KR20140129181A - 분리 가능한 슬라이드를 갖는 표본 가공 장치 - Google Patents

분리 가능한 슬라이드를 갖는 표본 가공 장치 Download PDF

Info

Publication number
KR20140129181A
KR20140129181A KR1020147025769A KR20147025769A KR20140129181A KR 20140129181 A KR20140129181 A KR 20140129181A KR 1020147025769 A KR1020147025769 A KR 1020147025769A KR 20147025769 A KR20147025769 A KR 20147025769A KR 20140129181 A KR20140129181 A KR 20140129181A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chamber
microfluidic
minutes
less
providing
Prior art date
Application number
KR1020147025769A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102079307B1 (ko
Inventor
아타 투나 씨프트리크
마틴 지아이제이에스
Original Assignee
에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘) filed Critical 에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘)
Publication of KR20140129181A publication Critical patent/KR20140129181A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102079307B1 publication Critical patent/KR102079307B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • G01N1/312—Apparatus therefor for samples mounted on planar substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0822—Slides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0442—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces thermal energy, e.g. vaporisation, bubble jet
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)

Abstract

생물학적 및 화학적 표본 가공 장치에 있어서, a. 고정화된 실체들, 생물학적 표본들 또는 분자들과 같은 분리 가능한 슬라이드 함유 표본들에 의하여 형성된 적어도 하나의 벽을 갖는 고압-저항성의 얕고 넓은 면적 를 포함하고, b. 상기 챔버에 유체를 주입하고 상기 챔버로부터 나온 유체를 수거하기 위한 미소유체 접근 구멍들의 배열을 포함하고, c. 상기 챔버의 외부에 형성되는 입구 포트들 및 미소유체 채널들과 인터페이스로 연결되고, d. 상기 슬라이드가 상기 장치와 접촉하여 상기 챔버를 형성할 수 있도록 구성되며, e. 유동 물질들 및 시약들을 상기 챔버 내로 신속하게, 바람직하게는 15 초 미만 내에, 그리고 미소유체 접근 구멍들의 상기 배열로 인해 규칙적이거나 균일한 방식으로 전달하고 수송하도록 개조된 장치.

