KR20140101173A

KR20140101173A - Acs4 유전자를 도입한 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화 촉진 방법

Info

Publication number: KR20140101173A
Application number: KR1020130014518A
Authority: KR
Inventors: 조용연
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-02-08
Filing date: 2013-02-08
Publication date: 2014-08-19

Abstract

본 발명은 배아줄기세포에 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자를 도입하여 ACS4를 배아줄기세포에서 발현시켜 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 뇌에서 특이적으로 발현하는 ACS4 1a 이소타입 유전자 및 이의 신경 분화능을 새롭게 규명하고, 이를 바탕으로 하는 배아줄기세포로부터 초기신경세포로의 분화 촉진 방법, 분화 촉진용 조성물 및 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

ACS4 유전자를 도입한 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화 촉진 방법 {Methods for Inducing Differentiation from Embryonic Stem Cells to Early Neuronal Precursor Cells by Introducing ACS4 Gene}

본 발명은 배아줄기세포에 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자를 도입하여 ACS4를 배아줄기세포에서 발현시켜 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진시키는 방법, ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 분화 촉진용 조성물 및 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자를 바탕으로 하는 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

배아줄기세포 (embryonic stem cell; ESC)는 배반포 (blastocyst)의 내부 세포덩어리 (inner cell mass)에서 유래하는 것으로, 자신의 성질을 그대로 유지할 수 있는 자기복제(self-renewal)의 특성과 다양한 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency) 즉, 생체 내 특정조직 및 특정세포로 분화될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 이러한 배아줄기세포는 초기 배아 발달, 다양한 장기나 조직의 분화 및 자가 재생 기전 및 관련 유전자 및 단백질의 기능 연구에 이용될 뿐 아니라 질병으로 인해 손상된 조직과 기관을 재생 또는 대체연구에도 이용되며 이를 통해 당뇨병, 심장병, 알츠하이머병, 및 암 등 각종 난치병의 효율적인 치료연구가 진행되고 있다.

뇌신경계 조직은 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없어, 줄기세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문에 신경세포 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환(neuronal diseases)에 대한 세포 치료제에 대해 많은 연구가 이루어지고 있다. 이에, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환, 척추손상 등의 질환 치료에 줄기세포를 적용하려는 시도가 현재 진행 중이다.

그러나, 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포, 특히 신경세포로 분화시키는 기술이 필요하다. 따라서 보다 정확하고 신속하게 줄기세포에서 신경세포로의 분화를 촉진하는 특성을 가진 물질 및 이를 탐색하고 검출해낼 수 있는 스크리닝 방법 등의 개발이 필요한 실정이다. 현재 한국공개특허 10-2012-0118619호에 베타-카테닌(beta-catenin)의 인산화를 바탕으로 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 물질을 스크리닝 하는 방법이 개시되어 있으나, 뇌에서 특이적으로 발현하는 단백질 이소타입을 대상으로 한 발명은 아직 공개된 바 없다.

따라서 본 발명은 줄기세포를 효율적으로 신경줄기세포로 분화시키는데 핵심요소로 작용하는 유전자 및 이의 서열을 새롭게 밝히고, 이를 통해 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화 촉진용 조성물, 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 배아줄기세포에 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자를 도입하여 ACS4를 배아줄기세포에서 발현시켜 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 줄기세포에 후보약물을 처리한 후 ACS4 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계; 및 (b) 후보약물을 처리한 후 ACS4 유전자의 발현 수준을 후보약물을 처리하지 않은 줄기세포의 ACS4 유전자의 발현 수준과 비교하여 증가 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자의 1a 이소타입은 뇌세포에서 특이적으로 발현이 증가되어 있으며, 배아줄기세포에서 ACS4 유전자의 발현을 억제하면 신경세포로의 분화 또한 억제되는 바, 이는 뇌세포의 아라키돈산 대사에 필수적인 역할을 수행하는 것으로 판단된다. 따라서 상기 ACS4 유전자, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제는 배아줄기세포로부터 초기신경세포로의 분화 촉진 방법, 분화 촉진용 조성물 및 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 용도에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 마우스 간 cDNA 유래 ACS4 서열 및 다양한 조직에서의 ACS4 발현을 검토한 실시예 1의 실험 결과이다.
도 2는 ACS4 이소타입 세 종류, Type 1a, 1b, 2 의 mRNA 5' 서열 차이와, 이를 바탕으로 한 조질별 발현 정도에 대한 실시예 2의 실험 결과이다.
도 3은 ACS4 type 1a 및 2 mRNA를 발현하는 TT2 ES 세포를 사용하여, 어떻게 ACS4 1a 및 1b가 내재적 단백질을 암호화하는지를 확인하고, ACS4가 신경세포 분화에 미치는 영향을 검토한 실시예 3의 실험 결과이다.
도 4는 ACS4 넉아웃 배아줄기세포를 대상으로 신경세포 분화에 미치는 ACS4 결실의 영향을 검토한 실시예 4의 실험 결과이다.

