KR20140113543A - AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편및 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법 및 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
AIMP2-DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질의 상호작용을 억제하는 항암제를 스크리닝 하는 방법으로, 항암성 물질을 선별하여 항암제를 제조하는데 효과적이다.
AIMP2-DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질의 상호작용을 억제하는 항암제를 스크리닝 하는 방법으로, 항암성 물질을 선별하여 항암제를 제조하는데 효과적이다.
Description
본 발명은 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편과 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편의 상호작용을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는 상기 두 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법 및 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암 특이적 마커의 개발은 암의 진단뿐만 아니라 암 특이적인 치료를 위해서도 요구되고 있다. 사이토톡신 치료(cytotoxic therapies)는 첫 항암 치료제로 사용된 이래 50여년 동안 암 치료에 광범위하게 쓰여 왔으나 암세포 외에 분열 속도가 비교적 빠른 다른 장기의 세포에 비특이적으로 작용하여 강한 독성을 나타내고, 심각한 부작용을 초래하는 문제가 있다. 이러한 기존 항암제의 부작용 및 내성을 극복하기 위하여 정상세포의 암화 과정에 나타나는 암 특이적 마커(cancer specific marker) 이용하여 종양 세포 특이적으로 작용하는 치료제를 개발하고자 하는 연구가 진행되었다. 항암제에 의한 독성을 최소화하기 위한 방안으로 떠오르는 암 타겟팅 치료(cancer targeted therapy)의 핵심은 암세포 특이적인 유전자를 찾아내는 것이다.
사람에서는 p14/ARF, 마우스에서는 p19ARF로 알려진 ARF는 종양억제 단백질이다. ARF 단백질은 E2F-1, -2, -3 transcription activators와 결합하여 이들의 전사활성을 저해하고, 26S proteasome pathway를 통해 이들을 분해한다. 이 결합은 세포 주기의 진행과 종양 민감성에서 나타나는 p53 비의존성인 ARF 활성 기전을 일으킨다.
AIMP2(ARS-interacting multi-functional protein 2)는 아미노아실-tRNA 합성효소 복합체(Aminoacyl-tRNA synthetase: ARSs)의 형성에 관련된 단백질 중의 하나로, p38/JTV-1 또는 p38로 불려지기도 한다. 본 발명자는 AIMP2가 신규한 암 억제자(tumor suppressor)로 Smad2/3과 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β의 신호전달을 강화시키는 기능을 함을 밝힌 적이 있고, 암 세포주 및 조직에서 AIMP2의 엑손 2가 결손된 형태의 변이체인 AIMP2-DX2가 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다. 또한 본 발명자는 AIMP2-DX2-형질전환된 세포에서는 TGF-β와 상관없이 AIMP2 수준이 극적으로 감소되는 것으로 AIMP2-DX2 생성이 AIMP2 활성의 상실을 초래하는 것을 확인하였다(등록특허 10-0762995).
벤조피린 유도 폐암에서 AIMP2-DX2-knock down 모델이 뛰어난 항암효과를 보이지만, 폐암 진행에서 AIMP2-DX2의 역할은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. AIMP2-DX2 단독으로는 폐암을 확실하게 유도하지 않기 때문에, AIMP2-DX2의 종양 형성 성질은 다른 유전적 요인에 의존적일 가능성이 있다.
이에 AIMP2-DX2의 발암성에 영향을 미치는 다른 유전적 요인을 찾던 중, 본 발명자들은 p14/ARF가 AIMP2-DX2와 관련이 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2의 발현이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2의 발현이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 AIMP2-DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 조직의 형태로 제공되는 것을 특징으로 한다.
상기 단계 (b)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 실시되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2의 발현이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 (b)는 공동-면역침전법(co-immunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 측정하는 것을 특징으로 한다.
상기 AIMP2-DX2는 AIMP2 단백질 서열(312aa version:AAC50391.1 또는 GI:1215669; 320aa version: AAH13630.1, GI:15489023, BC013630.1) 중 엑손 2의 영역이 결실된 변이체로서, AIMP2 등가물(아미노산 서열의 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 변형체로 AIMP2과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물, 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지나 AIMP2과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 유도체)에서 엑손 2의 영역이 결실된 단백질을 포함한다. 본 발명에서 AIMP2 단백질 서열 중 “엑손 2의 영역이 결실”되었다는 것은 AIMP2 단백질에서 엑손 2 영역의 아미노산 서열이 부분적으로나 전체적으로 상실되어 생긴 변이체가 AIMP2 단백질과 헤테로다이머를 형성하여 AIMP2의 정상적인 기능을 방해하는 것을 의미한다. 따라서 AIMP2-DX2 단백질은 AIMP2단백질의 엑손 2의 아미노산 서열이 모두 결실되거나 이 영역의 아미노산 서열을 포함하여 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4 또는 이들 영역 모두에서 이들 영역의 일부도 결실되거나, 엑손 2의 아미노산 서열의 일부만이 결실된 단백질을 포함한다.