Description

분리 가능한 슬라이드를 갖는 표본 가공 장치{SAMPLE PROCESSING DEVICE WITH DETACHABLE SLIDE}
현대 종양학에서, 생물표지 분석은 암 진단 및 예후를 위한 필수 불가결한 도구이다. 면역조직화학(IHC)은 의학 실험실에서 조직에 대한 일상적인 병리 검사가 진행되는 동안에 암 생물표지 분석을 위한 중요한 도구로서 이용되어 왔다. IHC는 조직 시편에 대한 생물표지 분석을 위해 식품 의약국과 같은 많은 지역 및 국제적인 당국에 의해 승인된 기법이다. 일반적으로, 사실은 항원인 특정 생물표지는 표적 생물표지에 대한 친화도를 갖는 특이적인 일차 항체들로 검색된다. 이후, 라벨과 접합되고 일차 항체들에 친화도를 갖는 특이적인 이차 항체들은 특이적인 라벨링을 위해 이용된다. 이 라벨은 흔히 형광 또는 착색 표지이며, 형광의 경우, 이러한 기법은 면역조직형광염색법(IHF)라고 한다.
이에 반하여, IHC 및 IHF는 표본 조직들에 바로 적용될 수 없고, 일부 사전-가공 단계들이 필요하다. 사전 가공은 고정 단계에 의하여 시작되는데, 여기서 환자로부터 취한 의심이 가는 조직학적 표본들은 우선 조직의 형태뿐만 아니라 조직 내에서 단백질 및 항원을 보존하는 절차를 거친다. 수많은 고정 기법이 존재하는 반면에, 흔히, 고정 단계는 액체 질소의 사용을 포함하는 매우 신속한 냉각 단계인 냉동 고정 또는 포름알데히드 고정 중 어느 하나에 의하여 수행된다. 이후, 조직은 현미경절편작성법의 공정을 거치는데, 여기서 조직은 박절편(4 ㎛ - 10 ㎛)으로 슬라이스되고, 표준 유리 슬라이드상에서 고정된다. 이후에 더 오랜 보존을 위해, 냉동 고정된(CF) 조직 편들은 냉동된 상태가 유지되는 반면에, 포름알데히드-고정된 조직들은 파라핀 왁스층에 의하여 보존된다. 후자는 "포르말린-고정된 파라핀-포매(FFPE)" 조직 편이라고 한다. 고정 단계 이후에, 냉동 고정된 조직들은 주위 온도가 된 이후 IHC 절차를 바로 거칠 수 있는 반면에, FFPE 조직들은 일부 추가 가공을 필요로 한다. 이들은 파라핀의 화학적 제거와 항원 회복(antigen retrieval)이라고 하는 다른 단계를 포함한다(1항원 회복은 많은 자료들에서 "에피토프 회복"이라고도 한다. 또한, 항원 회복하는 동안에 표본 가열이 포함된다면, 이는 유도된 열 또는 열 매개 항원 회복이라고도 할 수 있다). 항원 회복 단계는 가열 및 효소 반응들을 포함한 상이한 수단을 이용하여 포름알데히드에 의하여 교차-연결된 항원들의 회수를 보조한다.
실험실에서 하는 수동 가공은 별론으로 하고, 일상적인 진단에 대한 기법의 중요성 및 필요성으로 인하여 IHC 공정의 자동화를 위한 상업적인 조직 프로세서의 개발이 촉발되었다. 이 기구는 항원 회복으로부터 염색에 이르는 조직편을 가공을 가능하게 하고, 진단 및 예후를 위해 의약 실험실에서 일상적으로 이용된다. 종래 기구는, 공정 시간이 3 시간 내지 24 시간으로 가변적이며, 종래 기구는 일반적으로 다중 슬라이드들을 가공할 수 있다.
오랜 공정 지속시간
기법의 전진보다는 기존 조직 프로세서는 처리량 및 재현성을 특정한 정도까지 향상시키는 수동 공정을 자동화하고 대응시키기만 한다고 할 수 있다. 당면한 문제들 중 하나는 가공 사이클의 오랜 지속시간이다. 일반적으로, 공정들은 하룻밤 동안 수행되며, 처리되고 염색된 조직은 익일 이후에나 획득될 수 있다. 이는 현재 IHC 공정들의 큰 장애인데, 이 때 필요한 기간은 외과적 중재(surgical interventions)가 있는 동안에 분석을 수행할 수 없기 때문이다. 그러나, IHC가 중재술이 있는 동안에 수행될 수 있다면, 외과적 처리 프로토콜은 IHC로부터 나온 결과를 즉시 이용함으로써 미세 조정될 수 있다. 한 가지 매우 중요한 예는 암 진단 및 이의 후속적인 처리 단계들이다. 환자가 암을 진단 받는 경우, 통상적인 절차는 일반적으로 의심이 가는 조직에 대한 조직 생검을 실현하는 것이다. 이후, 이러한 표본들은 암에 대한 의심이 사실인지를 알아보기 위하여 IHC 분석을 거친다. 이에 대한 응답이 사실이면, 이후, 제2 수술이 수행되어 신체로부터 모든 종양을 제거하게 되는데, 이는 중대한 단계로서, 단일의 살아있는 암 세포도 다시 종양으로 성장할 수 있기 때문이다. 불행하게도, 지금까지, 종양이 완전히 없어진 것을 입증한 기법은 제시되지 않았다. 따라서, 가끔, 환자들은 남아 있을 수도 있는 이러한 세포들을 제거하는 추가적인 수술 또는 화학요법을 필요로 할 수 있다. 숫자로 세어본다면, 수술 횟수는 1 회 내지 3회로 가변적인데, 이는 의사의 시간 및 수술실 가용성과 같은 건강 자원들의 현저한 손실뿐만 아니라, 환자들의 위험, 비용 및 염려를 증가시키는 것이다.
수술 중(intra-operative) 이라고 불리는 절차의 공식적인 시간은 20 분 미만이다. 지금까지, IHC에 필요한 시간을 감소시키는 IHC 시스템은 유일하게 하나가 소개되었다. 이 기술은 "파랑(wave)" 메커니즘이라고 불리는 현상에 기초한 것으로, 2 개의 인접한 슬라이드들의 '파랑' 경첩식 운동(hinged motion)을 이용하는데, 이들 중 하나는 조직 슬라이스를 보유한다(PCT/US2006/015020 및 WO/2006/116037). 이 기법은 냉동 고정된 슬라이드들의 염색 기간을 15 분까지 감소시킬 수 있어서, 수술 중이라고 지칭될 수 있다. 반면에, 이 15 분은 고정, 관찰 및 영상화 시간을 포함하지 않으며, 이 시간에서, 어떤 결정에 대해 이러한 시간들이 적어도 약 15 분 이상을 필요로 할 수 있는데, 이는 수술 중 조건을 초과하는 것이다. 그러므로, 염색 프로토콜 지속시간은 전체 IHC 공정을 '수술 중'으로 만들기 위하여 5 분 미만으로 줄여야 한다. 또한, 냉동 고정된 조직들의 가공이 더 쉽다고 하지만, FFPE 조직들은 수많은 이유로 인하여 더 인기가 있다. 우선, 냉동-고정 절차에 있어서, 조직 보존 및 소정기간보존은 필요한 장비로 인하여 비용이 더 많이 드는 것이다. 더 현저하게는, 냉동 고정된 조직들은 FFPE 조직들보다 더 흔하게 가음성(false negatives) 또는 가양성(false positives)을 보인다. 그러므로, FFPE는 더 간편한 반면에, 냉동 고정은 더 신속한 결과들을 제공할 수 있다. "파랑" 메커니즘을 이용한 FFPE 조직편에 대한 보고된 가공 시간은 70 분인데, 이는 종래 자동화된 조직 프로세서의 기간에 근접한 기간이다.
정량 분석에 있어서 제한된 정확도
수술 중 양태는 별론으로 하고, 특정한 검정법을 진행하는 동안에 요구되는 바와 같이, 면역조직화학에 의하여 얻어진 신호의 범위를 이용한 정량적인 생물표지 발현 분석을 필요로 하는 경우들을 다루는 경우, 임의의 기술로 얻어진 결과들의 정확도는 지금까지제한적이다. 종래 기법에 의하면 그러한 반-정량적인 분석이 요구되는 최대 20% 경우까지 모호한 결과들을 낳을 수 있으며, 최종적인 진단 결과는 면역조직화학만을 이용하여서는 달성될 수 없다. 그러므로, 현재 표준에서는 최종 진단 결과를 달성하기 위하여 이러한 경우들이 후속 유전 분석(제자리 혼성화)를 거치게 되는데, 이로 인하여 진단 공정에 상당한 비용 및 시간(며칠 간)을 더하게 된다.
정량적 면역조직화학 분석의 부정확도는 조직 변성, 조직 고정에 있어서 변화, 파라핀 포매 및 열-유도된 에피토프 회복의 예측 불가능한 효과들뿐만 아니라 비특이적인 결합 반응들로 인한 항원 발현 정도에 항상 비례하는 것이 아닌 면역조직화학 신호의 세기에서 기인한다. 종래 IHC는 표면 항원의 생물시약에 대한 균일한 노출 및 결과의 재현성을 달성하는데 30 분 내지 수 시간의 범위의 반응 시간이 요구되는 대규모 수술이다. 이는 제한된 유동성 교환율(exchange rates)뿐만 아니라 오랜 확산 시간, 시약의 제어 및 복용의 정밀도의 부족으로부터 유래한다. 또한, 오랜 검정 및 항체 노출 시간은 항체들의 현저한 흡착 및 비-특이적인 결합으로 이어질 수 있어서, 이로 인한 조직면역화학 신호는 더 이상 조직에 대한 표적 생물표지 농도의 선형 함수가 되지 않는다. 이러한 정성적인 생물표지 발현 수준의 채점은 종종 병리학자의 해석과 경험을 거쳤다.
그러나, 생물표지 발현 수준 및 면역조직화학 신호 사이의 비례성이 확보될 수 있다면, 면역조직화학 신호는 정량적일 것이며, 훨씬 높은 정확도로 음성 및 양성 표본들 사이에서 구별이 이루어질 수 있다.
사실상, 표적 항원과 면역검정법으로부터 얻은 신호 사이의 이러한 비비례성은 진단 면역조직화학이나 일반적으로 면역조직화학에만 특이적인 것은 아니다. 이 문제는 고정화된 표적이 표면 상에 존재하는 모든 배경들(settings)에서 존재하며, 하나 이상의 검출기 시약은 이 표적에 검출기 시약들의 확산 속도에 의하여 제한된 속도로 결합한다. 이는 면역세포화학, DNA 혼성화, RNA 정량화, 압타머(aptamer) 및 올리고머 탐침들을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 여기에 더하여, 입체 장애 메커니즘들도 이 비비례성에 기여할 수 있으며, 최후 정량적 검정법을 약화시킬 수 있다.
기반시설, 장비 및 훈련된 인원 투자에 대한 요구
첨단 자동화된 장비들은 오랜 공정 지속시간 및 제한된 정확도의 내재적인 문제들에 더하여 몇 가지 다른 단점들을 갖고 있다. 현대 상업적 자동화된 IHC는 벤치(bench) 내에 공급되거나 벤치 탑(bench top)에 설치된 부피가 큰 것이다. 그러므로, 이들은 휴대용 및 소형인 것이 아니다. 휴대용인 것이 예를 들면, 수술 중 수술에 대한 요구사항은 아니지만, 이는 실험실 환경 또는 전기가 결여된 원격지에서 접근 가능성을 높일 수 있다.
일반적으로, 저예산의 진료소 및 원격지에 위치한 진료소는 그러한 종류의 진단을 수행할 수 있는 필요한 기반시설, 장비 및 전문적 소양을 갖추고 있지 않다. 사실상, 기반시설 및 장비에 관하여 약 1 백만 CHF 투자 및 훈련된 인원에 대하여 연간 30 만 초과의 CHF를 필요로 하는 소규모 진료소에서 그러한 실험실을 형성하고 유지하는 것은 극도로 비용이 많이 드는 것이다. 그러므로, 면역조직화학을 수행할 수 있는 실험실을 형성하는데 필요한 투자는 이 진단 기술에 대하여 전세계적으로 수많은 환자들이 접근할 수 있는 가능성을 막는 주요 장애들 중 하나이다.
최첨단 장비에 의하여 좌우되는 현재 실험실의 구조로 유발된 한 가지 추가적인 주요 장애는 특히 새로운 생물표지 발견 및 관련된 연구에 대하여 이용하는 경우에 나타나는 특별 주문 제작(customization)의 문제점이다. 기존의 대규모 진단 장비들을 새롭게 발견된 분자들 및 생물표지들을 갖는 용도에 개조시키는 것은 비용이 많이 들기도 하고 시간 소모가 크다. 이는 조사 및 발견에서 요구되는 유연성 및 중앙 진단 실험실에서 요구되는 병렬화(parallelization) 및 처리량의 정도 사이의 모순에서 유래한다. 또한, 중앙 설비들은 그러한 특별 주문 제작에 방해가 되는데, 이는 현재 진단 작업으로 과부하가 걸리거나 그러한 특별 주문 제작은 이후의 재현성에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 따라서, 면역조직화학을 포함하는 연구 과제는 일반적으로 수동적으로 수행된다. 그러나, 재현성에 대한 결과들 및 요구사항을 유효하게 하는데 필요한 수많은 시도들을 생각해 본다면, 그러한 연구들을 수동적으로 완수하는데 필요한 전체 시간은 몇 년에 이를 수 있어, 생물표지 발견의 전체 연구 및 개발 비용에 현저히 영향을 주게 된다.
선행 기술은 (a) IHC를 수행하는 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 장치들, (b) 공정 시간을 줄이는 제시된 자동화된 매크로 IHC 프로세서들, 및 (c) 유사한 미소유체 디자인들을 갖는 다른 응용들을 위해 제작된 랩온어칩 장치들로 구성된 3 개의 상이한 조직편들 하에서 요약될 수 있다. 여기서, 우리는 이를 요약하여 성능 지수(figure of merit)의 면에서 비교를 제공한다.
IHC를 수행하는 랩온어칩 장치들
지금까지, 감소된 확산 시간 및 개선된 유동성 교환 제어로부터 잠재적으로 이득을 볼 수 있는 종래 IHC의 특정 양태들을 호전시키기 위한 IHC에 대한 몇몇 미소유체 접근법들이 존재하였다. 이들 중 일부는 전체 분석 시간을 줄이는 것을 목적으로 하고 있으며, 다른 것들은 더 높은 항체 희석들을 갖는 공간적으로 변위된 위치들에서 상이한 표적의 생물표지들을 검색하기 위한 복수의 평행한 소형 채널들을 이용하여 다양한 IHC를 수행하는 것을 목적으로 하고 있다. 그러나, 이 연구들 중 어느 곳에서도, 미소유체 접근법은 정량적 분석의 정확도의 증가 및 그러한 분석들에 의하여 얻어진 모호한 진단 결과들의 감소로 이어짐이 암시되지 않았다.
