KR20140113719A

KR20140113719A - 치료 용도

Info

Publication number: KR20140113719A
Application number: KR1020147022507A
Authority: KR
Inventors: 롱 왕; 홍타오 루
Original assignee: 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2014-09-24
Also published as: EP2804853A4; BR112014017493A2; EP2804853A1; BR112014017493A8; AU2016203679A1; WO2013107336A1; RU2014133544A; US20150080380A1; AU2013211417A1; CA2863022A1; JP2015503598A

Abstract

본 발명은 H3 수용체의 역 효능제인 화합물의 신규한 치료 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다발성 경화증의 치료에 있어서 이들 화합물의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

치료 용도 {THERAPEUTIC USES}

본 발명은 H3 수용체의 역 효능제(inverse agonist)인 화합물의 신규한 치료 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다발성 경화증의 치료에 있어서 이들 화합물의 치료 용도에 관한 것이다.

다발성 경화증 (MS)은 중추신경계에 영향을 주는 만성 염증성 탈수초성(demyelinating) 질환이다. MS에서 근본적인 손상은 변경된 면역계 기능에 의해 야기되는 것으로 생각되는 CNS 내 축삭(axon)의 염증 매개된 탈수초화이다. 탈수초화는 축삭에 대한 영양 지지의 감소, 이온 채널의 재분배, 및 활동 전위 막 전위의 탈안정화를 야기할 수 있다. 축삭은 초기에 적응할 수 있지만, 최종적으로 원위 및 역행 변성이 발생하여 장애의 후속 발생을 야기할 수 있다.

내인성 CNS 복구 메카니즘이 MS 과정 동안 탈수초성 사건을 방지하기 위해 존재한다는 증거가 증가하고 있다. 이러한 재수초화 과정은 핍지교세포 전구체 세포 (OPC)로 언급되는 전구체 세포 집단에 의해 매개된다. 사후 데이터 및 실험 연구는 OPC 분화의 실패를 MS에서 재수초화 실패의 주요 원인으로 제시한다. 따라서, OPC 분화 및 핍지교세포의 보존을 통한 재수초화의 초기 촉진은 MS에서 중요한 표적이다. 탈수초성 사건 후에, OPC는 탈수초화 영역에서 신속하게 동원되고 증폭되어 여기서 핍지교세포의 수초화를 유발한다. 병변이 발달하면서, 현저한 성상세포 증식 (신경교증)이 존재한다. 생존 핍지교세포 또는 전구체 세포로부터 분화한 핍지교세포는 생존 노출(naked) 축삭을 부분적으로 재수초화하여, 소위 음영 플라크(shadow plaque)를 생성할 수 있다. 1차 탈수초화에 반응한 재수초화가 문헌에 잘 보고되어 있고 개체의 하위세트에서 놀라울 정도로 효율적이지만, 이것은 충분히 이해되지 않은 이유로 MS의 과정 동안 종종 실패한다. 그 결과, 충분히 재수초화된 병변은 비교적 드물다. 그 대신에, 많은 병변에서, 재수초화가 완전히 실패하지는 않고, 병변 경계에서 새로 형성된 수초(myelin sheath)의 작은 가장자리로 제한된 상태로 유지됨을 알 것이다. 또한, 많은 병변에서, OPC가 대단히 많은 수로 존재하지만 분화하지는 못함이 밝혀졌고, 이것은 OPC 분화의 향상이 MS에서 재수초화를 위한 실행가능한 표적이라는 가설을 지지한다 (문헌 [Kotter et al. Enhancing remyelination in disease - can we wrap it up? Brain (2011) 134: 1882-1990]).

MS의 초기 단계에서, 염증 공격은 짧은 간격의 급격하게 증가된 질환 활성에 걸쳐 발생한다. 상기 에피소드 다음에 회복 및 완화 기간이 이어진다. 완화 기간 동안, 신경계 병변 내의 국소 팽윤이 해결되고, 면역 세포는 활성이 감소하거나 불활성화되고, 수초-생산 세포는 축삭을 재수초화한다. 신경 신호전달은 개선되고, 염증 및 탈수초화에 의한 장애는 덜 심각해지거나 완전히 사라진다. 질환의 이러한 시기는 재발-완화 MS (RRMS)로 불린다. 그렇지만, 병변이 전부 완전히 치유되는 것은 아니다. 일부는 대체로 면역 세포가 결핍된 탈수초화된 코어 영역을 갖는 "만성" 병변으로 유지된다. 시간이 흐르면서, 상기 병변의 중심에 있는 뉴런은 대부분 죽지만, 염증이 종종 그 가장자리에서 지속된다. 뇌는 일부 뉴런의 상실에 잘 적응할 수 있고, 영구적인 장애가 오랜 세월 동안 발생하지 않을 수 있다. 그러나, 50% 초과의 MS 환자는 결국 2차 진행성 MS (SPMS)로 불리는 진행성 악화의 시기로 들어간다. 이 시기에, 질환은 더 이상 질환 조절 약물(disease-modifying drug)에 반응하지 않고, 환자의 장애는 꾸준히 악화된다. MS의 자연 과정에서 초기로부터 뉴런의 파괴는 MS의 진행성 장애가 결국 뇌의 보상 능력을 압도하는 축적된 뉴런 상실의 결과일 수 있음을 시사한다. 1차 진행성 MS는, 재발은 없지만 일정 시간에 걸쳐 신체적 및 인지 기능의 점진적인 상실이 존재하는 다발성 경화증의 한 종류이다.

다발성 경화증 증상 및 질병의 경로는 사람마다 상이할 수 있지만, 질환의 3가지 형태, 즉 재발-완화 MS, 2차 진행성 MS, 및 1차 진행성 MS가 존재한다.

MS의 치료를 위해 현재 승인된 모든 요법제는 공격의 수를 감소시키는 작용을 한다. 상기 요법제는 면역조절제이고, MS의 과정을 근본적으로 변경하는 작용을 하는 것이 아니라, 확장 장애 상태 척도(Expanded Disability Status Scale) (EDSS)에 의해 측정되는 바와 같이 재발을 감소시키고 질환 진행을 늦추는 중간 정도의 효과를 제공한다. 연구는 현재의 요법이 재발을 약 30-68% 감소시키고, 지속 장애의 상대적인 위험을 경험하는 재발성 MS 환자의 백분율을 30-42%의 범위 내로 감소시킴을 보여준다 (문헌 [Havrdova et al. (2010) Neurology 74: (suppl 3), S3-S7]). 추가로, 1차 신경보호/신경생성 효능을 제공하는 것을 목적으로 하는 I상 임상 개발에 항체, 예컨대 BIIB033 (비오젠 아이덱(Biogen Idec))이 존재하였다. 전임상 데이터는 BIIB033이 축삭 및/또는 수초 손상을 복구하는 작용을 수행할 수 있음을 시사한다 (문헌 [Mi et al. (2007) Nature Medicine 13: 1228-1233]).

히스타민 H3 수용체의 길항제 및 역 효능제는 많은 특허 출원에 개시되어 있다. H3 수용체는 포유동물 중추신경계 (CNS)에서 우세하게 발현되며, 일부 교감신경을 제외하고 말초 조직에서 최소로 발현되는 것으로 확인되었다 (문헌 [Leurs et al. (1998) Trends Pharmacol. Sci. 19: 177-183]). 선택적 효능제 또는 히스타민에 의한 H3 수용체의 활성화는 히스타민작동성 및 콜린작동성 뉴런을 비롯한 다양한 상이한 신경 집단으로부터 신경전달물질 방출을 억제시킨다 (문헌 [Schlicker et al. (1994) Fundam. Clin. Pharmacol. 8: 128-137]). 추가로, 시험관내 및 생체내 연구는 H3 길항제가 인지와 관련된 뇌 영역, 예컨대 대뇌 피질 및 해마에서 신경전달물질 방출을 촉진할 수 있음을 보여주었다 (문헌 [Onodera et al. (1998) In: The Histamine H3 receptor, ed Leurs and Timmerman, pp255-267, Elsevier Science B.V.]). 또한, 문헌의 많은 보고서는 5개의 선택 업무, 대상 인식, 고가 십자형 미로(elevated plus maze), 신규한 업무의 획득 및 수동적 회피를 포함하는 설치류 모델에서 H3 길항제 (예를 들어 티오페라미드, 클로벤프로피트, 시프록시판 및 GT-2331)의 인지 향상 특성을 입증하였다 (문헌 [Giovanni et al. (1999) Behav. Brain Res. 104: 147-155]). 길항제 및 부분적 효능제가 신경계 질환에서 인지 장애의 치료에 사용하기 위해 조사되었다.

본 발명에 이르러 H3 수용체가 분화하는 핍지교세포 상에서 발견되었다. 또한, H3 수용체 역 효능제로서 작용하는 화합물은 핍지교세포 전구체 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명자들은 H3 수용체의 역 효능제가 증가된 핍지교세포 전구체 분화를 통해 재수초화를 향상시킬 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, H3 수용체의 역 효능제는 MS 및 다른 탈수초성 질환의 치료를 위한 신규한 요법으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 제1 측면에서, MS의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공되고, 여기서 치료는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MS에서 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시키는데 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본 발명은 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 투여량의 경구 투여에 의한 인간에서의 MS의 치료에 사용하기 위한 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 경구 투여를 위한 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 투여량으로의 인간에서의 MS의 치료에 사용하기 위한 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 경구 투여를 위한 1일당 약 80 마이크로그램의 투여량으로의 인간에서의 MS의 치료에 사용하기 위한 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 제2 측면에서, 재수초화를 촉진하는데 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공된다.

본 발명의 한 실시양태에서, H3 수용체 역 효능제는 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본 발명의 제3 측면에서, 탈수초성 질환의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공된다.

제4 측면에서, 본 발명은 MS 또는 탈수초성 질환의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 포함하는, 인간에게 경구 투여하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에의 경구 투여에 사용하기 위한 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에의 경구 투여에 사용하기 위한 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에의 경구 투여에 사용하기 위한 1일당 약 80 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

도 1a-1c. OPC 분화 검정에서 H3R 실시예 화합물의 효과.
도 2. OPC 분화 검정에서 성숙 핍지교세포 마커의 발현에 대한, H3R 역 효능제인 실시예 화합물 2의 효과.
도 3a. OPC 분화 검정 (n=2)에서 H3R 역 효능제인 실시예 화합물 1의 효과.
도 3b. OPC 분화 검정 (n=5)에서 실시예 화합물 1의 효과.
도 4a. OPC 분화에 대한 siRNA를 통한 H3R 녹다운(knockdown)의 효과.
도 4b. 통계 분석을 사용할 때 OPC 분화에 대한 siRNA를 통한 H3R 녹다운의 효과.
도 5a. 쿠프리존 모델 (전뇌, 뇌량(corpus callosum), 블랙-골드(Black-gold) II 염색)에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 1의 효과.
도 5b. 쿠프리존 모델 (후뇌, 뇌량, 블랙-골드 II 염색)에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 1의 효과.
도 5c. 쿠프리존 모델 (뇌량, 탈수초화 영역)에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 1의 효과의 통계 분석.
도 5d. 쿠프리존 모델 (뇌량, 평균 강도)에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 1의 효과의 통계 분석.
도 5e. 쿠프리존 모델 (전뇌, 뇌량)에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 2의 효과.
도 5f. 쿠프리존 모델 (전뇌, 피질)에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 2의 효과.
도 6a. 1차 OPC (n=1)에서 cAMP의 세포내 수준에 대한 실시예 화합물 2의 효과.
도 6b. 1차 OPC (n=2)에서 cAMP의 세포내 수준에 대한 실시예 화합물 2의 효과.
도 7. H3R에 대한 기저 GTPγS의 결합에 대한 실시예 화합물 1의 효과.