본 발명은 배아줄기세포에 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자를 도입하여 ACS4를 배아줄기세포에서 발현시켜 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 ACS4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 ACS4 1a 이소타입 유전자일 수 있으나, 서열번호 1에 기재된 염기서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등의 돌연변이를 수행하여 본 발명에서 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

본 발명의 발명자들은 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자 중 5' 말단 부위에 41개의 아미노산을 코딩서열을 추가로 포함하는 ACS4의 1a 이소타입이 뇌세포에서 특이적으로 발현이 증가되어 있음을 확인하였고, 배아줄기세포에서 ACS4 유전자의 발현을 억제하면 신경세포로의 분화 또한 억제됨을 확인하고, 상기 ACS4 유전자, 특히 이의 1a 이소타입이 배아줄기세포로부터 초기신경세포로의 분화 촉진 방법, 분화 촉진용 조성물 및 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 용도에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진시에는 세포 배양 배지에 신경 성장인자(Nerve Growth Factor, NGF) 및 all-Trans RA(retinoic acid)를 포함시킬 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서 상기 (a) 단계는 후보약물을 처리한 후 ACS4 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계로서, 상기 분석은 세포 내에서 또는 시험관 내에서 분석할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 예컨대 RTPCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 노던 블로팅, cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응, 인시츄(in situ) 혼성화 반응 등을 이용하여 분석할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 '후보약물'은 ACS4 유전자의 발현에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보약물은 이에 제한되는 것은 아니나, 화학물질, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 후보약물은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물일 수 있으며, 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 후보약물을 줄기세포에 처리하는 단계에 있어, 화합물과 같은 물질의 경우 줄기세포주에 직접처리할 수 있으며, 생체 물질의 경우, 줄기세포 내의 분자적 발현을 위하여, 단백질, 펩타이드 등을 인코딩한 유전자(핵산)를 세포 내로 형질전환시켜 해당 후보 물질을 과발현 시킬 수 있다.

특히, 후보 물질이 생체물질일 경우, 시험관에서 단백질, 펩타이드와 같은 생체분자를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법 또는 생체분자가 세포 안에서 발현되도록 제조된 발현 벡터 또는 PCR-유래의 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법을 선택할 수 있다. 즉, 유전자를 플라스미드, 파지(phage) DNA를 통해 트랜스펙션(transfection) 시킬 수 있다.

이러한 경우, 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 함께 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI:polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 상기 (b) 단계는 후보약물을 처리한 후 ACS4 유전자의 발현 수준을 후보약물을 처리하지 않은 줄기세포의 ACS4 유전자의 발현 수준과 비교하여 증가 여부를 판단하는 단계로, 후보약물의 처리로 인해 ACS4 유전자의 발현이 증가하면 신경세포로의 분화 촉진용 물질로 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 이하의 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자는 배아줄기세포의 신경세포로의 분화에 필수적인 역할을 수행하는 바, ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상은 신경세포 분화를 통한 퇴행성 신경질환의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 퇴행성 신경질환 치료제의 제조를 위한 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 또는 ACS4 활성화제의 용도, 그리고 치료상 유효량의 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 퇴행성 신경질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크 (Pick)병, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 ACS4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 ACS4 1a 이소타입 유전자일 수 있으나, 서열번호 1에 기재된 염기서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등의 돌연변이를 수행하여 본 발명에서 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 시약

