KR20140104377A

KR20140104377A - 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20140104377A
Application number: KR1020140019141A
Authority: KR
Inventors: 장윤실; 박원순
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2014-02-19
Publication date: 2014-08-28
Also published as: WO2014129792A1; KR101654970B1; EP2959909A1; EP2959909A4; US20160000831A1; US10493104B2; EP2959909B1

Abstract

본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포는 뇌 염증성 질환 동물모델에 직접 투여될 경우, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상이 크게 감소하며, 체중 감소 현상이 크게 완화되는 등, 뇌 염증성 질환에 대한 우수한 치료 효과를 가지고 있어, 뇌 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물 {Composition containing stem cell for treating inflammatory disease of brain}

본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로, 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4~5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하고, 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며, 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다. 성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포로 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나 최근에는 성체 줄기세포를 이용하여 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다.

줄기 세포들은 자기 재생(self-renewing), 분화, 영구성(immortal) 등의 특징을 가지고 있으며, 다양한 조직으로부터 얻을 수 있는 성체 줄기 세포는 일반적으로 배아 줄기 세포에 비해 무제한적인 소스와 연구자들이 직면할 수 있는 윤리적 문제를 피할 수 있기 때문에 널리 연구에 이용되고 있다. 더욱이, 제대혈로부터 분리한 줄기세포는 골수나 지방 조직과 달리 기증자가 추가적인 해를 입을 염려가 없기 때문에 다른 성체 줄기세포들보다 더 큰 장점을 가지고 있다.

한편, 뇌 염증성 질환이란 특정 원인에 의해 뇌에 발생하는 염증성 질환을 의미하는 것으로, 뇌염, 뇌수막염, 수막뇌염 등을 모두 포함한다. 뇌염이란 뇌 실질의 염증성 질환을 총칭하는 말로서 뇌를 싸고 있는 뇌수막에 생기는 염증(뇌수막염)과는 구별되는 질환이다. 뇌수막염과 뇌염이 함께 있는 경우는 이를 수막뇌염이라고 한다. 뇌염은 원인에 따라 감염성, 혈관염성, 종양성, 화학성, 특발성 등으로 크게 분류할 수 있으며, 각각 세부 항목에 따라 구체적인 병인에 대한 뇌염으로 다시 분류를 할 수 있다. 또한 질환의 시간적 경과에 따라 급성, 아급성, 만성 뇌염으로 분류하기도 한다. 현재까지 뇌 염증성 질환의 치료를 위한 방안으로 항생제를 이용하고 있으나, 항생제 치료에 의해 원인균이 치료된다 하더라도 심각한 뇌 손상, 뇌 수두증, 난청, 간질 등의 부작용을 일으키고 있어, 이에 대한 새로운 치료법의 개발이 요구되고 있다. 그러나, 현재까지 줄기세포를 이용한 뇌 염증성 질환의 치료에 대해서는 체계적인 연구가 미비한 실정이다.

이에 본 발명자들은 새로운 뇌 염증성 질환의 치료제를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 줄기세포를 뇌 염증성 질환 동물모델의 뇌실에 직접 투여할 경우, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상이 크게 감소하고 체중 감소 현상이 크게 완화되는 등 부작용이 적으면서도, 세포 사멸 및 반응성 아교화의 정도가 감소하며, 뇌의 활성 대식세포의 수 및 염증성 사이토카인 수치가 현저하게 감소되는 등, 뇌 염증성 질환에 대한 우수한 치료 효과를 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포는 뇌 염증성 질환 동물모델에 직접 투여될 경우, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상이 크게 감소하고 체중 감소 현상이 크게 완화되는 등 부작용이 적으면서도, 세포 사멸 및 반응성 아교화의 정도가 감소하며, 뇌의 활성 대식세포의 수 및 염증성 사이토카인 수치가 현저하게 감소되는 등, 뇌 염증성 질환에 대한 우수한 치료 효과를 가지고 있어, 뇌 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 줄기세포의 뇌 염증성 질환에 대한 치료 효과를 확인하기 위한 실험 설계도를 나타낸 도이다.
도 2는 뇌 염증 유도 전 후, 및 줄기세포 투여 여부에 따라 변화한 뇌를 MRI 촬영을 통해 나타낸 도이다.
도 3은 뇌염 동물모델에서 줄기세포 투여 여부에 따른 뇌 손상 부위/전체 뇌 부위의 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 뇌염 동물모델에서 줄기세포 투여 여부에 따른 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 뇌염 동물모델에서 줄기세포 투여 여부에 따른 뇌 조직의 면역 형광 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 뇌염 동물모델에서 줄기세포 투여 여부에 따른 뇌 조직 내 단백질 발현의 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 뇌염 동물모델에서 줄기세포 투여 여부에 따른 뇌 조직 내 염증성 사이토카인 발현의 변화를 나타낸 도이다.