본 발명의 제1 측면에서, MS의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공되고, 여기서 치료는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MS에서 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시키는데 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MS에서 장애의 진행을 중지시키거나 역전시키는데 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MS에서 장애의 진행을 늦추는데 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물이 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염이다.

또한, MS의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 H3 수용체의 역 효능제인 화합물의 용도가 제공되고, 여기서 치료는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MS에서 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시키는데 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 H3 수용체의 역 효능제인 화합물의 용도가 제공된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염이다.

또한, 환자에게 치료 유효량의 H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물에서의 MS의 치료 방법이 제공되고, 여기서 치료는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다.

본 발명은 인간에게 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 투여량으로 경구 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 MS의 치료 방법을 제공하고, 여기서 치료는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명은 인간에게 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 투여량으로 경구 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 MS의 치료 방법을 제공하고, 여기서 치료는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간에게 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1일당 약 80 마이크로그램의 투여량으로 경구 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 MS의 치료 방법을 제공하고, 여기서 치료는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다.

본 발명의 한 실시양태에서, 치료는 핍지교세포 전구체 세포의 분화를 촉진함으로써 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킨다.

본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸, 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 화합물은 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘, (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 3-(1H-이미다졸-4-일)프로필 4-클로로벤질카르바미미드티오에이트 디히드로브로마이드, 또는 이들의 제약상 허용되는 염이다.

또한, 재수초화를 촉진하기 위한 의약의 제조에 있어서 H3 수용체의 역 효능제인 화합물의 용도가 제공된다.

또한, 치료 유효량의 H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 재수초화의 촉진을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물에서 재수초화를 촉진하는 방법이 제공된다.

또한, 탈수초성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 H3 수용체의 역 효능제인 화합물의 용도가 제공된다.

또한, 치료 유효량의 H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 탈수초성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물에서 탈수초성 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

제4 측면에서, 본 발명은 H3 수용체의 역 효능제인 화합물 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 인간에게 경구 투여하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에게 경구 투여로 사용하기 위한 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에게 경구 투여로 사용하기 위한 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에게 경구 투여로 사용하기 위한 1일당 약 80 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

제5 측면에서, 본 발명은 MS의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 제공한다. 한 실시양태에서, H3 수용체 역 효능제는 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 실시양태에서, H3 수용체 역 효능제는 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

또한, MS의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 H3 수용체의 역 효능제인 화합물의 용도가 제공된다. 한 실시양태에서, H3 수용체 역 효능제는 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 실시양태에서, H3 수용체 역 효능제는 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

또한, 환자에게 치료 유효량의 H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물에서 MS를 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, H3 수용체 역 효능제는 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 실시양태에서, H3 수용체 역 효능제는 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, H3 수용체의 역 효능제는 H3 수용체를 불활성 입체형태로 안정화시키는 화합물이다. 상기 안정화는 수용체의 G 단백질에 대한 자발적인 커플링을 감소시켜 구성적 활성을 억제한다. 구성적 활성이 존재하지 않으면, 역 효능제는 길항제로서 거동하고, 따라서 종래의 많은 문헌은 화합물을 H3 길항제 및/또는 역 효능제로서 설명하였다. H3 수용체의 역 효능작용 및 그의 검정은 문헌에 보고되었다 (문헌 [Constitutive Activity of Histamine H3 Receptors Stably Expressed in SK-N-MC Cells: Display of Agonism and Inverse Agonism by H3 Antagonists, Wieland et al. (2001) JPET 299:908-914]).

H3 수용체의 역 효능제는 또한 H3 수용체에 결합하고 이와 동시에 cAMP의 세포내 수준을 증가시키고 cAMP 경로를 활성화시키는 화합물로서 기능적으로 규정될 수 있다.

다발성 경화증이 있는 개체에서 신경학적 손상의 측정은 다양한 기능적 시스템을 평가하는 척도를 사용함으로써 달성되고; 확장 장애 상태 척도 (EDSS) 또는 다발성 경화증 기능 혼합척도(Multiple Sclerosis Functional Composite) (MSFC)가 가장 널리 사용된다. EDSS 평가는 0 (정상 신경학적 검사) 내지 10.0 (사망)의 범위로 이루어진다. MSFC는 팔 및 손 재주, 보행 속도 및 인지를 측정하는 3개의 성분으로 이루어진다. 상기 척도는 개개의 환자에서 장애 진행을 평가하고 대규모 임상 연구에서 현재 승인된 치료의 영향을 측정하기 위해 사용되었다. 임상 연구 치료 효과는 전체 집단에 대한 평균 변화로서 또는 주어진 기간에 걸쳐 지속된 소정의 변화를 갖는 대상체의 수로서 평가될 수 있다.

현재 승인된 치료는 어느 것도 EDSS 또는 MSFC에 의한 측정시에 장애 진행의 중지 또는 역전, 장애 진행의 유의한 늦춤을 분명히 보이지 않았다. H3 역 효능제는 재수초화를 촉진할 것으로 예상된다. 재수초화는 다음과 같은 2개의 가능한 결과를 보일 것이다: a) 정상 신경 자극 전도 (도약 전도)의 회복, 이에 의한 장애/손상의 잠재적 역전; 및 b) 급성 또는 만성 변성 메카니즘으로부터 축삭의 보호, 이에 의한 축삭 상실 및 그에 따른 장애 진행 방지. 장애는 기능적 척도, 예컨대 EDSS 및 MSFC를 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물이 제공된다.

합성 방법

1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 WO2004/056369에서 언급된 방법 또는 WO2005/123723에서 언급된 방법에 의해 제조될 수 있다.

4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴 및 그의 제약상 허용되는 염은 WO 2005/014571에서 언급된 바와 같이 제조될 수 있다.

3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸은 하기 반응식 1에 따라 제조될 수 있다:

<반응식 1>

본 발명의 화합물의 염은 그의 잠재적인 의약 용도 때문에 바람직하게는 제약상 허용되는 것이다. 적합한 염의 검토를 위해 문헌 [Berge et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19, (1977)]을 참조한다. 대개, 제약상 허용되는 염은 적절한 경우 요구되는 산 또는 염기를 사용함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 생성되는 염은 용액으로부터 침전되고 여과에 의해 회수될 수 있거나 또는 용매의 증발에 의해 회수될 수 있다.

제약상 허용되는 염기 부가 염은 임의로 적합한 용매 내에서 본 발명의 화합물과 적합한 무기 또는 유기 염기 (예를 들어 트리에틸아민, 에탄올아민, 트리에탄올아민, 콜린, 아르기닌, 리신 또는 히스티딘)의 반응에 의해, 대체로 예를 들어 결정화 및 여과에 의해 단리되는 염기 부가 염을 생성함으로써 형성될 수 있다. 제약상 허용되는 염기 염은 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨 및 칼륨의 염, 알칼리 토금속 염, 예컨대 칼슘 및 마그네슘의 염 및 유기 염기와의 염, 예를 들어 1급, 2급 및 3급 아민, 예컨대 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디시클로헥실 아민 및 N-메틸-D-글루카민의 염을 포함한다.

제약상 허용되는 산 부가 염은 임의로 적합한 용매, 예컨대 유기 용매 내에서 본 발명의 화합물과 적합한 무기 또는 유기 산 (예컨대 브로민화수소산, 염산, 황산, 질산, 인산, 숙신산, 말레산, 아세트산, 프로피온산, 푸마르산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 벤조산, 살리실산, 글루탐산, 아스파르트산, p-톨루엔술폰산, 벤젠술폰산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 예컨대 2-나프탈렌술폰산, 또는 헥산산)의 반응에 의해, 대체로 예를 들어 결정화 및 여과에 의해 단리되는 염을 생성함으로써 형성될 수 있다. 본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 산 부가 염은 예를 들어 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 술페이트, 니트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 말레에이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 푸마레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 글루타메이트, 아스파르테이트, p-톨루엔술포네이트, 벤젠술포네이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 나프탈렌술포네이트 (예를 들어 2-나프탈렌술포네이트) 또는 헥사노에이트 염일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.

다른 비-제약상 허용되는 염, 예를 들어 포르메이트, 옥살레이트 또는 트리플루오로아세테이트가 예를 들어 본 발명의 화합물의 단리시에 사용될 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다.

1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논의 제약상 허용되는 염은 WO2004/056369에 기재된 것을 포함한다. 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴의 제약상 허용되는 염은 WO 2005/014571에 기재된 것을 포함한다. 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸의 제약상 허용되는 염, 특히 상기 설명된 산 부가 염은 상기 설명된 바와 같이 제조될 수 있고, 특히 히드로클로라이드 염을 포함한다.

용도

H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 MS에서 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시킬 때 사용될 수 있다. 한 측면에서, H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 정상 신경 자극 전도 (도약 전도)의 회복, 이에 의한 장애/손상의 잠재적 역전에 의해 재수초화를 촉진하는데 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 급성 또는 만성 변성 메카니즘으로부터 축삭을 보호하고 이에 의해 축삭 상실 및 그에 따른 장애 진행을 방지함으로써 재수초화를 촉진하는데 사용될 수 있다.

H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 방사선 단독 증후군(Radiological Isolated Syndrome), 임상 단독 증후군(Clinical Isolated Syndrome), 재발-완화 다발성 경화증, 2차 진행성 다발성 경화증, 1차 진행성 다발성 경화증, 진행성/재발성 다발성 경화증, 시신경 척수염, 및 급성 MS (마르부르크(Marburg) 변형)을 포함하는 다발성 경화증의 치료에 사용될 수 있다. 한 측면에서, H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 재발-완화 다발성 경화증 (RRMS)의 치료에 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 2차 진행성 다발성 경화증 (SPMS)의 치료에 사용될 수 있다.

H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 탈수초화를 유발하는 질환, 예를 들어 급성 산재성 뇌척수염, 시신경염, 비타민 B12 결핍, 뇌교 중심부 수초용해증(Central Pontine myelinolysis), 척수로, 횡단성 척수염, 진행성 다초점성 백질뇌병증 및 백질이영양증의 치료에 사용될 수 있다.

H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 혈관성 치매, 혼합형 치매 및 알츠하이머(Alzheimer)병을 비롯하여 탈수초성 측면을 갖는 치매성 질환의 치료에 사용될 수 있다.

H3 수용체의 역 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염, 특히 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 및 그의 제약상 허용되는 염은 또한 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 급성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 밀러 피셔(Miller Fisher) 증후군, 급성 운동 축삭 신경병증, 급성 운동 감각 축삭 신경병증, 급성 범자율신경계 신경병증, 비커스탭(Bickerstaff) 뇌간 뇌염, 항-MAG 말초 신경병증, 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth) 질환 및 구리 결핍을 포함하는 말초 신경계의 탈수초성 질환의 치료를 위한 잠재적인 용도를 갖는다.

투여량

본 발명의 화합물은 경구 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 인간에게 1일당 약 1 내지 약 1000 마이크로그램, 또는 1일당 약 5 내지 약 500 마이크로그램, 또는 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 투여량으로 투여될 수 있다.