본 발명의 AIMP2-DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 AIMP2-DX2 단백질 또는 p14/ARF 단백질 및 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc..85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al,Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 상기 단백질들이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 형질전환체로부터 상기 단백질들을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 AIMP2-DX2 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있고, 더 바람직하게는 AIMP2-DX2는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시될 수 있고, p14/ARF는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명의 AIMP2-DX2 단백질 단편은 AIMP2 단백질의 엑손 1-3 junction을 포함하는 적어도 5개 내지 100개 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 p14/ARF 단백질의 단편은 서열번호 6의 1번째 내지 29번째 또는 2번째 내지 29번째 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
전술한 (a) 내지 (b) 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법은,
(c) 상기 (b)단계에서 선별된 1차 후보물질을 p14/ARF 및 이와 결합하는 AIMP2-DX2 이외의 단백질과 접촉시키는 단계
(d) 상기 (c)단계에서 p14/ARF 및 이와 결합하는 AIMP2-DX2 이외의 단백질의 상호작용에 영향을 미치지 않는 1차 후보물질을 2차 후보물질로 선별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 AIMP2-DX2 이외의 단백질은 이에 한정되지는 않으나, p53, MDM2(Cell, Vol. 92, 713723, March 20, 1998), E2F1(Oncogene (2001) 20, 1033 ± 1041), progerin(Cell Cycle 12:14, 22772290; July 15, 2013)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 p53일 수 있다.
상기 단계 (c)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 실시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용하는 "상호작용"이라는 용어는 AIMP2-DX2와 p14/ARF 두 단백질이 직접적으로 결합하여 AIMP2-DX2가 p14/ARF의 기능을 저해하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 "상호작용을 억제하는 항암제"라는 용어는 AIMP2-DX2가 p14/ARF의 기능을 저해하는 것을 억제하여 암을 치료 및 예방하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 "상호작용을 억제"한다는 용어는 AIMP2-DX2와 p14/ARF 간의 상호작용을 억제, 경감, 제거하는 것을 모두 포함한다. 상호작용 저해에는 AIMP2-DX2와 p14/ARF 상호간의 작용 자체를 저해할 수도 있으나 AIMP2-DX2의 활성을 감소시켜 상호간의 결합을 저해하는 것도 포함된다.
본 발명에서 사용하는 "항암"이라는 용어는 암의 성장을 억제하거나 예방하는 것을 의미한다. "암의 성장을 억제하거나 예방한다"는 것은 치료하거나 처리하지 않았을 때와 비교시에 암의 성장 및 암전이를 감소시키는 것을 포함하는 개념이다. 상기 "암전이(metastasis)"는 종양 세포가 신체의 멀리 떨어진 부분으로 확산되는 과정을 의미한다. 본 명세서에서 상기 용어는 전이 과정을 통하여 발생되는 암을 또한 포함한다.
본 발명에서 용어, “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
이전 연구에 따르면, p14/ARF는 핵에 존재하고, 세포 주기 휴지기 및 세포자살에 관여한다. 더욱이, p14/ARF의 비활성화는 폐암의 전이성 표현형을 촉진시킬 수 있다. AIMP2-DX2의 발암 성질은 p14/ARF가 비활성화 된 암의 특징과 비슷했기 때문에, AIMP2-DX2와 p14/ARF 간의 기능적 연관성을 실험해보았다.
먼저 p14/ARF 발현에 미치는 AIMP2-DX2의 영향을 관찰해보았다. AIMP2-DX2의 형질주입은 p14/ARF 발현을 감소시켰다. 그러나 음성 대조군인 RKIP는 AIMP2-DX2 형질주입의 영향을 받지 않았으므로, AIMP2-DX2가 선택적으로 p14/ARF 발현을 저해한다는 것을 알 수 있다(도 1 참조). 이어서 각 단백질에 작용하는 si-RNA를 이용하여 상기 두 단백질들을 각각 제거한 후, 단백질 반감기를 측정했다. AIMP2-DX2의 제거는 p14/ARF의 반감기를 연장시켰고, 비슷하게 p14/ARF의 제거는 DX-2의 발현을 연장했다(도 2 참조). 또한, si-AIMP2-DX2는 p14/ARF의 핵질 내 발현을 촉진시켰다.(도 3 참조).
AIMP2-DX2와 p14/ARF가 같이 존재하는 것에 기초하여 두 단백질의 결합을 검사했다. 세포 파쇄물과 재조합 AIMP2-DX2를 이용한 IP 분석을 통해, p14/ARF와 His-AIMP2-DX2 간의 연관성을 발견했다. 그러나 같은 조건에서 GFP-pRb 또는 뉴클레오린(nucleolin)은 AIMP2-DX2와 연관이 없었다(도 4 참조). 또한, AIMP2-DX2와 p14/ARF가 같이 존재하는 것을 IF 염색을 통해 확인했다(도 5 참조). 두 단백질의 직접적인 상호작용은 재조합 단백질을 이용한 IP assay로 확인하였고, 확인 결과 AIMP2-DX2는 p14/ARF에 직접 결합하였다.(도 6 참조). 두 단백질의 결합도메인을 알아보기 위해 AIMP2-DX와 p14/ARF의 N-말단부위 단편을 이용하여 pull down을 수행하였고, 확인 결과 p14/ARF의 N-말단부위 단편만으로도 AIMP2-DX와 결합함을 확인하였다(도 16 및 17 참조).
