 또는 AF-16을 사용한 비-손상된 래트의 처리는 귀에서 구조체를 변경시키지 않았다.
동물이 AF-16으로 처리된 경우 손상된 피부 및 그 밑에 있는 연골에 대한 치유 과정의 결말은 보다 유리하고 상흔 조직을 보다 적게 형성시킨다는 결론이 도출된다. 동결 손상은 AF-16으로 처리된 귀에서 관찰된 결과와 비교하였을 때 비히클로 처리된 귀에서 손상된 영역 내의 세포에서의 카베올라의 수를 훨씬 더 현저하게 감소시켰다.
실시예 4
AF-16의 투여가 손상된 피부 및 골막의 치유 과정에 영향을 미치는 지에 대해 성숙 토끼를 조사하였다.
마취된 성숙 뉴질랜드 알비노 토끼(암컷, 체중 2.5 내지 2.8 kg)는 외과수술에 의해 노출된 두개골에 접착된, 유리 섬유 강화 플라스틱으로 만들어진 헬멧을 가졌다. 가장자리 귀 정맥을 통해 AF-16 또는 비히클을 상기 토끼에게 정맥내 주사하였다. AF-16의 투여량은 1일 2회 체중 1 kg당 5 mg 이하이었다. 1주일 후, 귀에서 두개관 피부 상처 및 주사 부위를 거시적으로 관찰하였다. 이어서, 표본을 양쪽 영역으로부터 절개하고 고정, 포매(embedding), 절편화 및 염색을 수행하여 광학 현미경에 의한 검사를 준비하였다. AF-16을 사용한 처리는 치유 피부에서 부종의 존재 정도를 감소시켰고, 상기 피부는 염증이 더 적었으며, 비히클로 처리된 동물로부터의 상응하는 표본에서 확인될 수 있는 현저한 비대 상흔 조직을 갖지 않았다. 광학 현미경은 AF-16으로 처리된 동물로부터의 표본이 비히클로 처리된 동물로부터의 표본과 비교하였을 때 더 적은 염증세포 및 더 적은 콜라겐을 가졌음을 확인시켜주었다. 또한, AF-16으로 처리된 동물로부터의 표본에서 혈관이 더성숙하게 보였다.
AF-16이 깊은 피부 상처의 치유, 및 치유하지 않으면 현저할 염증과 부종 및 과도한 상흔 조직의 존재 정도의 감소를 개선시킨다는 결론이 도출된다. AF 처리는 카베올라의 감소된 빈도를 비히클로 처리된 동물들 중에서 관찰된 빈도보다 더 정상으로 되돌려 놓는 것으로 보였다.
실시예 5
실험적으로 유도된 위 상처의 치유가 AF-16의 투여에 의해 영향을 받는 지에 대해 성숙 래트를 조사하였다.
마취된 래트는 그의 등에 피하 이식된 삼투압 미니펌프(알제트 타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 20 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 추가로, 상기 펌프의 이식 직후 2 mg의 AF-16을 근육내로 주사하였다. 그 후, 복부를 면도하고 복부 벽을 외과수술로 개방하였다. 위를 확인하고 인접한 다른 기관 및 구조체가 건조되거나 기계적으로 손상되지 않도록 매우 조심하면서 위의 복면을 노출시켰다. 이어서, 위의 샘(원위) 부분의 복면을 유리 튜브에 함유된 80% 아세트산에 60초 동안 노출시켰다. 그 다음, 상기 유리 튜브를 신속히 제거하고 노출된 장막을 많은 부피의 PBS로 헹구었다. 그 다음, 봉합술로 복부를 봉합하였다. 동시에, 다른 래트를 동일한 방식으로 처리하되 펌프 내에 비히클이 있었고 동일 부피의 비히클을 주사하였다. 1주일 후, 래트를 1회 이상 마취시키고 복부를 노출시키고 외과수술로 개방하였다. 위궤양의 치유이었기 때문에 점착 및 복수액의 존재 정도를 조사하였다. 비히클로 처리된 래트와 비교하였을 때 AF-16으로 처리된 래트에서 복강 내에 유체가 더 적었다. 큰 그물막(omentum)과 위, 소장, 비장 및 간 사이의 점착 정도뿐만 아니라 복부벽 상처의 정도는 AF-16으로 처리된 동물에서 덜 현저하였고 빈도 및 크기에서 감소되어 있었다. 광학 현미경은 위벽의 부종이 더 적다는 거시적 관찰결과를 확인시켜주었다. 위의 내부 표면 상의 상피 외층은 AF-16 처리 후에 더 완전하고 광범위하였으며 더 잘 조직화되어 보였다. 또한, AF-16 처리 후 위벽 내에는 염증세포의 침윤이 더 적었다. AF-16이 위벽 상처의 치유를 개선시킨다는 결론이 도출된다. 나아가, 복수액의 존재 정도는 복부 점착의 정도 및 심각도와 마찬가지로 감소하였다.