본 발명은 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염의 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 투여량의 경구 투여에 의해 인간에서 MS 또는 탈수초성 질환의 치료에 사용하기 위한, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 한 실시양태에서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염은 인간에서 경구 투여를 위해 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 투여량으로 제공된다. 한 실시양태에서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염은 인간에서 경구 투여를 위해 1일당 약 80 마이크로그램의 투여량으로 제공된다.

제약 조성물

본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 투여 형태로 제제화될 수 있다. 상기 투여 형태 및 부형제는 당업계에 설명되어 있다. 예를 들어, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논은 제약 조성물 내에, WO2004/05369 및 WO2008/104590에 기재된 바와 같은 투여량 수준으로 제제화될 수 있다.

본 발명은 H3 수용체의 역 효능제인 화합물 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, MS 또는 탈수초성 질환의 치료에 사용하기 위한 인간에의 경구 투여용 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에게 경구 투여로 사용하기 위한 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에게 경구 투여로 사용하기 위한 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에게 경구 투여로 사용하기 위한 1일당 약 80 마이크로그램의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

조합물

본 발명에 따라 투여되는 화합물은 다른 치료제, 예를 들어 다발성 경화증의 치료에 유용한 것으로 주장되는 의약과 조합되어 사용될 수 있다. 상기 다른 치료제의 적합한 예는 글라티라머 아세테이트 (코팍손(Copaxone)), β 인터페론-1a (아보넥스(Avonex) 및 레비프(Rebif)), β 인터페론-1b (베타세론(Betaseron)), 핑골리모드 (길레냐(Gilenya)), 및 나탈리주맙 (티사브리(Tysabri))일 수 있다. 다른 적합한 치료제는 BG-12, Peg-아보넥스, 라퀴니모드, 테리플루노미드, 다클리주맙 (제나팍스(Zenapax)), 알렘투주맙 (캄파트(Campath)), BAF312, ONO-4641, 포네시모드, 플레네바, 플로바머, ATX-MS-1467, 트리메스타, V85546, ATL-1102, 오파투무맙, 세쿠키누맙, LY-2127399, 톡사빈, 마노코르트 및 피라테그라스트를 포함한다.

본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 다른 치료제와 조합되어 사용될 때, 화합물은 임의의 편리한 경로에 의해 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명은 따라서 추가의 측면에서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염과 추가의 치료제(들)의 조합물을 제공한다.

상기 언급된 조합물은 제약 제제의 형태로 사용하기 위해 편리하게 제시될 수 있고, 따라서 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 상기 규정된 조합물을 포함하는 제약 제제는 본 발명의 추가의 측면을 이룬다. 상기 조합물의 개별 성분들은 별개의 제약 제제 또는 조합된 제약 제제로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 동일한 질환에 대해 활성을 보이는 제2 치료제와 조합되어 사용될 때, 각각의 화합물의 용량은 화합물이 단독 사용될 때와 상이할 수 있다.

실시예

약어

bFGF 염기성 섬유모세포 성장 인자

BDM 화학적으로 한정된 기초 배지

BSA 소 혈청 알부민

CNS 중추신경계

CPZ 쿠프리존

EDSS 확장 장애 상태 척도

GPCR G 단백질 커플링된 수용체

H3R 히스타민 수용체 3

IOD 통합된 광학 밀도

MAG 수초-결합 당단백질

MBP 수초 염기성 단백질

MS 다발성 경화증

NAc N-아세틸-L-시스테인

OCT 최적 절단 온도 용액

OPC 핍지교세포 전구체 세포

PBS 포스페이트 완충 염수

PDGF 혈소판-유래 성장 인자

PDL 폴리-D-리신

PFA 파라포름알데히드

PO 폴리-오르니틴

RRMS 재발-완화 MS

RT-PCR 폴리머라제 연쇄 반응

SEM 평균의 표준 오차

siRNA 소형 간섭 RNA

SPMS 2차 진행성 MS

설명 1 : 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 카르보니트릴

포름산 (150 mL) 중 벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르브알데히드 (16 g, 107 mmol), 포름산나트륨 (14.50 g, 213 mmol)의 용액에 고체 히드록실아민 히드로클로라이드 (22.22 g, 320 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 2 hr 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 이어서, H₂O (200 mL)를 첨가하고, 혼합물을 DCM (200 mL×3)으로 추출하고, 유기층을 합하여 황산나트륨 상에서 건조하고, 감압 하에 증발시켜 벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르보니트릴을 황색 고체 (15 g, 91%)로서 수득하였다.

설명 2: (Z)- N' - 히드록시벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 카르복스이미드아미드

에탄올 (500 mL) 중 벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르보니트릴 (15 g, 102 mmol), 히드록실아민 히드로클로라이드 (14.17 g, 204 mmol)의 용액에 Na₂CO₃ (54.0 g, 510 mmol)를 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 5 hr 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 DCM (1L×4)으로 세척하고, 여과한 후, 여과물을 합하고 감압 하에 농축하여 (Z)-N'-히드록시 벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르복스이미드아미드를 황색 고체 (15 g, 73.5%)로서 수득하였다. MS(ES⁺) m/z 181.1 (MH⁺).

설명 3: 에틸 2-(1- 벤질피페리딘 -4- 일리덴 )아세테이트

N,N-디메틸포름아미드 (DMF) (400 mL) 중 1-벤질피페리딘-4-온 (30 g, 159 mmol)의 용액에 고체 에틸 2-(트리페닐포스포라닐리덴)아세테이트 (110 g, 317 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃에서 20 hr 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하고, 조 생성물을 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 20:1)에 의해 정제하여 에틸 2-(1-벤질피페리딘-4-일리덴)아세테이트를 황색 오일 (24 g, 55.5%)로서 수득하였다. MS(ES⁺) m/z 259.9 (MH⁺).

설명 4: 에틸 2-(피페리딘-4- 일 )아세테이트

에틸 아세테이트 (300 mL) 중 에틸 2-(1-벤질피페리딘-4-일리덴)아세테이트 (24 g, 93 mmol)의 용액에 Pd/C (3.94 g)를 첨가하였다. 혼합물을 H-큐브 (설정: 55℃, 55 psi)를 사용하여 16 hr 동안 수소화하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하여 에틸 2-(피페리딘-4-일)아세테이트를 무색 오일 (15 g, 90%)로서 수득하였다.

설명 5: 에틸 2-(1- 시클로부틸피페리딘 -4-일)아세테이트

20℃에서 공기 내에서 교반된 디클로로메탄 (DCM) (200 mL) 중 에틸 2-(피페리딘-4-일)아세테이트 (13 g, 76 mmol), 시클로부타논 (6.92 g, 99 mmol)의 용액에 아세트산 (4.35 mL, 76 mmol)을 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5 hr 동안 교반하였다. 이어서, 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (25.7 g, 121 mmol)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 3 hr 동안 교반하였다. 혼합물을 NaOH 용액 (2M, 150 mL)으로 세척하고, 무기층을 DCM (200 mL×3)으로 추출하고, 유기층을 합하여 황산나트륨 상에서 건조하고, 감압 하에 증발시켜 에틸 2-(1-시클로부틸피페리딘-4-일)아세테이트를 무색 오일 (15 g, 79%)로서 수득하였다.

설명 6: 2-(1- 시클로부틸피페리딘 -4-일)아세트산의 제조

에틸 2-(1-시클로부틸피페리딘-4-일)아세테이트 (18 g, 80 mmol) 및 HCl (12M, 150 mL)의 혼합물을 100℃로 가열하고, 반응 혼합물을 100℃에서 5 hr 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 제거하여 2-(1-시클로부틸피페리딘-4-일) 아세트산을 갈색 고체로서 수득하였다 (12 g, 68.5%).

설명 7: (Z)-N-( 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일(히드록시이미노)메틸 )-2-(1- 시클로부틸 -피페리딘-4-일) 아세트아미드

20℃에서 교반된 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) (20 mL) 중 2-(1-시클로부틸피페리딘-4-일)아세트산 (3 g, 15.21 mmol), HATU (8.67 g, 22.81 mmol) 및 DIPEA (7.97 mL, 45.6 mmol)의 용액에 고체 (Z)-N'-히드록시벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르복스이미드아미드 (2.74 g, 15.21 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1 hr 동안 교반하였다. 이어서, H₂O (50 mL)를 첨가하고, 혼합물을 DCM (30 mL×3)으로 추출하고, 유기층을 합하여 황산나트륨 상에서 건조하고, 감압 하에 증발시켜, 조 생성물을 바로 다음 단계를 위해 사용하였다 (3 g, 49.4%). MS(ES⁺) m/z 360.2 (MH⁺).

실시예 1

1-{6-[(3- 시클로부틸 -2,3,4,5-테트라히드로- 1H -3-벤즈아제핀-7- 일)옥시 ]-3-피리디닐}-2-피롤리디논

시클로부타논 (3.77 kg) 및 아세트산 (1.074 kg)의 혼합물을 디클로로메탄 (58 L) 중 1-[6-(2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일옥시)-3-피리디닐]-2-피롤리디논 (WO2005/123723A1, 설명 3) (5.8 kg)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 25-35℃에서 3시간 동안 교반한 후, 10-15℃로 냉각하였다. 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (5.72 kg)를 10분 간격으로 동일한 양으로 4회 첨가하고, 온도를 10-15℃에서 유지하였다. 생성된 혼합물을 25-35℃로 가열하고, TLC에 의해 측정시 반응이 완료될 때까지 3시간 동안 교반하였다.

반응 혼합물을 5-10℃로 냉각하고, pH를 수산화나트륨 수용액 (7.4% w/w)으로 pH 10-11로 조정하고, 30-40분 동안 교반하고, 상을 분리하였다. 수성상을 디클로로메탄 (3×17.5 L)으로 추출하였다. 유기상을 합하여 염화나트륨 수용액 (13% w/w)으로 2회 세척하고, 여과한 후, 여과물을 14.5 L 미만으로 농축하였다. 메탄올 (29 L)을 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 25-30분 동안 가열한 후, 온도를 50℃ 미만으로 유지하면서 14.5 L 미만으로 진공 하에 농축하였다. 메탄올 첨가, 가열 및 농축을 매번 29 L 메탄올을 사용하여 3회 반복하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (58 L)에 용해시키고, 염화나트륨 수용액 (4.8%)으로 3회 세척하고, 여과한 후, 14.5 L 미만으로 농축하였다. 메탄올 (29 L)을 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 25-30분 동안 가열한 후, 온도를 50℃ 미만으로 유지하면서 14.5 L 미만으로 진공 하에 농축하였다. 메탄올 첨가, 가열 및 농축을 반복하고, 증류를 8.7 L 미만까지 계속하였다. 생성된 슬러리를 환류 하에 2-프로판올에 용해시키고, 온도를 60℃ 미만으로 유지하면서 8.7 L 미만으로 진공 하에 증류하였다. 상기 과정을 29 L의 2-프로판올을 사용하여 반복하였다. 잔류물을 환류 하에 20분 동안 2-프로판올 (26 L) 내에서 가열하고, 70-75℃로 냉각하고, 2-프로판올 (17 mL) 중 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 (6 g)의 슬러리를 첨가하였다. 혼합물을 50분에 걸쳐 25-35℃로 냉각한 후, -5-0℃로 냉각하고, 3시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 케이크를 차가운 2-프로판올 (6 L)로 세척하고, 50-60℃에서 진공 하에 건조하여 표제 생성물 (4.74 kg)을 수득하였다.

