KR20140138920A - 통증 및 만성 폐쇄성 폐 질환의 치료에 사용하기 위한 극성 당지질의 혼합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대상체에게 시아노박테리움 오실라토리아 속(cyanobacterium Oscillatoria species)의 세포로부터 수득가능한 극성 당지질(CyP)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 통증 및/또는 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

통증 및 만성 폐쇄성 폐 질환의 치료에 사용하기 위한 극성 당지질의 혼합물{A mixture of polar glycolipids for use in the treatment of pain and COPD}

본 발명은 통증 및/또는 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)의 예방 및/또는 치료를 위해 사용하기 위한 시아노박테리움 오실라토리아 속(cyanobacterium Oscillatoria species)의 세포로부터 수득가능한 극성 당지질(CyP)을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

남조류로도 불리는 시아노박테리아는 고유의 성질을 가지는 활성 성분의 자연적인 공급원이다. 시아노박테리아로부터의 저분자량 당지질 추출물은 글리세롤 지방산 에스테르 부류(예를 들어, 모노갈락토실 디아실글리세롤(MGDG), 디갈락토실 디아실글리세롤(DGDG), 술포퀴노보실 디아실글리세롤(SQDG), 포스파티딜 글리세롤(PG), 등)에 속하는 지질 성분을 함유하는 것으로 잘 알려져 있다. 다양한 시아노박테리아로부터 제조된 이러한 저분자량 추출물은 다양한 유형의 생물학적 활성, 예를 들어, 특허 출원 EP1571203에 예를 들어 기술된 바와 같은 항염증 성질 및 문헌(Shiraashi et al., 1993, Chem. Pharm. Bull., 41:1664-66)에 기술된 바와 같은 항종양 성질을 나타낸다. 추가적으로, 시아노박테리아로부터 추출된 황지질도 또한 항-HIV 활성을 나타낸다(Gustafson, J. Natl. Cancer Instit., 1989, 81:1254-1258).

특허 출원 WO 2010/010172 및 WO 2010/094693은 담수 시아노박테리움 오실라토리아 속(cyanobacterium Oscillatoria species)으로부터 추출되고 LPS-유사 구조를 가지는 고분자량(33 kDa)의 극성 당지질을 포함하는 당지질 분획의 제제(본원에서 또한 "VB3323"으로 명명됨)를 기술하고 있다. 시아노박테리움 오실라토리아 플란코토트릭스(Oscillatoria Plankothotrix) 종의 세포로부터 추출될 수 있는 고도로 정제된 극성 당지질의 제제는 하나 이상의 람노스 단위를 포함하는 적어도 하나의 고분자량 당지질종의 존재를 특징으로 한다. 또한, 총 중량의 2% 이하의 단백질 오염을 특징으로 하고, 특히, 예를 들어 브래드포드 방법에 의해 평가된 단백질 오염의 부재를 특징으로 하고, 총 중량의 5% 이하, 특히 3% 이하의 핵산 오염을 특징으로 하는 이러한 제제 내에서, 세포외 ATP 수준의 감소를 초래하는 ATP 신타아제(ATP-SX)에 대한 저해 활성을 검출할 수 있다.

특허 출원 WO 2010/010172 및 WO 2010/094693에 당지질 추출물이 강한 항염증 활성을 가진다는 것이 나타나 있다. 보다 정확하게는, 인간 수지상 세포에서 TLR4 수용체 LPS 아고니스트(예를 들면 E. 콜라이(E. coli) 및 살모넬라 아보터스 에퀴나(Salmonella abortus equi)로부터의 LPS)에 의해 유발되는 전염증 효과를 상쇄하고 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 LPS의 전염증 효과를 상쇄할 수 있기 때문에 당지질 추출물이 강한 TLR4 길항제 활성을 가진다는 것이 나타나 있다. TLR4에 대한 작용 외에도, VB3323은 또한 세포 표면 ATP 신타아제의 활성을 부분적으로 저해하여 세포외 ATP 수준의 감소를 초래하는 것으로 나타나 있다.

톨 유사 수용체(Toll-Like receptor, TLR)는 면역 인식 및 자극에 대한 책임이 있는 세포 내로의 미생물 병원성 구조체의 도입 및 인식을 위한 주요 경로 중 하나를 나타낸다. 더욱이, 최근의 연구는 TLR이 잠재적인 병원균에 대한 염증 반응을 유발하는 것뿐 아니라 스트레스를 받거나 손상된 조직에 의해 활성화되는 반응에서도 중요한 역할을 수행한다는 것을 보여준다. TLR4는 염증의 증폭에 관련된 주요 수용체이다. 특히, 박테리아성 지질다당류(LPS)에 대한 선천성 면역 반응에 관련된 수용체로 알려진 TLR4는 스트레스 및/또는 조직 손상에 반응하여 생성되는 내인성 분자에 의해 활성화되는 세포 신호전달에서 중요한 역할을 가지는 것으로 나타나 있다. 이러한 분자들 중 일부는 열 충격 단백질(Heat Shock Proteins, HSP) 및 고 이동군 단백질 B1(High-Mobility Group protein B1, HMGB1)과 같은 괴사성 세포에 의해 방출되는 매개인자이고; 나머지는 비글리칸, 히알루론산 및 테나신-C의 단편과 같은 세포외 기질의 생성물이다.

ATP는 그의 하향조절이 TLR4 길항 활성과 시너지로 염증성 상태의 감소에 관련된 역할을 가질 수 있는 또 하나의 중요한 내인성 전염증 매개인자이다. ATP 신타아제 효소는 간세포, 뉴런, 성상세포, 섬유아세포, 면역 세포, 및 내피 세포를 포함하는 많은 상이한 세포 유형에서 발현되고, 종양 세포의 원형질 막에서 특히 높은 수준으로 발현된다.

따라서, 특허 출원 WO 2010/010172 및 WO 2010/094693는 전염증성 상태의 활성화에 의해 유발된 다수의 다양한 급성 또는 만성 병태의 치료를 위한 오실라토리아 플란크토트릭스(Oscillatoria Planktothrix) 종으로부터 추출한 당지질 분획의 용도를 개시한다.

본 발명에 제공된 일 구현예는 대상체에게 시아노박테리움 오실라토리아 속(cyanobacterium Oscillatoria species)의 세포로부터 수득가능하거나 수득된 극성 당지질(CyP)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 통증 및/또는 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 포함한다. 극성 당지질은 통상적으로 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 추출한 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)이다.

방법의 일 구현예에서, 극성 당지질은: (a) 시아노박테리움을 제공하는 단계; (b) 상기 시아노박테리움으로부터 극성 당지질을 추출하는 단계; (c) 단계 (b)로부터의 극성 당지질을 침전시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 추출되고 침전된 극성 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 수득가능하다. 특정 일 구현예에서, 단계 (b)는 무질서유발제(chaotropic agent) 및 비양성자성 유기 용매를 포함하는 변성 용액으로의 처리를 포함한다.

다른 구현예에서, 방법은 i) 시아노박테리움의 농축물을 제공하는 단계; ii) 상기 농축물을 용액에 현탁하는 단계; iii) 선택적으로, 마이크로파로 처리 및/또는 액체/고체 분리, 그리고 (상층액으로 명명되는) 액체상을 수집하는 단계; iv) 시아노박테리아의 현탁액 또는 상층액을 무질서유발제 및 비양성자성 유기 용매를 포함하는 변성 용액과 혼합하는 단계; v) 단계 (iv)에서 수득한 용액을 항온배양하는 단계; vi) 액체/액체 분리를 수행하고 수용성 액체상을 수집하는 단계; vii) 당지질 분획을 침전시키는 단계; viii) 침전물을 수용액에 재현탁하는 단계; ix) 선택적으로 단계 (viii)에서 수득된 용액을 유기 용매로 처리하고, 원심분리하고, 액체상을 수집하는 단계; 및 x) 이온 교환 컬럼을 통한 통과 단계 및 극성 당지질을 포함하는 분획의 수집 단계를 포함한다.