ACS4(Acyl-CoA synthetase 4)의 웨스턴 블랏팅을 위한 항체는 M.J. Kang, T. Fujino, H. Sasano, H. Minekura, N. Yabuki, H. Nagura, H. Iijima, T.T. Yamamoto, A novel arachidonate-preferring acyl-CoA synthetase is present in steroidogenic cells of the rat adrenal, ovary, and testis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 2880-2884. 에 기재된 바에 따라 제작하였다. 분자 생물학 및 버퍼 제조를 위한 Tris, NaCl 및 SDS(sodium dodecyl sulfate)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO) 사로부터 구입하였다. 제한효소 및 변형 효소는 Roche Diagnostics Korea (Gangnam Seoul, Korea) 로부터 구입하였다. cDNA 제조를 위한 Superscript II 역전사 효소는 Invitrogen Korea (Seocho, Seoul, Korea) 로부터 구입하였다. RT-PCR을 위한 Taq 폴리머라아제, Easy-A high ?idelity PCR cloning enzyme & master mix는 Stratagen (Santa Clara, CA, USA)로부터 구입하였다. ES 세포 배양을 위한 우태혈청(FBS), DMEM 및 다른 첨가물은 Invitrogen Korea (Seocho, Seoul, Korea)로부터 구입하였다. DNA ligation kit (Version 2.0)는 Takara Korea Biomedical Inc., (Geumcheon, Seoul, Korea)로부터 구입하였다.

2. 5' Race ( Rapid Amplification of cDNA Ends )

총 2 ㎍ 의 RNA가 DT-RACE 프라이머 (5'-TCT AGA ATT CAG CGG CCG CAT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV N-3')를 사용하여 역전사되었고, cDNA(50 ng)은 5'-RACE PCR에 프라이머와 함께 (primers; 5'-full sense: 5'-AAG CAG TGG TCT CAA CGC AGA TG-3', 5'-RACE (antisense): 5'-GGC TGTBCCT TCT TCC CAA AT-3') 사용되었다. PCR 산물은 T-vector에 도입되고, DNA 서열이 판독되었다.

3. 웨스턴 블랏

단백질은 Nonidet P-40 세포 용해 버퍼로 동결/해동을 거쳐 추출되었고, 농도가 측정되었다. 동량의 단백질을 포함하는 샘플을 적절한 분율의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막에 이동시켰다. 상기 막은 5% 탈지유에서 1시간동안 상온에서 배양되어 블락되었고, 항체 결합은 4℃ 에서 하룻밤 동안 수행된 후, 호스래디쉬-퍼옥시다아제(HRP)-결합 이차 항체 결합이 1시간동안 상온에서 수행되었다. 막은 세척된 후, 단백질은 ECL 검출 키트 (GE healthcare-Korea, Seoul, Korea)를 사용하여 시각화되었다.

4. 신경 분화

TT2 ES 세포는 ES 세포 배양 배지(LIF (100 IU), 1X 비필수 아미노산, 1X 소듐 피루베이트 및 4mM 글루타메이트를 포함하는 20% FBS DMEM 배지) 에서 feeder layer 에서의 항생제 없이 배양되었다. ES 세포에 트립신이 처리되었으며, 이는 저부착성 세포 배양접시에 재분주되어 48시간 동안 배아체를 형성하였다. 배아체는 신경 분화 배지(5 ng/ml NGF 및 1μM all-trans RA를 포함하는 10% FBS-DMEM 배지)를 포함하는 타입 IV-콜라겐이 코팅된 세포 배양 배지에 분주되어 10일간 배양되었다. 50% 의 신경 분화 배지가 매일 새 배지로 교체되었고, 분화 정도를 광학 현미경으로 관찰하였다(100Ⅹ).