실시예 2

3-( 벤조 [d][1,3] 디옥솔 -5-일)-5-((1- 시클로부틸피페리딘 -4-일) 메틸 )-1,2,4-옥 사 디아졸

N,N-디메틸포름아미드 (DMF) (30 mL) 중 (Z)-N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일(히드록시이미노)메틸)-2-(1-시클로부틸-피페리딘-4-일)아세트아미드 (5 g, 13.91 mmol)의 용액을 120℃로 가열하고, 반응 혼합물을 120℃에서 24 hr 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하고, 조 생성물을 예비-HPLC로 정제하여 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸을 백색 고체 (1.5 g, 31.6%)로서 수득하였다.

실시예 3

4-(4-((1-이소 프로필피페리딘 -4- 일)옥시 )피페리딘-1- 일 )벤조니트릴 히드로클로라이드

4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴 히드로클로라이드는 WO2005014571에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

비교 실시예 4

4-[3-( 페닐메톡시 )프로필]-1H- 이미다졸 옥살레이트

4-[3-(페닐메톡시)프로필]-1H-이미다졸 옥살레이트는 상업적 공급원 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국)으로부터 구입하였다.

비교 실시예 5

4-[3-(1H- 이미다졸 -4-일)프로필]피페리딘 디히드로브로마이드

4-[3-(1H-이미다졸-4-일)프로필]피페리딘 디히드로브로마이드는 상업적 공급원 (토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience), UK)로부터 구입하였다.

실시예 6

1-(3-(3-(4- 클로로페닐 ) 프로폭시 )프로필)피페리딘

H3R의 역 효능제인 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 (문헌 [Schwartz, (2011) Br. J. Pharmacol. 163:713-721])은 상업적 공급원 (토크리스 바이오사이언스, UK)로부터 구입하였다. 실시예 6은 미국 특허 번호 7169928에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.

실시예 7

(R)-6-(4-(3-(2- 메틸피롤리딘 -1-일) 프로폭시 ) 페닐 ) 피리다진 -3(2H)-온

H3R의 역 효능제인 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온은 문헌 [Hudkins et al., J. Med. Chem. (2011) 54: 4781-4792] 또는 미국 특허 번호 8207168에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.

실시예 8

3-(1H- 이미다졸 -4-일)프로필 4- 클로로벤질카르바미미도티오에이트 디히드로브로마이드

3-(1H-이미다졸-4-일)프로필 4-클로로벤질카르바미미도티오에이트 디히드로브로마이드 (클로벤프로피트로도 알려짐)는 H3R의 역 효능제이다 (문헌 [Moreno-Delgado et al., Neuropharmacology (2006) 51:517-523]). 이것은 상업적 공급원 (토크리스 바이오사이언스, UK)으로부터 구입하였다.

생물학적 검정

실시예 9

핍지교세포 전구체 세포 ( OPC ) 분화 검정

히스타민 수용체 3 (H3R)의 소분자 역 효능제 및 중성 길항제의 OPC 분화에 대한 효과는 다음 검정을 이용하여 결정하였다.

세포 단리

2일령 래트 새끼 전뇌를 절개하여 농축된 OPC를 얻었다. 새끼를 마취하고, 목을 절단하였다. 이어서, 두개골을 미세절개 가위로 절단하고, 피질을 뒤몬트 겸자(Dumont forceps)를 사용하여 얻었다. 뇌막을 미세한 말단부로 제거하였다. 세포 여과기를 통한 피질의 반복된 분쇄 후에, 세포를 20% 소 태아 혈청 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드), 글루타민 (4 mM, 인비트로젠)을 보충한 DMEM으로 이루어진 배양 배지로 재현탁하고, 폴리-D-리신 (PDL, 1h 동안 100 ㎍/ml, 시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스)-코팅된 T75 플라스크 상에 도말하였다. 생성된 배양물에 매주 2회 신선한 배양 배지를 공급하였고, 거의 모든 뉴런은 1주 내에 높은 농도의 혈청 때문에 죽을 것이다. 이어서, 혼합된 신경교 세포를 2주 후에 순수한 OPC를 얻기 위해 일련의 진탕 제거(shake-off) 절차를 적용하였다. 구체적으로 설명하면, 혼합된 신경교 세포를 초기에 1시간 동안 100 rpm에서 진탕하여 소교세포를 제거하고, 20-22시간 동안 37℃에서 200 rpm에서 진탕하여 OPC를 농축하였다. 1200 rpm에서 5 min 동안 원심분리하여 OPC를 수거하고, 화학적으로 한정된 기초 배지 (BDM) 내에 재현탁하였다. BDM은 N2 배지 (100X, 인비트로젠), 글루타민 (4 mM, 인비트로젠), BSA (0.1 mg/ml, 시그마), 히드로코르티손 (20 nM, 시그마), 셀레늄 (30 nM, 시그마) 및 비오틴 (10 nM, 시그마)을 보충한 DMEM으로 이루어졌다. OPC는 폴리-오르니틴 (PO, 1hr 동안 50 ㎍/ml, 시그마)-코팅된 배양 접시 상에 도말하고, 실험 조작 전에 bFGF (10 ng/ml, 인비트로젠) 및 PDGF (10 ng/ml, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주 로키 힐)를 보충한 BDM 내에 유지하였다. OPC는 A2B5+ 염색에 의해 95% 순수한 것으로 판정되었다.

약물 및 시약

이뮤노블롯 및 면역세포화학 실험을 위해 사용된 항체는 토끼 항-수초 염기성 단백질 (MBP, 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카), 마우스 항-수초-결합 당단백질 (MAG, 압캠(abcam), 미국 매사추세츠주 캠브리지)이었다.

OPC 분화 검정

OPC 분화를 개시시키기 위해서, OPC를 먼저 0.05% 트립신/EDTA로 처리하고, 2,000 내지 5,000 세포/웰의 밀도로 PO-코팅된 384-미니 웰 플레이트에 시딩하였다. 각각의 시험 화합물을 검정을 위해 10 mM의 농도로 DMSO에 용해시켰다. 상이한 농도의 화합물 (전체 용량(full dose) 곡선, 0.3 nM-10 μM)을 에코(Echo) 기기 (써모(Thermo), 미국 매사추세츠주 왈탐)를 사용하여 이중으로 OPC 배양물 내에 첨가하였다. OPC를 4일 동안 성숙 핍지교세포로 분화시키기 위해서 N-아세틸-L-시스테인 (30 μM, 시그마)을 보충한 BDM 내에서 배양하였다. BDM은 DMEM (인비트로젠), N2 (100X, 인비트로젠), L-Glu (50X, 인비트로젠), 피루브산나트륨 (100X, 인비트로젠), BSA (0.1%, 시그마), 비오틴 (10 nM, 시그마), 히드로코르티손 (10 nM, 시그마)을 포함한다. 생성된 배양물을 4% 폴리포름알데히드 (시그마)로 고정하고, 샘플을 차단 완충제 (당나귀 혈청 3%, 시그마; 트리톤(Triton) X-100 0.04%, 시그마)로 차단하였다. 이어서, 고정된 세포를 4℃에서 밤새 1차 항체 (항-수초 염기성 단백질, MBP 항체, 차단 완충제 중 600X 희석액)와 함께 인큐베이션하고, PBS로 완전히 세척한 후, 2h 동안 실온에서 알렉사(Alexa) 488-표지된 2차 항체 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 인비트로젠)와 함께 인큐베이션하고, PBS로 완전히 세척하고 다피(Dapi) (1 ㎍/ml, 시그마)로 염색하였다.

데이터 획득 및 분석

전체 플레이트(full-plate) 면역세포화학 염색은 자동 영상 기반 분석 시스템-셀로믹스(Cellomics) (써모)에 의해 판독하고, 각각의 웰에 대한 원 데이터는 다음과 같이 MBP+ 집단의 백분율로서 얻었다: 웰당 8개 필드(field)의 사진을 캡쳐하고, 정량적으로 분석하였고; 웰 데이터는 8개 필드의 평균이다. 시토졸 내의 항-MBP 염색의 강도가 양성 대상의 기준으로서 사용되었다. 양성 대상의 역치는 양성 대조군 웰의 평균 강도를 기초로 하여 설정되었고, 이를 위해 트리아이오도티로닌 (15 nM)이 사용되었다. 이어서, 데이터를 분석하고, 비히클 대조군 웰 수의 변화 배수로서 제시하였다. 그래프는 소프트웨어 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 및 IDBS XL fit5를 사용하여 생성하였다. 곡선 피팅(fitting)은 양성 화합물의 EC50을 유도하기 위해 소프트웨어 XL fit5를 사용하여 수행하였다.

웨스턴 블롯(Western blot)

처리 후에, OPC를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 총 세포 용해물을 RIPA 용해 완충제 (50 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM 오르토바나듐산나트륨, 50 mM 플루오린화나트륨, 0.1% 2-메르캅토에탄올, 1% 트리톤 X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일(cocktail))에서 수거하였다. 용해물을 짧게 초음파처리하고, 웨스턴 분석 전에 -80℃에서 보관하였다. BCA 단백질 검정 시약 (피어스(PIERCE), 써모)을 단백질 농도를 결정하기 위해 사용하였다. 샘플당 15 ㎍의 총 단백질을 분취하고, 2X SDS 완충제 (125 mM 트리스-HCl, 4% SDS, 20% 글리세롤, 100 mM DTT)와 혼합하고, 5 min 동안 비등시키고, 비스-트리스(Bis-Tris) 미니-겔 (인비트로젠)에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 5% 우유/TBS-0.1% 트윈(Tween) 내에서 1 h 동안 실온에서 차단하였다. 이어서, 막을 5% 우유/TBS-0.1% 트윈 내에 희석된 1차 항체의 존재 하에 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 막을 TBS-0.1% 트윈으로 5 min 동안 3회 세척하고, 5% 우유/TBS-0.1% 내에서 1 h 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

트윈은 염소 항-토끼 또는 염소 항-마우스 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 1:5000의 희석액으로 함유한다. HRP 접합된 2차 항체의 검출을 후지(FUJI) 영상화 장비 (후지, 일본 도꾜)를 사용하여 향상된 화학발광 기질 혼합물 (피어스)에 의해 수행하였다.

통계 분석

도 1을 제외한 모든 데이터는 평균±평균의 표준 오차 (SEM)로 제시된다. 도 1의 데이터는 평균±표준 편차 (SD)로서 제시된다. 도 3b의 통계 분석은 적절한 경우 일원(one-way) ANOVA 또는 스튜던트 t 검정(student's t test)을 사용하여 수행하였다. 도 1c의 통계 분석은 스튜던트 t 검정을 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 p<0.05일 경우에 추정되었다.