AIMP2-DX2-p14/ARF 결합이 직접적이고 선택적이라는 것을 확인하기 위해, GST(Glutathione S-transferase)-pull down을 수행했다. p53을 이용한 GSP-pull down assay를 통해, AIMP2-DX2 뿐만 아니라 AIMP2와의 상호작용을 관찰했다. 이 결과는 AIMP2와 AIMP2-DX2가 p53과 직접적으로 결합한다는 이전 연구의 결과와 일치했다. 반대로 GST-p14/ARF는 AIMP2-DX2와의 선택적 상호작용을 보여준다(도 7 참조).
pRb의 결핍은 소세포폐암(SCLC) 진행에 필수적이고, pRb는 세포 분화와 증식과 관련이 있음이 알려져 있다. 따라서 AIMP2-DX2가 pRb 기능에 어떤 영향을 주는지 알아보았다. AIMP2-DX2가 형질주입됐을 때, 핵의 pRb는 세포질로 방출됐다.(도 8 참조). 이를 세포 분획을 통해서 다시 확인해 본 결과, AIMP2-DX2가 핵 내 pRb 발현을 방해함을 확인했다.(도 9 참조)
상기 결과가 AIMP2-DX2와 pRb간의 결합 때문인지 관찰한 결과, 이와는 다르게 pRb는 AIMP2-DX2가 아닌 p14/ARF와 상호작용을 했고(도 10 참조), GST-pull down assay로 p14/ARF가 변이형이 아닌 야생형 pRb와 선택적으로 관련이 있음을 확인했다(도 11 참조). 또한, 변이 pRb의 세포내 위치는 AIMP2-DX2의 영향을 받지 않았고(도 12 참조), 이 결과는 p14/ARF가 pRb의 핵 내 위치하는 것에 필요하다는 것을 보여준다.
AIMP2-DX2와 pRb-p14/ARF 간간 분자적 상관관계를 살피기 위해, pRb와 p14/ARF의 결합에 AIMP2-DX2가 미치는 영향을 관찰했다. 이 실험에서, AIMP2-DX2가 p14/ARF와 pRb 간의 상호작용을 막는 것을 확인했고(도 13 참조), 이를 다시 확인하기 위해 A549-p14/ARF transfectant로부터 AIMP2-DX2를 제거한 후, pRb의 발현을 측정한 결과, p14/ARF 및 pRb 의 발현이 증가했다(도 14 참조). 이 결과는 AIMP2-DX2가 p14/ARF 봉쇄를 통해 pRb 기능을 억제한다는 것을 보여준다.
따라서 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 결합 저해제는 항암효과가 있음을 알 수 있다.
p14/ARF-DX2 결합에 특이적인 결합저해제를 선별하기 위해 ELISA-기반 스크리닝을 한 결과, p14/ARF-DX2 결합을 70%이상 저해하는 1차 후보물질을 선별할 수 있었다(18 내지 20 참조). 상기 1차 후보물질이 DX2-p14/ARF 이외에 p53-p14/ARF 쌍 결합을 저해하는지 GST pull down assay를 통해 확인하여 p53-p14/ARF 결합에는 영향을 주지 않는 p14/ARF-DX2 특이적 결합저해제를 선별할 수 있었다(도 21 및 도 22). 또한, p14/ARF-DX2 특이적 결합 저해제로 선별된 후보물질이 p14/ARF-DX2 결합을 저해하는지 GST-pull down assay를 통해 다시 확인한 결과 실제로 p14/ARF-DX2의 결합을 저해함을 확인할 수 있었다(도 23 참조).
따라서 본 발명의 스크리닝 방법은 p14/ARF-DX2 특이적 결합 저해제를 효과적으로 선별할 수 있음을 알 수 있다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 물질 또는 그 물질의 약제학적으로 허용되는 담체의 유효량을 포함한다. 본 명세서에서 용어 “유효량”은 암의 치료 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 0.0001-100 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 유효성분으로 이용되는 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용 억제제는 다양한 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 유효성분은 단일 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 항체 또는 펩타이드를 포함한다.
AIMP2-DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질의 상호작용을 억제하는 항암제를 스크리닝 하는 방법으로, 항암성 물질을 선별하여 항암제를 제조하는데 효과적이다.
도 1은 AIMP2-DX2 형질주입에 따른 p14/ARF의 발현 정도를 측정한 것이다.(EV : AIMP2-DX2 유전자를 포함하지 않는 벡터/ Myc-AIMP2-DX2 : Myc로 tagging 한 AIMP2-DX2 유전자를 포함하는 벡터)
도 2는 AIMP2-DX2, p14/ARF의 제거가 서로의 반감기에 어떤 영향을 주는지 측정한 결과이다.(si-Count : 대조군, si-AIMP2-DX2 : AIMP2-DX2 발현 억제한 실험군, si-p14/ARF : p14/ARF 발현 억제한 실험군, CHX : chlorhexidine, -,2,7(hr) : CHX를 처리한 시간)
도 3은 AIMP2-DX2 제거에 따른 p14/ARF의 핵으로의 위치 이동을 살펴본 것이다.(녹색 : p14/ARF, 파란 색 : 핵, 1.5, 2.5 : si-AIMP2-DX2를 처리한 농도)
도 4는 AIMP2-DX2 면역침전으로 AIMP2-DX2와 p14/ARF 간의 선택적인 결합을 확인한 것이다.(IP:His-AIMP2-DX2 : AIMP2-DX2를 침전시킨 그룹, Sup:침전물의 상층액을 분리한 그룹(AIMP2-DX2와 결합하지 않은 그룹), GFP-EV, GFP-p14, GFP-pRb, GFP-nucleolin, pRb+p14, Nucleolin+p14 : HEK293 세포에 각각의 단백질을 발현시킨 것)
도 5는 핵 내에 AIMP2-DX2와 p14/ARF가 같이 존재하는 것을 면역형광염색으로 관찰한 것이다.