우리 그룹은 시간-대-결과를 줄이는 IHC를 위해 가공되는 수많은 랩온어칩 들을 제시하였다. 우리는 조직들을 상대적으로 신속하게 분석할 수 있는 (20분 대 종래 2시간) PDMS에서 제1 세대 LOC를 보였다[V. Fernandez-Moreira 등. Analyst, no: 135, 42-52 페이지, 2010]. 불행하게도, 이 장치는 제한된 분석 속도 및 검출 면적을 보였다. 이 시스템은 고압을 지탱할 수 없어서, 최대 조업 체적 유량이 약 50 nL/s에 이르게 된다. 이 시스템의 번거로운 조립 및 해체(수동 통합)는 분석 시간 및 불용 체적(dead volume)을 현저히 증가시켰다. 또한, 조직 슬라이스의 일부만이 노출될 수 있어서(표면의 10%에 약간 못 미침), TS 검출 면적을 제한하게 된다.
이후, 우리는 면적을 증가시키고 배양 시간을 3.5 분으로 감소시킨, PDMS에서 다시 생성된 제2 세대 장치(A.T. Ciftlik 등, Proc. of 14th Int. Conf. on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (microTAS '10), 699-701 페이지, 2010년 10월)를 실현하였다. 반면에, 이 장치는 정량 분석의 정확도 및 이의 낮은 비용으로 상업화를 크게 약화시키는 수많은 문제점들을 겪었다. 낮은 정확도는 시간 분해 형광의 사용을 필수불가결하게도 하는, 챔버 내에서 일어나는 최후의 확산-제어된 항원-항체 반응로부터 유래한다. 챔버의 단면 구조 및 이에 연결된 미소유체 채널들은 도 1에 도시된 바와 같은 구조를 형성한다. 단면으로 보면, 챔버는 넓고 얕은 직사각형이고, 조직편은 바닥이 넓은 측면을 형성한다. 미소유체 채널들은 높이가 약 50 ㎛인 파이프들이고, 이 채널들은 조직편과 대향하는 것으로 보인 위쪽이 넓은(upper-wide) 측에 가까운 우측 및 좌측 내에서 얕은 모서리들 상의 챔버에 연결되어 있다. 그러한 디자인에서, 유체 흐름이 얕은 측면들 상에서 위쪽이 넓은 모서리들에 가까운 정의된 입구 및 출구들을 이용하여 유도되는 경우, 유체 흐름의 크기는 상면 주위에서만 현저한 반면에, 유체 흐름의 크기는 조직편 주위에서는 훨씬 더 적다. 따라서, IHC 프로토콜 시약들을 조직 표면으로 수송하는 것은 분자들이 상면으로부터의 느린 교차-흐름 확산에 여전히 크게 의존한다. 또한, 이 디자인은 챔버 높이가 미소유체 채널들의 높이보다 항상 더 높을 것을 요구하고, 이 조건은 항체들의 수송에 있어서 확산의 제한적인 역할을 훨씬 더 현저하게 하는 것이다. 이 종래 디자인으로 인해 챔버는 250 ㎛ 미만으로 될 수 없게 되는데50 ㎛ 높이의 챔버와 비교하면, 확산 시간을 25 배로 증가시키게 된다(단락 번호 . 더 현저하게는, 프로토콜 시약들의 조직 표면으로의 느린 확산-제한된 수송으로 인하여 얻어진 신호와 조직 표면 상의 항원 발현도와의 비례성을 약화시켜, 조직면역화학 신호의 성공적인 정량적 평가를 불가능하게 한다.
(단락 번호 0016 및 인용된 문헌들에 기재된 바와 같이) 그러한 확산-제한된 시스템에서 짧은 배양 시간을 이용하는 것은 첨단의 영상화 장비 및 재료들을 이용하는 경우에만 가능하였다. 그러한 오랜 확산 시간으로 인하여, 일차 및 이차 항체들의 작은 일 부분만 프로토콜 내에서 짧은 시약 배양 시간을 이용하는 경우 조직편 표면에 도달할 수 있으며, 시간 분해 형광에 의하여 그러한 낮은 신호들을 검출하는 것만 가능하였다. 시간 분해 형광은 발형광단(fluorophore) 여기와 발광의 기록이 여기 이후에 현저히 오랫동안 발광을 계속할 수 있는 특별한 시간 분해 표지-접합된 항체들(란탄족 원소들)을 이용함으로써 비-중첩 기간에 수행되는 첨단 영상화 기법이다. 여기 및 발광 공정들의 시분할다중화(time multiplexing)는 조직 및 주위 물질로부터 유래하는 자기 형광(auto-fluorescent) 배경 신호를 크게 제거하고, 조직 상에서 아주 소량의 결합된(일차 및 이차) 항체들을 용이하게 검출할 수 있도록 한다. 표준 형광 영상화 장비 및 상업적인 발형광단들을 이용하면, 이 신호를 검출할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 시간 분해 표지들(란탄족 원소들)을 위한 발형광단들 및 현미경 검사 장비는 매우 비싸고 비표준적이며, 접합된 진단 항체들은 상업적으로 이용 가능하지 않다. 그 결과, 시간 분해 현미경법에 필요한 요구사항은 이 장치의 성공적이고 저비용의 상업적인 구현을 막아 버리기 때문에, 발형광단 및 색원체와 같은 표준 염색 시약들을 이용하는 경우 작동할 수 없게 되는 다른 장애를 구성한다.
상기 열거된(단락 번호 0016 내지 0017 및 인용된 문헌) 디자인 관련 문제점들을 별론으로 하고, 구조적 물질로서 PDMS의 사용으로 인한 수많은 단점들도 존재한다. PDMS의 상대적으로 낮은 영률은 채널들을 더 높은 유동성 압력 하에서 실질적인 변형에 감수성이 있도록 한다. 즉, 유동 특징들은 프로토콜에 포함된 가변 압력 및 유량 하에서 변화할 수 있다. 또한, 이 선행 디자인에서, 통합된 조직편 슬라이드의 밀봉은 아래에 있는 입구/출구 미세채널들의 벽들을 형성하는 PDMS를 이용하여 수행된다. 다시, PDMS의 낮은 영률로 인하여, 조직 슬라이드의 더 양호한 밀봉에 요구되는 힘은 이 채널들이 막히게 되고 장치의 운용이 불가능하게 되는 정도까지 이 채널들을 용이하게 변형시킬 수 있다. 채널들의 용이한 변형으로 인한 디자인 수치 및 유량에 있어서 이러한 변화는 얻어진 IHC 신호의 변화를 도입할 수 있게 되고, 진단에 이용되는 경우, 결과들의 재현성을 상당히 약화시킬 수 있다. 또한, PDMS의 열적 성질은 70℃ 초과의 온도 이용을 막으며, PDMS는 IHC 프로토콜들에 포함될 수 있는 자일렌과 같은 많은 시약들과 화학적으로 융합할 수 없다. 이 장치의 다른 단점은 특별 주문 제작으로 인해 진단 장치로서 이 구조의 상업화 문제에서 비용 문제를 구성하게 되는, 비표준 조직편 슬라이드 형상들만을 받아들인다는 것이다.
결론적으로, 단락 번호 0016 내지 0018에 기재된 시스템은 면역조직화학 검정법의 프로토콜 시간을 개선시키지만, 이는 요구되는 재료 및 기반시설의 면에서, 비용이 많이 들고 가장 접근 불가능한 방법인 시간 분해 형광을 이용을 대가로 개선한 것이다. 또한, 검정 시간 최소화는 시약들의 조직 표면으로의 확산-제어된 수송을 제거하지 못하며, 이 시스템을 이용하여 수행될 수 있는 정량적 분석을 수행하는 능력은 종래 배경: 어떠한 조직 생물표지들의 정량화도 가능하지 않다라는 것과 상이하지 않다. 마지막으로 말하지만 결코 무시하지 못할 것으로서, 시스템의 낮은 영률은 시스템을 형성하는 미소유체 구조들에서 가능한 변형들로 인하여 재현성을 아주 약화시킨다.
문헌에 제시된 다른 접근법은 공간적으로 상이한 위치에서 상이한 표지들을 검색하기 위한 다양한 소형 채널들을 갖는 소위 다중화된 미소유체 IHC(MMIHC) 플랫폼(M. S. Kim 등 , Biomaterials, Vol: 32, Iss: 5, 1396-1403 페이지, 2011 and M.S. Kim 등, PLoS ONE, vol: 5(5): e10441 페이지, 2010)이다. 90 분의 반응 시간을 가지기 때문에, 장치는 여전히 자동화된 IHC 프로세서들의 반응 시간들의 시간 범위 내에 있다. 또한, 장치는 TS 면적의 약 1.5%를 염색할 수 있는데, 이는 기법의 일반화에 대한 단점이다. 유방암의 특이적인 경우에 대하여, 저자들은 이 작은 면적에서 조차도, 전체적으로 염색된 TS와 약 85%의 상관관계가 있다는 것을 보였음에도 불구하고, 충분한 상관관계는 달성될 수 없었다. 각각의 상이한 경우에 대하여 이 상관관계 연구를 실현하는 것도 번거로운 작업이다. 반면에, 저자들은 비용이 많이 드는 항체 소비를 감소시키는 중요한 단계인 일차 항체 농도들을 10 배로 감소시킬 수 있다는 것을 보여주고 있다.
공정 시간을 감소시키는 상업적인 자동화된 매크로 IHC 프로세서
이전에 소개된 바와 같이, 낮은 IHC 공정 시간을 갖는 시장에서 유일한 프로세서는 "파랑" 시스템이다(PCT/US2006/015020 및 WO/2006/116037). 이 기술은 "파랑" 메커니즘이라고 불리는 현상에 기초하고, 2 개의 인접한 슬라이드들의 '파랑' 경첩식 운동을 이용하는데, 이들 중 하나는 조직 슬라이스를 보유한다(Celerus Diagnostics). 이는 냉동 고정된 슬라이드들의 염색 기간을 15 분까지 감소시킬 수 있어서, 수술 중이라고 지칭될 수 있다. 반면에, 이 15 분은 고정, 관찰 및 영상화 시간을 포함하지 않으며, 여기서, 어떤 결정에 대해 이러한 시간들이 적어도 약 15 분 이상을 필요로 할 수 있는데, 이는 수술 중 조건을 초과하는 것이다.
유사한 미소유체 디자인들을 갖는 다른 응용들을 위해 제작된 랩온어칩 장치들
고정화된 시편들이 있는 슬라이드들을 받아들이는 수직 구멍 계열 장치들은 문헌에서 찾을 수 있다. Mcneely 등(PCT/US2002/07113 및 WO/2002/072264)은 DNA 마이크로어레이 가공을 위해 제작된 그러한 장치를 소개하였다. IHC에 요구되는 바와 같은 광면적 챔버라기 보다는 이 DNA 마이크로어레이 가공 장치는 DNA 마이크로어레이의 요소가 존재하는 각각의 소형 반점에 시약들을 전달하는 복수의 수직 구멍들과 미소유체 채널들의 네트워크를 갖는다. "미소유체 탐침"이라고 불리는 유사한 장치도 제시되었고(A. Queval 등, Lab Chip, vol: 10, 326 내지 334 페이지, 2010 및 특허 문헌 PCT/IB2010/052018 및 WO/2010/128483), 여기서, 수직 미소유체 구멍들은 이 탐칩 헤드가 공간적으로 이동될 수 있는 조직 또는 세포 단일층 내에서 특정한 지점들을 염색하는 아주 작은 반점(대각선이 약 100 um) 내에 배열되어 있다. Delamarche 등(PCT/IB2003/005350 및 WO/2004/050246)에 의한 다른 특허에서, 표면 상에서 액체를 흐르게 하기 위한 장치가 소개되었는데, 여기서 수직 구멍들 및 스페이서는 표면 상에 챔버를 형성하는데 이용된다.
유사한 기법들을 이용하여 제작된 추가적인 DNA 혼성화 장치(US/2006/0003440) 및 서열분석 장치(PCT/US2010/047392 및 WO 2011/026136)도 존재하는데, 여기서 이들 장치도 고정화된 DNA를 이용한 미소유체 채널들에 연결된 수직 구멍들로 이루어져 있다. Adey(PCT/US02/24616 및 WO/2003/015922)는 응용에 따라 챔버 높이를 변화시키는 유연한 절곡막(deflecting membrane)을 이용한 DNA 및 RNA 가공용의 저 체적 챔버를 갖는 다른 장치를 기재하고 있다. Kim 등(PCT/US2008/074865 및 WO/2009/029845)도 반원의 입구 구멍 및 삼각형 모양의 출구 구멍이 균일한 분포를 갖는, 광 면적의 미소유체용 장치를 기재하고 있다.
수직 미소유체 구멍을 이용한 연구들 중에서, 고압 저항성(high-pressure resistivity)을 이용하여 매우 짧은 시간에 작동하는 광면적의 균일한 시약 분배 장치는 제시되지 않았다. 상기 장치들 및 연구들 중 어느 곳에서도, 미소유체 접근법은 고정화된 표적들의 정량적 분석의 정확도의 증가 및 그러한 분석들에 의하여 얻어진 모호한 진단 결과들의 감소로 이어짐이 암시되지 않았다. 또한, 일차 항체 배양만이 온칩(on-chip)에서 수행되는 MMIHC의 경우에 반-수동인 랩온어칩 IHC 프로세서들은 TS의 일 부분만 염색시킬 수 있거나 높은 시약 비용들을 갖는다.
본 발명은 청구의 범위에서 정의된 바와 같은 장치 및 프로세서에 관한 것이다.
이는 특히 임상 면역조직화학에서 정확한 생물표지 검출용 미소유체 조직 프로세서(MTP)를 지칭한다. 광면적(256 ㎟) 및 얕은(<100 ㎛) 챔버는 조직 슬라이스를 면역검정 생물시약들에 신속하고도 균일하게 노출시키기 위한 접근 구멍들을 포함하는 유리/실리콘 미소가공(micro-machined) 구조를 갖는 유방암 조직 슬라이스를 보유한 표준 현미경 슬라이드를 클램핑함으로써 형성된다. 얕은 챔버 내에서 작은 수직 확산 길이와 조합된 미소유체 흐름 패턴들은 생물시약 배양 시간을 2 분 정도로 짧게 이용하도록 한다. 이는 표면 표적량과 얻어진 신호 사이의 비례성을 보존함으로써 정확한 정량 분석을 가능하게 하였다.
미소유체 장치 디자인