본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 줄기세포란 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서, 어느 특정한 또는 복수 개의 기능적 세포로 분화되는 능력 및 스스로 동일한 세포를 반복적으로 생산할 수 있는 자기 복제 능력을 가진, 미분화 세포를 일컫을 수 있다. 이것은 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견될 수 있다.

상기 줄기세포는, 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 유래의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 줄기세포로서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하였다.

본 발명의 일 실시예에서 이용된 줄기세포는 인체의 제대혈에서 분리, 배양한 것으로, 상기 줄기세포는 CD105와 CD73 표지자가 발현되고, CD34, CD45 및 CD14 표지자는 거의 발현되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포는 HLA-AB에 양성이고, HLA-DR에는 음성이며, 다분화 표지자인 Oct4 및 SSEA-4가 발현되는 특성을 가지고 있다.

본 발명의 줄기세포를 수득하기 위하여, 제대혈을 채취, 분리하는 방법은 다음과 같다. 정상 질식분만의 경우에는 아기 출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취할 수 있으며, 제왕절개의 경우에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다. 출산 후 자궁 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 제대혈을 채취할 때는, 신생아가 태어난 후 태반과 태아를 연결하고 있던 제대정맥으로부터 무균적 조작법에 의해 채취한다. 이때, 출산 후 자궁에서 태반박리가 일어나기 전에 제대혈을 채취하거나, 태반박리가 일어난 후 체외에서 제대혈을 채취하는 두 가지 방법을 모두 사용할 수 있다. 제왕절개의 경우에는 태반박리가 일어난 후 체외에서 제대혈을 채취하는 방법을 사용하며, 제대정맥을 확보한 후에 채취침을 이용하여 항응고제가 함유된 제대혈 채취백(주머니)에 제대혈을 채취한다.

채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리배양하는 방법으로는 대한민국 공개특허 제2003-0069115호의 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법(Pittinger MF et al. Science, 284: 143-7, 1999; 및 Lazarus HM et al. Bone Marrow Transplant, 16: 557-64, 1995)을 사용할 수 있으며, 그 중 한 예를 들면 다음과 같다. 먼저, 채취된 제대혈을, 예를 들어, 피콜-하이팩 농도구배(Ficoll-Hypaque gradient)를 이용하여 원심분리함으로써 조혈모세포 및 간엽줄기세포를 포함하는 단핵구 세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질을 제거한다. 세척 후 적절한 밀도로 단핵세포들을 배양용기에 심어 배양하면, 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는데, 이 중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성(homogeneous)이면서, 방추형 모양(spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 집락(colony) 형태로 증식하는 세포가 간엽줄기세포이다. 이후 세포가 배양되어 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식시킨다.

본 발명에서 간엽줄기세포의 분리 및 배양에 사용 가능한 배양 배지로는 10% 내지 30% FBS를 포함하는 세포 배양용 배지를 사용할 수 있으며, 세포 배양용 배지로는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지(minimal essential medium, MEM)를 비롯하여 알파-최소 필수 배지(-MEM), 맥코이스(McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지(eagle's basal medium), CMRL(Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우(Glasgow) 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠(Liebovitz') L-15 배지, RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지는 모두 사용 가능하다.

본 발명에 따른 줄기세포는 뇌 염증성 질환 동물모델의 뇌실에 직접 투여될 경우, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상이 크게 감소하고 체중 감소 현상이 크게 완화되는 등 부작용이 적으면서도, 세포 사멸 및 반응성 아교화의 정도가 감소하며, 뇌의 활성 대식세포의 수 및 염증성 사이토카인 수치가 현저하게 감소되는 등, 뇌 염증성 질환에 대한 우수한 치료 효과를 가지고 있어, 뇌 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에서 뇌 염증성 질환은 뇌에 발생하는 모든 염증성 질환을 총칭하는 것으로, 뇌염, 뇌수막염, 수막뇌염을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 줄기세포와 함께 뇌 염증성 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 개체의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 바람직한 효과를 위해서, 줄기세포의 1일 투여량은 1.0×10² 내지 1.0×10¹⁰ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 개체의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 개체의 뇌실 내에 직접 생착 또는 이식하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 뇌 염증성 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 중간엽 줄기세포의 준비 및 특징 분석

인간 제대혈(human umbilical cord blood)로부터 중간엽 줄기세포를 분리하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 채취된 제대혈을 피콜-하이팩 농도구배(Ficoll-Hypaque gradient)를 이용하여 원심분리함으로써 조혈모세포 및 간엽 줄기세포를 포함하는 단핵구 세포들을 분리한 후, 이를 여러 번 세척하여 이물질을 제거하였다. 세척 후 단핵세포들을 배양용기에 심어 배양한 후, 단일층을 이루면서 증식하는 세포 중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성(homogeneous)이면서, 방추형 모양(spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 집락(colony) 형태로 증식하는 세포인 간엽 줄기세포를 분리하였으며, 상기 세포의 계대배양을 수행하였다. 5회째 계대배양한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 줄기세포는 CD105와 CD73 표지자가 발현되고, CD34, CD45 및 CD14 표지자는 거의 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 상기 줄기세포는 HLA-AB에 양성이고, HLA-DR에는 음성이며, 다분화 표지자인 Oct4 및 SSEA-4가 발현됨을 확인하였다.