추가적인 일 구현예에서, 극성 당지질은 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 변성 무질서유발제로의 추출 단계, 핵산 오염의 수준이 총 중량의 5% 이하에 도달할 때까지 뉴클레아제로 추출물을 처리하는 단계, 30 kDa의 컷오프를 가지는 디바이스 상에서의 분자 분리 단계, 이어서, 고분자량 분획의 회수 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하다. 구체적인 일 구현예에서, 극성 당지질은 변성 무질서유발제로의 추출로서, 추출 단계가 하기 단계 b)에 기술된 바와 같이 수행되고, 뉴클라아제 처리는 하기 단계 g)에 기술된 바와 같이 수행되고, 분자 분리는 하기 단계 k)에 기술된 바와 같이 수행되며, 하기 추가의 단계 a), c) 내지 f), e), h) 내지 j), 및 l) 내지 m)을 포함하는 것인 추출을 포함하는 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속의 세포로부터 수득된다: a) 시아노박테리움 오실라토리아 속의 농축물을 1:1 및 1:2 사이의 부피비로 수용액에 현탁하는 단계; b) 시아노박테리아의 현탁액을 무질서유발제, 극성 양성자성 유기 용매 및 비양성자성 유기 용매를 포함하는 2 내지 4 부피의 변성 용액과 혼합하는 단계; c) 60분 보다 짧은 시간으로 항온배양하는 단계; d) (상층액으로 명명된) 액체상을 원심분리하고 수집하는 단계; e) 상층액에 염 및 유기 용매를 첨가하여 당지질 분획을 침전시키는 단계 및 침전물(또는 펠렛)을 물에 희석된 에탄올로 세척하는 단계; f) 침전물을 수용액에 재현탁하는 단계; g) 뉴클라아제, 그리고 이어서 프로테아제로 처리하는 단계; h) 염 및 유기 용매의 첨가에 의해 당지질상을 침전시키는 단계; i) 펠렛을 물에 희석된 에탄올로 선택적으로 세척하고 이온 계면활성제 및 4차 암모늄 염을 포함하는 수용액에 재현탁하는 단계; j) 단계 b) 내지 f)에 기술된 바와 같이 수용액으로부터의 재추출 단계; k) 30 KDa의 컷오프를 가지는 디바이스 상에서의 분자 분리 단계; l) 물 또는 완충 수용액으로 고분자량 극성 당지질 분획을 회수하는 단계 및 핵산 또는 단백질 오염의 수준의 평가 단계; m) 총 중량의 5% 미만 핵산 오염을 가지는 분획의 회수 및 사용 단계.

추가의 일 구현예에서, 조성물은 스테아르산(C18:0, 옥타데카노익) 및/또는 팔미트산(C16:0, 헥사데카노익)을 주요 당지질 성분의 지방산로서 포함하는 극성 당지질의 혼합물을 포함하되, 지방산 중 적어도 1종은 적어도 하나의 단위의 람노오스 또는 그의 유도체를 포함하는 당류와 결합한다. 구체적인 일 구현예에서, 극성 당지질의 혼합물은 당지질 혼합물의 총 지질 분획에 대하여 50% 내지 80% 스테아르산(C18:0, 옥타데카노익) 및/또는 15% 내지 40% 팔미트산(C16:0, 헥사데카노익)을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 극성 당지질의 혼합물은 당지질 혼합물의 총 지질 분획에 대하여 65% 내지 75% 스테아르산(C18:0, 옥타데카노익) 및/또는 20% 내지 32% 팔미트산(C16:0, 헥사데카노익)을 포함한다.

일 구현예에서, 시아노박테리움 오실라토리아 속은 기탁 번호 1459/45 하에 조류 원생동물 종균관리센터(Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP)에 기탁된 오실라토리아 속이다.

다른 구현예에서, 방법은, 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다. 구체적인 일 구현예에서, 방법은 신경병성 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다. 다른 구체적인 구현예에서, 방법은 말초 신경병성 통증, 중추성 신경병성 통증 또는 혼합(말초 및 중추성) 신경병성 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다. 추가의 구체적인 구현예에서, 방법은 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군 또는 암에 의해 유발된 신경병성 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다.

일 구현예에서, 방법은 COPD의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다.

일 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 다른 안정화제를 더 포함한다.

다른 구현예에서, 조성물은 경구, 정맥내(i.v.), 흡입 또는 국소 투여용이다.

도 1: 도 1의 A 및 B는 프로인드 완전 어쥬번트(Freund complete adjuvant) 모델에서 기계적 이질통 및 열 통각 과민증에 대한 VB3323 급성 치료의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2: 도 2의 A 및 B는 FCA 모델에서 기계적 이질통 및 발 부종에 대한 VB3323 경구 치료적 만성 치료의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3: 도 3의 A 및 B는 마우스 체중 및 기관 육안적 형태 평가에 대한 VB3323 경구 치료적 만성 치료의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4: 도 4의 A 및 B는 좌골 신경 결찰 모델에서 기계적 이질통 및 열 통각 과민증에 대한 VB3323 만성 치료의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5: 도 5는 마우스 체중에 대한 VB3323 만성 치료의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6: 도 6은 E. 콜라이-LPS 항온배양 동안의 TNFα 방출에 대한 VB3323의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7: 도 7은 3종의 상이한 배치(bacth)의 VB3323의 NMR 프로파일이다.
도 8: 도 8은 체중 변화에 대한 VB3323 치료의 효과를 나타낸 그래프이다(COPD 모델 마우스).
도 9: 도 9는 COPD 모델 마우스에서 폐부종(폐 중량)에 대한 VB3323 치료의 효과를 나타낸 그래프이다.

당지질 혼합물의 치료적 용도

본 발명의 발명자들은 오실라토리아 속(Oscillatoria species)으로부터의 당지질 분획인 VB3323이 통증의 동물 모델에서 통증을 완화한다는 것을 보여주고 있다. 특히, 본 발명자들은 당지질 혼합물로의 급성 치료가 프로인드 어쥬번트(Freund? adjuvant)에 의해 유도된 만성 염증의 마우스 모델에서 기계적 이질통 및 열 통각 과민증을 강력하고 용량 의존적으로 감소시켰다는 것을 보여주고 있다(실시예 2). 본 발명자들은 본원에 기술된 바와 같은 당지질 제제로의 만성 치료가 기계적 이질통을 유의하게 감소시킨다는 것을 보여준다(실시예 3). 마지막으로, 본 발명자들은 당지질 제제로의 만성 치료가 좌골 신경 결찰에 의해 유도된 신경병성 통증의 마우스 모델에서 열 통각 과민증 및 기계적 이질통을 유의하게 감소시켰다는 것을 보여준다(실시예 5).

따라서, 이러한 당지질을 포함하는 조성물은 통증, 특히 신경병성 통증의 치료 및/또는 예방을 위해 유리하게 사용될 수 있다.

신경병성 통증은 말초 또는 중추 신경계의 기능장애 또는 손상으로부터 기인한다. 따라서, 신경병성 통증은 말초 신경병성 통증, 중추성 신경병성 통증, 또는 혼합(말초 및 중추) 신경병성 통증으로 분류될 수 있다.

신경병성 통증은 종종 말초 신경을 손상시키는 당뇨병, 후천성 면역 결핍 증후군 또는 암과 같은 신경 손상 또는 질환에 의해 유발된다. 진단은 조직 손상, 감각 장애(예컨대, 화상, 자통) 및 신경학적 검사 중에 검출된 신경 손상의 징후에 비해 과중한 통증에 의해 제시된다. 신경병성 통증의 하나의 공통적인 증상은 보통 무해한 촉각 자극에 대한 고통스런 반응을 특징으로 하는 촉각 이질통이다.

비록, 신경병성 통증은 아편유사체에 감응하지만, 치료는 대개 어쥬번트 약물(예컨대, 항우울제, 항경련제, 바클로펜, 국소 약물)을 사용한다.

통증은 임의의 수준의 신경계, 말초 또는 중추에 대한 손상 후 발달될 수 있고; (교감신경적으로 유지되는 통증을 유발하는) 교감신경계가 관련될 수 있다. 구체적인 증상은 대상포진 후 신경통, 신경근 결출, 동통성 외상성 단발신경병증, (특히, 당뇨병에 의한) 동통성 다발신경병증, (임의의 수준의 신경계의 사실상의 임의의 병변에 의해 잠재적으로 유발되는) 중추 통증 증후군, 수술 후 통증 증후군(예컨대, 유방절제술 후 증후군, 개흉수술 후 통증 증후군, 환상 통증), 및 복합부위 통증 증후군(반사교감신경이상증 및 작열통)을 포함한다.

따라서, 당지질 혼합물을 포함하는 조성물은, 유리하게, 말초 신경병성 통증, 중추성 신경병성 통증, 또는 혼합(말초 및 중추) 신경병성 통증의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 특히, 당지질 혼합물을 포함하는 조성물은 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군 또는 암에 의해 유발된 신경병성 통증 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명자들은 또한 오실라토리아로부터의 당지질 분획이 인간 기관지 실질조직 조직 배양에서 E. 콜라이-LPS에 의해 유도되는 TNF-α의 방출을 저해한다는 것을 보여준다(실시예 7). 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 박테리아 또는 박테리아 생성물(LPS)에 의해 유발되는 만성 염증이다. 인간 기관지 실질조직 조직 배양에서 얻어진 결과는 VB3323이 박테리아 또는 박테리아 생성물(LPS)에 의해 유도된 염증을 생체 내에서 저해할 수 있고, 따라서 COPD를 치료 및/또는 예방할 수 있다는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명에 제공된 다른 양태는 COPD의 치료 및/또는 예방을 위한 당지질을 포함하는 조성물의 용도이다.