도 6은 AIMP2-DX2, p14/ARF를 직접 재조합 단백질로 만들어 단백질 간의 상호작용을 관찰한 결과이다.(Sup : 침전물의 상층액을 분리한 그룹(AIMP2-DX2와 결합하지 않는 그룹), IP:GST : GST 항체로 침전시킨 그룹 )
도 7은 GST-pull down을 통해 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 특이적 상호작용을 확인한 결과이다.
도 8은 AIMP2-DX2가 pRb 의 이동에 영향을 주는 것을 면역형광으로 관찰한 결과이다. (EV : AIMP2-DX2 유전자가 포함안 된 벡터로 형질주입 시킨 HCT116 세포, AIMP2-DX2 : AIMP2-DX2 유전자가 포함된 벡터로 형질주입 시킨 HCT116 세포)
도 9는 세포 분획별로 pRb 발현여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.(pRb(S.E.) : Short Expose/ pRb(L.E.) : Long Expose )
도 10은 p14/ARF와 pRb가 결합하는 것을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.(Input : 세포파쇄물)
도 11은 p14/ARF가 야생형 pRb와 상호작용하는 것을 확인한 결과이다.
도 12는 2개의 변이형 pRb가 AIMP2-DX2 발현 여부와 관계없이 세포질에 존재하는 것을 면역형광으로 확인한 결과이다.
도 13은 AIMP2-DX2가 p14/ARF와 pRb의 상호작용을 저해하는 것을 증명하는 결과이다.
도 14는 AIMP2-DX2의 감소가 p14/ARF 및 pRb의 발현을 증가시키는 것을 보여주는 결과이다.
도 15는 AIMP2-DX2가 없으면 pRb와 p14/ARF가 핵으로 이동한다는 것을 보여준다.
도 16은 His-DX2 Co-immunoprecipitation을 통해 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 특이적 상호작용을 확인한 결과이다. (p14-F : p14/ARF full length, p14-N : p14/ARF N-말단 부위)
도 17은 AIMP2-DX2가 p14/ARF의 N-말단 부위에 결합하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 18은 p14/ARF-DX2 특이적 저해제 스크리닝 방법을 나타내는 모식도이다.
도 19는 ELISA를 이용하여 p14/ARF-DX2 결합을 저해하는 시험물질을 찾아내는 방법을 보여준다.
도 20은 시험물질을 ELISA-기반 스크리닝한 결과를 보여준다.
도 21은 ELISA-기반 스크리닝을 통해 선별된 1차 후보물질들의 p14/ARF-DX2 결합저해를 확인한 GST pull down 결과이다.
도 22는 ELISA-기반 스크리닝을 통해 선별된 1차 후보물질들이 p14/ARF-DX2 이외의 단백질결합을 저해하는지 확인한 특이성 검사 결과이다.
도 23은 특이성 검사 결과 선별된 후보물질의 p14/ARF-DX2 결합저해를 확인한 GST pull down 결과이다.
도 2는 AIMP2-DX2, p14/ARF의 제거가 서로의 반감기에 어떤 영향을 주는지 측정한 결과이다.(si-Count : 대조군, si-AIMP2-DX2 : AIMP2-DX2 발현 억제한 실험군, si-p14/ARF : p14/ARF 발현 억제한 실험군, CHX : chlorhexidine, -,2,7(hr) : CHX를 처리한 시간)
도 3은 AIMP2-DX2 제거에 따른 p14/ARF의 핵으로의 위치 이동을 살펴본 것이다.(녹색 : p14/ARF, 파란 색 : 핵, 1.5, 2.5 : si-AIMP2-DX2를 처리한 농도)
도 4는 AIMP2-DX2 면역침전으로 AIMP2-DX2와 p14/ARF 간의 선택적인 결합을 확인한 것이다.(IP:His-AIMP2-DX2 : AIMP2-DX2를 침전시킨 그룹, Sup:침전물의 상층액을 분리한 그룹(AIMP2-DX2와 결합하지 않은 그룹), GFP-EV, GFP-p14, GFP-pRb, GFP-nucleolin, pRb+p14, Nucleolin+p14 : HEK293 세포에 각각의 단백질을 발현시킨 것)
도 5는 핵 내에 AIMP2-DX2와 p14/ARF가 같이 존재하는 것을 면역형광염색으로 관찰한 것이다.
도 6은 AIMP2-DX2, p14/ARF를 직접 재조합 단백질로 만들어 단백질 간의 상호작용을 관찰한 결과이다.(Sup : 침전물의 상층액을 분리한 그룹(AIMP2-DX2와 결합하지 않는 그룹), IP:GST : GST 항체로 침전시킨 그룹 )
도 7은 GST-pull down을 통해 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 특이적 상호작용을 확인한 결과이다.