고정화된 조직편들을 갖는 단순히 표준 현미경 슬라이드들인 조직 슬라이드들(TS)을 미소유체 채널들로 신속하게 조립하는 것은 전체 분석 시간이 중대한 매개변수이기 때문에 매우 중요하다. 신속한 조립에 더하여, 우리는 TS만 변화시킬 필요가 있는 반면에 다른 양태들(미소유체 회로)는 변하지 않은 채로 유지되는 시스템을 고안한다. 도 2는 (a) 유입 및 유출용 조직 챔버의 모서리들을 따라 그리고 (b) 유입용 챔버의 중심 및 유출용 챔버의 모서리들에 위치된 미소유체 접근 구멍들을 갖는 장치의 단면의 제시를 도시한다. 이 장치는 o-링을 이용하여 TS를 미소유체 채널 장치부로 밀봉함으로써 형성된 얇은 챔버에 접근하기 위하여 상단 미소유체층 및 수직 미소유체 접근 구멍들을 이용하여, TS로의 전달을 위한 유체의 안내 및 사전조정용 측면 미소유체 채널들을 갖는다.
챔버가 들로부터 직접 접근되는 이전에 제시된 시스템들(단락 번호 0016 내지 0019 참조)과는 달리, 이 미소유체 채널들은 수직 미소유체 접근 구멍들에 의하여 조직 챔버에 연결된다. 이 배열은 조직 챔버의 형성 및 구조에 상관없이, 상층 미소유체 채널 매개변수들(두께, 구조, 압력 유지 능력 등)의 조정을 가능하게 한다. 조직 챔버의 압력 유지 능력도 검정 시간에 대한 결정요인이기 때문에, TS를 갖는 미소유체 챔버의 밀봉은 매우 중대하다. 여기서, 폴리디메틸실록산(PDMS) 몰딩을 이용한 특별 주문 제작된 o-링에 의하여 밀봉이 이루어졌다. 이 디자인을 이용하면, 적용된 밀봉력은 챔버 두께 및 챔버 자체의 압력 유지 능력에만 영향을 주고, 이 밀봉 메커니즘은 나머지 미소유체 시스템으로부터 기계적으로 분리된다.
또한, 이 디자인에 의해 챔버 높이가 이전 시스템들(단락 번호 0016 내지 0019 참조)보다 훨씬 더 낮아 질 수 있다. 특히, 조직 챔버 높이는 o-링 노치에 대한 o-링 두께 및 TS에 적용된 밀봉력도 선택함으로써 겨우 결정된다. 사실상, 챔버의 두께는 중대한 매개변수인데, 이는 상대적으로 큰 항체 분자들의 느린 확산에 의하여 결정되는 IHC 공정에서 이용된 시약들의 배양 시간에 직접 영향을 주기 때문이다. 장치가 TS와 통합되는 경우, 50 ㎛에서 100 ㎛ 사이의 두께를 갖는 조직 챔버가 형성된다. 마우스 항-인간 IgG 분자들과 같이 흔히 사용되는 항체들에 대하여, 우리는 1 분의 배양 시간은 100 ㎛ 미만의 챔버 높이를 필요로 한다고 계산하였다. 반면에, 챔버 높이를 50 ㎛ 미만으로 감소시키는 것이 가능하지만, 고압의 충진-및-세척(fill-and-wash) 사이클들이 있는 동안에는 잠재적으로 TS로부터 조직의 분리로 이어질 수 있으며, 전체 흐름 지속시간을 증가시킬 수 있다.
그러한 얕은 유동성 챔버들을 형성하는 능력은 주된 수송 메커니즘을 확산으로부터 이류로 변환시키는데 중요하다. 챔버 내에서 시약들의 결정적인 수송 메커니즘을 변환시키는 것은 고정화된 표적들의 비례하는 염색을 약화시키고 정량적 분석들을 부정확하게 하는 확산-제어된 반응들을 방지하는데 중요하다. 최소한의 챔버 높이뿐만 아니라 미소유체 접근 구멍 디자인도 도 2에 도시된 바와 같이 통합된 TS의 표면으로 유체 흐름을 안내함으로써 정확한 정량화에 기여한다. 유체 흐름의 그러한 안내는 시약들의 조직 표면으로의 이류-중재된 수송을 가능하게 하고, 반응-제어된 체제(regime)에서 면역조직화학 반응들이 일어나도록 한다.
장치의 이용 가능한 염색 면적을 100%로 증가시키기 위하여, 16 ㎜ x 16 ㎜ 수치의 큰 챔버를 실현시켜야 한다. 이러한 챔버 내에서 균일한 유체 분포는 단위 시간당 조직의 각 부분으로 동일한 양의 시약을 전달하고 용액들을 세척하는데 매우 중요하다. 따라서, 우리는 챔버 전체에 걸쳐 흐름을 균일하게 하는 분포된 미소유체 채널 네트워크 구조를 채용하였다. 도 3은 상층에서 제작된 분포된 네트워크 채널뿐만 아니라 미소유체 접근 홀 배열의 상면도를 도시한다. 미소유체 접근 구멍들의 배열은 챔버 내에서 시약들의 균일한 분포를 실현시키는 것을 목적으로 한다. 반면에, 분포된 미소유체 채널 네트워크 구조는 조직 챔버 전체에 걸쳐 시약들의 균등한 전달을 확보한다. 원칙적으로, 챔버, 미소유체 채널들 및 이에 따라 구멍 배열을 크기 조정함으로써 챔버 면적을 25 ㎜ x 50 ㎜로 증가시킬 수 있다.
도 4는 50 ㎛ 챔버 높이에 대해 10 ㎕/s 유량용의 분포된 네트워크 채널들을 갖는 조직 챔버 내에서 대류의 유한요소법(FEM) 모사들을 도시한다(COMSOL
Figure pct00001
Multiphysics). 이 모사는 2.5초의 완충액 세척 이후에, 최악의 경우에 있어서 이전 시약의 달성된 농도는 이 최초 농도의 10-12에 불과하다는 것을 제시한다. 따라서, 우리는 10배 정도(order-of-magnitude) 더 높은 세척 및 충진 시간을 필요로 하는 사표면(dead-surface) 위치들이 없음을 예상한다. 분포된 네트워크 채널은 2차원적인 것으로 간주될 만큼 충분히 얇은 조직 챔버와 조합될 때에만, 도 4에서 FEM 모사들로 주어진 바와 같이 효과적으로 작용한다. 이전 작업에서는 유사한 미소유체 채널 네트워크 구조들을 보인 반면에(단락 번호 0016 내지 0019 및 도 1 참조), 이들의 단면 구조는 이류에 의하여 TS 표면으로 직접적으로 시약이 공급되지 못하게 하였다. 즉, 시약들은 조직 표면의 위치에 대향하는 챔버의 상측에 전달되며, 조직 표면으로 시약들의 수송은 완전히 확산에 의하여 지배된다. 이에 반하여, 기계적으로 분리되는 조직 챔버 및 미소유체 접근 구멍들을 통해 챔버에 연결된 미소유체 채널 네트워크를 갖는 본 장치는 모사된 이류 수송의 모든 장점들을 실증한다(단락 번호 0037 내지 0038 및 도 8 참조).
통합된 장치 단면은 도 5에 도시되어 있는데, 여기서 시스템은 용이한 통합을 위한 매크로가공 어댑터(adapter) 및 미소유체이동 및 조직 염색을 위한 미소가공된 칩으로 이루어져 있다. 미소유체 장치는 어댑터부와 영구적으로 통합되는 반면에, TS들만이 분석하는 사이에서 조립되고 해체된다. 이 구성은 표준 상업 유체 어댑터들을 갖는 미소유체 장치에 접근하는데 필요하다. 또한, 외부 배관의 그러한 통합은 200 bar를 초과하는 유압을 활용할 수 있게 한다.
시약들 사이의 교차-오염없이 순차 처리를 수행할 수 있는 시스템은 생의학적 염색 프로토콜을 신뢰할 수 있게 실현하는데 매우 중요하다. 우리의 경우, 3 가지 시약들을 이용한 IHC 검정법들은 각각의 표적에 대하여 필요하다. 이 목적을 위하여, 미소유체 입구선(inlet lane)은 상업적으로 이용 가능한 일 방향 체크 밸브들을 조합할 수 있는 어댑터 구조로 제작되었다. 이러한 체크 밸브들은 TS가 조립 및 해체되는 동안에 외부 유체 시스템을 차단하는데 있어서 뿐만 아니라 교차-오염을 방지하는데 있어서 필수적이다. 조업 도중에, 필요한 시약의 주사기에는 압력이 가해져, 해당 체크 밸브를 개방하고 조직 챔버 내에서 유체를 방출하는 반면에, 다른 주사기들은 가압되지 않은 상태로 유지되어, 조직 챔버로부터 밀봉된다. 그러한 통합도 처리량을 개선시키는데, 이는 우리가 각각의 교체에 있어서 외부 미소유체 시스템의 큰 불용 체적을 충진하는 것을 방지하기 때문이다. 반면에, 소형화된 체크 밸브들의 장치로의 통합이 이루어지면, 불용 체적 및 유동 시간은 더 감소될 수 있다.
미소제작
본 발명에 있어서, 더 높은 정밀도 및 파열 압력을 달성하기 위해, 도 6에 도시된 바와 같이 미소유체 트렌치들의 다단계 심도 반응성 이온 에칭(DRIE) 및 파릴렌-C로 코팅된 파이렉스(Pyrex) 웨이퍼와의 후속적인 결합에 의하여 미소유체 장치들이 제작된다. 1) 2.5 ㎛의 습윤 산화물을 갖는 4인치 실리콘 웨이퍼가 시작으로 취해졌다. 2) 이후, 5 ㎛ AZ9260 포토레지스트가 회전되고, DNC 마스크로 노출되었으며, 현상되어 채널들을 형성하였다. 아래에 있는 산화물은 RIE(Alcatel 601E)로 에칭되었다. 3) 레지스트는 박리되고, 5 ㎛ AZ9260 포토레지스트(MicroChemicals GmbH, 독일) 및 챔버 마스크를 이용하여 추가적인 리소그래피 단계가 실현되었다. 리소그래피 이후에, 정면은 두 단계로 DRIE(Alcatel 601E) 에칭된다. 이는 상이한 높이에 채널들과 챔버들을 형성하는 것이었다. 우선, 챔버는 100 ㎛ 깊이로 에칭되고, 레지스트는 박리되었다. 4) 레지스트 박리 이후에, 채널들은 제1 단계에서 패턴된 하드 마스크를 통해 에칭되었다. 에칭 깊이는 디자인에 따라 50 ㎛에서 200 ㎛ 사이에서 가변되었다. 5) 이후, 이 웨이퍼는 낮은 응력의 파릴렌-C 결합 절차에 의하여 2 ㎛ 파릴렌-코팅된 파이렉스 웨이퍼에 결합된다. 양극 접합(anodic bonding)도 이 단계에서 이용될 수 있지만, 이는 더 높은 응력과 균열들을 유도할 수 있다는 점에 유의하라. 6) 결합 이후에, 8 ㎛ 두께의 AZ9260 레지스트를 갖는 슬라이드 측으로부터 결합된 적층(bonded stack)에 추가적인 리소그래피 단계가 적용되었다. 이후에, 챔버에 도달될 때까지 DRIE의 단계가 1회 더 수행되는데, 이는 o-링 부착용 노치들을 생성하기 위해서 이용되기도 하였다. 최종적으로, 레지스트는 박리된다. 웨이퍼를 주사위꼴로 자름으로써 제작이 완료된다. 도 7(a)는 제작 및 주사위꼴 절단 이후에 장치의 상층 내에의 미소유체 채널들을 도시한다. 도 7(b)는 장치의 바닥측에 위치한, o-링이 설치되어 있는 노치와 함께 미소유체 접근 구멍들을 도시한다.
본 발명에서 사용된 물질들 및 미소제작 기법은 PDMS의 사용으로 인한 종래 단점들을 제거해 준다. Si 및 SiO2는 PDMS보다 훨씬 더 높은 영률을 갖는데, 이로 인해 미소유체 채널들을 더 높은 유압(fluidic pressures) 하에서의 변형에 저항하고, 최대 16 MPa의 유압을 가할 수 있다(A.T. Ciftlik 등. Lab Chip, vol: 12, 396 내지 400 페이지). PDMS-제작된 시스템들이 비교되는 경우, 이 시스템들은 약 0.7 MPa의 압력에 한정된다(M. A. Eddings 등. J. Micromech. Microeng., 18, 067001 페이지). 그러므로, 우리의 디자인에서, 흐름 특성들은 IHC 프로토콜에 포함될 수 있는 훨씬 더 높은 압력 및 유량 하에서도 안정적일 것이다. 또한, 상기 설명된 사용된 물질들의 높은 강성 및 기계적인 분리로 인하여(단락 번호 0028 참조), 조직 슬라이드의 더욱 양호한 밀봉에 요구되는 힘은 어떠한 제약도 가하지 않으며, 미소유체 채널들은 변하지 않은 상태로 유지된다. 그러므로, 채널들의 변형으로 인한 디자인-치수 및 유량의 변화는 무시할 만하다. 따라서, 정밀한 프로토콜 적용이 가능한데, 진단을 위해 이용되는 경우, 이러한 정밀도는 재현성을 보장한다. 또한, 본 장치는 최대 200℃까지 작동할 수 있으며, IHC 프로토콜들에 포함될 수 있는 시약들과의 화학적인 상용성의 면에서, 훨씬 더 강한 것이다. 또한, 어떠한 특별 주문 제작도 필요로 하지 않는 표준적인 조직편 슬라이드 형상을 받아들이며, 진단 장치로서 이 구조의 상업화는 임상 실무에서 이용되는 표준들을 이용하여 수월해진다. 도 7(c)는 표준 TS의 통합된 시스템으로의 통합을 도시하고, 도 7(d)는 형성된 조직 챔버를 갖는 통합된 시스템을 도시한다.
장치 성능 및 임상 결과
농도 반응 시간 및 균일성 특징화
개방된 소스 이미지 J 소프트웨어를 이용하여 획득된 이미지들로부터 조직 챔버의 세기 프로파일들을 분석함으로써 농도는 특징화되었다. 분석을 위하여, 초당 5개 프레임들을 갖는 비디오들이 회색 스케일로 변환된다. 우선, 최대 농도 세기(MxCl)는 40 μL/s의 유량으로 오랜 시간 동안(수 백분) 챔버 전체에 걸친 평균 세기를 계산함으로써 실험적으로 찾게 되었다. 마찬가지로, 최소 농도 세기(MnCl)는 PBS 완충용액을 흘린 이후에 실험적으로 찾게 되었다. 이 두 수치들은 실험들에서 기록된 세기를 정규화하는데 이용되며, 정규화된 수치들은 0 내지 1에 이르는 시약 농도 C로서 이용된다. 이후, 우리는 16 초의 주기 및 50% 듀티 사이클을 갖지만, 180°의 위상 변이를 갖는 사각 파형(square waveform)의 형태로 적용된 시약 및 완충용액 양쪽 모두를 적용하였다. 얻어진 비디오들로부터, 평균적인 거동뿐만 아니라 조직 챔버의 상이한 영역들에서 농도 변화들의 반응 시간이 연구되었다. 생성된 반응 시간 곡선들은 우리 장치의 가능한 시간 성능을 평가하는데 이용된다. 그러므로, 우리는 C 및 1-C의 로그 플롯들에서 직선 피팅을 이용하였다. 이 피팅들은 주어진 충진/세척 순도에 대하여 필요한 세척 및 충진 시간들을 계산하기 위한 지표인 초당 10 회(dec/s)로 환산한 충진 및 세척 성능을 제공한다. 반면에, 조직 챔버 전반에 걸친 농도 균일성은 완전한 충진 및 세척의 순간에 조직 염색 면적의 픽셀 히스토그램의 표준 편차를 카메라 픽셀 깊이로 나눔으로써 계산되었다.