만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)은 염증 반응에 의해 유발된 부분적으로 역전가능한 기류제한이다. 증상은 수년에 걸쳐 발달되는 젖은 기침 및 호흡곤란이다. 공통적인 징후는 낮아진 숨소리, 호흡의 연장된 호기상 및 천명을 포함한다. 보통의 치료는 기관지확장제, 코르티코스테로이드 및, 필요한 경우, O₂ 및 항생제를 포함한다. 약 50%의 환자가 진단 10년 이내에 사망한다.

COPD는 만성 폐쇄성 기관지염 및 폐기종을 포함한다. 많은 환자들은 양 특징을 가진다.

만성 폐쇄성 기관지염은 기도 폐쇄를 가지는 만성 기관지염이다. 만성 기관지염은 기도 폐쇄의 폐활량계 증거가 발달한다면 만성 폐쇄성 기관지염이 된다. 만성 천식성 기관지염은 만성 젖은 기침, 천명 및 부분적으로 역전가능한 기도 폐쇄를 특징으로 하는 유사하고 중첩되는 병태이다; 만성 천식성 기관지염은 천식의 기왕력을 가지는 흡연자에서 우세하게 발생한다. 일부 경우에서, 만성 폐쇄성 기관지염 및 만성 천식성 기관지염 사이의 구분은 명확하지 않다.

기도 허탈의 경향을 증가시키는 폐기종은 탄력 반동의 소실 및 폐포 중격 및 방사성 기도 견인의 소실을 야기하는 폐 실질조직의 파괴이다. 폐 과다팽창, 기류제한 및 공기폐색이 뒤따른다. 공기공간이 비대해지고 결국 수포가 발달될 수 있다.

따라서, 본 발명은 당지질, 특히, 시아노박테리움 오실라토리아 속의 세포로부터 수득되거나 수득가능한 극성 당지질을 포함하는 통증 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)의 예방 및/또는 치료를 위해 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 통증 및/또는 COPD의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 극성 당지질의 혼합물을 포함하는 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 조성물은 특히 치료적 유효량으로 투여된다.

조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 다른 안정화제를 포함할 수 있고 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 특정한 투여 경로는 경구, 정맥내(i.v) 또는 국소 투여, 또는 흡입을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이 제조된, 총 중량의 2% 이하의 단백질 오염 수준을 나타내며, 특히 단백질 오염의 부재를 나타내고, 총 중량의 5% 이하, 특히, 3% 이하의 핵산 오염의 수준을 나타내는, 시아노박테리아 극성 당지질을 포함하는 조성물은 세포주 및 인간 혈액으로부터 분리된 PBMC에서 세포독성 검정법으로 평가한 바와 같이 포유동물 세포에 대하여 세포독성이 아니다. 조성물의 세포독성의 결여는 시험관 내 세포 시스템에서 최대 (100 ?/ml)의 농도(최소 유효 농도보다 100배 더 높음)까지 검증한다. 따라서, 환자에 대한 안전성을 보장하면서 통증 및/또는 COPD의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물의 사용을 구상할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 VB3323 만성 치료가 프로인드 어쥬번트에 의해 유도된 만성 염증의 마우스 모델에서 어떠한 유의한 체중 변화 및 기관 변형을 유도하지 않고(실시예 4), 좌골 신경 결찰에 의해 유도된 신경병성 통증의 마우스 모델에서 만성 통증에 의해 유도된 체중 감소를 낮춘다(실시예 6)는 것을 보여주었다. 이러한 데이터는 신경병성 통증 및/또는 COPD의 예방 및/또는 치료를 휘한 치료적 화합물로서 극성 당지질 혼합물의 잠재적인 용도를 더 뒷받침한다.

대상체는 인간이거나 고양이, 개, 설치류, 영장류, 소, 양 또는 말과 같은 인간이 아닌 포유동물일 수 있다. 일정 구현예에서, 대상체는 인간, 예를 들면, 아동, 여성 또는 남성이다.

본원에서 사용된 "치료 (treatment 또는 treating)" 라는 용어는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 이러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 진행을 역전하거나, 완화시키거나 저해하는 것을 의미한다. "예방(prevention 또는 preventing)" 은 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 이러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생을 예방하는 것을 의미한다.

오실라토리아로부터의 극성 당지질의 치료적 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 치료적 유효량은, 예를 들면, 대상체의 연령, 체중, 병태 등에 좌우될 수 있다. 또한, 통상적으로, 오실라토리아로부터의 극성 당지질의 치료적으로 유효한 일일 용량은 0.01 mg 및 50 mg 사이, 예컨대, 0.1 mg 및 5 mg사이(예를 들면, 0.3 및 3 mg 사이)를 포함할 수 있다.

극성 당지질을 포함하는 조성물의 특성

특허 출원 WO 2010/010172 및 WO 2010/094693은 기탁번호 1459/45하에 Bluegreen Biotech s.r.l.에 의해 Massena(15, 20125 Milano, Italy)를 통하여 2008년 7월 9일에 조류 원생동물 종균관리센터(Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP(Scotland, United Kingdom))에 기탁된 시아노박테리움 오실라토리아 속의 세포로부터의 추출로 수득되거나 수득가능한 극성 당지질의 고도로 정제된 제제가 하나 이상의 람노오스 단위를 포함하는 적어도 하나의 고분자량 당지질 종의 존재를 특징으로 한다는 것을 나타내고 있다.

따라서, 본 발명에서 사용될 당지질을 포함하는 조성물은, 예컨대, 시아노박테리움 오실라토리아 플란크토트릭스(Oscillatoria Planktothrix) 종과 같은 시아노박테리움 오실라토리아 속의 세포로부터 수득가능할 수 있거나 수득될 수 있다. 이러한 극성 당지질의 제제는 과학 문헌에서 때때로 "CyP"로 지칭된다.

상기 시아노박테리움 오실라토리아 속은, 예를 들어, 조류 원생동물 종균관리센터(CCAP)에 기탁된 임의의 오실라토리아 속, 예를 들면, 기탁 번호 1459/45, 1459/43, 또는 1459/44하에 기탁된 균주들일 수 있다.

구체적인 일 구현예에서, 상기 오실라토리아 속은 기탁번호 1459/45하에 조류 원생동물 종균관리센터(CCAP)에 기탁된 종이다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 시아노박테리움 오실라토리아 속은 담수 시아노박테리움이다. 특히, 시아노박테리움 오실라토리아 속은 이탈리아의 바레세 호수에 존재하는 시아노박테리움일 수 있다. 예를 들면, 상기 시아노박테리움은 문헌(Pomati et al., J. Phycol. 2000;36:553-562, Macagno et al., J Exp Med. 2006;203(6):1481-92, Jemmett et al., Infect Immun. 2008;76(7):3156-63, 및 Thorgersen et al., Mol Immunol. 2008;45(13):3553-7)에 기술된 오실라토리아 플란크토트릭스 FP1 종일 수 있다.

본 발명에 따른 당지질은 극성 당지질이다. 특히, 조성물에 포함되는 극성 당지질은 지질다당류(LPS)일 수 있다.

극성 당지질을 포함하는 상기 조성물은, 예를 들어, 분획, 추출물, 당지질의 혼합물, 제제, 및/또는 약학적 조성물일 수 있다.

시아노박테리움 오실라토리아 속의 세포로부터의 극성 당지질(CyP)을 포함하는 이러한 조성물을 수득하기 위해 사용될 수 있는 방법은 당업자에 의해 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌(Yi et al., Analyst 2000;125(4):651-6, Macagno et al., J Exp Med. 2006;203(6):1481-92, Jemmett et al., Infect Immun. 2008;76(7):3156-63, 및 Thorgersen et al., Mol Immunol. 2008;45(13):3553-7)에 기술되어 있다.

구체적인 일 구현예에서, 극성 당지질은 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 추출될 수 있다.

특히, 극성 당지질을 포함하는 조성물은 다음을 포함하는 제1 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 수득가능할 수 있다:

a) 상기 시아노박테리움을 제공하는 단계:

b) 상기 시아노박테리움으로부터 극성 당지질을 추출하는 단계;

c) 단계 (b)로부터의 극성 당지질을 침전시키는 단계; 및

d) 단계 (c)로부터의 추출되고 침전된 극성 당지질을 정제하는 단계.

일 구현예에서, 단계 (b)는 무질서유발제(chaotropic agent) 및 클로로포름과 같은 비양성자성 유기 용매를 포함하는 변성 용액으로의 처리를 포함한다.