결과

도 1에 도시된 바와 같이, 다양한 구조 및 프로파일을 갖는 H3R을 표적화하는 실시예 화합물을 일련의 용량 (0.3 nM-10 μM)에서 OPC 분화 검정에서 시험하였다. H3R 역 효능제인 실시예 화합물 2는 OPC 분화를, 도 1a에 제시된 증가된 MBP+ 집단에 의해 입증되는 바와 같이 EC50 = 25 nM에서 용량 의존적 방식으로 촉진하였다. 유사하게, 또 다른 H3R 역 효능제인 실시예 화합물 3도 31 nM의 EC50에서 유사한 촉진 효과를 보였다. 역시 H3R 역 효능제이고 구조적으로 상이한 실시예 화합물 6, 7 및 8을 사용한 처리는 도 1c에 제시된 바와 같이, 각각 14 nM, 250 nM, 48 nM의 EC50에서 핍지교세포 분화에 대한 유사한 촉진 효과를 보였다. 이와 대조적으로, 중성 길항제인 실시예 화합물 4 및 5를 사용한 처리는 모든 농도에서 OPC 분화에 대한 어떠한 효과도 보이지 않았다 (도 1b).

결론

H3R의 중성 길항제는 수용체의 히스타민-의존성 활성만을 억제할 수 있고; 다른 한편으로, 역 효능제는 히스타민-의존성 활성 및 히스타민-비의존성 구성적 활성 둘 모두를 억제할 수 있다. 역 효능제만이 OPC 분화 검정에서 양성 효과를 보였고, 이러한 결과는 H3R의 구성적 활성이 핍지교세포 분화의 조절에서 매우 중요한 역할을 수행함을 입증한다.

결과

실시예 2의 화합물을 도 2에 도시된 바와 같이 웨스턴 블롯을 사용한 추가의 분석을 위해 선택하였다. 일관되게, 웨스턴 블롯은 실시예 화합물 2 처리 후에 핍지교세포의 분화시에 성숙 핍지교세포의 2개의 마커, 즉 수초-결합 당단백질 (MAG) 및 수초 염기성 단백질 (MBP)의 발현 수준의 유의한 증가를 보여주었고, 이것은 실시예 화합물 2의 처리가 보다 많은 OPC의 분화를 유도함을 시사한다 (도 2).

또 다른 H3R 역 효능제인 실시예 화합물 1은 OPC 분화 검정에서 다른 역 효능제와 유사한 프로파일을 보였다. 실시예 화합물 1 처리는 보다 많은 MBP+ 세포 및 성숙 핍지교세포에 대한 2개의 바이오마커인 MAG 및 MBP의 증가된 발현 수준에 의해 제시되는 바와 같이 118±49 nM의 EC50에서 OPC 분화를 촉진하였다 (2개의 실험 (n=2)으로부터의 데이터가 도 3a에 제시된다). 실험을 3회 더 실시하고, 5개의 실험 (n=5)으로부터의 데이터를 통계 분석에 적용하였다. 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 10개 투여군 (비히클 및 9개 활성 투여군) 사이의 차이를 비교하였다. ANOVA의 <0.0001인 p-값은 통계상 유의한 차이를 나타내었다. 5개의 실험으로부터의 데이터를 평균내고, 비히클 대조군 웰에서의 백분율의 변화 배수로서 표현하였다. 처리군 대 비히클, ^*, p<0.05, ^**, p<0.01, ^***, p<0.001. 도 3b에 제시된 바와 같이, 실시예 화합물 1은 보다 많은 MBP-양성 세포 (3 μM에서 대조군의 1.8±0.1배까지)에 제시되는 바와 같이, 시험관내에서 OPC 분화를 159±57 nM의 EC₅₀ 값으로 농도-의존 방식으로 촉진하였다.

결론

웨스턴 블롯의 결과는 정량적 면역세포화학 분석의 결과와 일치하였다. 실시예 화합물 1 및 실시예 화합물 2는 성숙 핍지교세포 마커의 발현 수준을 용량 의존적 방식으로 증가시켰다.

실시예 10

H3R 녹다운 실험

OPC에서 H3R 발현을 녹다운시키기 위해 H3R 특이적 소형 간섭 RNA (siRNA)를 사용하고, 생성된 표현형을 분화 조건에서 조사하였다.

세포 단리

2일령 래트 새끼 전뇌를 절개하여 농축된 OPC를 얻었다. 새끼를 마취하고, 목을 절단하였다. 이어서, 두개골을 미세절개 가위로 절단하고, 피질을 뒤몬트 겸자를 사용하여 얻었다. 뇌막을 미세한 말단부로 제거하였다. 세포 여과기를 통한 피질의 반복된 분쇄 후에, 세포를 20% 소 태아 혈청, 글루타민 (4 mM)을 보충한 DMEM으로 이루어진 배양 배지로 재현탁하고, 폴리-D-리신 (PDL, 1h 동안 100 ㎍/ml)-코팅된 T75 플라스크 상에 도말하였다. 생성된 배양물에 매주 2회 신선한 배양 배지를 공급하였고, 거의 모든 뉴런은 높은 농도의 혈청 때문에 죽을 것이다. 이어서, 혼합된 신경교 세포를 2주 후에 순수한 OPC를 얻기 위해 일련의 진탕 제거 절차를 적용하였다. 구체적으로 설명하면, 혼합된 신경교 세포를 초기에 1시간 동안 100 rpm에서 진탕하여 소교세포를 제거하고, 20-22시간 동안 37℃에서 200 rpm에서 진탕하여 OPC를 농축하였다. 1200 rpm에서 5 min 동안 원심분리하여 OPC를 수거하고, 화학적으로 한정된 기초 배지 (BDM) 내에 재현탁하였다. BDM은 N2 배지 (인비트로젠), 글루타민 (4 mM), BSA (0.1 mg/ml), 히드로코르티손 (20 nM), 셀레늄 (30 nM) 및 비오틴 (10 nM)을 보충한 DMEM으로 이루어졌다. OPC는 폴리-오르니틴 (PO, 1hr 동안 50 ㎍/ml)-코팅된 배양 접시 상에 도말하고, 실험 조작 전에 bFGF (10 ng/ml) 및 PDGF (10 ng/ml)를 보충한 BDM 내에 유지하였다. OPC는 A2B5+ 염색에 의해 95% 순수한 것으로 판정되었다.

OPC 형질감염

OPC를 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 siRNA로 형질감염시켰다: OPC를 0.05% 트립신-EDTA로 소화하고, 100 g 상대원심력에서 15 min 동안 펠릿화하였다. OPC를 DMEM 내에 재현탁하고, 모든 트립신을 세정 제거하기 위해 다시 펠릿화하였다. OPC의 총 2-3×10⁶ 분취액을 100 pmol의 스마트풀(SMARTpool) 래트 Hrh3 (L-093904-01, 다마콘(Dharmacon)) 또는 100 pmol의 si-대조군 비표적화 소형 간섭 RNA (siRNA) 풀(pool) (D-001810-10, 다마콘)을 함유하는 100 ㎕의 아막사(Amaxa) OPC 뉴클레오펙션(nucleofection) 시약 (VPG-1009; 아막사, 론자(Lonza))에 재현탁한 후, O-17 프로그램을 사용하여 아막사 뉴클레오펙션 장치로 전기천공하였다. 형질감염시킨 OPC를 PO-코팅된 6-웰 플레이트에 도말하고, 4일 동안 트리아이오도티로닌 (30 nM) 및 N-아세틸-L-시스테인 (30 μM)을 보충한 BDM에서 배양하였다. 세포를 수거하고, 단백질 샘플을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

시약

이뮤노블롯 실험을 위해 사용된 항체는 토끼 항-수초 염기성 단백질 (MBP, 밀리포어), 마우스 항-수초-결합 당단백질 (MAG, 압캠) 및 토끼 항-H3R (밀리포어)이었다. 모든 siRNA 스마트풀은 다마콘, 써모로부터 구입하였다.

웨스턴 블롯

처리 후에, OPC를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 총 세포 용해물을 RIPA 용해 완충제 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM 오르토바나듐산나트륨, 50 mM 플루오린화나트륨, 0.1% 2-메르캅토에탄올, 1% 트리톤 X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일)에서 수거하였다. 용해물을 짧게 초음파처리하고, 웨스턴 분석 전에 -80℃에서 보관하였다. BCA 단백질 검정 시약 (피어스, 써모)을 단백질 농도를 결정하기 위해 사용하였다. 샘플당 15 g의 총 단백질을 분취하고, 2X SDS 완충제 (125 mM 트리스-HCl, 4% SDS, 20% 글리세롤, 100 mM DTT)와 혼합한 후 5 min 동안 비등시키고, 비스-트리스 미니-겔 (인비트로젠)에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 5% 우유/TBS-0.1% 트윈 내에서 1 h 동안 실온에서 차단하였다. 이어서, 막을 5% 우유/TBS-0.1% 트윈 내에 희석된 1차 항체의 존재 하에 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 막을 TBS-0.1% 트윈으로 5 min 동안 3회 세척하고, 5% 우유/TBS-0.1% 내에서 1 h 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

트윈은 염소 항-토끼 또는 염소 항-마우스 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 1:5000의 희석액으로 함유한다. HRP 접합된 2차 항체의 검출을 후지 영상화 장비 (후지, 일본 도꾜)를 사용하여 향상된 화학발광 기질 혼합물 (피어스)에 의해 수행하였다.

정량적 실시간 RT - PCR

총 RNA는 RNeasy 미니 키트(Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 단리하고, 제1 가닥 cDNA를 제조자의 지시에 따라 센시스크립트(Sensiscript) RT 키트 (퀴아젠)를 사용하여 합성하였다. mRNA 발현은 표준 열순환기 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 조건 하에 SYBR 그린 마스터 믹스(Green Master mix)를 사용하여 실시간 PCR에 의해 결정하였다. 데이터를 수집하고, ABI 프리즘(Prism) 7900 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)으로 정량적으로 분석하였다. PCR 프라이머 쌍의 서열은 다음과 같다: β-액틴 (내부 대조군): 정방향 5'-GCGTCCACCCGCGAGTACAAC-3', 역방향 5'-CGACGACGAGCGCAGCGATA-3'; Hrh3: 정방향 5'-TACTGTGTGCCTCCTCGGTCTT-3' 및 역방향 5'-AGCTCGAGTGACTGACAGGAATC-3'.

통계 분석

모든 데이터는 평균±평균의 표준 오차 (SEM)로 제시된다. 도 4b의 통계 분석은 적절한 경우 일원 ANOVA 또는 스튜던트 t 검정을 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 p<0.05일 경우에 추정되었다.

결과

H3R이 핍지교세포 분화에 참여하는지 확인하기 위해, 특이적 siRNA를 사용하여 H3R 발현을 녹다운시켰다. 도 4a에 제시된 바와 같이, H3R의 녹다운 (정상의 ~40%까지 저하시킴, RT-PCR)은 성숙 핍지교세포의 바이오마커인 수초 염기성 단백질 (MBP) 및 수초-결합 당단백질 (MAG)의 발현 수준을 증가시켰다. 통계 분석을 수행하였고, 도 4b에 제시된 바와 같이, siRNA를 사용한 H3R의 녹다운은 내인성 H3R의 발현을 유의하게 감소시켜, 2개의 성숙 핍지교세포 바이오마커의 발현의 통계상 유의한 증가를 유도하였다: 수초 염기성 단백질 MBP (18 kDa 밴드), si-대조군의 1.7±0.1배 (p<0.01), 18 kDa 밴드와 함께 측정될 때 si-대조군에 비해 1.9±0.1 변화 배수를 보인 MBP의 추가의 밴드 (21, 17 및 14 kDa) (p<0.01); 및 수초-결합 당단백질 MAG, si-대조군의 1.8±0.2배 (n=5) (^**, p<0.01, siHrh3 대 si-대조군).

