KR20140096014A - 동물뼈로부터 유래된 저결정성 세라믹재의 제조 방법 - Google Patents

동물뼈로부터 유래된 저결정성 세라믹재의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물뼈로부터 저결정성 세라믹재를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 저결정성 세라믹재는 체내에서 생분해가 가능하며, 골전도 능력이 매우 높고, 인체에 안전하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 저결정성 세라믹재 및 이를 포함하는 골 이식재 및 골 지지체, 생체적합성 고분자를 추가적으로 포함하는 복합재를 제공한다.

Description

동물뼈로부터 유래된 저결정성 세라믹재의 제조 방법{Method for Preparing Low Crystalline Ceramics Derived from Animal Bone}
동물뼈로부터 유래된 저결정성 세라믹재의 제조 방법에 관한 것이다.
골은 혈액 다음으로 가장 빈번히 이식되며, 각종 골재건술, 척추골 융합술, 불유합성 골절, 중증의 복합골절, 지연유합, 관절유합술, 사지 구제술, 구강 악안면 재건술 및 치과용 임플란트 시술 등 매우 다양한 분야에서 광범위하게 이용되고 있으며, 크기가 작은 낭종성 결손부, 골벽이 양호한 발치창, 단순 골절 등을 충전할 목적으로도 사용된다. 그러나, 부전유합이나 임계결손크기의 골결손부(critical sized defect)를 채우기 위해서는 대체물질이 필요하다. 생체이식용 세라믹은 생체적합성과 기계적 물성이 고분자보다 우수하여 현재까지도 경조직인 골(bone) 결손 및 회손 부위의 재생 및 치료를 목적으로 하는 치과, 정형 및 성형외과에서 가장 널리 사용되고 있는 생체재료이다. 세라믹은 크게 산화계와 비산화계 세라믹으로 나눌 수 있으며 이중 인체에 가장 널리 사용되고 있는 세라믹들로는 인산칼슘과 생활성 유리, 알루미나, 지르코니아 및 이들의 복합체들이다. 그리고 인산칼슘계는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA), 제삼인산칼슘(tricalcium phosphate, TCP), 제사인산칼슘(tetracalcium phosphate, TTCP), 제이인산칼슘(dicalcium phosphate, DCP) 등이 있고 생활성 유리로는 유리를 기본으로 하는 실리카 계열(silica-based glasses), 인산계열(phosphate-based glasses) 및 유리 세라믹 등이 있다. 또한, 세라믹은 인간과 동물의 골, 어류의 골, 조개 및 오징어 등의 패각 또는 산호 및 계란껍질 등으로부터 얻을 수 있으며, 이중 인간과 동물의 골로부터 채취된 세라믹은 다양한 처리를 통하여 인체 골 재생을 위해 적용되고 있다.
현재까지의 골이식법 중 가장 이상적인 방법은 환자 자신에게서 채취한 자가골을 이식하는 방법으로 자가골은 골결손 부위의 골치유 및 골형성 과정에서 다른 골이식재에 비해 뛰어난 능력을 가지고 있다. 그러나 자가골 이식법은 채취 시 전신마취, 부가적인 수술의 필요, 채취 부위의 통증, 골채취량 제한 등의 단점을 가지고 있어 현재에는 자가골을 대체할 수 있는 동종골, 이종골 및 합성골의 쓰임이 점차 늘어가고 있는 추세이다.