실시예 6
또 다른 실험에서, AF-16이 이식된 외래 물질의 체내에서의 생체통합(biointegration)에 영향을 미치는 지를 조사하였다.
마취된 성숙 래트는 그의 등에 피하 이식된 삼투압 미니펌프(알제트 타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 10 또는 20 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 추가로, 이식 직후 2 mg의 AF-16을 근육내로 주사하였다. 상기 이식물은 모두 분해가능한 폴리우레탄 우레아(아텔론(Artelon)(등록상표), 스웨덴 프롤룬다 소재의 아팀플란트(Artimplant)로부터 선물로 얻음)로 만들어진 박막(1 x 2 cm), 봉합사 및 발포체(0.2 x 0.5 x 1 cm; 증강을 위한 것임)로 구성되었다. 동시에, 동일한 물질을 추가적 래트의 등의 근육 근막 바로 아래의 동일한 부위에 이식하였다. 이식 과정은 출혈 및 과도한 조직 손상을 피하도록 가능한 약하게 수행하였다. 또한, 키토산 및 키토산 막으로 만들어진 스폰지(스웨덴 브롬마(Bromma) 소재의 메디카르브(Medicarb) AB)를 AF-16 또는 비히클로 처리된 래트에 전술한 바와 같이 이식하였다.
10일 후 검사하였을 때, 얇은 염색된 절편을 거시적 및 광학 현미경으로 판단하였을 경우 AF-16으로 처리된 동물에서 이식물의 생체통합이 훨씬 더 우수함을 발견하였다. 이식물의 경계를 따라 염증세포 및 대식세포가 더 적게 존재하였고, 섬유모세포는 AF-16으로 처리된 동물로부터 회수된 발포 이식물에 들어간 것으로 인식되었다. 추가로, AF-16으로 처리된 래트에서의 피부 상처의 치유는 비히클로 처리된 래트와 비교하였을 때 반응성 변화를 더 적게 보이면서 더 성숙한 것으로 보였다. 반응성 조직 변화를 초래하는 신호 전달도입은 손상된 조직 내의 세포의 지질 라프트 및 카베올라를 통한 신호 전달을 수반하는 것으로 공지되어 있다.
실시예 7
AF-16의 투여가 체내의 내부 기관에서의 허혈 반응에 영향을 미치는 지를 조사하기 위한 실험을 수행하였다.
마취된 성숙 래트는 그의 등에 피하 이식된 삼투압 미니펌프(알제트 타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 20 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 추가로, 상기 펌프의 이식 직후 2 mg의 AF-16을 근육내로 주사하였다. 40분 동안 신장 동맥을 통한 혈류를 차단한 후 재순환시킴으로써 허혈을 좌측 신장 한쪽에서만 유도하였다. 우측 신장은 조여진 시간 동안 외과수술로 제거하였다. 그 다음, 상처를 봉합하고 동물에게 추가적 치료를 제공하지 않고 마취약을 제공하였다. 동시에, 펩티드를 제공하지 않고 비히클을 제공한 추가적 래트를 좌측 신장에서의 허혈에 노출시키고 그들의 우측 신장을 제거하였다. 상기 동물을 4 또는 7일 후에 1회 더 마취시켰다. 신장을 단리하고, 검사하고, 측정하고, 체중을 측정하고, 광학 현미경을 위한 추가적 처리를 위해 완충 포르말린 용액 중에서 고정시켰다.
본 실험은 신장의 허혈성 및 반응성 변화가 근위 세관에서 가장 현저하였음을 보여주었다. AF-16으로 처리된 동물에서는 출혈 및 괴사가 더 적었다.
실시예 8
본 실험은 신생물성 종양을 사용하여 수행하였고 AF-16을 사용한 처리가 상기 종양의 성장에 영향을 미치는 지에 대해 조사하였다.
마취된 성숙 래트는 그의 등에 피하 이식된 삼투압 미니펌프(알제트 타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 20 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 추가로, 상기 펌프의 이식 직후 2 mg의 AF-16을 근육내로 주사하였다. 상기 펌프를 1주일당 1회씩 새로운 펌프로 교체하였다. 화학적으로 유도된 또는 이식된 다양한 종양들이 비히클을 사용한 처리와 비교하였을 때 AF-16 투여에 의해 영향을 받는 지에 대해 조사되었다.