반응 시간 및 균일성 측정들의 플롯들이 도 8에 주어져 있다. 도 8(c)는 표시된 바와 같이, 챔버의 입구, 중간 및 출구 주위에 위치된 상이한 조직 챔버 영역들의 농도 반응을 도시한다. 입구 및 출구 사이에 농도 반응에서 명백한 지체가 있는 반면에, 총 시약 적용 시간은 동일하다. 이는 결과들의 재현성를 위해 매우 중대한 것인데, 이는 조직의 특정한 영역들을 항체들 및 염색에 오랫동안 또는 단기로 노출시키면 가성 표적 발현 수준으로 이어질 수 있기 때문이다. 우리는 챔버 전체에 걸친 평균 세기가 챔버의 중간에서의 측정들에 매우 근접하다는 것도 관찰하였다. 따라서, 조직 슬라이스의 특정한 부분을 광학적으로 고배율로 확대시키는 것이 요구되는 상황들에 대하여, 챔버의 중간을 이용할 수 있는데, 이는 나머지는 어떻게든 모니터링될 수 없기 때문이다. 전체 조직 챔버를 평균함으로써 계산된 C 및 1-C의 로그 플롯들은 도 8(a) 및 8(b)에 주어져 있는데, 여기서 최선의 선 핏팅 기울기들의 평균이 세척 및 충진 사이클들에 대하여 도시되어 있다. -0.40 dec/s의 충진 성능이 관찰되는데, 이는 주사기 내부에서 시약 농도의 99%를 달성하는데 5 s의 충진이 요구된다는 것을 의미한다. 마찬가지로, 세척 성능은 -0.32 dec/s였는데, 이는 농도를 초기치의 1%의 미만으로 감소시키는데 7 s의 완충액이면 충분하였다는 것을 나타낸다. 우리는 이 둘간의 차이가 충진 사이클에 유리하지만, 세척을 약화시키는, 분자들의 확산에 기인한 것으로 생각한다. 도 8(d)는 5 s의 충진 이후에 챔버 전체에 걸친 2% 농도 비균일성을 보여주는 충진된 상태에 있는 챔버의 픽셀 히스토그램을 도시한다.
암 조직에 대한 생물표지들의 비례성 검출을 위한 배양 시간의 최적화
미소유체 챔버의 시간 반응을 입증한 후에, 우리는 인간 유방암 조직들에 대한 진단적인 생물표지들의 분석에 눈을 돌렸다. 이전의 분석에 기초하여, 양성인 경우들에 있어서 재현성 있게 높은 신호-대-배경(SBR) 비율로 형광 이미지들을 생성하는 최적 배양 시간뿐만 아니라 순차적인 프로토콜이 개발될 필요가 있다. 이 최적화 연구에서, 우리는 동일한 종양적출 표본으로부터 인접하게 절단된 강력한 발현을 하는 7 개의 HER2/neu 양성 조직 슬라이스들을 배양 조건들을 수립하기 위해 일차 및 이차 항체들의 상이한 배양 시간들(t inc ) 동안 이용하였으며, 배양 시간이 얻어진 신호에 미치는 영향을 평가하기 위하여 n= -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4 로 배양의 2 n 분(minutes)을 취하여 배양 시간이 15 초에서 16 분까지 대수적으로 가변되었다. 이는 충진 후에 중심으로부터 조직 슬라이스 표면에 이르는 1 분의 확산 지속시간을 제시하는 장치 디자인과 연계된 것이며, 상기 배양 시간들의 셋팅은 이론적 수치 주위에서 대수적으로 분포된 경우들을 구성한다.
도 9는 프로토콜 시간의 최적화를 도시한다. (a) 일차 및 이차 항체들의 상이한 배양 시간들(tinc) 동안에 동일한 종양적출 표본으로부터 인접하게 절단된 HER2/neu 양성 조직 슬라이스들에 대하여 얻은 형광 세기. (b) (a)의 신호 및 배경 수치들의 비율을 취함으로서 얻은 배양 시간에 대한 신호-대-배경 비율(SBR). SBR의 주요 부분은 배양의 최초 2 분 동안 직선적으로 전개되는데, 이는 면역반응들이 이 시간 척도상에서 동적인 체제에 있다는 것을 암시하는 것이다. (c) 추가적인 배양 시간당 SBR의 변화율. 이 비율은 tinc = 2 분일 때 최대이며, 조직 슬라이스들이 더 긴 배양 시간을 거치게 되는 경우, 감소하기 시작한다. (d) 표적 항원을 발현하는 동일한 조직 슬라이스에 관하여 상이한 영역들에 대해 계산된 신호 수치 수준에서 변동 계수(CV)의 연구. 약 2%의 변동 계수(CV)를 갖는 재현성 있는 신호 균일성은 2 분과 8 분 사이의 배양 시간들(tinc) 동안에 관찰된다.
조직 제조 및 항원 회복 이후에 표 1에 나타난 프로토콜들은 조직 슬라이슬에 적용되는데, 여기서 시약 충진 및 완충액 세척 시간들은 각각 5 초 및 7 초로 선택되었다. MTP에 대하여 적용된 프로토콜을 따른 이후 현미경 슬라이드들은 인출되고, 커버 글래스로 덮이며, 주사 형광 현미경을 이용하여 이미지 획득(image acquisition)이 수행되었다. 이후, 이 이미지들은 암 세포들의 세포막에 위치된 HER2/neu-발현 구역들에 해당하는 이미지 픽셀들에 대한 형광 세기를 이용함으로써 신호 수치들을 획득하는데 이용된다. 마찬가지로, 배경 수치들은 픽셀들의 나머지에 대하여 형광 세기를 평균함으로써 획득된다(도 9(a)). n = -2인 프로토콜에서도 신호는 검출 가능하고, 우리는 HER2/neu 경우에 대하여 배양 시간을 64 배 증가시킨 경우 SBR은 1.2 내지 1.90으로만 개선된다는 것을 알 수 있는 도 9(c)에서 도시된 바와 같이 각각의 배양 시간에 대하여 계산된 SBR의 플롯. SBR의 주요 부분은 배양의 최초 2분 동안 직선적으로 전개되는데, 이는 면역반응들이 이 시간 척도상에서 동적인 체제에 있음(반응 제어됨)과 이후 확산에 의하여 제어되고 있음을 암시하는 것이다. 우리는 표적 항원을 발현하는 동일한 조직 슬라이스에 관하여 상이한 영역들에 대해 계산된 신호 수치 수준에서 변동 계수(CV)도 연구하였다. 재현성있는 신호 균일성이 관찰되며, 비록 시간에 따라 감소하더라도, CV는 n = 1 이후에 안정된다(도 9(d)).
우리는 우리의 임상적 연구에서 사용하기 위한 최종 프로토콜로서 n = 1 (2분의 배양 시간)을 갖는 프로토콜을 선택하였다. 주된 이유는 n ≤ 1에 대하여, 면역반응들은 동적인 체제에 있는 것으로 간주되어서, 이 시간 척도에서 배양하게 되면 조직 슬라이스들 상에 발현된 항원의 양에 선형적으로 비례하는 형광 신호들이 생성될 것이기 때문이다. 다음으로, SBR 증가율은 n = 1일 때까지 최대이고, 조직 슬라이스들이 더 오랜 배양 시간들을 거치게 되는 경우 감소하기 시작하므로, 배양 시간당 SBR은 n = 1이 이용된 경우 최대로 유지된다.(도 9(c)). 우리는 n=1을 갖는 프로토콜이 최적이라고 결론지을 수 있는데, 이는 이 프로토콜이 면역반응들이 신호 수준에서 최대 SBR 이득(gain) 및 최소 달성 가능한 CV가 있는 동적 체제에 있는 것이기 때문이다. 이는 곧 바로 전체 프로토콜 시간이 41/2 분이라는 것이다.
이전 IHC 기법들과의 정량적인 기술적 성능 비교를 하기 위하여, 우리는 시약 체적당 염색된 면적, 분석 시간 및 시약 비용으로 정의된 성능 지수를 설계하였다. 표 4는 종래 기법들에 대하여 시간에 있어서 거의 100-배 개선 및 1000-배 전체 개선을 나타내는 결과들을 표로 작성한 것이다.
표적당 소비된 전체 시간을 감소시키려는 시도로, 우리는 다중화 프로토콜의 개연성에 의문도 제기하였다. 일차 항체들 및 이차 항체들의 혼합물들은 IHC 검정법에서 표적당 전체 시간을 차례로 감소시키는 1개 초과의 수용체를 표적하는데 이용된다. 표 2는 우리의 유방암 조직 슬라이스들에 적용되는 그러한 프로토콜의 계시(timing)을 보여준다. 동일한 전체 시간을 가지는 반면에, 표적당 시간은 비-다중화 프로토콜의 절반으로 감소되었다. 도 10은 우리의 시스템을 이용한 면역조직화학을 이용하여 유방암 생물표지인 인간 상피 성장 인자 수용체(HER2/neu) 및 에스트로겐 수용체(ER)의 예시적인 다중화 형광 검출을 도시한다. 미소유체 조직 프로세서를 이용한 면역조직화학을 이용하여 유방암 생물표지인 인간 상피 성장 인자 수용체(HER2/neu) 및 에스트로겐 수용체(ER)의 다중화 형광 검출. 검출은 2 분(n = 1)의 배양 시간을 가지며 각각의 항원들에 대하여 표적된 일차 및 이차 항체들의 혼합물을 이용하는 최적화된 프로토콜을 이용하여 수행되었다. (a) 청색 채널은 DAPI와 접합된 핵 대비염색제를 나타내며, 세포들의 핵을 영상화하는데 도움이 된다. (b) HER2/neu은 단일클론 토끼 항-인간 일차 항체로 검출되었고, 여기서 적색 채널 내에 표시된 Alexa-Fluor 594 라벨링된 염소-항-토끼 다중클론 IgG 이차 항체로 영상화되었다. (c) 에스트로겐 수용체(ER)은 단일클론 마우스 항-인간 일차 항체(Clone 6F11)로 검출되었고, 여기서 녹색 채널로 표시된 Alexa-Fluor 647 접합된 염소 항-마우스 다중클론 IgG 이차 항체로 영상화되었다. (d) 3 개 채널들을 함께 도시한다. 이미지들의 폭은 600 ㎛에 해당하고, 주사 형광 현미경을 이용하여 6 x 6으로 합쳐진 고 해상도 이미지들로 획득되었다.
임상적 연구
실제 세계 배경에서 개발된 MTP 시스템을 시험하기 위하여, 우리는 병리학의 학회 기록보관소로부터 회수한 76 개의 침윤성 관상 유방 암종 한 세트에 대하여 일련의 면역조직학 반응들을 수행하였다. MTP에 대한 HER2/neu 면역조직화학에 대한 최적의 실험 조건들이 수립된 이후에, 2 분(n=1)의 일차 및 이차 항체들에 대한 배양 시간으로 우리는 우리의 프로토콜을 76 개의 침윤성 관상 유방 암종들에 적용하였다. 종래 IHC 및 MTP-IHC 사이의 진단 결과들의 비교는 도 11에 도시되어 있다. MTP-IHC는 종래 IHC와 비교되는 경우 90% 미만의 모호한 결과들을 배출하고, ISH 증폭 결과들을 정확하게 예측한다. 삽입된 표는 연구된 76 개 건들에 대한 종래 IHC 및 MTP IHC 점수들의 교차-상관관계를 보여주고 있다. MTP-IHC 기법을 이용하는 경우, 우리는 점수(0) 및 (+) 건들 및 점수(+++) 건들 각각에 대한 단일 가양성 또는 가음성 결과를 생성하지 않았다. 더욱 중요하게는, 점수(++)의 모호한 경우들의 개수는 27 개 건들에서 3 개 건들로 현저히 감소되었다(거의 90% 감소). 고전적인 IHC에 의하여 진단된 점수(++)의 모호한 건들 중 24 개 건들은 MTP IHC에 의하여 (0)/+ 또는 (+++)로 점수가 매겨졌으며, 이 24 개 건들 중 각각에서, 할당은 유전자 증폭 상황에 해당하는 것이었다. 최초에 (+++) 건으로 진단되었던 1 개 건은 (++) 점수로 재할당되었다. 그러므로, 최후의 진단성 HER2/neu 결과는 표시된 MTP-IHC가 종래 IHC 대신에 이용되는 경우 훨씬 더 정확하게 예측된다.
사용의 대안적이고 확장된 면적들
본 발명의 유동 조업은 압력 구동 흐름의 생성에만 제한되지 않는다. 본 장치의 진보성(동적인 체제에서 프로토콜 반응들을 유지하는 배양 시간의 동시적인 감소로서, 얻어진 판독 신호 및 표적 항원량 사이에서 입증된 비례성으로 이어지고, 신속하고도 균일한 유체들의 교환으로 인한 높은 균일성)도 유체 흐름이 전기역학적 흐름 또는 열적으로 유도된 흐름을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 다른 가동 메커니즘들에 의하여 유도되는 경우 적용된다. 예를 들면, 전기역학적 또는 열적으로 유도된 흐름을 이용하는 다른 발명들이 존재한다(WO/2011/102801 및 EP 1 974 814), 그러나, 이 문헌들에 있어서, 진보성은 흐름 그 자체를 유도하는 특이적인 전극들의 특정 배열들(또는 디자인들, 형상들 등)에 존재한다. 그러므로, 그러한 이전의 청구의 범위는 상기 미소채널들 및 상기 조직 챔버 내부로 유체 흐름을 유도하는 다른 기법들과 조합되는 경우, 본 발명의 사용을 제한할 수 없다.
마찬가지로, 본 장치의 진보성은 통합된 (금속 또는 중합체) 전극들 및 센서들에 한정되지 않지만, 바람직하게는 이들에 의해 수행되고/되거나 예열된 요소에 접촉시켜 수행되는 온도 제어 시스템이 본 발명에서 기재된 미소유체 장치 및 통합된 시스템 내에서 조합되는 경우에도 적용된다. 예를 들면, 미소유체 시스템에서 통합된 및/또는 첨가된 온도 제어 시스템들(US/2005/009101)을 이용하는 다른 발명들이 존재하지만, 이 문헌들에서, 진보성은 온도 제어 시스템을 구성하는 가열 및 센싱 요소들의 특정한 특징들, 디자인 및/또는 형상에 존재한다. 그러므로, 그러한 이전의 청구의 범위는 상기 미소채널들 및 상기 조직 챔버 내부에서 온도 제어를 실현하는 기법과 조합되는 경우, 본 발명의 사용을 제한하지 않는다.