동종골(allograft)은 동종의 사체나 생존해 있는 다른 공여자에게서 얻는 것으로 이식재를 동결시키거나 동결건조, 탈회동결건조 및 방사선 조사, 고압 멸균 등을 가한 형태로 항원성을 제거하여 면역반응을 최소화시켜 사용한다. 주로 사람에서 동종골을 채취하는 방법은 고관절대치술에서 나오는 대퇴골두와 사체에서 얻게 되나, 사체에서 채취하는 경우 살아있는 환자에서 채취할 때보다 4배 정도의 세균 감염률이 높은 것으로 알려져 있다. 이종골(xenograft)은 소나 돼지 등의 다른 종의 동물에서 골을 채취한 후 동결건조, 탈회동결건조, 그리고 방사선 조사압 및 열 멸균 등을 거쳐 골전도 능력을 기대하는 골이식재이다. 그러나 이러한 동종골과 이종골은 면역반응이나 교차감염면에서 100% 안전하지는 않다. 이러한 단점을 보완하기 위해 최근 많이 사용되고 있는 골이식재가 바로 합성골이다. 합성골(alloplast)은 주로 사람 골의 주재료인 무기질을 인공적으로 합성한 것으로 동종골이나 이종골에 비해 경제적이고, 쉽게 구할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 그러나 이들 재료는 골이 형성될 때 골소주의 형성을 용이하게 하는 골전도 물질로 구분되고 있으나 자가골과는 달리 골형성능이 없으므로 자가골에 비해 골형성에 필요한 기간이 길고, 새로 형성되는 골량도 자가골, 동종골, 이종골에 비해 크게 떨어지는 단점을 가지고 있다.
현재 골이식재로 사용되는 재료 중에 이종골 이식재가 전체 이식재에서 70-80%를 차지하고 있다. 이종골은 주로 소나 송아지 등에서 골조직을 채취해 이식하는 것으로 골조직을 구하기 쉬운 장점에도 불구하고, 최근 광우병 파동에서 자유롭지 못하다. 또한, 흡수가 느리고 골형성 유도능력이 낮다는 단점이 있다. 임상에서 많이 사용되는 대표적인 이종골(소 해면질골)은 특수 처리과정을 통해 유기성분을 제거한 것으로 이식재로서 우수한 골전도성 치유를 보이는 것으로 알려져 있다. 또한 이종골 이식방법으로 돼지 해면질골을 처리하여 만든 이식재는 단독 혹은 자가골이나 다른 이식재 등과 혼합하여 사용되고 있으며 이미 많은 연구를 통해 골전도성이 인정된 골이식재이다. 그러나 현재까지 자가골을 대체할 수 있는 골이식 방법이 없다.
지난 수년 동안 세라믹 재료의 주 연구초점은 보다 안전한 세라믹 원료의 개발보다는 의료용으로서 상호 기공들이 연결된 높은 다공성을 갖는 블록(block) 또는 입자(particle) 형태의 골 대체재를 개발하는 것이었다. 그 노력에 힘입어 인공합성 세라믹 또는 천연 골로부터 채취된 세라믹 원료를 이용하여 입자 제거법(Flautre et al., J Mater Sci Mater Med, 12, 679-682(2001)), 액체질소법(Hone et al., J Mater Sci Mater Med, 22, 349-355(2011)), 기포형성법(Li et al., J Biomed Mater Res, 61, 109-120(2002)), 고분자 스펀지 템플레이트법(Appleford et al., Biomaterials, 28, 4788-4794(2007)), CAD(Computer aided desing) 시스템을 이용한 프로토타이핑법((Rumpler et al., J Biomed Mater Res, 81A, 40-50(2007)) 등으로 다공성 세라믹 재료를 제조할 수 있게 되었으며, 최근에는 생분해성 고분자와 결합된 유무기 복합체(또는 하이브리드)로 이루어진 생체이식용 재료들이 개발되고 있다.