상기 발견은 H3R이 구성적 활성을 갖는 몇몇의 GPCR 중의 하나로서 핍지교세포 분화를 음성 조절함을 시사하고, 이것은 도 1 내지 3에 제시된 결과와 일치한다.

결론

siRNA에 의한 H3R 발현 수준의 감소는 MBP 및 MAG의 증가된 발현에 의해 입증되는 바와 같이 OPC 분화를 촉진하였다. 결과는 핍지교세포 분화에서 H3R의 구성적 활성의 음성 역할을 입증한다.

전임상 실험

모든 생체내 연구는 GSK R&D 차이나(China)의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 획득한 프로젝트 면허(Project Licences)에 따라 및 실험 동물의 보호 및 사용에 대한 글락소 스미스클라인(Glaxo SmithKline) 회사 정책 및 관련 실무 규범을 준수하여 수행하였다.

실시예 11

생체내 재수초화를 향상시키는 실시예 1의 화합물의 능력은 마우스 쿠프리존-유도 탈수초 모델을 사용하여 결정하였다.

쿠프리존 처리

쿠프리존 모델을 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 수행하였다: 8주령의 C57BL/6 마우스에게 탈수초화를 유도하기 위해 0.2% 쿠프리존 (w/w)과 새로 혼합된 분말 마우스 먹이를 5주 동안 공급한 후, 동물을 회복시키고 (식이로부터 쿠프리존의 제거), 추가로 9일 동안 실시예 화합물 1을 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg 및 10 mg/kg (체중)으로 경구로 b.i.d. 투여한 후, 희생시켰다. 뇌 샘플을 수초화 평가를 위해 수거하였다. 실시예 1의 화합물을 비히클로서 1% 수성 메틸셀룰로스를 사용하여 현탁액으로서 제제화하였다.

수초 염색 및 정량화

마우스를 깊이 마취하고, 혈액을 유출시키기 위해 좌심실을 통해 0.9% 염수를 신속하게 관류하였다. 전체 뇌를 꺼내고, 밤새 후고정을 위해 4% 파라포름알데히드 (PFA)가 담긴 15 ml 튜브에 넣은 후, 탈수를 위해 24-48h 동안 30% 수크로스 내에 담갔다. 냉동 포매를 위해, 뇌를 드라이 아이스와 혼합된 이소펜탄 내에서 즉시 급속 동결한 후, 최적 절단 온도 용액 (OCT) 내에 포매하였다. 전체 뇌를 저온 유지 장치 (MICROM HM525)를 사용하여 문헌 [Paxinos and Franklin (The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates_3rd Edition)]에 의한 마우스 지도(atlas)를 따라 전정 -2.46 mm로부터 1.18 mm까지 관상 위치에서 30 ㎛의 두께로 절편화하였다. 모든 절편을 항-냉동 용액 [500 ml 0.1 M PB 용액 (11.505 g Na₂HPO₄ 및 2.275 g NaH₂PO₄를 합하고 증류수로 1L로 희석하고 pH를 7.4로 조정) + 300 ml 에틸렌 글리콜 내에 용해되고 증류수로 1L로 희석된 300 g 수크로스]을 충전한 96-웰 플레이트 내에 넣었다. 블랙-골드 II 염색을 위해, 각각의 마우스에 대해 전정 0.86 mm 주위의 전뇌로부터의 2개의 절편 및 전정 -1.58 mm 주위의 후뇌로부터의 2개의 절편을 문헌 [Paxinos and Franklin]에 의한 마우스 지도를 따라 선택하였다. 수초화 검출을 위한 블랙-골드 II 염색은 제조자 (AG105, 밀리포어)로부터 채택한 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 전뇌로부터의 2개의 자유 유동(free-floating) 절편 및 후뇌로부터의 2개의 절편을 각각 2분 동안 MilliQ 물로 2회 재수화하고, 24-웰 플레이트 내에서 0.3% 블랙-골드 II 용액으로 60℃에서 20분 동안 염색하였다. 절편을 염색 정도를 결정하기 위해서 모니터링하였다. 가장 우수한 수초화(myelinated) 섬유가 암적색 내지 흑색으로 염색될 때, 염색 과정을 중지하였다. 이어서, 절편을 각각 2분 동안 MilliQ 물로 2회 세정하였다. 이어서, 절편을 나트륨 티오술페이트 용액 (1%)으로 6분 동안 60℃에서 처리하였다. PBST (PBS 중 0.05% 트리톤 X100) 내에서 세정한 후, 절편을 슬라이드 (라이카 마이크로시스템즈 플러스 슬라이드(Leica Microsystems Plus Slides)) 상에 올리고, 2-4시간 동안 37℃ 가열 플랫폼 상에서 추가로 공기 건조하였다. 탈수시킨 슬라이드에 로봇형 커버슬리퍼(robotic coverslipper) (CV5030, 라이카)로 커버슬립을 덮었다. 염색된 슬라이드를 스캔스코프(Scanscope) (아페리오 테크놀로지스 인크.(Aperio Technologies Inc.))로 스캐닝하였다. 중심 뇌량 또는 대상속(cingulum)에 근접한 피질의 디지탈 영상은 20x의 배율에서 이미지스코프(ImageScope) (아페리오 테크놀로지스 인크.)를 사용하여 캡쳐하였다.

이미지-프로(Image-Pro) 6.3 소프트웨어 (미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics), 미국 20814 메릴랜드주 베데스다)를 후속 정량적 평가를 위해 사용하였다. 역치는 각각의 게이팅된(gated) 뇌량에서 블랙-골드 II 염색으로 설정하고, 동등한 대상에 대해 얻은 영상 및 프로세싱된 슬라이드에 대한 광 강도에 대해 일정하게 유지되었다. 2개의 파라미터를 여기서 사용하였다: 면적 및 IOD (통합된 광학 밀도). 탈수초화 영역의 측정을 위해, 모든 디지탈 영상은 8의 그레이스케일(greyscale) 값으로 전환된 후에 동일한 색상 범위 하에 설정하였다. 20x 배율에서 중심 뇌량의 블랙-골드 염색의 빈 공간 및 총 면적에 의해 표시된 탈수초화 영역은 각각의 영상에 대해 따로 측정하였다. 평균 탈수초화 영역은 (탈수초화 영역/중심 뇌량의 총 면적)×100으로서 계산되었다. 평균 밀도의 측정을 위해, 중심 뇌량 또는 피질 내의 면적 및 IOD는 모든 디지탈 영상을 동일한 색상 범위 하에 설정된 후에 계산하였다. 평균 밀도는 IOD/중심 뇌량 또는 게이팅된 피질의 총 면적으로 계산되었다. 결과는 나이브(naive) 대조군의 평균 밀도의 백분율로서 표현되었다. 각각의 동물의 전뇌로부터 2개의 절편, 후뇌로부터 2개의 절편, 및 전뇌 및 후뇌 둘 모두로부터 4개의 절편으로부터의 데이터를 각각 평균내고 분석하였다. 군 데이터는 평균±SEM으로서 표현되었다. 그래프는 그래프패드5 프리즘(GraphPad5 PRISM) 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, 인코(GraphPad Software, Inco, 미국 캘리포니아주 샌디에고))에 의해 생성되었다.

통계 분석

그래프는 그래프패드5 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 인코, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 의해 생성하였다. R 소프트웨어에 의한 t-검정을 군들 사이의 차이의 분석을 위해 사용하였다. P 값 <0.05은 통계상 유의한 것으로 간주되었다. 유의성은 도면에 별표로 표시된다: ^*p<0.05, ^**p<0.01.

결과

쿠프리존 모델에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 1의 효과

5주의 쿠프리존 식이 처리, 이어서 9일의 정상 식이 처리는 나이브 군과 비교할 때 비히클 대조군에서의 블랙-골드 II 염색의 상실에 의해 가시화되는 바와 같이 뇌량의 심각한 탈수초화를 야기하였다 (도 5a 및 5b).

생체내 재수초화는 2개의 상이한 정량적 파라미터, 즉 탈수초화 영역 및 블랙-골드 II 염색에 의해 표시되는 평균 염색 강도에 의해 결정하였다. 도 5a-5d에 제시된 바와 같이, 실시예 화합물 1의 처리 (10 mg/kg, 9일)는 비히클 대조군에 비해 병변에서 수초-특이적 블랙-골드 II 염색의 강도를 유의하게 증가시켰고, 전뇌 및 후뇌 둘 모두에서 뇌량의 탈수초화 영역을 감소시켰고; 실시예 화합물 1의 효과는 용량이 증가함에 따라 증가하였다 (3 mg/kg 제외).

실시예 12

생체내 재수초화를 향상시키는 실시예 화합물 2의 능력은 마우스 쿠프리존/라파마이신-유도 탈수초화 모델을 사용하여 결정하였다.

쿠프리존 + 라파마이신 처리

쿠프리존 + 라파마이신 모델을 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 수행하였다: 라파마이신을 100% 에탄올에 용해시키고, 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. 주사 직전에, 라파마이신을 5% PEG-400, 5% 트윈 80, 및 4% 에탄올 중 최종 농도를 얻기 위해 비히클 용액에 희석하였다. 8주령의 C57BL/6 마우스에게 탈수초화를 유도하기 위해 5주 동안 0.2% 쿠프리존 (w/w)과 새로 혼합된 분말 마우스 먹이를 공급하고, 라파마이신 (10 mg/kg (체중))을 매일 복강내 주사한 후, 동물을 회복시키고 (식이로부터 쿠프리존의 제거 및 라파마이신 주사), 추가로 9일 동안 실시예 화합물 2를 30 mg/kg (체중)으로 경구로 b.i.d. 투여한 후, 희생시켰다. 뇌 샘플을 병리학적 분석을 위해 수거하였다. 실시예 화합물 2를 비히클로서 1% 수성 메틸셀룰로스를 사용하여 현탁액으로서 제제화하였다.