발암성 화학물질을 제공받은 래트는 비히클 처리와 비교하였을 때 AF-16을 사용한 처리 후 더 낮은 빈도로 더 작은 유선 종양을 발달시켰다. 반응성 및 염증성 변화 또한 덜 현저하였다. 또한, 추가적인 실험적 종양들도 비히클 처리와 비교하였을 때 AF-16으로 처리된 종양에서 달성된 유리한 효과에 대해 조사되었다.
실시예 9
본 실험은 스트렙토조신을 사용한 처리에 의해 유발된 실험적으로 유도된 진성 당뇨병을 가진 래트를 사용하여 수행하였고 상기 래트가 AF-16을 사용한 처리에 의해 영향을 받는 지에 대해 조사하였다.
마취된 성숙 래트는 그의 등에 피하 이식된 삼투압 미니펌프(알제트 타입 2001; 충전 부피 약 235 ㎕; 펌핑 속도 약 1 ㎕/h; 미리 시작됨; 15% 에탄올이 첨가된 PBS 중에 용해된 20 mg/㎖의 AF-16을 함유하는 충전 용액)를 가졌다. 비교를 위해, 추가적 래트를 비히클로 처리하되 펩티드로 처리하지 않았다. 단회 용량의 스트렙토조신(시그마)을 상기 래트에게 주사하였고, 소변 중의 당의 존재를 시판되는 스틱으로 검사하였고 소변의 부피가 증가되었음이 관찰되었다.
AF-16을 사용한 처리는 본 발명자들이 예측한 바와 같이 소변 중의 당의 상실을 감소시켰고 소변 부피도 감소시켰다. 혈당 값은 AF-16 처리 후 더 낮아진 것으로 보였다.
따라서, AF-16은 화학적으로 유도된 진성 당뇨병에서 증상의 발달에 유리한 효과를 발휘한다.
실시예 10
본 실험은 II형 진성 당뇨병을 앓는 인간 피실험자에게 투여된 AF를 사용하여 수행하였다. 본 연구는 의사 및 환자에게 알리지 않았다. 모든 환자들은 II형 진성 당뇨병을 앓고 있으며 스웨덴 런드(Lund) 소재의 대학병원에서 진성 당뇨병 외의 다른 질환의 존재에 대해 모두 철처히 검사받았다. 지역 위원회가 윤리적 허가를 승인하였다. 한 군의 x 피실험자들은 AF를 투여받은 반면, 제2 군의 x 피실험자들은 비교를 위해 동일한 양의 대조군 물질을 투여받았다. 12주 후, 혈액 샘플을 채취하여 분석하였다.
관찰된 결과는 비-활성 용액을 투여받은 피험실자들과 비교하였을 때 AF를 투여받은 피험실자들의 경우 HbA1c의 수준이 0.2 유니트까지 유의하게 감소된다(p≥ 0.05)는 것이다. 이것은 AF를 투여받은 피실험자들의 혈당 수준이 비교군(위약 군)의 피실험자들의 상태와 비교하였을 때 더 낮은 수준으로 유지되고 더 잘 조절된다는 것을 의미한다. 따라서, II형 진성 당뇨병의 결말에 대한 유리한 효과가 AF를 투여받은 피험실자들에서 달성된다.
실시예 11
칼슘 이온 농도에서의 변동하는 변화는 많은 유형의 세포, 예컨대, 뇌, 척수 및 망막에 풍부한 신경 및 성상세포에서 신호 전달 기구의 핵심적인 부분을 구성한다. 또한, 내분비 세포, 예컨대, 췌장 β-세포는 주기적으로 인슐린을 분비하는 것으로 개시되어 있다. 내분비 췌장세포는 예를 들어, 당의 흡수 시 관련된 이온 변화도 가진 것으로 밝혀져 있다. 성상세포의 칼슘 이온 변동의 미미한 방해는 예를 들어, 세포외 글루타메이트의 조절을 방해하는 것으로 간주되어 있고, 상기 세포외 글루타메이트의 조절 방해 그 자체는 전구염증 사이토카인을 생성하는 국소적 미세아교세포 활성화, 성상세포 팽창, 및 이러한 팽창으로 인한 감소한 세포외 공간 및 결과적으로 뇌 손상을 초래할 수 있다. 이러한 증상 동안, 글루타메이트 방출 및 신경전달 둘다가 감소한다. 추정컨대, 뇌에서의 이러한 감소한 전달 및 방해된 활성은 신경계의 기능장애 및 병리학적인 정신신경학적 활동 및 행동과 상호관련되어 있을 것이다.