5. RT - PCR

다양한 조직 및 TT2 ES 세포에서 유래된 총 1㎍의 RNA가 Superscript II RNase H-역전사 효소, 랜덤 헥사머 프라이머 및 dNTP를 사용한 역전사에 사용되었고, 42℃ 에서 50분간 수행 후, 75℃에서 15분간 열 불활성화 되었다. 폴리머라아제 연쇄반응은 ACS4 를 증폭하기 위해 수행되었고, 50 ㎕의 반응 부피로, HotStarTaq Master Mix Kit (Qiagen Korea Ltd., Gumcheon, Seoul, Korea)을 사용하여 수행하였다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같으며, 정방향: 5'-ACC CAG TGG CAG ACT CGT AGC-3', 및 역방향: 5'-ATC CAG AGT ATC TGC TCC AGG-3', 이하의 사이클에 따라 반응시켰다: 1 사이클의 항체 불활성화: 95℃, 15분; 35 사이클의 증폭: 94℃에서의 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 3분간 연장; 및 1 사이클의 말단 연장: 75℃, 15분.

10㎕ 의 PCR 산물은 겔 전기영동되었으며, 증폭된 DNA 밴드는 브롬화 에티듐 염색 및 UV 노출을 통해 시각화되었다.

6. 세포 배양

TT2 마우스 ES 세포는 배양보조세포층(feeder layer) 상에서 LIF (1000 U)를 포함하는 FBS-DMEM 배지와 함께 배양되었고, 70%로 증식할때까지 계대배양되었다. ES 배지는 매일 교체되었다. PC-12 랫트 신장 피질 세포는 열 불활성화 10% 말 혈청/5% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지와 함께 타입 IV-콜라겐이 코팅된 세포 배양 접시에서 배양되었다. 배양 배지는 매일 교체되었고, 세포는 70%로 증식할때까지 계대배양되었다.

7. 노던 블랏 분석

랫트 조직으로부터 획득된 총 RNA는 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동되고, 나일론 막에 블랏되었다. 블랏은 엄격한 조건 하에서 마우스 ACS4의 ³²P-표지된 2.2kb 구조적인 유전자 단편과 결합되었다. 필터는 0.1% SDS를 포함하는 0.1X 표준 살린 시트레이트(SSC) 로 65℃ 에서 30분간 세척된 후 코닥 XAR-5 필름에 형광 증감지(intensifying screen)와 함께 -80℃ 에서 48시간 동안 노출되었다. 각 조직에서 분리된 15 ㎍ 의 총 RNA가 레인에 로딩되었다. 동일한 막은 차례로 래트 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH, Takara Korea Biomedical Inc, Geumcheon, Seoul, Korea)에 결합하는 대조군 프로브와 함께 결합되었고, 코닥 XAR-5 필름에 형광 증감지(intensifying screen)와 함께 -80℃ 에서 20시간 동안 노출되었다.

< 실시예 1> 마우스 ACS4 규명 및 다양한 조직에서의 발현 분포 검토

마우스 ACS4의 cDNA는 클로닝되었고, 이는 C8-C22 포화 지방산 및 C14-C22 불포화 지방산 중 아라코도네이트 (arachodonate) 및 에이코사펜타에노에이트 (eicosapentaenoate) 에 특이적인 효소 활성을 보인다. ACS4가 신경 세포에 미치는 기능을 확인하기 위해, 마우스 간 cDNA 에서 마우스 ACS4를 클로닝하였고, cDNA 서열을 확인하였다(도 1A 참조). 도 1A를 참고하면, 마우스 ACS4 cDNA는 640 아미노산을 코딩하는 번역 부위의 2010 뉴클레오티드로 이루어져 있음을 알 수 있다. ACS4와 뉴런과의 기능적 관계를 확인하기 위해, 다양한 조직에서 이의 RNA 발현 정도를 확인하였고 결과를 도 1B에 나타내었다. 도 1B를 참조하면, ACS4는 상대적으로 신장 및 간 조직에서 높은 수준으로 발현되며, 뇌 및 폐에서 중간 수준으로, 심장, 평활근 및 정소에서 낮은 수준으로 발현됨을 알 수 있었다. 또한, ACS4는 난소 및 부신과 같은 스테로이드 형성 조직에서 높은 수준으로 발현됨을 알 수 있었다(도 1B 참조). 또한, 뇌에서의 ACS4 mRNA 길이는 다른 조직보다 길었는데, 이는 뇌-타입 ACS4가 다른 조직과는 다른 관계가 있음을 시사한다.