다른 구현예에서, 극성 당지질을 포함하는 조성물을 수득하기 위한 방법은 다음의 단계를 포함한다:

i) 시아노박테리움의 농축물, 예를 들면 원심분리에 의해 시아노박테리움을 배양 배지로부터 수집한 후 수득된 동결 건조된 농축물을 제공하는 단계;

ii) 상기 농축물을 용액에 현탁하는 단계;

iii) 선택적으로, 마이크로파로 처리 및/또는 원심 분리와 같은 액체/고체 분리, 그리고 (상층액으로 명명되는) 액체상을 수집하는 단계;

iv) 시아노박테리아의 현탁액 또는 상층액을 무질서유발제 및 비양성자성 유기 용매(예를 들면, 클로로포름)를 포함하는 변성 용액과 혼합하는 단계;

v) 단계 (iv)에서 수득한 용액을 항온배양하는 단계;

vi) 수용성 액체상을 원심분리하고 수집하는 단계에 의한 것과 같은 액체/액체 분리를 수행하는 단계;

vii) 예를 들어, 상층액으로의 유기 용매(예를 들면, 아세톤) 및 염의 첨가에 의해 당지질 분획을 침전시키는 단계;

viii) 침전물을 수용액에 재현탁하는 단계;

ix) 선택적으로 (viii)에서 수득된 용액을 이소프로판올과 같은 유기 용매로 처리하고, 원심분리하고, 액체상을 (예를 들면, 원심분리에 의해) 수집하는 단계; 및

x) 이온 교환 컬럼에 통과시키고 극성 당지질을 포함하는 분획을 수집하는 단계.

다른 구체적인 구현예에서, 극성 당지질은 (본원에 참조로서 명확하게 포함된) 특허 출원 WO 2010/094693에 기술된 바와 같이 오실라토리아 속의 배양물로부터 제조될 수 있다. 이러한 제2 방법에서, 박테리아 펠렛은 우선 유기 용매 및 무질서유발제의 혼합물과 같은 변성제(예를 들어, 페놀 및 구아니디늄 티오시아네이트의 혼합물)와 탈단백질제로 처리된다. 또한, 과정은 총 중량의 5% 이하(예를 들면, 총 중량의 3% 이하, 또는 총 중량의 2% 이하)의 핵산 오염의 수준에 도달할 때까지의 뉴클레아제 처리 및 30 kDa의 컷오프를 가지는 디바이스 상에서의 분자 분리 단계 및 뒤이은 고분자량 분획의 회수를 특징으로 한다. 일 구현예에서, 극성 당지질의 혼합물을 포함하는 조성물은 총 중량의 2% 이하의 단백질 오염의 수준을 나타낸다. 특히, 상기 조성물에는 단백질 오염이 없다.

특히, 극성 당지질을 포함하는 조성물은 변성 무질서유발제로의 추출 단계, 핵산 오염의 수준이 총 중량의 5% 이하(예컨대, 3% 이하)에 도달할 때까지 뉴클레아제로의 추출물의 처리 단계, 30 KDa의 컷오프를 가지는 디바이스 상에서의 분자 분리 단계, 이어서, 고분자량 분획의 회수 단계를 포함하는 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 수득가능하거나 수득될 수 있다.

보다 정확하게, 오실라토리아 속의 배양물로부터 수득되는 극성 당지질을 포함하는 조성물은, 예를 들어, 다음과 같이 제조될 수 있다.

시아노박테리아는 배양 배지, 예를 들어 BG-1 1 배지(Sigma-Aldrich, Cat No. C3061)에서 25℃의 온도로 5 umol.m^-2.sec^-1의 광강도의 24시간 연속 광계획으로 차가운 백색광하에서 생장한다. 정체 성장기에 도달하면, 시아노박테리아의 배양물을, 예를 들어, 원심분리(펠렛화)에 의해 침전시키고; 침전물(또는 펠렛)을 추출 이전에 동결시키거나 동결건조시킨다. 해동, 또는 (동결 건조의 경우) 재수화 후, 침전물은 다음의 단계를 통하여 가공된다:

a) 펠렛은, 예를 들면, 1:1 및 1:2 사이에 포함되는 부피의 물 또는 수용성 용매로의 희석에 의해 재현탁된다;

b) 당지질 혼합물을 함유하는 (상층액으로도 명명되는) 세포 추출물을 수득하기 위해, 재현탁된 펠렛은, 전술된 바와 같이, (예를 들어, Chomczynski P. and Mackey(Biotechniques, 1995, 19(6):942-5)에 기술된 바와 같은) 변성제(예를 들어, 페놀과 같은 극성 양성자성 유기 용매 및 무질서유발제(예를 들면, 구아니디늄 티오시아네이트)에 기반한 시약, 예를 들면, Trireagent®(Sigma cat. N T3934) 또는 Trizol®(Invitrogen)과 같은 유사한 시약을 포함함) 및 비양성자성 유기 용매(예를 들면, 클로로포름)를 함유하는 적절한 부피의 용액과 약 1 부피의 시아노박테리아의 수용성 현탁액, 2 내지 4 부피의 추출 용액(예를 들면, 약 3 부피의 추출 용액) 및 약 0.5 내지 1 부피의 클로로포름의 비로 혼합된다;

c) 세포 추출물은 적어도 5분 이상, 예를 들면, 10분 이상이지만 60분을 초과하지 않는 시간 길이로 상온에서 항온배양된다;

d) 예컨대, 대략 2000xg에서의 원심 분리 및 극성 당지질 분획을 함유하는 상층액(수용성상)이 수집된다. 이러한 상층액은, 예를 들어 전기 영동 및 은 염색법에 의해서나 생물학적 활성 검정법(예를 들면, LPS 존재 하에 THP1 세포주로부터 유래한 단핵구/대식세포 내에서 TNF-알파 생성의 저해 또는 ATP 신타아제(ATP-SX)에 대한 결합 또는 그의 활성의 저해)에 의해 측정될 수 있다. d)에서 원심분리에 의해 수득된 펠렛은 물 또는 수용성 완충액을 (수집된 부피와 대략 동일한 양으로) 첨가함으로써 재추출될 수 있고, 시료의 재원심분리가 이어진다. 이러한 제2 상층액은 이전의 상층액과 조합되고, 그런 다음, 통합된 시료는 다음을 포함하는 추가의 단계를 거친다:

e) 염, 예컨대 아세트산 나트륨(최종 5 내지 20 mM) 및 아세톤과 같은 유기 용매를, 예컨대, 약 2 부피의 양으로 첨가함에 의한 침전, 이어서 위와 동일한 조건 하에서의 원심 분리, 및 물에 희석된 에탄올, 예컨대, 70% 에탄올로의 적어도 1회 또는 2회의 펠렛 세척 단계,

f) 펠렛을 용액(예를 들면, 50 mM TRIS와 같은 완충 수용액)에 재현탁하는 단계,

g) 핵산 오염물을 엔도 및/또는 엑소 뉴클레아제(예컨대, DNase 및 RNase)의 사용에 의해 효소적으로 처리하고, 이어서, 단백질 오염물을 충분한 시간(37℃에서 적어도 1시간) 동안 프로테아제, 예컨대, 프로테이나제 K, 예컨대, 100 ?/ml으로의 분해에 의해 효소 처리하는 단계.

효소 분해 후, 시료를 다시 원심분리하고, 상층액을 수집하고, 염(예컨대, 아세트산 나트륨, 최종 약 10 mM) 및 적절한 부피(예컨대, 2 부피)의 유기 용매(예를 들면, 아세톤)의 첨가에 의해 더 침전시키고, 다시 원심분리한 후, 펠렛을 적어도 1종의 계면활성제(예를 들면, 데옥시콜레이트(DOC))를 함유하고, 또한, 예를 들어, 양이온성 계면활성제(예를 들면, 테트라에틸암모늄)도 함유하는 수용액 또는 물 내로 재현탁하고; 물질을 섹션 b)에 기술된 (변성) 추출 용액으로 다시 추출한 다음 전술된 아세트산 나트륨/아세톤으로 더 침전시키고, 70% 에탄올로 세척하고, 물 또는 수용액 내에 재현탁하고, 30 kDa의 컷오프를 가지는 필터(또는 다른 적합한 디바이스)의 사용에 의한 분자 분리를 수행하여 필터를 통과하는 물질을 제거하고 투석유물 내의 고분자량 당지질 분획을 총 중량의 5% 미만의 핵산 오염의 수준으로 물 또는 완충 수용액 내에 회수한다.