신경 조직에서 성상세포 내의 칼슘 이온 변동을 입증하기 위한 실험을 수행하였다. 상기 변동은 자극제, 예컨대, 히스타민 및/또는 단아민성 전달제(monoaminergic transmittor)에 의해 유도되고, AF와 같은 특정 단백질을 사용하여 활성을 모니터링할 가능성이 평가된다. 칼슘 이온의 국소적 농도는 그 형광도가 세포내 칼슘 이온의 농도에 따라 정량적 및 정성적으로 변하는 칼슘 결합 화합물을 사용하여 확인한다. 주로 시험관 내에서 배양된 성상세포 및 신경의 형광 현미경 및 공초점 주사 현미경이 이용된다. 전기생리학적 방법도 이용된다. 상기 세포 내의 지질 라프트에 편재된 이온 수송자 시스템에 대한 효과를 평가하기 위해 특정 농도의 AF를 상기 세포에 첨가한다.
추가로, 다양한 유형의 근육세포 및 결합조직세포를 AF 및 관련 화합물의 첨가 전, 첨가 시 및 첨가 후에 그들의 세포질 내에서의 칼슘 이온 변동의 존재 정도, 빈도 및 진폭에 대해 유사하게 평가한다.
대표도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포, 조직 및/또는 기관 내에서의 칼슘 변동의 모니터링은 그러한 신호 전달 이벤트 기능장애 및 정상화에서의 도움 여부를 모니터링할 수 있게 한다. 따라서, 기능장애 및 질환 치료가 가능하다.
실시예 12
아쿠아포린은 막에 내재하는 단백질 족(family)이고 모든 살아있는 세포 및 유기체 내에서 발현된다. 아쿠아포린의 주요 기능은 세포 내로의 물 유동 및 세포 외로의 물 유동, 즉 세포의 세포질과 세포외 환경 사이의 물 유동을 조절하는 것이다. 각각의 유형의 세포, 조직 및 기관은 특징적인 분포 패턴을 가진 아쿠아포린으로 이루어진 그들의 특이적 세트를 가진다. 기능성 아쿠아포린은 지질 라프트 및 카베올라에 주로 응집되어 있지만, 서브유니트 및 분리된 아쿠아포린 결합체는 이 막 성분들 외부에서 확인될 수 있다.
뇌 및 척수에 대해 수행된 실험은 허혈 또는 비틀림 및 기계적 하중에 노출되었을 때 아쿠아포린, 주로 아쿠아포린 1 및 아쿠아포린 4의 발현 및 분포가 변경된다는 것을 보여주었다. 또한, 면역조직화학적 및 면역화학적 기법에 의해 밝혀진 바와 같이, 뇌 및 척수 감염, 예컨대, 뇌염에서 상기 2가지 아쿠아포린의 분포 및 강도의 패턴이 변경되었다. 예를 들어, 신경 및 지지 아교세포와 혈관 구조체 사이의 상호작용은 난해하고 복잡한 것으로 보이지만 중요하다.
외상, 감염 및 다른 병리학적 증상의 영향에 대한 보다 상세한 지도작성(mapping)을 위한 실험을 수행한다. AF 단백질, 펩티드, 유도체 및 유사체를 사용한 치료는 단회 투여로서 국소적 및 전신적으로 투여되거나, 다회 투여 또는 만성적으로, 즉 치료받는 객체의 남은 생애 동안 국소적 및 전신적으로 투여된다. 효과를 정량적 및 정성적으로 규명하고, 체내의 다양한 유형의 아쿠아포린의 구조 및 기능에 대한 효과의 중요성을 평가한다. 본 실험은 AF가 서로 상호작용하는 아쿠아포린 및 이온 채널 복합체의 존재 정도, 분포 및 활성을 모니터링하고 심지어 정상화시키는 데 있어서 큰 영향을 미친다는 것을 보여준다. 따라서, 중요한 신규 치료 방법이 달성된 결과에 기초하여 개발될 수 있다.
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Claims (1)

  1. 세포막 내의 지질 라프트(lipid raft), 수용체 및/또는 카베올라(caveolae)의 기능장애의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 항분비 단백질, 동등한 활성을 갖는 이의 유도체, 유사체 및/또는 단편, 및/또는 이들의 약학적 활성 염의 용도.
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