온도 제어를 필요로 하는 예시적인 응용은 포르말린-고정된 파라핀 포매(FFPE) 조직편들의 직접적인 가공이다. FFPE 조직편들의 가공은 파라핀 왁스 제거(탈랍), 탈수 및 항원 회복 단계들이 온칩에서 수행될 것을 요구한다. 사실상, 이는 미소-가열기들(전극들)이 장치 상에 제작될 수 있다면 가능한데, 이는 항원 회복 절차가 일반적으로 약 95℃에서 조직들의 가열을 필요로 하기 때문이다. 우리는 염색 프로토콜에 대하여 요구되는 알려진 시간에 기초하여 이 온칩 표본 가공을 실현하는데 요구되는 시간을 추정할 수 있다. 표 3은 온칩 탈랍 및 항원 회복 프로토콜을 요약한 것으로, 이는 그러한 가공은 5 분의 추가적인 기간에서 실현 가능할 수 있다는 것을 암시한다. 그러므로, 염색에 요구되는 2.5분과 함께, 장치는 FFPE 조직편들의 완전한 가공을 7.5분 만에 실현하는 잠재력을 갖는 반면에, 지금까지 보고된 가장 빠른 완전한 가공은 70 분의 프로토콜 시간을 갖는 "파랑" 메커니즘이다(PCT/US2006/015020 및 WO/2006/116037).
마찬가지로, 본 장치의 진보성은 챔버 내에서 고정화된 실재들의 영상화를 위한 영상화 시스템(실리콘 마이크로전자 기술을 이용하여 제작될 수 있는 광 검출기들 또는 원천들, 또는 광 검출기들의 어레이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 이를 포함함)이 본 발명에서 기재된 미소유체 장치 및 통합된 시스템과 조합되는 경우에도 적용된다. 예를 들면, 미소유체의 맥락에서 그러한 영상화 시스템들(WO/2010/148252)을 이용하는 다른 발명들이 존재하지만, 이 문헌들에서, 진보성은 영상화 시스템들을 구성하는 이러한 요소들 및/또는 구조들의 특정한 특징들, 디자인 및/또는 형상에 있다. 그러므로, 그러한 이전의 청구의 범위는 미소채널들 및 조직 챔버 내부에서 영상화 시스템을 통합하는 기법과 조합된 본 발명의 사용을 제한하지 않는다.
마찬가지로, 본 장치의 진보성은 광학적 성분들(광 검출기들 및 원천들 또는 이러한 광 검출기들 및 원천들의 어레이 정면에 위치된 렌즈들, 대물 렌즈들, 마이크로렌즈 어레이들, 편광 및/또는 형광 광학 필터들에 한정되지 않지만, 바람직하게는 이를 포함함)이 본 발명에 기재된 미소유체 장치 및 통합된 시스템과 조합되는 경우에도 적용된다. 예를 들면, 미소유체의 맥락에서 그러한 광학 요소들(WO/2010/148252)을 이용하는 많은 다른 발명들이 존재하지만, 이 문헌들에서, 진보성은 광학 시스템들을 구성하는 이러한 요소들 및/또는 구조들의 특정한 특징들, 디자인 및/또는 형상에 있다. 그러므로, 그러한 이전의 청구의 범위는 미소채널들 및 조직 챔버 내부에서 광학 요소들을 통합하는 기법과 조합된 본 발명의 사용을 제한하지 않는다.
본 발명에 기재된 장치는 종래 면역조직화학과 비교하는 경우, (유전자 증폭에 의하여 확인된 바와 같이) 진단적인 결과의 면에서, 훨씬 개선된 변별력이 있는 암 생물표지들의 면역조직화학적 검출에 유용한 것으로 증명되었다 (도 11). 이는 현저한 단축된 배양 시간으로 설명되는데, 초기 최초 배양 시간 분들을 좌우하는 비례성으로부터 이득을 보도록 하며, 여기서 항체들은 항체 및 항원의 농도의 직접 함수로서 일정한 결합 속도로 항원들에 높은 비례적 방식으로 결합하게 된다. 그러므로, 본 발명의 응용은 IHC에 한정되지 않으며, 고체 지지체 상에 고정화된 표적들의 정도에 선형적으로 비례하는 반응을 달성하기 위하여 비례적인 동역학적 체제에서의 작업으로 조정될 수 있는 임의의 표면 반응에 대해 이용될 수 있다.
본 발명에 기재된 장치는 챔버 외연(도 3)의 주위에 수직 접근 구멍들 및 분포된 미소유체 채널 네트워크의 정보화된(intelligent) 건축적 배열 및 고압을 이용하여 조직 슬라이스들(도 2 내지 8) 위에 가로놓여 있는 대형(16 ㎜ x 16 ㎜)이지만 매우 얕은(100 um 미만) 배양 챔버의 적은 체적 내에서 신속하고, 완전하며 균일한 생물시약 교환을 확보하게 된다. 이러한 방식으로, 획득된 대류 흐름으로 인한 조직 슬라이스들 상에서 생물시약들의 세척-및-충진 기간은 5 내지 7초의 최소값에서 유지되는 반면에, 실제 배양 기간 동안에는 어떠한 흐름 조건도 확보되지 않는다. 또한, 우리는 배양 시간의 함수로서 SBR 비율의 증가는 초기 반응-제한된 선형 체제(도 9(c)) 동안에 더 현저한 것을 관찰하였는데, 이는 본 장치에서 짧은 배양 시간은 일반적으로 검출 항체 농도들을 항상 증가시키는 것은 아니더라도 충분히 강한 판독 신호들을 달성하는데 충분하다는 것을 시사하고 있다.
FFPE 조직들로부터 10분의 완전한 가공 시간은 또한 단독의 소형화되고 자동화된 진단 IHC 시스템의 사용뿐만 아니라 기법의 수술 중 활용의 시간 스케일과도 잘 들어 맞는다. 조직 표본들 상에서 불용 체적들을 감소시키고, 시스템 압력을 증가시키며 균일한 시약 및 완충액 흐름들을 실현하게 되면 검정 시간을 감소하는데 도움이 되었는데, 이는 수술하는 동안에 즉각적인 피드백으로 간주되기에 충분히 짧은 것이다. 표준 유리 슬라이들 상에 고정화된 조직 슬라이스들은 미소유체 구조에 기계적으로 클램핑되며 1 분 내에 교체될 수 있는데, 이는 TS를 변화시키는데 요구되는 유일한 조립 단계이다. 성능 지수 비교(표 4)로 인하여 본 발명은 기존 기법들과 비교하여 1000-배 개선을 보여줄 수 있는 것으로 밝혀졌다.
제시된 기술은 소형화된 현미경의 통합에 의하여 단독의 완전한 면역조직화학적 진단 해법으로 용이하게 전환될 수 있다. 그러므로, 진단은 추가적인 기반시설, 훈련된 요원없이 실질적으로 아무런 정비없이 수행될 수 있다.
그러나, 본 발명은 앞에서 토의된 예들에 한정되지 않는다.
[인용참고문헌]
Vanesa Fernandez-Moreira, Bo Song, Venkataragavalu Sivagnanam, Anne-Sophie Chauvin, Caroline D. B. Vandevyver, Martin Gijs, Ilkka Hemmila, Hans-Anton Lehr, and Jean-Claude G. Buenzli.　Bioconjugated lanthanide luminescent helicates as multilabels for lab-on-a-chip detection of cancer biomarkers. Analyst, number　135, pages　42-52, 2010.B
Ata Tuna Ciftlik, Bo Song, Caroline Vandevyver, Jean-Claude Buenzli, Hans-Anton Lehr, and Martinus Gijs. Fast immunohistochemical biomarker detection device for cancer tissue slices. Proceedings of 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, Groningen, Netherlands, October 3-7, 2010, 2010.
Minseok S. Kim, Seyong Kwon, Taemin Kim, Eun Sook Lee, Je-Kyun Park. Quantitative proteomic profiling of breast cancers using a multiplexed microfluidic platform for immunohistochemistry and immunocytochemistry, Biomaterials, Volume 32, Issue 5, February 2011, Pages 1396-1403
Kim MS, Kim T, Kong S-Y, Kwon S, Bae CY, et al. Breast cancer diagnosis using a microfluidic multiplexed immunohistochemistry platform. PLoS ONE 5(5): e10441. doi:10.1371/journal.pone.0010441, 2010
Page Erickson, Michael Everman, Michael Bell, Kevin Edberg, Matthew Botke. Enhanced fluidic method and apparatus for automated rapid immunohistochemistry. PCT/US2006/015020, WO/2006/116037, 2011
Micheal Mcneely, Nis Adey, Mark Spute, Edward Ayliffe, et. al., Method and system for microfluidic interfacing to array. PCT/US02/07113, WO/2002/072264, 2002
Arthur Queval, Nageswara R. Ghattamaneni, Cecile M. Perrault, Raminder Gill, Maryam Mirzaei, R. Anne McKinney and David Juncker. Chamber and microfluidic probe for microperfusion of organotypic brain slices. Lab Chip, 2010, 10, 326-334
Emmanuel Delamarche, Ute Dreschsler, and Robert Lovchik. Multilayer microfluidic probe head and method of fabrication thereof. PCT/IB2010/052018, WO/2010/128483, 2010
Emmanuel Delamarche, David Juncker, Bruno Michel, and Heinz Schmid. Method and device for flowing a liquid on a surface. PCT/IB2003/005350, WO/2004/050246, 2004
Lamprecht Waltraud, Mathes Anton, Wenczel Gyoergy, and Streit Wolfgang. Device and process unit for providing a hybridization chamber. US/2006/0003440, 2006
Jon Hoshizaki, Joon Mo Yang, Maryam Shariati, David Cox, Kirk Hirano et. al., Low-volume sequencing system and method of use. PCT/US2010/047392, WO 2011/026136, 2011
Nils Adey. Laminated microarray interface device. PCT/US02/24616, WO/2003/015922, 2003.
Gibum Kim, Todd Schwoerer. Microfluidic apparatus for wide area microfluidics. PCT/US2008/074865, WO/2009/029845, 2009
Ata Tuna Ciftlik and Martin A.M. Gijs, Parylene to silicon nitride bonding for post-integration of high pressure microfluidics to CMOS devices,　Lab on a Chip, 2012, 12 (2), 396 - 400. doi:10.1039/c1lc20727j.
Mark A Eddings, Michael A Johnson　and Bruce K Gale, Determining the optimal PDMS?DMS bonding technique for microfluidic devices, Journal of Micromechanics and Microengineering, 2008, 18, 067001.
Nathaniel Robinson and Per Erlandsson, An electrokinetic fluidic system, WO/2011/102801, 2011.
Koninklijke Philips Electronics NV, A microfluidic device based up on active matrix principles, EP1974814, 2008
Gary Blackburn, Microfluidic devices comprising biochannels, US/2005/009101, 2005.
Jody Vykoukal, Daynene M. Vykoukal, Gregory P. Stone, Eckhard U. Alt, method and apparatus for quantitative microimaging , WO/2010/148252, 2010.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