< 실시예 2> 내재적 뇌-타입 ACS4 이소타입의 규명 및 발현 검토

상기 실시예 1의 결과는 뇌-타입 ACS4가 다른 조직의 ACS4보다 크기가 큼을 보여주는데, 이는 뇌-타입 ACS4의 mRNA 및 단백질 구조가 다름을 시사한다. 따라서 본 발명의 발명자들은 마우스 뇌의 총 RNA를 대상으로 5'-및 3'-RACE 를 수행하여 mRNA 서열 차이를 규명하였다. 본 발명의 발명자들은 간의 ACS4 cDNA(도 1A 참조)와 비교할 때, 5'-RACE 를 통해 얻어진 5'-UTR 및 업스트립 서열이 ATG 코돈의 5'-영역에 있어서 다른 패턴을 보임을 확인하였다(도 2A 참조). 가장 짧은 클론인 타입 2 ACS4는 도 1에 나타난 간의 cDNA 서열과 동일한 cDNA 서열을 포함하였다. 또한, 타입 1a 및 1b 는 41번째 아미노산에 또다른 삽입된 메티오닌을 포함하고 있었으며, 이는 타입 2 ACS4의 5'-업스트림 부위에 존재하였다. 타입 1b 는 5'-UTR 부위의 또다른 45bp 를 포함하며, 이는 타입 1a에 존재하지 않았다. 상기 결과를 종합하면, 엑손 1a, 1b 및 1c의 3 엑손으로 구성된 ACS4 5'-영역 및 이의 선택적 재조합(alternative splicing)이 ACS4 mRNA의 세가지 다른 타입을 형성하는 것을 알 수 있었다(도 2B 참조). 어떤 이소타입이 주로 뇌에서 발현되는지 여부를 확인하기 위해, 역전사(RT)-중합효소 연쇄반응(PCR)을 다양한 조직 및 TT2 마우스 ES세포로부터 유래된 총 RNA를 사용하여 수행하였고, ACS4 이소타입중 가장 짧은 형태인 ACS4 타입 2 이소타입이 뇌를 제외한 가장 많은 조직에서 발현됨을 확인할 수 있었다(도 2C 참조). 특히, ACS4 타입 1a의 수준은 타입 2의 수준보다 뇌에서 10배 가량 높은 것을 알 수 있었다. 반면, 타입 1a ACS4의 함량은 소장, 정소 및 TT2 ES 세포에서 타입 2 ACS4 함량에 비해 2배 가량만 높음을 확인할 수 있었다(도 2C 참조). ACS4 타입 1b는 뇌에서 매우 극미량 존재하였다(도 2C 참조). 상기 결과를 참조하면, 마우스 ACS4는 두개의 독립적인 ATG 개시코돈을 사용하며, 이는 조직마다 다르게 발현됨을 알 수 있으며, ACS4 타입 1a는 주된 뇌-타입 ACS4 이소타입임을 알 수 있었다.

< 실시예 3> 두가지 타입의 ACS4 단백질의 NGF 처리로 인한 신경세포 분화에 미치는 영향 검토

상기 실시예 2에서, 본 발명의 발명자들은 뇌-타입 ACS4 1a 및 1b가 특히 뇌에서 다른 형태의 단백질을 암호화할 가능성이 있음을 보였다. 따라서 본 발명의 발명자들은 높은 수준의 ACS4 1a 및 2 mRNA를 발현하는 TT2 ES 세포를 사용하여, 어떻게 ACS4 1a 및 1b가 내재적 단백질을 암호화하는지를 확인하였다.