도 8은 AIMP2-DX2가 pRb 의 이동에 영향을 주는 것을 면역형광으로 관찰한 결과이다. (EV : AIMP2-DX2 유전자가 포함안 된 벡터로 형질주입 시킨 HCT116 세포, AIMP2-DX2 : AIMP2-DX2 유전자가 포함된 벡터로 형질주입 시킨 HCT116 세포)
도 9는 세포 분획별로 pRb 발현여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.(pRb(S.E.) : Short Expose/ pRb(L.E.) : Long Expose )
도 10은 p14/ARF와 pRb가 결합하는 것을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.(Input : 세포파쇄물)
도 11은 p14/ARF가 야생형 pRb와 상호작용하는 것을 확인한 결과이다.
도 12는 2개의 변이형 pRb가 AIMP2-DX2 발현 여부와 관계없이 세포질에 존재하는 것을 면역형광으로 확인한 결과이다.
도 13은 AIMP2-DX2가 p14/ARF와 pRb의 상호작용을 저해하는 것을 증명하는 결과이다.
도 14는 AIMP2-DX2의 감소가 p14/ARF 및 pRb의 발현을 증가시키는 것을 보여주는 결과이다.
도 15는 AIMP2-DX2가 없으면 pRb와 p14/ARF가 핵으로 이동한다는 것을 보여준다.
도 16은 His-DX2 Co-immunoprecipitation을 통해 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 특이적 상호작용을 확인한 결과이다. (p14-F : p14/ARF full length, p14-N : p14/ARF N-말단 부위)
도 17은 AIMP2-DX2가 p14/ARF의 N-말단 부위에 결합하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 18은 p14/ARF-DX2 특이적 저해제 스크리닝 방법을 나타내는 모식도이다.
도 19는 ELISA를 이용하여 p14/ARF-DX2 결합을 저해하는 시험물질을 찾아내는 방법을 보여준다.
도 20은 시험물질을 ELISA-기반 스크리닝한 결과를 보여준다.
도 21은 ELISA-기반 스크리닝을 통해 선별된 1차 후보물질들의 p14/ARF-DX2 결합저해를 확인한 GST pull down 결과이다.
도 22는 ELISA-기반 스크리닝을 통해 선별된 1차 후보물질들이 p14/ARF-DX2 이외의 단백질결합을 저해하는지 확인한 특이성 검사 결과이다.
도 23은 특이성 검사 결과 선별된 후보물질의 p14/ARF-DX2 결합저해를 확인한 GST pull down 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 세포 및 시약
세포 HEK293, HCT116는 American Type culture collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구매하였고, NCI-H23 세포는 서울대 김성훈 교수님으로부터 얻었으며, 배지는 10% FBS와 항생물질을 함유하고 있는 RPMI-1640 또는 DMEM를 사용했다. 일반적인 시약들은 Sigma(St Louis, MO, USA)로부터 구입했고, 화학적 저해제들은 Calbiochem(San Die해, CA, USA)에서 구입했다.
2. 웨스턴 블랏 (Western blot analysis)
세포로부터 단백질 추출은 Radioimmunoprecipitation assay (RIPA; 150mM NaCl, 25mM Tris-Cl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, protease 저해제 혼합물)를 이용했다. 버퍼용액에 세포 파쇄물을 넣은 후, 7분 동안 95℃에서 보관했다. 시료들은 SDS-PAGE를 한 후, 웨스턴 블랏을 실시했다. 단백질이 옮겨진 막을 일차 항체들과 함께 배양했다. 사용한 항체들은 아래 [표 1]에 표시했다. 막을 5분 동안 세척한 후, HRP-conjugated 2nd 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 배양된 막은 5분씩 3번 세척하였다.
| 항체 | Cat. No. | Provider | Dilution |
| Actin | sc-1616 | Santa Cruz | 1:1000 |
| C-Myc | M5546 | Sigma | 1:1000 |
| GFP | sc-9996 | Santa Cruz | 1:1000 |
| GST | sc-138 | Santa Cruz | 1:1000 |
| HA | sc-7392 | Santa Cruz | 1:1000 |
3. 재조합 단백질, 면역 침전, GST pull-down
p14/ARF 단편(Full-length)을 pGEX-4T1 자리에 TEV 프로 프로테아제 절단 부위를 더해서 제조한 pGEX-TEV 벡터의 Hind II 부위에 라이게이션 시켰다. 재조합 단백질은 E. coli strain BL21(DE3)에서 GST 결합 형태로 발현된다. 단백질은 글루타티온 친화성 크로마토그래피로 분리한다. 분리한 p14/ARF의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시된다.
두 단백질의 직접적인 결합을 확인하기 위해서 agarose-bead conjugated GST (음성 대조군) 또는 GST-단백질을 RIPA 버퍼에 4℃에서 1시간 동안 놓아둔다. 면역침전(Immunoprecipitation, IP) 분석은 RIPA 버퍼에서 세포파쇄물 또는 재조합 단백질로 수행했다. 모든 세포 파쇄물은 4℃에서 2시간 동안 적합한 항체와 배양한 후, A/G agarose beads-conjugated secondary antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 와 2시간 동안 혼합하였다. 배양 후, 혼합물을 RIPA 버퍼로 2번 세척해 준 후, 침전된 단백질은 웨스턴 블랏 분석으로 확인한다.