극성 당지질을 포함하는 조성물은 따라서 변성 무질서유발제를 포함하는 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속의 세포로부터 수득가능하거나 수득될 수 있으며, 이 때 추출 단계는 하기 단계 b)에 기술된 바와 같이 수행되고, 뉴클라아제 처리는 하기 단계 g)에 기술된 바와 같이 처리되고, 분자 분리는 하기 단계 k)에 기술된 바와 같이 수행되고, 이러한 방법은 하기 추가의 단계 a), c) 내지 f), e), h) 내지 j) 및 l) 내지 m)를 포함한다:

a) 선택적으로 또한 동결 건조된 시아노박테리움 오실라토리아 속(No. 1459/45)의 농축물을, 예를 들어, 1:1 및 1:2 사이에 포함되는 부피비의 수용액으로 재현탁시키는 단계;

b) 시아노박테리아의 현탁액을 무질서유발제, 극성 양성자성 유기 용매(예를 들면, 페놀) 및 비양성자성 유기 용매(예를 들면, 클로로포름)를 포함하는 2 내지 4 부피, 예컨대, 약 3 부피의 변성 용액과 혼합하는 단계;

c) 60분보다 짧은 시간으로의 항온배양 단계;

d) 상층액으로 명명된 액체상의 원심분리 및 수집 단계;

e) 염 및 유기 용매(예를 들면, 아세톤)를 상층액에 첨가하여 당지질 분획을 침전시키는 단계 및 침전물(또는 펠렛)을 물에 희석된 에탄올로 세척하는 단계;

f) 완충 수용액과 같은 수용액 내로의 침전물의 재현탁 단계;

g) 엔도- 및/또는 엑소-뉴클라아제와 같은 뉴클라아제, 이어서 프로테이나제 K와 같은 프로테아제로의 처리 단계;

h) 염 및 유기 용매(예를 들면, 아세톤)의 첨가에 의한 당지질상의 침전 단계;

i) 물에 희석된 에탄올로의 선택적인 펠렛 세척 단계 및 이온 계면활성제(예를 들면, 데옥시콜레이트 나트륨 및 4차 암모늄 염)를 포함하는 수용액 내로의 재현탁 단계;

j) 단계 b) 내지 f)에 기술된 바와 같이 수용액으로부터의 재추출 단계;

k) 30 KDa의 컷오프를 가지는 디바이스 상에서의 분자 분리 단계;

l) 물 또는 완충 수용액으로의 고분자량 극성 당지질 분획의 회수 및 핵산 또는 단백질 오염의 수준의 평가 단계;

m) 총 중량의 5% 미만, 예컨대, 3% 미만의 핵산 오염을 가지는 분획의 회수 및 사용 단계.

이렇게 수득된 당지질 분획의 활성은 사이토카인(예를 들어, IL-6, IL-8, TNF-알파 및/또는 IL-1 베타)을 생성하는 세포(예로서, THP1)에서 (P. 진지발리스 또는 E. 콜라이로부터의) LPS에 의해 유도되는 전염증 활성의 저해를 기반으로 하는 생물학적 시험 및/또는 예를 들어 전기영동과 같은 생화학적 검정법에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 이렇게 수득된 당지질 분획의 활성은, 예를 들어, 인간 TLR-4 유전자 및 NF-kB 유도성 SEAP 보고 유전자를 안정적으로 공동발현하도록 조작된 세포에서 LPS에 의해 유도되는 TLR4 매개 NF-kB 활성화에 대한 저해 효과를 측정함으로써 평가될 수 있다. 당지질 분획 활성은, 또한, 실시예 7에서와 같이, 인간 폐 실질조직에서 LPS 항온배양 후 TNF-α 방출에 대한 저해효과를 측정함으로써 관찰될 수 있다.

WO 2010/094693에는 전술된 방법에 의해 수득된 본 발명에 따른 당지질을 포함하는 추출물의 분석적 특성이 더 기술된다.

극성 당지질 분획의 당의 분석은 (100%로 주어진) 당류 성분 내에, 람노오스는 통상적으로 20 내지 40%, 포도당(Glc)은 20 내지 40%, 크실로오스(Xyl)는 5 내지 10%, 만노오스(Man)는 3 내지 5%, 갈락토오스(Gal)는 3 내지 5%, 글루코사민(GlcN)은 0.5 내지 1%, 갈락투론산(GalA)은 1 내지 6%이고, 이 때 이러한 당이 단당일 수 있거나 보다 통상적으로 당들은 복합당 및/또는 당 유도체라는 것을 나타낸다. 당 잔기의 정성적 및 정량적 분석은 80℃에서 20시간 동안 메탄올-염산(HCl 1 M/MeOH)으로의 당지질 혼합물의 가수분해, 헥산 내로 추출 및 피리딘 및 무수 아세트산으로의 아세틸화 후 아세틸화된 메틸 글리코시드의 GC-MS 분석 및/또는 120℃에서 1시간 동안 2 M 트리플루오로아세트산으로의 처리, 이어서 수소화붕소 나트륨으로의 1시간의 처리, 및 이어지는 피리딘 및 무수 아세트산으로의 아세틸화 후에 수득된 알디톨 아세테이트의 분석에 의해 수행될 수 있다.

당지질 혼합물의 주요 당지질 성분의 분석적인 분석은 다음의 상대적인 조성(중량/중량 %)을 나타낸다:

- 당류: 람노오스 51%, 갈락투론산 15%, 만노오스 11%, 갈락토오스 11%, 크실로오스 4%, 글루코오스 4%, 글루코사민 4%; 및

- 지방산: 옥타데카노산(C 18:0, 55%); 헥사데카노산 및 3-하이드록시헥사데카노산(C16:0 + C16(3OH)), 35%); 3-하이드록시운데카노산(C15(3OH)), 10%).

원소 분석은 탄소 41%, 수소 6.5%, 및 질소 4%의 발생을 나타내었다.

따라서, 극성 당지질은 적어도 하나의 단위의 람노오스 또는 그의 유도체를 포함하고, 30 kDa 초과, 예컨대 30 및 40 kDa 사이(예를 들면, 32 내지 34 kDa 사이(약 33 kDa))의 분자량을 특징으로 하되, 분자량은, 예를 들어, 은 염으로의 염색이 뒤따르는 DOC-PAGE에 의해 결정될 수 있다.

특히, 본 발명에 제공된 조성물은 스테아르산(C 18:0, 옥타데카노익) 및/또는 팔미트산(C 16:0, 헥사데카노익)을 주요 당지질 성분의 지방산으로서 포함하는 극성 당지질의 혼합물을 포함할 수 있고, 이 때 지방산 중 적어도 하나는 적어도 하나의 단위의 람노오스 또는 그 유도체를 포함하는 당류에 결합된다.

이러한 지방산은, 예를 들어, 그들의 포화된 형태로 존재하고, 통상적으로 당지질 혼합물의 총 지질 분획에 대하여 각각 50% 내지 80% 스테아르 산 및/또는 15% 내지 40%의 팔미트산을 각각 포함하는 양으로 존재하고(이때, 100이 총 지질 분획임), 보다 더 통상적으로 이러한 지방산은 각각 65 내지 75% 및 20 내지 32% 사이에 포함되는 양으로 존재한다. 다른 지방산 사슬은 15%를 초과하지 않는 양으로 존재할 수 있고, 통상적으로는 라우로레인 산(Lauroleic acid)(또는 도데센산(C12: 1)) 또는 3-하이드록시운데카노산을 10%를 초과하지 않은 양, 예컨대, 지질 분획의 5% 이하로 포함한다. 지방산의 분석은, WO 2010/094693에 기술된 바와 같이, 80℃에서 20시간 동안 메탄올-염산(HCl 1M/MeOH)으로의 화합물의 가수 분해 및 헥산 상 중 메틸 에스테르로의 추출 후 GC-MS에 의해 수행될 수 있다.

당지질 혼합물에는 통상적으로 인지질 및 유리 지질이 결여된다. 더욱이, 당지질 혼합물에는, 또한, 전형적인 시아노박테리아 틸라코이드 막인 일반적으로 1 kDa 미만의 분자량을 가지는 글리세롤의 지방산 유도체(모노갈락토실 디아실글리세롤(MGDG), 디갈락토실 디아실글리세롤(DGDG), 술포퀴노보실 디아실글리세롤(SQDG))와 같은 저분자량 당지질이 결여될 수 있다.

약학적 조성물

화합물의 완전한 수용성은 당업자에게 잘 알려진 수용성 부형제 및 희석제를 가지는 약학적 조성물, 특히 액체 제형의 치료적 사용을 가능하게 한다. 당지질 추출물은 물 및 비양성자성 용매(예를 들면, DMSO) 둘 다에 희석될 수 있고 수용액에서 안정하다. 또한, 열에도 안정하다.