Claims (11)

  1. 생물학적 및 화학적 표본 가공 장치에 있어서,
    a. 고정화된 실체들, 생물학적 표본들 또는 분자들과 같은 분리 가능한 슬라이드 함유 표본들에 의하여 형성된 적어도 하나의 벽을 갖는 고압-저항성의 얕고 넓은 면적 를 포함하고
    b. 상기 챔버에 유체를 주입하고 상기 챔버로부터 나온 유체를 수거하기 위한 미소유체 접근 구멍들의 배열을 포함하고,
    c. 상기 챔버의 외부에 형성되는 입구 포트들 및 미소유체 채널들과 인터페이스로 연결되고,
    d. 상기 슬라이드가 상기 장치와 접촉하여 상기 챔버를 형성할 수 있도록 구성되며,
    e. 유동 물질들 및 시약들을 상기 챔버 내로 신속하게, 바람직하게는 15 초 미만 내에, 그리고 미소유체 접근 구멍들의 상기 배열로 인해 규칙적이거나 균일한 방식으로 전달하고 수송하도록 개조된 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    챔버 내부에 유체 흐름을 발생시키기 위한, 즉, 입구들 및 출구들 사이에서 압력 차이를 유도하는 압력 구동 흐름 발생 수단을 포함하는 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미소유체 챔버, 상기 미소유체 채널들 및 상기 미소유체 접근 구멍들의 임의의 두 개 이상의 지점들 사이에서 전위 차이를 적용함으로써 상기 챔버 내부에서 유체 흐름을 발생시키기 위한 전기역학적 흐름 발생 수단을 포함하는 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    즉, 상기 미소유체 챔버, 상기 미소유체 채널들 및 상기 미소유체 접근 구멍들의 임의의 두 개 이상의 지점들 사이에서 온도 차이를 발생시켜 유동성 흐름을 유도함으로써 상기 챔버 내부에서 유체 흐름을 발생시키기 위한 열적으로 유도된 흐름 발생 수단을 포함하는 장치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 챔버, 상기 미소유체 채널들 및 상기 미소유체 접근 구멍들 내에 국한된 유체의 온도를 조절 및 제어하는 가열 요소 및 온도 센서를 포함하는 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    밝은장(bright field) 또는 형광 검출을 위한 유리 슬라이드 상에 고정화된 실재들의 디지털 영상화를 위한 실리콘 마이크로전자 기술로 제작된 광 검출기들 및 원천들 또는 광 검출기들 및 원천들의 어레이를 포함하는 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    광 검출기들 및 원천들 또는 이러한 광 검출기들 및 원천들의 어레이의 정면에 위치된 마이크로렌즈 어레이들, 편광 및/또는 형광 광 필터들을 포함하는 장치.
  8. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 정의된 상기 장치를 이용하여 수행되는 생물학적 및 화학적 표본 가공의 방법에 있어서,
    a. 하나 이상의 측면에 실체들을 갖는 상기 슬라이드들을 수동으로 또는 자동으로 획득하는 단계,
    b. 상기 슬라이드들을 상기 미소유체 장치에 수동으로 또는 자동으로 통합함으로써 상기 형성된 챔버를 설립하는 단계,
    c. 상기 슬라이드들 상의 상기 실재들을 소정의 기간 동안 그리고 소정의 온도에서 적절한 유체 또는 반응성 물질들에 순차적으로 거치게 하는 단계,
    d. 상기 슬라이드들 상의 상기 실재들을 검출의 표시를 위해 소정의 기간 동안 그리고 소정의 온도에서 적절한 유체 또는 반응성 물질들에 순차적으로 거치게 하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    a. 전체 조직화학적 검출을 10 분 미만으로 제공하는 단계,
    b. 조직화학적 검출을 5 분 미만으로 제공하는 단계,
    c. 조직화학적 검출을 2.5 분 미만으로 제공하는 단계,
    d. 세포화학적 검출을 10 분 미만으로 제공하는 단계,
    e. 세포화학적 검출을 5 분 미만으로 제공하는 단계,
    f. 세포화학적 검출을 2.5 분 미만으로 제공하는 단계,
    g. 2 분 미만으로 제공하는 단계,
    h. 파라핀 용해 또는 에칭 공정을 2 분 미만으로 제공하는 단계,
    i. 항원 회복 공정을 5 분 미만으로 제공하는 단계,
    j. 에피토프 회복 공정을 5 분 미만으로 제공하는 단계,
    k. 열 유도된 항원 회복 공정을 5 분 미만으로 제공하는 단계, 및
    l. 열 유도된 에피토프 회복 공정을 5 분 미만으로 제공하는 단계 중 어느 하나를 포함하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    비특이적인 표시, 가양성 및 모호한 결과들을 감소시키도록 상대적으로 짧은 가공 및 유체 교환 시간에 의하여 특징되는 방법.
  11. 상기 슬라이드의 표면 상의 실체들을 소정의 기간 동안에 적절한 유체 또는 반응성 물질 또는 임의의 순서의 적절한 유체 반응성 물질들에 거치게 하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에서 정의된 장치의 용도로서,
    i. 조직화학적 공정
    ii. 세포화학적 공정
    iii. 면역조직화학적 공정
    iv. 면역세포화학적 공정
    v. 면역조직형광 공정
    vi. 면역세포형광 공정
    vii. 제자리 혼성화 공정
    viii. 형광 제자리 혼성화 공정
    ix. 항원 회복 공정
    x. 에피토프 회복 공정
    xi. 열 유도된 항원 회복 공정
    xii. 열 유도된 에피토프 회복 공정
    xiii. 파라핀 용해 또는 에칭 공정, 및
    xiv. 염색 공정의 조작들 중 적어도 하나를 포함하는 용도.
KR1020147025769A 2012-02-27 2013-02-15 분리 가능한 슬라이드를 갖는 표본 가공 장치 KR102079307B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH00256/12 2012-02-27
CH2562012 2012-02-27
PCT/IB2013/051245 WO2013128322A1 (en) 2012-02-27 2013-02-15 Sample processing device with detachable slide