실시예 2. 뇌염 동물 모델에서 중간엽 줄기세포의 뇌실 내 이식 및 뇌염 치료 효과 검증

2-1. 뇌염 동물 모델의 디자인

뇌염 동물 모델을 만들기 위해, 생후 10일 된 신생 백서를 일산화질소(NO)로 흡입 마취한 후, 스테레오텍식 프레임(stereotaxic frame)을 이용하여 오른쪽 뇌실에 1×10³ CFU(colony forming unit)의 E. coli(Escherichia coli) (10 ul)를 31 gauze 주사기로 60초에 걸쳐서 천천히 투여하고, 항생제(Ampicilline, 200 mg/kg)를 12시간 간격으로 2일간 투여하였다. 본 발명의 줄기세포의 뇌염 치료 효과를 확인하기 위해, 모델링(뇌염 유발) 1일 후인, 생후 11일(P11) 째에 중간엽 줄기세포 1×10⁵개를 10 ul PBS에 희석하고, 일산화질소(NO) 흡입 마취 하에 스테레오텍식 프레임을 이용하여, 백서의 오른쪽 뇌실 내로 천천히 투여하였다. 뇌염 대조군의 경우 생리식염수를 백서의 오른쪽 뇌실 내에 투여하였다. 이상의 실험 과정을 도 1에 나타내었다.

2-2. 뇌 MRI 촬영 및 체중 측정

상기 2-1에서 확립한 뇌염 동물 모델을 이용하여 뇌 MRI 촬영, 뇌척수액 배양 및 체중을 측정하였다. 보다 구체적으로, 뇌염 유발 1일 후인, 생후 11일 째(P11)의 백서의 뇌를 7-teslar 자기공명영상(MRI)을 이용하여 촬영하고, 뇌염으로 인한 손상의 정도를 DWI(Diffusion Weighted Image) 영역으로 확인하였다. 또한, 뇌척수액 감염을 확인하고자, 각 백서에 Cistern tap을 시행하여 뇌척수액을 얻었고, 상기 뇌척수액의 배양을 통해 E.coli를 확인하였다. 또한, 백서의 생후 16일 째(P16)에 모든 백서의 뇌를 7-teslar MRI를 이용하여 촬영하여 뇌 손상 정도를 추적 관찰하였다. 뇌 MRI 이미지는 Image J 프로그램을 이용하여 뇌실 증가와 DWI의 뇌실질 경색부위를 측정하여 뇌 손상으로 정의하고 "전체 손상된 뇌의 부피/전체 뇌의 부피"를 구하였다. 또한, 실험 전후로 각 백서의 체중을 측정하였다.

각 실험 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 생후 11일 째의 정상 백서(Normal)에 비하여, 뇌염이 유도된 백서(P11)의 경우 심각한 뇌실질의 부종(edema) 및 손상 소견과 뇌실확장 소견이 보였고, 뇌척수액 배양검사에서 E.coli가 배양되어 뇌염이 유도되었음을 확인하였다. 또한, 생후 16일(P16) 째에 추적 관찰한 뇌 MRI에서, 뇌염이 유도된 이후 본 발명의 줄기세포를 뇌실 내로 투여받은 백서의 경우, 줄기세포를 투여받지 않은 백서에 비해 뇌실 확장의 정도가 의미 있게 감소함을 확인하였다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 뇌염 유도군은 정상 백서(Normal)에 비해 뇌 손상이 증가하였으며, 각 물질의 투여 전(P0)에는 생리식염수를 투여한 뇌염 대조군(Meningitis control)과 본 발명의 줄기세포를 투여한 뇌염 줄기세포 치료군(Meningitis+MSC) 간에 뇌 손상 정도의 차이가 없었으나, 각 물질의 투여 후(P7)에는 뇌염 대조군에선 뇌 손상이 유의하게 증가한대 비해, 뇌염 줄기세포 치료군은 뇌 손상이 증가하지 않아, 뇌염 유도 후 본 발명의 줄기세포 투여에 의해 뇌 손상의 정도가 현저히 개선됨을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 실험 시작 시점(P0)에는 모든 그룹간에 평균 몸무게가 유사하였으나, 각 물질의 투여 후(P7)에는 뇌염이 유도되고 줄기세포를 투여받지 못한 뇌염 대조군(Meningitis control)의 경우 뇌염으로 인한 전신 상태 약화로 몸무게가 크게 감소하였으며, 본 발명의 줄기세포를 투여한 뇌염 줄기세포 치료군(Meningitis+MSC)의 경우 몸무게의 감소 정도가 현저하게 적은 경향을 나타냄을 확인하였다.