따라서, 당지질은 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 오실라토리아 속으로부터의 당지질 추출물을, 예를 들면, 0.1 및 100 ?/ml 사이의 농도, 예컨대, 1 및 50 ?/ml 사이(예를 들면, 4 및 20 ?/ml 사이)로 포함한다.

경구, 정맥 내(i.v.) 및 국소 투여를 위해, 환자에게 투여될 당지질 추출물 일일 용량은 통상적으로 0.01 및 50 mg 사이, 예컨대, 0.1 및 5 mg 사이(예를 들면, 0.3 및 3 mg 사이)에 포함된다.

더욱이, 구체적인 일 양태에서, 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 및/또는 다른 유효 성분 및 안정화제를 포함한다. 특히, 당지질 추출물은 경구, 정맥내(i.v.), 흡입 또는 국소 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체와 결합할 수 있다.

본원에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체”라는 용어는, 적절하게, 동물, 또는 인간에게 투여될 때 유해하거나 다른 지향되지 않은 반응을 생성하지 않는 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

경구 투여 형태는, 예를 들어, 고체 형태, 부착정, 바이오필름 또는 크림, 연고 및 페이스트를 포함한다. 일 구현예에서, 형태는 미국 특허 제5,244,663호에 기술된 것과 같은 정제이다.

담체는, 이에 제한되지는 않지만, 붕해제, 결합제, 윤활제, 향미제, 착색제, 보존제를 더 포함할 수 있다. 적합한 붕해제는 건조 전분, 탄산 칼슘, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소디움 라우릴 설페이트, 스테아린 모노글리세라이드, 락토오스뿐 아니라 크로스포비돈(예컨대, GAF로부터 수득할 수 있는 Polyplasdone^TM. XL)과 같은 가교 결합된 폴리비닐피롤리돈, 크로스카멜로오스(예컨대, FMC로부터 수득할 수 있는 Ac-di-sol^TM)와 같은 가교결합된 카복실 메틸셀룰로오스, 알긴산, 및 소디움 카복시메틸 스타치(예컨대, Edward Medell Co., Inc로부터 수득할 수 있는 Explotab^TM), 메틸셀룰로오스, 아가 벤토나이트 및 알긴 산을 포함한다. 결합제는, 만일 사용된다면, 부착을 증진하는 것들이다. 이러한 결합제의 예는, 이에 제한되지는 않지만, 전분, 젤라틴 및 수크로오스, 덱스트로오스, 당밀 및 락토오스와 같은 당을 포함한다. 바람직한 윤활제는 스테아레이트 및 스테아르산이다.

락토오스, 만니톨 및 크로스카멜로오스는 바람직한 부형제이다.

투여 형태에 포함될 수 있는 추가적인 성분은 당업자에게 공지되어 있거나 명확할 것이다; 예를 들어, 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition (Mack Publishing, 1995))을 참조한다.

구체적인 일 구현예에서 약학적 조성물은 액체 형태이다.

수용성 현탁액의 제조를 위해, 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 및, 만일 원한다면, 유화제 및/또는 현탁제를 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 이의 다양한 조합과 같은 희석제와 함께 채용할 수 있다. 글리세린이 바람직하다.

추가의 양태에 따르면, 혼합물은 또한 전술된 치료적 목적과 동일한 수의학적 용도의 조성물의 제조에도 적합하다.

실시예

실시예 1 : 재료 및 방법

VB3323

VB3323은 Bluegreen Biotech(Milano, Italy)로부터 수득되었다. VB3323은 지질다당류(LPS)를 포함하는 당지질 분획인 조성물에 해당하고, 상기 당지질 분획은 기탁번호 1459/45하에 조류 원생동물 종균관리센터(Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP)에 기탁된 오실라토리아(Oscillatoria) 균주로부터 추출된다. VB3323의 3종의 상이한 배치(batch)의 NMR 프로파일이 도 7에 나타나 있다.

통증 및 COPD에 사용된 모델

실시예 1 내지 6에서 사용된 동물 모델은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 실험은 표준 절차를 사용하여 수행되었다. 이러한 좌골 신경 결찰 마우스 모델 및 통각 시험은 하기에 더 기술되어 있다. 실시예 7 및 8에서 사용된 세포 모델은 해당하는 실시예에 기술되어 있다.

좌골 신경 결찰

28±3g으로 칭량된 C57BL/6N, Crl BR 마우스(야생형)를 펜토바르비탈 나트륨(65 mg/kg, i.p.)으로 마취하고 수술적 절차를 따랐다. 간략하게, 보통의 좌골신경을 넓적다리 중앙의 수준에서 노출시키고, 좌골 신경 삼분지에 근접하게, 그 주위로 4개의 결찰을 약 1 mm 간격으로 느슨하게 묶어서 신경외막 순환이 보존되게 하였다. 마우스에서, 결찰은 각각의 뒷다리에서 짧은 경련이 나타날 때까지 묶어졌다. 샴(sham) 동물(결찰 없이 좌골이 노출됨)이 대조군으로서 사용되었다.

통각 시험

열 통각 과민증은 특정 기기(Ugo Basile, Varese, Italy)를 사용한 하그리브스(Hargreaves) 방법(족저 시험)에 따라(Hargreaves et al.,1988), 복사열 자극에 대한 발 움츠림 잠복기를 기록하여 평가하였다. 동물을 투명한 유리 플랫폼 위의 아크릴 상자 내에 위치시키고, 순응되도록 하였다. 일정한 강도의 복사열원을 플랫폼을 통하여 뒷발의 족저 표면에 적용하였다. 자극에 대한 반응은 발의 움츠림을 검출하고, 잠복기를 초로 나타내는 광전지에 의해 기록하였다. 열 통각 과민증은 주사된 뒷발 및 반대쪽 뒷발에서 CFA 주사 전, CFA 주사 7 및 14일 후(마지막 약물 치료 24시간 후) 또는 CCI 모델에서 상이한 시간에 평가하였다.

기계적 이질통은 본 프레이(von Frey)에 의해 기술된 방법(Villetti et al., 2003)에 따라 기계적 자극에 대한 반응을 측정하는 기기(Plantar Aesthesiometer, Ugo Basile, Italy)를 사용하여 평가하였다. 간략하게, 마우스를 금속 메쉬 테이블에 위치시키고, 순응 후, 마우스가 발을 움츠릴 때까지 전기 바늘을 (20초 기간 동안 50 g으로) 증가하는 기계적 압력으로 족저 발 표면에 대하여 밀었다. 기계적 이질통은 주사된 뒷발 및 반대쪽 뒷발에서 FCA 주사 전, FCA 주사 7 및 14일 후(마지막 약물 치료 24시간 후) 또는 CCI 모델에서 상이한 시간에 움츠림 임계를 그램으로 측정함으로써 평가하였다.

실시예 2 : VB3323은 강력하고 용량 의존적으로 열 통각 과민증 및 기계적 이질증을 FCA 처리된 마우스에서 낮췄다

족저 내 프로인드 완전 어쥬번트(Freund Complete Adjuvant, FCA) 주사 14일 후, 마우스는 FCA 처리된 발에서 열 움츠림 잠복기 및 기계적 이질통 임계 모두 유의한 감소(약 50%)를 나타냈다.

경구 VB3323(30 및 100 mg/kg)은, 유의하고 용량 의존적으로, FCA 투여 14일 후의 경구 VB3323의 투여 2시간(28 및 67%의 회복) 및 6시간 후(각각, 15% 및 69% 회복)에 기계적 이질통을 저해하였다. 동일한 실험에서, VB3323은 2시간(19 및 80% 회복) 및 6시간(39 및 38% 회복)에서 열 통각 과민증에 대한 활성을 나타냈다. 100 mg/kg 용량과 유사하게, 10 mg/kg으로의 복강 내 VB3323은 기계적 이질통 및 열 통각 과민증을 낮출 수 있었다.

실시예 3 : 30mg/kg으로의 VB3323 만성 치료는 기계적 이질통을 유의하게 낮췄다

족저 내 프로인드 완전 어쥬번트(FCA) 처리된 마우스에서, VB3323(7일간 30 mg/kg)로의 만성 경구 치료는 FAC 투여 후 14일차에 기계적 이질통을 유의하게 낮췄다(59% 회복). 효과는 마지막 VB3323 치료 24시간 후에 평가하였다.

실시예 4 : VB3323 만성 치료는 어떠한 유의한 체중 변화 및 육안적 형태 평가에 의한 기관 변형을 유도하지 않았다

마우스 체중을 VB3323 치료부터 시작하여 매일 모니터링하였다. 육안적 형태 평가에 의한 기관 변형 및 비장 중량을 마지막 VB3323 치료 24시간 후에 살상된 동물에서 평가하였다.