4. 포유류 발현 플라스미드의 형질주입과 si-RNA
GFP-p14/ARF(p14/ARF의 N 말단에 GFP 부착) 또는 GFP-p14/ARF-N(N-말단 부위)을 암호화하는 포유류 발현 플라스미드(Cancer Research UK, London Research Institute), His-AIMP2, His-AIMP2-DX2 벡터(서울대 김성훈 교수)를 준비하였다. 상기 GFP-p14/ARF 또는 GFP-p14/ARF-N은 발현 시, GFP 단백질의 시작코돈을 사용하여 p14/ARF 단백질은 아미노산 서열 2번째부터 발현되었다.
야생형 및 두 변이형 pRb(567L, 661W; point mutant; Sellers, 1998)는 Addgene (Cambridge, USA)에서 구입하였다.
각각 유전자를 간섭하는 si-RNA는 아래 [표 2]에 기재했다. 형질주입은 Jet-pei (Polyplus Transfection, New York, NY) reagent를 이용하여 24시간동안 수행되었다. 간단히 말하자면, 하루 전에 뿌린 세포를 PBS로 세척한 후, 무혈청 조건으로 4시간 동안 DNA/Jet-pei mixture와 같이 배양한다. 대조군은 타겟이 없는 서열이다.
| si-RNA | 서열(5‘ -> 3’) | 서열번호 |
| AIMP2-DX2 | TCGAGCGGGCCACGTGCAGGACTA | 1 |
| p14/ARF | GAACATGGTGCGCAGGTTC | 2 |
| 대조군 | AATTCTCCGAACGTGTCTCGT | 3 |
5. 면역형광 염색
커버슬립에서 세포를 100% MeoH로 -20℃에서 1시간 동안 고정시킨다. PBS로 세척 후, PBS 버퍼(non-related Goat 항체(1:500))로 비특이적 반응을 제거하여 차단했다. 그 후, 세포들은 일차 항체들(1: 50~1: 200; overnight at 4℃), Rhodamine-conjugated secondary antibodies(상온, 1시간 내지 12시간)와 배양했다. DAPI(4, 6-diamidino-2-phenylindole)는 핵염색에 사용했다. PBS로 세척 후, 커버슬립에 mounting solution(Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA), H-5501)을 떨어뜨린 후, 형광 현미경 분석(Zeizz)을 한다.
6. p14/ARF-DX2 특이적 저해제 스크리닝
<6-1> 화학물질 라이브러리
스크리닝에 사용된 시험물질은 합성화합물과 천연물 라이브러리는 논문(Lee, S.H. et al., Oncogene 29, 4576-4587, 2010; Lee, S.H. et al., p53, Oncogene 28, 2005-2014, 2009)에 기재된 것과 대한화학회에서 제공받은 8000개 화학물질을 사용하였다.
<6-2> 효소면역분석법
p14/ARF의 DX2 결합을 저해하는 저해제를 찾기 위해, 효소면역분석법-기반 스크리닝 시스템을 만들었다. His-DX2 재조합 단백질을 96-well plate에 1% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. plate를 건조하고 세척한 후, 최종농도 0.1mM 화학물질과 GST-p14/ARF 단백질을 배양하였다. 1시간 후 plate를 Tris-buffered saline-Tween20로 세척한 후, 항-GST 항체(1:10,000)와 30분, anti-mouse IgG-HRP(1:50,000)와 1시간동안 배양하였다. 두 번 세척한 후, plate를 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine solution (Calbiochem)과 stop solution (1N H₂SO₄)으로 배양하였다. 그 후, ELISA reader를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
ELISA 결과를 기반으로, p14/ARF-DX2 결합을 70% 이상 저해하는 화학물질을 p14/ARF-DX2 결합저해제의 1차 후보물질로 선별하였다. 그 중 다른 스크리닝에 의해 이미 알려진 화학물질을 제외하였다. 상기 1차 후보물질 중 GST pull down assay를 통해 p53-p14/ARF의 결합을 저해하는 비특이적 저해제를 1차 후보물질에서 제외하여, p14/ARF-DX2 특이적 결합저해제를 선별하였다.
<실험결과>
1. AIMP2-DX2는 p14/ARF의 발현을 조절한다.
AIMP2-DX2를 형질주입 한 그룹과 하지 않은 실험군으로 나눈 후, p14/ARF 발현을 웨스턴 블랏으로 측정해보았고, 그 결과는 [도 1]에 표시했다. 상기 도 1에서 AIMP2-DX2의 형질주입이 p14/ARF 발현을 감소시켰음을 확인할 수 있다. 반면 음성대조군으로 사용한 RKIP(Raf kinase 억제 단백질/ 암 억제 기능)은 AIMP2-DX2 형질주입 여부에 관계없이 발현되었다. 따라서 AIMP2-DX2가 선택적으로 p14/ARF를 저해하는 것으로 판단된다.
또한, AIMP2-DX2와 p14/ARF에 각각 작용하는 si-RNA를 이용하여 단백질들의 발현을 저지한 후, 0, 2, 7시간마다 CHX(Cycloheximide)를 처리해서 나머지 단백질의 발현정도로 반감기를 관찰했고, 그 결과는 [도 2]에 표시했다. AIMP2-DX2의 제거는 p14/ARF 의 반감기를 연장시켰고, p14/ARF 제거는 AIMP2-DX2의 반감기를 연장시킴을 상기 도 2에서 확인할 수 있다.