TT2 ES 세포가 두가지 타입의 ACS4 단백질을 발현하는지 여부를 확인하기 위해, TT2 ES 세포의 세포막을 대상으로 ACS4 특이 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였고, 결과를 도 3에 나타내었다. TT2 ES 세포는 두가지 형태의 ACS4 단백질을 발현하였으며, 보다 작은 ACS4 타입 2는 마우스 ACS4와 동일한 분자량을 보였으며, 이는 ACS4 타입 2와 일치하였다(도 3A 참조). 보다 ES 세포의 보다 큰 ACS4는 ACS4 타입 1a 및 1b에 상응하는 것으로 나타났다(도 3A 참조). 신경 세포에서의 ACS4의 역할을 규명하기 위해, NGF (5 ng/ml)를 처리하여 PC-12 세포를 신경 세포로 분화시켰고, ACS4 단백질은 웨스턴 블랏으로 확인되었다. 결과를 도 3B에 나타내었다. 상기 결과를 통해, ACS4 단백질 수준은 NGF 처리 후 초기부터 증가하여 처리 72시간 후 감소함을 알 수 있었다. 상기 결과는 ACS4가 신경세포 분화 초기에 중요한 역할을 수행함을 시사한다.

< 실시예 4> 신경세포 분화에 미치는 ACS4 결실의 영향 검토

ACS4가 신경세포 분화에 미치는 영향을 분석하기 위해, TT2 ES세포에 트립신을 처리하고, 2일간 저부착 배양 접시에서 배양하여 배아체가 형성되도록 하였다. 배아체는 RA (1 ng/ml) 및 NGF (5 ng/ml)를 포함하거나 포함하지 않는 세포 배양 접시에 재접종 된 후 10일간 배양되었다. 신경세포 분출은 RA 및 NGF 처리 4일 후에 최초로 관찰되었고(도 4, 패널 b 참조), 이는 분화 기간동안 지속적으로 진행되었다(도 4, 패널 c 및 d 참조). 분화가 완료된 세포 및 신경 네트워크는 RA 및 NGF 처리 10일 후부터 관찰되었다(도 4, 패널 e참조). 그러나, ACS4 결핍 ES 세포는 분화되지 않거나, 매우 일부 분화되어 약한 신경 콜로니를 형성하였다(도 4, 패널 f 참조). 본 발명의 발명자들은 TT 대조군 ES 세포 및 ACS4 넉아웃 ES 세포에서 신경 네트워크를 포함하는 신경세포 콜로니로 분화된 배아체를 계수하였다. 결과를 도 4의 B에 나타내었다. 약 50% 의 TT2 ES 세포 배아체가 인근 TT2 ES 세포 콜로니와 신경 네트워크를 형성하였다. 그러나, ACS4 넉아웃 ES 세포주 3개는 오직 9%의 콜로니만 약한 신경 네트워크를 형성하였다(도 4B 참조). 상기 결과를 종합하면, ACS4가 신경 세포 분화 초기에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Methods for Inducing Differentiation from Embryonic Stem Cells to Early Neuronal Precursor Cells by Introducing ACS4 Gene <130> DP-2012-0899 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2448 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 1 acccagtggc agactcgtag cgagcgaggc agcaccttcg actcagatca caggagatac 60 acctgttctt aaaagtgaaa gaagaaatct gtgtacttta ttgctggctt ccaaagatta 120 ctaactttta tctgtatcac taaaattgaa ttcccttggc tatactgcta ctcttactgc 180 tgcttccatt attgccttct ccaaaaacct aaggctttaa gaagccaaag aataacagca 240 aataaacgcc atattagaag ccttccacta tgaaccttaa gctaaatgtg ctcaccatta 300 tattgctgcc tgtccacttg ttaataacaa tatacagtgc ccttatattt attccatggt 360 attttcttac caatgccaag aagaaaaacg ctatggcaaa gagaataaaa gctaagccca 420 cttcagacaa acctggaagt ccatatcgct ctgtcacaca cttcgactca ctagctgtca 480 tagacatccc tggagcagat actctggata aattatttga ccatgctgta gccaaatttg 540 ggaagaagga cagccttgga acccgggaga tcctgagtga agaaaatgaa atgcagccaa 600 atggaaaggt ttttaagaag ttaattcttg ggaattataa atggataaac tatcttgaag 660 tgaactgcag agtgaataac tttggaagtg gcctcactgc attgggactg aaaccaaaga 720 acaccattgc cattttctgt gagaccaggg cagagtggat gattgcagca cagacttgct 780 ttaagtacaa ctttccactt gtgactttat atgccacact tggcagagaa gctgtagttc 840 atggattaaa tgaatctgag gcttcctatc tgaattacta gtgttgagct tctggaaagc 900 aaactgaagg cggccttagt agatatcaat tgtgttaaac atatcattta tgtggataat 960 aagactatca atagagcaga gtaccctgag gggcttgaaa ttcacagcat gcaatcagta 1020 gaggagctgg gagccaagcc agaaaacttg agcgttcctc caagtagacc aaccccttca 1080 gacatggcca ttgtcatgta