VB3323 만성 치료는 위에서 언급된 파라미터에 어떠한 변형도 유도하지 않았다.

실시예 5 : VB3323은 기계적 이질통 및 열 통각 과민증을 유의하게 낮췄다

만성 신경병성 통증 모델인 좌골 신경의 만성 협착 손상 14일 후, 마우스는 결찰된 발에서 열 움츠림 잠복기 및 기계적 이질통 임계 모두에서 유의한 감소(약 50%)를 나타냈다. 경구 VB3323(8일간 매일 10 및 30 mg/kg)은 그의 마지막 투여로부터 2시간에서 이질통(45 및 50% 회복) 및 열 통각 과민증(42 및 43% 회복)을 유의하게 저해하였다.

이 모델에서, VB3323은 단일 투여 후 이질통에 효과를 나타내지 않았고, 열 통각 과민증에 대해서는 적은 효과를 나타냈다. VB3323의 활성은 중요한 치료적 활성을 시사하는 반복 투여 후 나타났다.

실시예 6 : VB3323 만성 치료는 만성 통증에 의해 유도된 체중 손실을 낮춘다

좌골 신경 결찰에 의해 유발된 신경병성 통증은 마우스 체중 감소(기저 체중으로부터 약 4의 델타%)를 유도하였다.

VB3323 만성 치료(8일간 매일 10 및 30 mg/kg)는 만성 통증에 의해 유도된 체중 손실을 낮췄다.

종합하면, 실시예 1 내지 6의 결과는 VB3323이 통증, 특히 신경병성 통증 및/또는 만성 통증을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 7 : VB3323은 인간 기관지 실질조직에서 LPS 유도된 TNFα 방출을 저해하였다

인간 실질조직 폐 조직은 산 제라르도 병원(San Gerardo Hospital, Monza, Italy)에서 암종에 대한 절제술을 경험한 환자로부터 수득하였다. 환자들은 방사선요법 또는 스테로이드, 아편유사체 또는 화학요법으로의 만성 치료를 받지 않았다. 실질 조직의 시편은 종양과 구분되는 자리에서 수득하였다. 연구는 이탈리아 몬자의 산 제라르도 병원의 기관 윤리 위원회에 의해 승인되었고, 모든 지원자에게 고지에 입각한 동의서가 제공되었다. 절제된 폐 조직은 종양, 대기도, 흉막, 가시적인 혈관이 없도록 절개하였고, 크렙의 완충액(Kreb's buffer)(nM 조성: NaCl 118.4, KCl 4.7, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25, 포도당 11.7)으로의 수회의 세척 중에 해부 가위를 사용하여 2 mm의 단편으로 미세하게 잘랐다. 6개의 외식편(explant)(대략 30 mg의 총중량)을 배양 생물반응기(Synthecon/NASA USA)에서 RPMI-1640 배지(1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신, 및 1% 겐타마이신을 함유함)로 37℃에서 5% 이산화탄소/공기 중에 16시간 동안 항온배양하였다. 그런 다음, 조직을 100 ng/ml LPS(Sigma-Aldrich)로 자극하거나 4시간 동안 세포 배양 배지 내에서 단독으로 유지하였다. TNF의 중화를 위해, 조직을 100 ng/ml LPS로의 자극 1시간 전에 0.01, 0.1, 또는 1 μM의 VB3323으로 항온배양하였다. 폐 조직 단편 및 상층액을 수확하였고, -80℃에서 분석 시까지 저장하였다. 조직 단편을 칭량하여서 방출된 사이토카인의 수준을 정규화하기 위한 총 조직 중량을 결정하였다. 상층액 중 TNF 알파의 수준은 효소 결합 면역 흡착 검정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의해 측정하였고, 농도는 조직 중량에 대해 교정되었다. 인간 TNF 특이적 ELISA 키트(0.2 pg/mg의 조직의 검출 한계)는 Pirce로부터 구입하였고, 각 ELISA에 대해 제조자의 프로토콜을 따랐다.

VB3323은, 농도(0.01, 0.1, 또는 1 μM) 의존적으로, 인간 기관지 실질조직 조직 배양에서 E. 콜라이-LPS에 의해 유도되는 TNF 알파의 방출을 0.1 μM의 IC50으로 저해하였다. 1 μM의 VB3323은 동일한 농도에서 참조 표준 덱사메타손(69%)과 비교하여 TNF 알파 방출의 저해에서 더욱 강력하였다(89%).

덱사메타손은 인간에서 COPD를 치료하기 위해 사용되는 약물이다. 본원에서, 본 발명자들은 VB3323이 덱사메타손보다 더욱 강력하다는 것을 발견하였다. 따라서, VB3323은 COPD의 치료에서 매우 유망한 약물이다.

실시예 8 : VB3323은 마우스 기관지 실질조직에서 LPS 유도된 TNF α 방출을 저해하였다

동물(BALB/c 수컷 마우스, 체중 20 내지 22g)을 경추 탈구에 의해 희생시켰다. 갈비뼈를 자르면서 흉곽을 열었다. 수술용 핀셋으로 심장을 고정시키고, 폐 및 심장을 수술용 가위를 사용하여 흉강으로부터 절개하고 차가운 크렙 용액(nM 조성: NaCl 118.4, KCl 4.7, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25, 포도당 11.7)에 넣었다. 대기도 및 가시적인 혈관을 절개하였다. 폐를 30 mg(마우스 당 약 5 조각)의 단편으로 나누었고, 메스를 사용하여 (각 단편은 약 2 mm3의 6개의 조각) 미세하게 잘랐다. 24웰 플레이트의 웰(2.0 cm2) 당 6개의 외식편(총 중량 30 mg)을 1 ml의 RPMI-1640 배지(RPMI-1640 + 항생제 항진균제 용액100x, Sigma-Aldrich)로 37℃ 에서 5% 이산화탄소/공기 중에 16시간 동안 항온배양하였다. 그런 다음, 배지를 신선한 배지로 교체하였고, 조직을 1시간 동안 화합물로 처리하였다. 한 시간 후, 조직을 100 ng/ml LPS E. 콜라이 055:B5(Sigma-Aldrich)로 자극하였다. LPS 자극 4시간 후, 상층액을 수확하고 ELISA 분석 시까지 -80℃에서 저장하였다. 6개의 조직 외식편 중 3개는 조직학/면역조직화학적 분석을 위해 10% 포르말린 완충액에 고정하였다. 나머지 3개의 조직 외식편은 RNA-후 완충액(RNA-later buffer)에 밤새 넣어둔 다음, -80℃에 저장하였다.

마우스 TNF 특이적 ELISA 키트(0.2 pg/mg의 조직의 검출의 한계)는 Pirce로부터 구입하였고, 각 ELISA를 위해 제조자의 프로토콜을 따랐다.

VB3323은 1 μM에서 E. 콜라이 LPS에 의해 유도된 TNF 알파의 방출을 마우스 기관지 실질조직 조직 배양에서 저해하였다. 동일한 농도에서 참조 표준 덱사메타손의 활성(67%)와 유사한 68%의 활성을 가짐.

실험은 VB3323이 COPD의 치료에서 매우 유망한 약물이라는 것을 확인한다.

실시예 9 : 마우스에서 COPD 모델에 대한 경구 VB3323의 효과

조합된 담배 연기/오존 노출:

사용된 동물은 Balb/CBYJ 마우스(암컷, 15 내지 17주령)였다. 동물은 담배 연기 및 오존의 조합에 노출되었다. 간략하게, 3일간의 담배 연기(CS)에 대한 제1 순응 후, 4종의 연구 담배의 주류 연기(2R4F) 및 오존(O₃)을 1.7 LPM(분 공기 당 리터)의 희석 공기와 혼합하였고, 동물을 20분간 CS + O₃에 노출하였다. 그 후, 1시간의 회복 기간이 이어졌다. 절차를 2회 더 반복하였다(총 일간 노출은 1시간이었다). CS + O₃ 노출의 총 지속기간은 14일이었다.

동물의 치료:

동물을 전체 노출 기간(CS 순응 및 CS + O₃ 노출) 동안 치료하였다. VB3323(10 mg/kg/일)는 제1 CS 또는 CS + O₃ 노출 1시간 전에 매일 제공되었다. 샴(미치료) 및 CS + O₃ 대조 동물을 비히클로 처리하였다.

측정된 파라미터들:

상이한 파라미터들을 측정하였다:

- 체중 변화는 매일 측정하였다.

- 폐 기능 시험(Buxco)은 마지막 CS + O₃ 노출 18 내지 24시간 후 정적 및 동적인 폐 기능(기능 잔기 용량(FRC), 총폐용량(TLC), [20초 내 강제호기량]/[강제호기값]([FEV₂₀]/FVC))을 측정하기 위해 실현되었다.