또한 AIMP2-DX2 제거는 p14/ARF의 핵질 내 발현을 촉진시킴을 면역형광염색으로 관찰했고, 이는 도 3에서 확인할 수 있다.
2. AIMP2-DX2와 p14/ARF는 직접적으로 결합한다.
AIMP2-DX2와 p14/ARF가 직접적으로 결합하여 상호작용하는지 검사해보았다. GFP-p14/ARF가 발현한 HEK293 세포 파쇄물을 Histidine으로 표지한 AIMP2-DX2(His-AIMP2-DX2)과 함께 배양했다. 배양물을 Histidine 항체로 면역침전킨 후, 침전된 단백질에 p14, pRb(암 억제 단백질), 뉴클레오린(암 억제 저해 단백질)이 포함되어 있는지 GFP 항체로 확인해보았다. 그 결과, 침전된 단백질에서는 p14만 발견되었다. 반면에 AIMP2-DX2와 혼합한 뒤, 침전물을 제외한 상층액에서는 p14, pRb, 뉴클레오린 모두 발견되었다(도 4 참조). 따라서 AIMP2-DX2는 p14와 결합한다는 것을 알 수 있다.
AIMP2-DX2와 p14/ARF가 같이 같은 곳에 존재하는 것을 면역형광염색(HEK293 세포의 GFP-p14/ARF : 녹색/ 재조합 단백질 Myc-AIMP2-DX2 : 빨강)으로 확인하였다. 결과는 [도 5]에 표시하였다.
AIMP2-DX2와 p14/ARF가 결합하는지 두 단백질을 재조합 단백질로 제조하여 직접 살펴보았다. AIMP2-DX2는 His으로 표지(His-AIMP2-DX2)하였고, p14/ARF는 GST(GST-p14)로 표지하였다. GST 항체 면역침전을 실시한 결과, His-AIMP2-DX2는 단독으로 넣었을 때는 검출이 안됐지만, GST-p14와 같이 넣었을 때는 검출이 되었다. 따라서 AIMP2-DX2가 p14/ARF와 결합한다는 것을 알 수 있다(도 6 참조).
또한, 상기 AIMP2-DX2-p14/ARF 결합이 직접적이고 선택적이라는 것을 확인하기 위해, p53을 이용한 GST pull-down을 실시했다. p53은 AIMP2-DX2, AIMP2와 상호작용한다는 것이 밝혀진 바 있다. GST-p53 으로 실험한 결과에서는 pull-down 후, His 면역침강 결과, AIMP2-DX2, AIMP2 에 관계없이 모두 단백질이 검출되었지만, GST-p14에서는 His-AIMP2-DX2를 넣었을 때에만, His 면역침강 시 단백질이 검출되었다.
p14/ARF와 AIMP2-DX2의 결합 도메인을 알아보기 위해, p14/ARF full-length 또는 N-말단 부위로 형질감염된 세포 파쇄물을 His-DX2 Co-immunoprecipitation으로 분석해보았다. 분석한 결과, AIMP2-DX2가 p14/ARF의 N-말단부위에 결합하며, AIMP2는 결합하지 않는 것을 확인하였다(도 16 참조). AIMP2-DX2는 AIMP2의 엑손 2 영역이 결실된 것으로, AIMP2의 엑손 1 및 3 영역이 연결된 부위에 해당하는 AIMP2-DX2 도메인이 p14/ARF N-말단 부위에 결합하였다(도 17 참조).
3. pRb는 p14/ARF를 통해 AIMP2-DX2에 의해 억제된다.
pRb의 결핍은 소세포폐암(SCLC) 진행에 필수적이고, pRb는 세포 분화와 증식과 관련이 있음이 알려져 있다. 따라서 AIMP2-DX2가 pRb 기능에 어떤 영향을 주는지 알아보았다. AIMP2-DX2 와 pRb 벡터를 HCT116 세포에 24시간 동안 형질주입 시켰고, 고정 후, 세포를 항-pRb(녹색) 와 DAPI 염색(파랑)을 하였다. 그 결과, pRb의 위치는 AIMP2-DX2에 의해 핵에서 세포질로 이동했다(도 8 참조).
형질주입한 상기 HCT116 세포를 분획을 실시하여 각각의 분획에서 웨스턴 블랏을 실시한 결과, AIMP2-DX2는 핵 내 pRb의 발현을 감소시켰다(도 9 참조).
이에 AIMP2-DX2와 pRb의 결합을 알아보고자, pRb 및 p14 과발현 HEK293 세포 파쇄물을 His 표지한 AIMP2-DX2 재조합 단백질과 함께 배양하였다. 그 후, 항-pRb 항체와 함께 공동 면역 침전을 한 후, 웨스턴 블랏을 실시했다. 그 결과, pRb는 AIMP2-DX2에 결합하지 않고, p14/ARF에 직접적으로 결합했다(도 10 참조).
p14/ARF가 결합하는 pRb가 야생형인지 변이형인지 여부를 GST-pull down assay로 밝혔다. Agarose bean conjugated GST-p14/ARF 를 야생형, 변이형 pRb(567L, 661W)가 각각 과발현 된 HEK293 세포 파쇄물과 같이 배양했고, 결합 여부는 웨스턴 블랏으로 테스트 하였다. GFP-pRb는 양성대조군으로 사용했다. p14/ARF는 변이형이 아닌 야생형 pRb와 상호작용 한다는 것을 확인하였다(도 11 참조). 또한, 상기 두 변이형 벡터들을 HCT116에 형질주입 하여 면역형광염색을 실시한 결과, 2개의 변이형 타입은 AIMP2-DX2 과발현 여부와 관계없이 세포질에 존재했다(도 12 참조).