2-3. 뇌 조직의 염색 및 단백질 발현 분석

상기 2-1에서 확립한 뇌염 동물 모델의 실험 종료(생후 16일 째, P16) 후, 각 백서에 케타민을 복강 내 주사하여 마취를 시행하였다. 이후 31 gauze 주사기로 각 백서의 소뇌숨뇌수조(cistern magna)에서 뇌척수액(CSF)을 채취하였으며, 이를 급속 냉동시킨 후, -70˚C에 보관하였다.

또한, 각 백서의 사지 고정 후 흉곽을 절개하여 심장과 폐 조직을 드러나게 하여 23 게이지 바늘을 좌심실 내에 고정한 후 우심방을 천자하여 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 관류시켰다. 이후 두개골을 절개하고, 조심스럽게 뇌 조직을 채취하여 4% 포르말린에 고정하거나, 뇌실 주위 부분을 잘라낸 후 질소 가스를 이용하여 이를 급속 냉동시킨 후 -70˚C에 냉동 보관하였다.

상기 과정을 통해 분리한 뇌 조직을 이용하여 종래 공지된 방법에 따라 TUNEL(immunofluorescent terminal deoxynycleotidyltransferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling), GFAP(neuronal specific glial fibrillary acidic protein) 및 ED-1 등 면역 형광염색을 수행하였으며, 웨스턴 블랏을 통해 GFAP와 Caspase-3의 발현 정도를 분석하였다.

또한, 상기 과정을 통해 분리한 뇌실 주위 조직과 뇌 척수액을 이용하여 종래 공지된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 통해 염증성 사이토카인(IL-1, IL-1β, IL-6, TNF-α)의 발현 정도를 측정하였다.

각 실험 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, TUNEL 염색 결과, 양성으로 보이는 세포의 사멸 정도가 정상 백서(Normal)에 비하여 뇌염이 유도되고 줄기세포를 투여받지 못한 뇌염 대조군(Control)에서 크게 증가되었으나, 본 발명의 줄기세포를 투여한 뇌염 줄기세포 치료군(MSC)에서는 대조군에 비하여 현저하게 감소되는 경향을 보였다. 또한, GFAP 염색 결과, 양성으로 보이는 반응성 아교화의 정도가 정상 백서(Normal)에 비하여 뇌염이 유도되고 줄기세포를 투여받지 못한 뇌염 대조군(Control)에서 크게 증가하였으나, 본 발명의 줄기세포를 투여한 뇌염 줄기세포 치료군(MSC)에서는 대조군에 비하여 현저하게 감소되는 경향을 보였다. 또한, ED-1 염색 결과, 양성으로 보이는 뇌의 활성 대식세포의 수가 정상 백서(Normal)에 비하여 뇌염이 유도되고 줄기세포를 투여받지 못한 뇌염 대조군(Control)에서 크게 증가하였으나, 본 발명의 줄기세포를 투여한 뇌염 줄기세포 치료군(MSC)에서는 대조군에 비하여 현저하게 감소되는 경향을 보였다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블랏 결과, 정상 백서(Normal)에 비하여 뇌염이 유도되고 줄기세포를 투여받지 못한 뇌염 대조군(Control)에서 GFAP와 Caspase-3의 비(ratio)가 유의하게 증가되었다. 그러나, 본 발명의 줄기세포를 투여한 뇌염 줄기세포 치료군(MSC)에서는 반응성 아교화의 정도와 세포의 사멸 정도를 판단할 수 있는 GFAP와 Caspase-3의 비가 대조군에 비하여 현저하게 감소되었다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, ELISA 결과, 뇌의 염증성 사이토카인의 발현 정도가 정상 백서(Normal)에 비하여 뇌염이 유도되고 줄기세포를 투여받지 못한 뇌염 대조군(Control)에서 급격하게 증가되었다. 그러나, 본 발명의 줄기세포를 투여한 뇌염 줄기세포 치료군(MSC)에서는 염증성 사이토카인의 수치가 대조군에 비하여 유의하게 호전되었다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 줄기세포의 뇌실 내 이식을 통해 뇌 염증성 질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.

Claims

줄기세포를 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 유래의 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 하기와 같은 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
(1) CD 105, CD73 및 HLA-AB에 대하여 양성의 면역학적 특성;
(2) CD34, CD45, CD14 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성; 및
(3) Oct4 및 SSEA-4의 발현;
제 1항에 있어서, 상기 뇌 염증성 질환은 뇌염, 뇌수막염 및 수막뇌염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.