- 폐 염증은 마지막 CS + O₃ 노출 5시간 후 수행된 기관지 폐포 세척에 의해 측정되었다. 총 세포 수 및 중성구 수를 평가하였다.

결과:

도 8에서, TLR4 길항제 VB3323 치료는 CS + O₃ 노출로 유도된 체중 감소에 대해 단지 약하지만 유의한 효능을 나타내었다.

도 9에서, TLR4 길항제 VB3323 치료는 CS + O₃ 노출로 유도된 폐부종을 유의하게 개선하였다.

다른 실험들이 수행되었고, TLR4 길항제로의 치료가 폐기종/과도팽창 및 기도 폐쇄의 예측인자인 정적 또는 동적 폐 기능 파라미터들에 어떠한 효능도 가지지 않는 것으로 나타났다.

TLR4 길항제 VB3323(2주간 매일 10 mg/kg)의 경구 투여는 담배 연기/오존으로 유도된 체중 감소에서의 약한 감소를 유발하고, CS + O₃으로 유도된 폐 부종을 유의하게 완화시켰다.

VB3323의 경구 투여는 기관지 폐포 세척액에서 평가된 CS + O₃으로 유도된 기도 염증에는 효과가 없었다. 이러한 결과는 시험된 용량이 낮았고/낮았거나 VBR322가 흡입 대신 경구로 투여되었다는 사실에 의해 설명될 수 있을 것이다.

조류 원생동물 종균관리센터 CCAP1459/45 20080709

Claims (19)

1. 통증 및/또는 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 시아노박테리움 오실라토리아 속(cyanobacterium Oscillatoria species)의 세포로부터 수득가능한 극성 당지질(CyP)을 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 극성 당지질은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)인, 상기 사용을 위한 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 극성 당지질은 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 추출된 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 극성 당지질은:
   a) 상기 시아노박테리움을 제공하는 단계;
   b) 상기 시아노박테리움으로부터 극성 당지질을 추출하는 단계;
   c) 단계 (b)의 극성 당지질을 침전시키는 단계; 및
   d) 단계 (c)의 추출되고 침전된 극성 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 수득가능한 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
5. 제4항에 있어서, 단계 (b)는 무질서유발제(chaotropic agent) 및 비양성자성 유기 용매(예를 들면, 클로로포름)를 포함하는 변성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
   i) 시아노박테리움의 농축물, 예를 들면 원심분리에 의해 시아노박테리움을 배양 배지로부터 수집한 후 수득된 동결 건조된 농축물을 제공하는 단계;
   ii) 상기 농축물을 용액에 현탁하는 단계;
   iii) 선택적으로, 마이크로파로의 처리 및/또는 예를 들면 (상층액으로 명명되는) 액체상을 원심분리하고 수집하는 것에 의한 액체/고체 분리를 수행하는 단계;
   iv) 시아노박테리아의 현탁액 또는 상층액을 무질서유발제 및 비양성자성 유기 용매(예를 들면, 클로로포름)를 포함하는 변성 용액과 혼합하는 단계;
   v) 단계 (iv)에서 수득한 용액을 항온배양하는 단계;
   vi) 바람직하게는 수용성 액체상을 원심분리하고 수집하는 것에 의해 액체/액체 분리를 수행하는 단계;
   vii) 예를 들어, 상층액에 아세톤과 같은 유기 용매 및 염을 첨가하는 것에 의한 당지질 분획의 침전 단계;
   viii) 침전물을 수용액에 재현탁하는 단계;
   ix) 선택적으로 (viii)에서 수득된 용액을 이소프로판올과 같은 유기 용매로 처리하고, 원심분리하고, 액체상을 바람직하게는 원심분리에 의해 수집하는 단계; 및
   x) 이온 교환 컬럼을 통한 통과 단계 및 극성 당지질을 포함하는 분획의 수집 단계를 포함하는 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 극성 당지질은 변성 무질서유발제로의 추출 단계, 핵산 오염의 수준이 총 중량의 5% 이하에 도달할 때까지 뉴클레아제로 추출물을 처리하는 단계, 30 KDa의 컷오프를 가지는 디바이스 상에서의 분자 분리 단계, 이어서 고분자량 분획의 회수 단계를 포함하는 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속으로부터 수득가능한 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
8. 제7항에 있어서, 극성 당지질은, 변성 무질서유발제로의 추출로서, 추출 단계가 하기 단계 b)에 기술된 바와 같이 수행되고, 뉴클라아제 처리는 하기 단계 g)에 기술된 바와 같이 수행되고, 분자 분리는 하기 단계 k)에 기술된 바와 같이 수행되며, 하기 추가의 단계 a), c) 내지 f), e), h) 내지 j), 및 l) 내지 m)을 포함하는 것인 추출을 포함하는 방법에 의해 시아노박테리움 오실라토리아 속의 세포로부터 수득가능한 것인, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물:
   a) 선택적으로 동결 건조된 시아노박테리움 오실라토리아 속의 농축물을 바람직하게는 1:1 및 1:2 사이에 포함되는 부피비로 수용액에 현탁하는 단계;
   b) 시아노박테리아의 현탁액을 무질서유발제, 극성 양성자성 유기 용매, 바람직하게는, 페놀, 및 비양성자성 유기 용매, 예를 들면 클로로포름을 포함하는 2 내지 4 부피, 바람직하게는 약 3의 변성 용액과 혼합하는 단계,
   c) 60분보다 짧은 시간으로 항온배양하는 단계;
   d) 상층액으로 명명된 액체상을 원심분리하고 수집하는 단계;
   e) 상층액에 염 및 유기 용매, 바람직하게는 아세톤을 첨가하여 당지질 분획을 침전시키는 단계 및 침전물(또는 펠렛)을 물에 희석된 에탄올로 세척하는 단계;
   f) 바람직하게는 완충된 수용액 내에서의 침전물의 재현탁 단계;
   g) 뉴클라아제, 바람직하게는 엔도- 및/또는 엑소-뉴클라아제 및 이어서 프로테아제, 바람직하게는 프로테이나제 K로의 처리 단계;
   h) 염 및 유기 용매, 바람직하게는 아세톤의 첨가에 의한 당지질상의 침전 단계;
   i) 물에 희석된 에탄올로 선택적으로 펠렛을 세척하는 단계 및 이온 계면활성제, 바람직하게는 데옥시콜레이트 나트륨, 및 4차 암모늄 염을 포함하는 수용액 내로의 재현탁 단계;
   j) 단계 b) 내지 f)에 기술된 바와 같이 수용액으로부터의 재추출 단계;
   k) 30 kDa의 컷오프를 가지는 디바이스 상에서의 분자 분리 단계;
   l) 물 또는 완충 수용액으로의 고분자량 극성 당지질 분획의 회수 단계 및 핵산 또는 단백질 오염의 수준의 평가 단계;
   m) 총 중량의 5% 미만 핵산 오염을 가지는 분획의 회수 및 사용 단계.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 스테아르산(C18:0, 옥타데카노익) 및/또는 팔미트산(C16:0, 헥사데카노익)을 주요 당지질 성분의 지방산로서 포함하는 극성 당지질의 혼합물을 포함하되, 지방산 중 적어도 1종은 적어도 하나의 단위의 람노오스 또는 그의 유도체를 포함하는 당류와 결합하는 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 극성 당지질의 혼합물은 당지질 혼합물의 총 지질 분획에 대하여 50% 내지 80% 스테아르산(C18:0, 옥타데카노익) 및/또는 15% 내지 40% 팔미트산(C16:0, 헥사데카노익)을 포함하는 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 극성 당지질의 혼합물은 당지질 혼합물의 총 지질 분획에 대하여 65 내지 75% 스테아르산(C18:0, 옥타데카노익) 및/또는 20 내지 32% 팔미트산(C16:0, 헥사데카노익)을 포함하는 것인, 상기 사용을 위한 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시아노박테리움 오실라토리아 속은 기탁 번호 1459/45 하에 조류 원생동물 종균관리센터(Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP)에 기탁된 오실라토리아 속인, 상기 사용을 위한 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물로서, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물.
14. 제13항에 있어서, 신경병성 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물로서, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물.
15. 제13항에 있어서, 말초 신경병성 통증, 중추성 신경병성 통증 또는 혼합(말초 및 중추성) 신경병성 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물로서, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물.
16. 제13항에 있어서, 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군 또는 암에 의해 유발된 신경병성 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물로서, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물.
17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, COPD의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물로서, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 다른 안정화제를 더 포함하는 것인, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 흡입 또는 국소 투여에 의한 경구용, 정맥내(i.v.)용인, 극성 당지질을 포함하는 상기 사용을 위한 조성물.

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