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140129181A true KR20140129181A (ko) 2014-11-06
KR102079307B1 KR102079307B1 (ko) 2020-02-19

Family

ID=48289520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147025769A KR102079307B1 (ko) 2012-02-27 2013-02-15 분리 가능한 슬라이드를 갖는 표본 가공 장치

Country Status (14)

Country Link
US (1) US10436683B2 (ko)
EP (1) EP2819783B1 (ko)
JP (1) JP6318094B2 (ko)
KR (1) KR102079307B1 (ko)
CN (1) CN104284725B (ko)
AU (1) AU2013227390B2 (ko)
CA (1) CA2902127C (ko)
DK (1) DK2819783T3 (ko)
ES (1) ES2704989T3 (ko)
HU (1) HUE042751T2 (ko)
PL (1) PL2819783T3 (ko)
SG (1) SG11201405196VA (ko)
TR (1) TR201900296T4 (ko)
WO (1) WO2013128322A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2017010593A (es) * 2015-02-26 2018-05-07 Fraunhofer Ges Forschung Aparato y método para procesar una señal de audio para obtener una señal de audio procesada usando una envolvente en el dominio del tiempo objetivo.
WO2016168429A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Method and apparatus for extracting and collecting single cells from formalin-fixed paraffin embedded tissues
EP3286298A1 (en) * 2015-04-22 2018-02-28 Berkeley Lights, Inc. Culturing station for microfluidic device
ES2799705T3 (es) * 2016-02-08 2020-12-21 Lunaphore Tech Sa Procedimientos de multiplexación cíclica de muestras y obtención de imágenes in situ
EP3222351A1 (en) 2016-03-23 2017-09-27 Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) Microfluidic network device
EP3427829A1 (en) * 2017-07-12 2019-01-16 Lunaphore Technologies SA Methods of in situ antigen retrieval of a biological sample & imaging thereof
WO2019046613A1 (en) * 2017-08-30 2019-03-07 Microbedx, Inc. DEVICE FOR OPTIMIZING THE GROWTH OF MICROORGANISMS IN LIQUID CULTURE
US10706535B2 (en) * 2017-09-08 2020-07-07 International Business Machines Corporation Tissue staining quality determination
EP3459632A1 (en) * 2017-09-26 2019-03-27 Lunaphore Technologies SA Microfluidic cartrige with built-in sampling device
CN111215159A (zh) * 2018-11-26 2020-06-02 南京怡天生物科技有限公司 微流控芯片及基于该芯片融合样本的方法
EP3798640A1 (en) * 2019-09-27 2021-03-31 Lunaphore Technologies SA Biological sample processing system and microfluidic cartridge therefor

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030094280A (ko) * 2001-03-09 2003-12-11 바이오마이크로 시스템즈, 인크. 어레이에 대한 마이크로유체 인터페이스 방법 및인터페이스용 시스템
US20040101870A1 (en) * 2002-11-26 2004-05-27 Caubet Bruno S. Microvolume biochemical reaction chamber
JP2010266453A (ja) * 2002-12-19 2010-11-25 Bayer Healthcare Llc 被検物をマイクロ流体デバイスの多チャネルに分割する方法及び装置

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5188963A (en) * 1989-11-17 1993-02-23 Gene Tec Corporation Device for processing biological specimens for analysis of nucleic acids
CA2074214C (en) * 1991-07-23 2000-02-22 Will Bloch Improvements in the in situ pcr
WO1996039813A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Flinders Technologies Pty. Ltd. Dry solid medium for storage and analysis of genetic material
WO2002061387A2 (en) * 2000-10-25 2002-08-08 Exiqon A/S Open substrate platforms suitable for analysis of biomolecules
US20050009101A1 (en) 2001-05-17 2005-01-13 Motorola, Inc. Microfluidic devices comprising biochannels
EP1260265B1 (de) 2001-05-25 2005-02-02 Tecan Trading AG System mit Verfahrenseinheit zum Hybridisieren von Nukleinsäureproben, Proteinen und Gewebeschnitten
WO2003015922A1 (en) 2001-08-20 2003-02-27 Biomicro Systems, Inc. Laminated microarray interface device
US20050239195A1 (en) * 2002-06-13 2005-10-27 Millenium Biologix Ag Reaction chamber
TWI245739B (en) 2002-12-05 2005-12-21 Ibm Method and device for flowing a liquid on a surface
DE10316723A1 (de) * 2003-04-09 2004-11-18 Siemens Ag Probenplatte zum Einbau in eine Gehäusestruktur
CA2559778C (en) * 2004-03-26 2011-07-05 Infectio Recherche Inc. Removable microfluidic flow cell
ATE497837T1 (de) * 2004-04-09 2011-02-15 Vivebio Llc Vorrichtungen und verfahren für abnahme, lagerung und transport von biologischen proben
EP1877788A2 (en) 2005-04-21 2008-01-16 Celerus Diagnostics, Inc. Parallel processing fluidic method and apparatus for automated rapid immunohistochemistry
US20070054293A1 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 California Institute Of Technology Microfluidic chaotic mixing systems and methods
US20100190265A1 (en) * 2005-12-02 2010-07-29 Technical University Of Denmark Fluidics device for assay
EP1974814A1 (en) 2007-03-23 2008-10-01 Koninklijke Philips Electronics N.V. A micro-fluidic device based upon active matrix principles
WO2009029845A1 (en) 2007-08-29 2009-03-05 Plexera Bioscience Llc Microfluidic apparatus for wide area microarrays
TR200806315A2 (tr) 2008-08-22 2010-03-22 Külah Haluk MEMS teknolojisi ile üretilmiş, eşmerkezli elektrot ve spiral mikroakışkan kanallı diyelektroforetik mikro hücre kromatografisi aygıtı
CN102203581B (zh) * 2008-10-10 2013-10-23 西泰克公司 用于制备细胞试样的微流体装置及方法
EP2429697B1 (en) 2009-05-07 2018-10-17 International Business Machines Corporation Multilayer microfluidic probe head
WO2010148252A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Jody Vykoukal Method and apparatus for quantitative microimaging
WO2011021984A1 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Haluk Kulah A microfluidic-channel embeddable, laterally oscillating gravimetric sensor device fabricated with micro-electro-mechanical systems (mems) technology
WO2011026102A1 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Life Technologies Corporation Methods of bead manipulation and forming bead arrays
SE534488C2 (sv) 2010-02-22 2011-09-06 Lunavation Ab Ett system för elektrokinetisk flödesteknik

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030094280A (ko) * 2001-03-09 2003-12-11 바이오마이크로 시스템즈, 인크. 어레이에 대한 마이크로유체 인터페이스 방법 및인터페이스용 시스템
US20040101870A1 (en) * 2002-11-26 2004-05-27 Caubet Bruno S. Microvolume biochemical reaction chamber
JP2010266453A (ja) * 2002-12-19 2010-11-25 Bayer Healthcare Llc 被検物をマイクロ流体デバイスの多チャネルに分割する方法及び装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Wang et al.,"A self-powered, one-step chip for rapid, quantitative and multiplexed detection of proteins from pinpricks of whole blood.", Lab Chip. 2010 Nov 21, 10(22), 3157-3162. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015517088A (ja) 2015-06-18
EP2819783A1 (en) 2015-01-07
AU2013227390B2 (en) 2016-04-14
ES2704989T3 (es) 2019-03-21
US20150005190A1 (en) 2015-01-01
CA2902127C (en) 2021-08-10
DK2819783T3 (en) 2019-01-28
PL2819783T3 (pl) 2019-07-31
KR102079307B1 (ko) 2020-02-19
CA2902127A1 (en) 2013-09-06
AU2013227390A1 (en) 2014-09-11
JP6318094B2 (ja) 2018-05-09
WO2013128322A1 (en) 2013-09-06
EP2819783B1 (en) 2018-10-10
HUE042751T2 (hu) 2019-07-29
TR201900296T4 (tr) 2019-02-21
SG11201405196VA (en) 2014-09-26
CN104284725A (zh) 2015-01-14
CN104284725B (zh) 2017-04-26
US10436683B2 (en) 2019-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102079307B1 (ko) 분리 가능한 슬라이드를 갖는 표본 가공 장치
US10906043B2 (en) Microfluidic based integrated sample analysis system
US20190137494A1 (en) Microfluidic devices for isolating particles
AU2014352822B2 (en) Microfluidic methods and systems for isolating particle clusters
Brooks et al. Macro-to-micro interfacing to microfluidic channels using 3D-printed templates: application to time-resolved secretion sampling of endocrine tissue
CA2622745A1 (en) Systems and methods for enrichment of analytes
US11364502B2 (en) Device and method for high-throughput multiparameter measurements in one or more live and fixed cells
US20230338952A1 (en) System and method for automated single cell processing and analyses
US11759781B2 (en) Integrated fluidic circuit and device for droplet manipulation and methods thereof
Zhou et al. The label-free separation and culture of tumor cells in a microfluidic biochip
WO2013183013A1 (en) Autonomous and programmable sequential flow of solutions in capillary microfluidics
Peng et al. A multichannel microchip containing 16 chambers packed with antibody-functionalized beads for immunofluorescence assay
Stephens et al. Mass-producible microporous silicon membranes for specific leukocyte subset isolation, immunophenotyping, and personalized immunomodulatory drug screening in vitro
Furuberg et al. RNA amplification chip with parallel microchannels and droplet positioning using capillary valves
Deliorman et al. Affinity-based microfluidics combined with atomic force microscopy for isolation and nanomechanical characterization of circulating tumor cells
US20190025163A1 (en) Systems and methods for parallel processing of biological samples
Ma et al. Experimental and theoretical study of hydrodynamic cell lysing of cancer cells in a high-throughput Circular Multi-Channel Microfiltration device
WO2022208506A1 (en) Bio-ferrographic system and methods of use
Jackson et al. Microfluidic platform for detecting circulating leukemic cells: Analysis of minimum residual disease in acute myeloid leukemia as a case example
EP3412764A1 (en) Microfluidic device
Wu et al. An automated microfluidic sample preparation system for laser scanning cytometry
Zhao Sensitive and High-throughput Detection, Separation and Analysis of Circulating Tumor Cells
Aymerich Check for updates Chapter 9 A Guide to the Quantitation of Protein Secretion Dynamics at the Single-Cell Level Nathan Aymerich, Olivia TM Bucheli, Kevin Portmann, Klaus Eyer, and Jean Baudry

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right