수초 염색 및 정량화

마우스를 깊이 마취하고, 혈액을 유출시키기 위해 좌심실을 통해 0.9% 염수를 신속하게 관류하였다. 전체 뇌를 꺼내고, 밤새 후고정을 위해 4% 파라포름알데히드 (PFA)가 담긴 15 ml 튜브에 넣은 후, 탈수를 위해 24-48h 동안 30% 수크로스 내에 담갔다. 냉동 포매를 위해, 뇌를 드라이 아이스와 혼합된 이소펜탄 내에서 즉시 급속 동결한 후, 최적 절단 온도 용액 (OCT) 내에 포매하였다. 전체 뇌를 저온 유지 장치 (MICROM HM525)를 사용하여 문헌 [Paxinos and Franklin (The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates_3rd Edition)]에 의한 마우스 지도를 따라 전정 -2.46 mm로부터 1.18 mm까지 관상 위치에서 30 ㎛의 두께로 절편화하였다. 모든 절편을 항-냉동 용액 [500 ml 0.1 M PB 용액 (11.505 g Na₂HPO₄ 및 2.275 g NaH₂PO₄를 합하고 증류수로 1L로 희석하고 pH를 7.4로 조정) + 300 ml 에틸렌 글리콜 내에 용해되고 증류수로 1L로 희석된 300 g 수크로스]을 충전한 96-웰 플레이트 내에 넣었다. 블랙-골드 II 염색을 위해, 각각의 마우스에 대해 전정 0.86 mm 주위의 전뇌로부터의 4개의 절편 (뇌량으로부터의 2개, 피질로부터의 2개)을 문헌 [Paxinos and Franklin]에 의한 마우스 지도를 따라 선택하였다. 수초화 검출을 위한 블랙-골드 II 염색은 제조자 (AG105, 밀리포어)로부터 채택한 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 전뇌로부터의 4개의 자유 유동 절편 (뇌량에 대한 2개, 피질에 대한 2개)을 각각 2분 동안 MilliQ 물로 2회 재수화하고, 24-웰 플레이트 내에서 0.3% 블랙-골드 II 용액으로 60℃에서 20분 동안 염색하였다. 절편을 염색 정도를 결정하기 위해서 모니터링하였다. 가장 우수한 수초화 섬유가 암적색 내지 흑색으로 염색될 때, 염색 과정을 중지하였다. 이어서, 절편을 각각 2분 동안 MilliQ 물로 2회 세정하였다. 이어서, 절편을 나트륨 티오술페이트 용액 (1%)으로 6분 동안 60℃에서 처리하였다. PBST (PBS 중 0.05% 트리톤 X100) 내에서 세정한 후, 절편을 슬라이드 (라이카 마이크로시스템즈 플러스 슬라이드) 상에 올리고, 2-4시간 동안 37℃ 가열 플랫폼 상에서 추가로 공기 건조하였다. 탈수시킨 슬라이드에 로봇형 커버슬리퍼 (CV5030, 라이카)로 커버슬립을 덮었다. 염색된 슬라이드를 스캔스코프 (아페리오 테크놀로지스 인크.)로 스캐닝하였다. 중심 뇌량 또는 대상속에 근접한 피질의 디지탈 영상은 20x의 배율에서 이미지스코프 (아페리오 테크놀로지스 인크.)를 사용하여 캡쳐하였다.

이미지-프로 6.3 소프트웨어 (미디어 사이버네틱스, 미국)를 후속 정량적 평가를 위해 사용하였다. 역치는 각각의 게이팅된 뇌량에서 블랙-골드 II 염색으로 설정하고, 동등한 대상에 대해 얻은 영상 및 프로세싱된 슬라이드에 대한 광 강도에 대해 일정하게 유지되었다. 2개의 파라미터를 여기서 사용하였다: 면적 및 IOD (통합된 광학 밀도). 평균 밀도의 측정을 위해, 중심 뇌량 또는 피질 내의 면적 및 IOD는 모든 디지탈 영상을 동일한 색상 범위 하에 설정된 후에 계산하였다. 평균 밀도는 IOD/중심 뇌량 또는 게이팅된 피질의 총 면적으로 계산되었다. 결과는 나이브 대조군의 평균 밀도의 백분율로서 표현되었다. 각각의 동물의 전뇌 뇌량으로부터 2개의 절편, 전뇌 피질로부터 2개의 절편으로부터의 데이터를 각각 평균내고 분석하였다. 군 데이터는 평균±SEM으로서 표현되었다. 그래프는 그래프패드5 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 인코, 미국)에 의해 생성되었다.

통계 분석

그래프는 그래프패드5 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 인크., 미국)에 의해 생성하였다. 그래프패드에 의한 독립표본(unpaired) t-검정을 군들 사이의 차이의 분석을 위해 사용하였다. P 값 <0.05은 통계상 유의한 것으로 간주되었다. 유의성은 도면에 별표로 표시된다: ^*p<0.05, ^**p<0.01.

쿠프리존 + 라파마이신 모델에서 재수초화에 대한 실시예 화합물 2의 효과

쿠프리존 + 라파마이신 모델의 또 다른 배치에서, 마우스를 5주 동안 라파마이신의 복강내 주사, 이어서 9일 동안 화합물 투여와 조합하여 쿠프리존 식이로 처리하였다. 쿠프리존 식이 + 라파마이신의 복강내 주사는 뇌량 및 피질 둘 모두에서 심각한 탈수초화를 유도하였고, 실시예 화합물 2의 처리 (30 mg/kg, 9일)는 비히클 대조군에 비해 전뇌의 뇌량 및 피질의 병변에서 수초 특이적 블랙-골드 II 염색의 밀도를 유의하게 증가시켰다 (도 5e 및 5f).

결과 (도 5)

도 5a에서, 대표적인 영상은 실시예 화합물 1의 처리가 쿠프리존 모델 (5주의 쿠프리존 식이 + 9일의 화합물 처리)에서 전뇌 뇌량의 탈수초화된 영역을 감소시키고 블랙-골드 II 염색의 평균 강도를 증가시킴을 보여준다.

도 5b에서, 대표적인 영상은 실시예 화합물 1의 처리가 쿠프리존 모델 (5주의 쿠프리존 식이 + 9일의 화합물 처리)에서 후뇌 뇌량의 탈수초화된 영역을 감소시키고 블랙-골드 II 염색의 평균 강도를 증가시킴을 보여준다.

도 5c는 탈수초화 영역의 감소에 의해 입증되는 바와 같이 재수초화에 대한 실시예 화합물 1의 처리 효과의 통계 분석을 보여준다. 각각의 동물에 대해 전뇌 및 후뇌 둘 모두로부터의 4개의 절편을 분석하였다. 각각의 군에 대한 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다. ^**P<0.01 대 비히클 대조군.

도 5d는 뇌량에서 블랙-골드 II 염색의 증가된 평균 밀도에 의해 표시되는 바와 같이 재수초화에 대한 실시예 화합물 1의 처리 효과의 통계 분석을 보여준다. 각각의 동물에 대해 전뇌 및 후뇌 둘 모두로부터의 4개의 절편을 분석하였다. 각각의 군에 대한 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다. ^*P<0.05 대 비히클 대조군.

도 5e는 실시예 화합물 2의 처리가 쿠프리존 + 라파마이신 모델 (5주의 쿠프리존 식이 및 라파마이신 주사 + 9일의 화합물 처리)에서 전뇌 뇌량의 재수초화를 촉진함을 보여준다. 대표적인 영상 (상부 패널) 및 정량적 분석 (하부 패널)은 회복기에서 9일 동안 실시예 화합물 2 처리가 비히클 대조군에 비해 전뇌 뇌량에서 블랙-골드 II 염색의 평균 밀도를 유의하게 증가시킴을 입증하였다. 각각의 동물에 대해 전뇌 뇌량으로부터의 2개의 절편을 평균내고 분석하였다. 각각의 군에 대한 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다. ^*P<0.05 대 비히클 군.

도 5f는 실시예 화합물 2의 처리가 쿠프리존 + 라파마이신 모델 (5주의 쿠프리존 식이 및 라파마이신 주사 + 9일의 화합물 처리)에서 전뇌 뇌량의 재수초화를 촉진함을 보여준다. 대표적인 영상 (상부 패널) 및 정량적 분석 (하부 패널)은 회복기에서 9일 동안 실시예 화합물 2 처리가 비히클 대조군에 비해 전뇌 피질에서 블랙-골드 II 염색의 평균 밀도를 유의하게 증가시킴을 입증하였다. 각각의 동물에 대해 전뇌 피질로부터의 2개의 절편을 평균내고 분석하였다. 각각의 군에 대한 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다. ^*P<0.05 대 비히클 군.

도 5a에 제시된 바와 같이, 실시예 화합물 1의 처리는 쿠프리존 모델 (5주의 쿠프리존 식이 + 9일의 화합물 처리)에서의 전뇌 뇌량에서 비히클 대조군에 비해 탈수초화된 영역 (블랙-골드 II 염색의 빈 공간)을 감소시키고, 블랙-골드 II 염색의 평균 강도를 증가시켰다 (A 및 C에서 대표적인 영상에 의해 표시되는 바와 같음). B 및 D는 분석 수행 방법을 보여주는 예이다. B는 이미지-프로 6.3 소프트웨어 (미디어 사이버네틱스, 미국)에 의해 전환된 A로부터 유래된 영상이고, B의 적색 영역은 탈수초화 영역으로서 측정하였다. D는 이미지-프로에 의해 전환된 A로부터 유래된 영상이고, D의 적색 색상의 강도는 수초 강도로서 측정하였다.

도 5b에 제시된 바와 같이, 실시예 화합물 1의 처리는 쿠프리존 모델 (5주의 쿠프리존 식이 + 9일의 화합물 처리)에서의 후뇌 뇌량에서 비히클 대조군에 비해 탈수초화된 영역 (블랙-골드 II 염색의 빈 공간)을 감소시키고, 블랙-골드 II 염색의 평균 강도를 증가시켰다 (A 및 C에서 대표적인 영상에 의해 표시되는 바와 같음). B 및 D는 분석 수행 방법을 보여주는 예이다. B는 이미지-프로 6.3 소프트웨어에 의해 전환된 A로부터 유래된 영상이고, B의 적색 영역은 탈수초화 영역으로서 측정하였다. D는 이미지-프로에 의해 전환된 A로부터 유래된 영상이고, D의 적색 색상의 강도는 수초 강도로서 측정하였다.

도 5c에 제시된 바와 같이, 정량적 분석은 10 mg/kg의 실시예 화합물 1의 처리가 탈수초화 영역을 유의하게 감소시킴을 보여준다 (비히클 군: 54.81%±7.27%; 0.3 mg/kg 군: 46.82%±3.54%; 1 mg/kg 군: 38.45%±7.55%; 3 mg/kg 군: 41.22%±11.14%; 10 mg/kg 군: 27.62%±5.20%; 동물당 4개의 절편으로부터의 데이터를 분석하였다; 2개의 전뇌 절편, 2개의 후뇌 절편).

도 5d에 제시된 바와 같이, 정량적 분석은 10 mg/kg의 실시예 화합물 1의 처리가 전뇌 및 후뇌 둘 모두에서 뇌량의 수초 염색 강도를 증가시킴을 보여준다 (비히클 군: 15.75%±2.08%; 0.3 mg/kg 군: 18.61%±1.01%; 1 mg/kg 군: 22.00%±3.41%; 3 mg/kg 군: 28.32%±7.76%; 10 mg/kg 군: 26.36%±3.10%; 동물당 4개의 절편으로부터의 데이터를 분석하였다; 2개의 전뇌 절편, 2개의 후뇌 절편).

도 5e에 제시된 바와 같이, 30 mg/kg의 실시예 화합물 2의 처리는 쿠프리존 + 라파마이신 모델 (5주의 쿠프리존 식이 및 라파마이신 주사 + 9일의 화합물 처리)에서 전뇌 뇌량의 재수초화를 촉진하였다. 대표적인 영상 (상부 패널) 및 정량적 분석 (하부 패널)은 회복기에서 9일 동안 실시예 화합물 2 처리가 비히클 대조군에 비해 전뇌 뇌량에서 블랙-골드 II 염색의 평균 밀도를 유의하게 증가시킴을 입증하였다 (평균 강도: 비히클: 14.65±1.96%; cpd: 27.68±5.44%. 비히클, n=9, 실시예 화합물 2, n=7, 동물당 2개의 절편으로부터 분석된 데이터).