caccagtggt tctacgggcc gccccaaggg attgatgatg 1140 catcatacca atttgattgc tggaatgaca ggccagtgtg aacgtatccc tggactagga 1200 ccgaaggaca catatattgg ctacttacct ttggctcatg tgctggaact gacagcagag 1260 atatcatgct tcacctatgg ctgtaggatt ggatactctt caccccttac actgtctgac 1320 cagtccagca aaatcaagaa gggaagcaag ggtgattgta ctgtactgaa acccacactt 1380 atggccgctg ttccggaaat catggataga atttataaga atgttatgag caaggttcaa 1440 gagatgaatt atgttcagaa aactctattt aaaatcgggt atgattacaa attagagcaa 1500 atcaagaaag gctatgacgc ccctctttgt aatctgatac tgtttaaaaa ggtgaaggat 1560 ttggtgggag ggaatgtccg catgatgctg tatggcggcg cgccactgtc ccctcagaca 1620 caccgattca tgaatgtctg cttgtgctgc cccattggtc agggatatgg gctgacagaa 1680 tcatgtggtg ctggaacagt tactgaagtt actgactaca ctactggaag agttggagct 1740 cctcttattt gctgtgaaat taaactgaaa gactggcagg aaggtggtta tacagttcat 1800 gataagccga accccagagg tgagattgtg atcggtggcc agaatatctc catgggatat 1860 tttaaaaacg aagagaaaac agcagaagat tattgtgttg atgaaaatgg acaaaggtgg 1920 ttttgcactg gcgatattgg agaattccat cctgatggat gcttacagat tatagatcgt 1980 aagaaagatc tggtaaagtt acaagcagga gaatatgtat ttcttgggaa agtagaagct 2040 gcactgaaga attgtccact gatcgacaac atctgtgctt ttgccaaaag tgaccagtcc 2100 tatgtgatca gttttgtggt tcctaaccag aaaaagttga ctcttttggc acaacagaag 2160 ggggtagaag gatcttgggt tgatatttgc aataatcccg ccatggaagc tgaaatactg 2220 aaagaaattc gagaagctgc aaatgccatg aaattggagc gatttgaaat tccgatcaag 2280 gttcggttaa gcccagagcc atggaccccc gagactggtt tggtaacaga tgccttcaag 2340 ctgaaaagga aggagttgaa gaaccattat ctcaaagacg ttgagcggat gtatgggggc 2400 aaataaaatg cggctctctg atttccattt gcacaggagg tggcctga 2448

Claims

배아줄기세포에 ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자를 도입하여 ACS4를 배아줄기세포에서 발현시켜 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진시키는 방법.
제2항에 있어서,
상기 ACS4 유전자는 ACS4 1a 이소타입 유전자인 것인 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화를 촉진시키는 방법.
ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화 촉진용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 ACS4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 ACS4 1a 이소타입 유전자인 것인 배아줄기세포로부터 초기신경세포의 분화 촉진용 조성물.
(a) 줄기세포에 후보약물을 처리한 후 ACS4 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계; 및 (b) 후보약물을 처리한 후 ACS4 유전자의 발현 수준을 후보약물을 처리하지 않은 줄기세포의 ACS4 유전자의 발현 수준과 비교하여 증가 여부를 판단하는 단계를 포함하는 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법.
제5항에 있어서,
상기 ACS4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 ACS4 1a 이소타입 유전자인 것인 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법.
ACS4(Acyl-CoA synthetase 4) 유전자, ACS4 발현 촉진제 및 ACS4 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 ACS4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 ACS4 1a 이소타입 유전자인 것인 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크 (Pick)병, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것인 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.