AIMP2-DX2가 p14/ARF와 pRb의 결합을 저해하는지 여부를 알아보기 위해, His-AIMP2-DX2와 Myc-p14/ARF+pRb가 발현된 HEK293 세포 파쇄물을 면역침전 분석을 해보았다. 분석한 결과, AIMP2-DX2는 p14와 pRb간의 상호작용을 저해하는 것을 확인하였다(도 13 참조). A549 세포에 p14/ARF를 형질주입하고, si-AIMP2-DX2를 처리하여 내생성 AIMP2-DX2를 제거한 후, 면역침전 분석을 한 결과, AIMP2-DX2의 감소는 p14 및 pRb를 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 14 참조). 또한, NCI-H23 세포(내생성 AIMP2-DX2가 발현된 인간 폐암 세포주)에 GFP-p14/ARF를 형질주입하여, si-AIMP2-DX2를 처리한 후, IF를 실시한 결과, AIMP2-DX2의 결핍이 pRb와 p14/ARF의 핵으로의 이동을 촉진시킴을 확인하였다(도 15 참조).
4. p14/ARF-DX2 결합 특이적 저해제를 선별하였다.
p14/ARF-DX2 결합에 특이적인 결합저해제를 선별하기 위해 ELISA-기반 스크리닝을 하였다. 시험물질 9200여개의 ELISA 결과 p14/ARF-DX2 결합을 70%이상 저해하는 화학물질을 선별한 후, 이미 스크리닝된 물질은 후보에서 제하였다(18 내지 20 참조). 상기 과정을 통해 얻어진 14개 후보물질이 GST pull down assay를 통해 p53-p14/ARF 쌍 결합 또는 DX2-p14/ARF 쌍 결합을 저해하는지 확인해보았다. 그 결과, 5개 후보물질(D12, F6, F9, 889-A4, SLC36)만이 p53-p14/ARF 결합에는 영향을 주지 않는 p14/ARF-DX2 특이적 결합저해제임을 확인할 수 있었다(도 21 및 도 22). 또한, p14/ARF-DX2 특이적 결합 저해제로 선별된 SLC36이 p14/ARF-DX2 결합을 저해하는지 GST-pull down assay를 통해 다시 확인한 결과 실제로 SLC36이 p14/ARF-DX2의 결합을 저해함을 확인할 수 있었다(도 23 참조).
AIMP2-DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질의 상호작용을 억제하는 항암제를 스크리닝 하는 방법으로, 항암성 물질을 선별하여 항암제를 제조할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.
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tcgagcgggc cacgtgcagg acta 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aattctccga acgtgtctcg t 21
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<212> PRT
<213> AIMP2-DX2 of Homo sapiens
<400> 4
Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly
20 25 30
Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly
35 40 45
Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu
50 55 60
Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu
65 70 75 80
Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu
85 90 95
Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr
100 105 110
Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met
115 120 125
Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile
130 135 140
Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn
145 150 155 160
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165 170 175
Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser
180 185 190
Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala
195 200 205
Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val
210 215 220
Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu
225 230 235 240
Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys
245 250
<210> 5
<211> 243
<212> PRT
<213> AIMP2-DX2 of Homo sapiens
<400> 5
Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly
35 40 45
Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu
50 55 60
Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu
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Pro Gly Arg Gly Ala Ala Gly Arg Ala Arg Cys Leu Gly Pro Ser Ala
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Arg Gly Pro Gly
130
Claims (14)
- (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험물질이 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편은 이를 발현하는 세포 또는 조직의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 AIMP2-DX2 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 p14/ARF 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 시험물질을 분리된 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편 및 분리된 p14/ARF 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 AIMP2-DX2 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계로, 상기 시험물질이 접촉되지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 AIMP2-DX2의 발현이 감소된 경우, 상기 시험물질을 1차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 AIMP2-DX2 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 p14/ARF 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단계 (b)는 공동-면역침전법(co-immunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 p14/ARF 단백질의 단편은 서열번호 6의 1번째 내지 29번째 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 p14/ARF 단백질의 단편은 서열번호 6의 2번째 내지 29번째 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은
(c) 상기 (b)단계에서 선별된 1차 후보물질을 p14/ARF 및 이와 결합하는 AIMP2-DX2 이외의 단백질과 접촉시키는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 p14/ARF 및 이와 결합하는 AIMP2-DX2 이외의 단백질의 상호작용에 영향을 미치지 않는 1차 후보물질을 2차 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2와 p14/ARF의 상호작용을 억제하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 AIMP2-DX2 이외의 단백질은 p53, MDM2(Mouse double minute 2 ), E2F1(E2F transcription factor 1), 프로게린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 단계 (c)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
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