도 5f에 제시된 바와 같이, 30 mg/kg의 실시예 화합물 2의 처리는 쿠프리존 + 라파마이신 모델 (5주의 쿠프리존 식이 및 라파마이신 주사 + 9일의 화합물 처리)에서 전뇌 피질에서 재수초화를 촉진하였다. 대표적인 영상 (상부 패널) 및 정량적 분석 (하부 패널)은 회복기에서 9일 동안 실시예 화합물 2 처리가 비히클 대조군에 비해 전뇌 피질에서 블랙-골드 II 염색의 평균 밀도를 유의하게 증가시킴을 입증하였다 (평균 강도: 비히클: 40.79±3.60%; cpd: 60.05±6.28%. 비히클, n=9, 실시예 화합물 2, n=7, 동물당 2개의 절편으로부터 분석된 데이터).

결론

상기 결과는 본 발명의 화합물인 실시예 화합물 1 및 실시예 화합물 2의 처리가 내인성 재수초화를 향상시킬 수 있음을 나타내고, 시험관내 발견과 잘 부합하였다. 따라서, 본원에서 제시한 생체내 및 시험관내 데이터는 증가된 OPC 분화를 통해 CNS 수초 복구를 촉진함으로써 다발성 경화증에 대한 신규한 요법으로서의 H3R의 역 효능제를 강력하게 지지한다.

실시예 13

OPC를 사용한 히스타민 H3R 기능적 역 효능제 검정 ( cAMP 검정)

세포 표면에서 발현된 히스타민 수용체 3 (H3R)은 시클릭 AMP (cAMP)의 형성을 자극하는 아데닐릴 시클라제에 그 기능을 차단하는 방식으로(negatively) 커플링된다. 히스타민의 부재 하에, 구성적으로 활성인 H3R은 cAMP의 세포내 수준을 억제할 것이다. 따라서, H3R의 구성적 활성을 차단하는 H3R의 역 효능제는 cAMP 수준을 증가시킬 것이다. H3R의 구성적 활성을 억제하는 실시예 화합물 2의 능력은 세포성 cAMP 검정으로 결정하였다.

검정되는 각각의 화합물에 대해, OPC를 PO 코팅된 96-웰 플레이트에 20000 세포/웰의 밀도로 접종하고, bFGF (10 ng/ml 페트로테크(Petrotech)) 및 PDGF (10 ng/ml 페트로테크)가 존재하는 BDM 내에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 먼저 상이한 농도의 실시예 화합물 (30 nM 내지 3 M)로 30분 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 실시예 화합물의 존재 하에 15분 동안 포르스콜린 (3 M, 시그마)으로 자극하였다. cAMP 농도를 cAMP 화학발광 면역검정 키트 (인비트로젠, Cat. No. C10557)에 의해 측정하였다. 세포를 용해 완충제 (60 ㎕, 인비트로젠 키트 리에이전트(Invitrogen Kit reagent))로 37℃에서 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 예비-코팅된 마이크로플레이트 (인비트로젠 키트 리에이전트)로 옮기고, cAMP-AP (30 ㎕, 인비트로젠 키트 리에이전트) 및 cAMP 항체 (60 ㎕, 인비트로젠 키트 리에이전트)와 혼합하였다. 1시간 인큐베이션 후에, 웰을 세척 완충제 (인비트로젠 키트 리에이전트)로 5회 세척하였다. CSPD® 기질/사파이어-II™ 인핸서(CSPD® Substrate/Sapphire-II™ Enhancer) 용액 (100 ㎕, 인비트로젠 키트 리에이전트)을 각각의 웰 내에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 화학발광 신호를 스펙트라맥스 M5 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Readers) (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))로 웰당 1초 동안 측정하였다.

결과

도 6a 및 6b에 제시된 바와 같이, 실시예 화합물 2는 1차 핍지교세포 전구체 세포에서 포르스콜린-자극된 cAMP 수준을 용량 의존적 방식으로 증가시켰다.

결론

실시예 화합물 2는 핍지교세포 전구체 세포의 세포내 포르스콜린-자극된 cAMP 수준 (H3R 효능제의 부재 하)을 용량 의존적 방식으로 증가시켰다. 결과는 실시예 화합물 2가 H3R의 역 효능제임을 시사한다.

실시예 14

H3R 수용체에 대한 기저 GTPγS 결합에 대한 실시예 화합물 1의 효과를 GTPγS 결합 검정으로 결정하였다.

세포 유지 및 백맘(Bacmam ) 바이러스 감염

G 단백질 GαO를 안정적으로 발현하는 인간 배아 신장 293 세포 (HEK-293-GO)를 가습 환경에서 37-8℃, 5% CO₂에서 얼(Earle) 염, 2 mM L-글루타민, 400 mg/ml 게네티신 및 10% 소 태아 혈청을 보충한 최소 필수 배지 (MEM) 내에서 유지하였다. 지수적으로 성장하는 세포를 다음과 같이 인간 재조합 H3 수용체를 코딩하는 백맘 바이러스 (Biocat: 바이러스 96801)로 감염시켰다. 세포를 PBS 내에서 플라스크로부터 떼어놓고, 실온에서 5 min 동안 200X g에서 원심분리에 의해 수거하였다. 이어서, 세포를 100의 감염 다중도 (m.o.i.)로 바이러스를 함유하는성장 배지에 재현탁하고, 재도말한 후, 정상 성장 조건 하에 24 h 동안 인큐베이션하였다.

GTPγS 결합 검정

GTPγS 결합 검정은 상기한 바와 같이 인간 H3R-코딩 백맘 바이러스로 형질도입된 HEK-293-GαO 세포를 사용하여 수행하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 세포를 10 ml PBS 내로 수집하고, 5 min 동안 200X g에서 원심분리하였다. 상청액의 제거 후에, 펠릿을 재현탁하고, 3 mM MgCl₂ 및 100 mM NaCl을 함유하는 20 mM HEPES (pH 7.4) 내에 균질화하고, 20 min 동안 50,000X g에서 원심분리한 후, 균질화하고, 다시 원심분리하였다. 이어서, 막 펠릿을 재현탁하고, 단백질 농도에 대해 검정하였다.

세포 막을 검정 완충제 (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, pH 7.4) 내에 ~1 mg/ml로 희석하고, 맥아 응집소 섬광 근접 검정 (SPA) 비드 (아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))와 함께 45 min 동안 인큐베이션한 후, GDP (40 mM)를 첨가하였다. 다양한 농도의 실시예 화합물 1 (1/2 log 증분의 100 nM-0.001 nM)을 10 ml 검정 완충제와 함께 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 비-특이적 결합은 0.6 mM GTPγS을 포함시켜 결정하였다. 이어서, 60 ㎕ (~55 mg 단백질/웰)의 막/SPA 비드/GDP 믹스를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30 min 동안 회전 진탕기에서 인큐베이션하였다. 이어서, [35S]-GTPγS (0.3 nM)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가로 30 min 동안 진탕기에서 인큐베이션하고, 화트만(Whatman) GF/B 필터를 통한 신속한 진공 여과에 의해 인큐베이션을 중지시켰다. 필터를 4 ml 빙냉수로 2회 세척하고, 필터 상에 결합된 [35S]-GTPγS를 왈락 1450 마이크로베타 트리룩스(Wallac 1450 Microbeta Trilux) 계수기를 사용한 섬광 계수에 의해 측정하였다.

데이터 획득 및 분석

데이터를 분석하고, 비히클 대조군 웰 (DMSO)의 수의 변화 배수로서 제시하였다. 그래프를 소프트웨어 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드 프리즘5.0에 의해 생성하였다. 곡선 피팅은 실시예 화합물 1의 pEC₅₀ 값을 유도하기 위해 소프트웨어 그래프패드를 이용하여 수행하였다. 곡선 피팅은 소프트웨어에 내장된(embedded) 로지스틱(Logistic) 모델에 의해 수행하였다 (S자형 용량-반응: Y=하부 + (상부-하부)/(1+10⁽ ^LogEC50 ^-X))).

통계 분석

모든 데이터는 평균±평균의 표준 오차 (SEM)로 제시된다. 통계 분석은 적절한 경우 일원 ANOVA 또는 스튜던트 t 검정을 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 p<0.05일 경우에 추정되었다.

결과

실시예 화합물 1은 HEK-293-GO 세포에서 발현된 인간 H3R에서 역 효능제 특성을 보였다. 기저 GTPγS 결합 (H3R 효능제의 부재 하)은 실시예 화합물 1 (100 nM-0.001 nM)에 의해 용량 의존적 방식으로 억제되었고, pEC50은 3개의 독립적인 실험으로부터 9.95±0.07이었다 (도 7). 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 11개 용량군 (비히클 및 10개의 활성 용량) 사이의 차이를 비교하였다. ANOVA 9.735e-10 <0.0001의 p-값은 통계상 유의한 차이를 나타내었고, H3R 효능제인 α-메틸히스타민은 검정을 인증하기 위한 대조군으로서 사용하였다. GTPγS 검정의 3개의 독립적 배치로부터의 데이터를 평균내고, 비히클 대조군 웰에서의 백분율의 변화 배수로서 표현하였다. 실시예 1 대 비히클, ^*, p<0.05, ^**, p<0.01, ^***, p<0.001. α-메틸히스타민 대 비히클,#, p<0.05.

결론

실시예 화합물 1은 HEK293 세포의 막 상에 발현된 H3R에 대한 기저 GTPγS 결합 (H3R 효능제의 부재 하)을 용량 의존적 방식으로 억제하였다. 결과는 실시예 화합물 1이 H3R의 역 효능제임을 나타내었다.

Claims

다발성 경화증 (MS)에서 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시키는데 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물.
제1항에 있어서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 투여량으로 인간에게 경구 투여되는 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 투여량으로 인간에게 경구 투여되는 화합물.
치료 유효량의 H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, MS에서 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나, 역전시키는 방법.
제6항에 있어서, 화합물이 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 화합물이 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물을 1일당 5 내지 500 마이크로그램의 투여량으로 인간에게 경구 투여하는 것을 포함하는 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물을 1일당 10 내지 150 마이크로그램의 투여량으로 인간에게 경구 투여하는 것을 포함하는 방법.
탈수초성 질환의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물.
제11항에 있어서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
치료 유효량의 H3 수용체의 역 효능제인 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 탈수초성 질환의 치료 방법.
제14항에 있어서, 화합물이 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 화합물이 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
재수초화를 촉진하는데 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 화합물.
제17항에 있어서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논, 3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 4-(4-((1-이소프로필피페리딘-4-일)옥시)피페리딘-1-일)벤조니트릴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제17항 또는 제18항에 있어서, 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
5 내지 500 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, MS의 치료에 사용하기 위한 인간에의 경구 투여용 제약 조성물.
제20항에 있어서, 10 내지 150 마이크로그램의 1-{6-[(3-시클로부틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-7-일)옥시]-3-피리디닐}-2-피롤리디논 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-5-((1-시클로부틸피페리딘-4-일)메틸)-1,2,4-옥사디아졸 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
MS의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제23항에 있어서, 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제23항에 있어서, (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
치료 유효량의 H3 수용체의 역 효능제인 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 화합물을 환자에게 경구 투여하는 것을 포함하는, MS의 치료 방법.
제26항에 있어서, 화합물이 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
제26항에 있어서, 화합물이 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
탈수초성 질환의 치료에 사용하기 위한, H3 수용체의 역 효능제인 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 이들의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제29항에 있어서, 1-(3-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)프로필)피페리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
제29항에 있어서, (R)-6-(4-(3-(2-메틸피롤리딘-1-일)프로폭시)페닐)피리다진-3(2H)-온 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.