최근까지 생체의료용 세라믹 원료 및 골이식 재료는 부분의 골이식재는 1200℃ 이상의 높은 온도에서 소결과정을 거치면서 제작된 수산화아파타이트로 고결정성을 나타내며, 소결과정 중 결정 성장(grain growth)이 발생하여 골조직에 존재하는 아파타이트보다 수십 배 더 큰 크기를 가진다. 결정도가 높고 입자 크기가 클 경우에는 체내에서 생분해가 거의 불가능하고, 골전도 능력이 매우 낮으며 파골세포에 의해 분해될 수 없다. 따라서 현재 사용되고 있는 다양한 채취된 세라믹보다 인체에 안전하고, 우수한 골형성 효과가 있는 생체의료용 세라믹 골이식 재료는 앞으로는 더욱 중요한 관건이 되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 저결정성을 가지며 골형성 능력이 높은 세라믹재를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 돼지뼈로부터 해면골을 수득한 후, 해면골로부터 지방질 및 단백질의 제거하고 건조한 다음, 300-500℃의 온도에서 열처리하고 이를 분말화함으로써 저결정성을 갖는 세라믹재를 제조하는 새로운 방법을 개발하고, 이렇게 재조된 세라믹재의 다양한 응용 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 저결정성 세라믹재의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 재조된 세라믹재를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세라믹재를 포함하는 골 이식재를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세라믹재를 포함하는 골 지지체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세라믹재 및 생체적합성 고분자를 포함하는 복합재를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 저결정성(low crystallinity) 세라믹재의 제조방법을 제공한다:
(a) 동물뼈를 절단하는 단계;
(b) 상기 절단된 동물뼈로부터 피질골 및 혈액을 제거하여 해면골을 수득하는 단계;
(c) 상기 해면골을 물에 넣고 끓여(boiling) 지방질 및 단백질의 제1차 제거과정을 실시하는 단계;
(d) 상기 해면골을 건조하는 단계;
(e) 상기 해면골을 300-500℃에서 열처리하는 단계; 및
(f) 상기 열처리된 해면골을 분말화하여 저결정성 세라믹재를 수득하는 단계.
본 발명자들은 저결정성을 가지며 골형성 능력이 높은 세라믹재를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 돼지뼈로부터 해면골을 수득한 후, 해면골로부터 지방질 및 단백질의 제거하고 건조한 다음, 300-500℃의 온도에서 열처리하고 이를 분말화함으로써 저결정성을 갖는 세라믹재를 제조하는 새로운 방법을 개발하고, 이렇게 재조된 세라믹재의 다양한 응용 가능성을 확인하였다.
본 발명의 방법의 기본적인 기술적 사상은 종래 방법의 문제점을 보완하여 저결정성으로 체내에서 생분해가 가능하고, 골형성 능력이 높으며 높은 생체적합성을 갖는 세라믹재를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 저결정성 세라믹재의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “저결정성(low crystallinity)”은 X선 회절 분석에서 피크(peak)의 너비가 넓을수록 저결정성이 증가하는 것을 의미한다. 한편, 피크의 너비가 좁을수록 고결정성을 나타낸다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 저결정성 세라믹재는 X선 회절 분석 결과, 전체 피크의 총 면적은 작고, 각각의 피크(회절선 인덱스)의 너비는 전반적으로 넓게 나타났다(표 2).
본 발명의 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 동물뼈의 절단
본 발명에 따르면, 우선 동물뼈를 절단한다.
본 발명에서 이용되는 동물뼈는 바람직하게는 돼지뼈, 소뼈 또는 말뼈이고, 보다 바람직하게는 돼지뼈이다.
본 발명에서 이용되는 돼지뼈는 바람직하게는 돼지의 머리뼈, 팔뼈, 다리뼈, 갈비뼈, 복장뼈, 척추뼈, 엉치뼈, 꼬리뼈 또는 치아이고, 보다 바람직하게는 팔뼈, 다리뼈 또는 갈비뼈이며, 보다 더 바람직하게는 팔뼈 또는 다리뼈이고, 가장 바람직하게는 대퇴골이다.
동물뼈 절단은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 동물뼈는 0.5-5.0 cm3, 보다 바람직하게는 0.5-3.0 cm3, 보다 더 바람직하게는 0.5-2.0 cm3, 가장 바람직하게는 1.0-1.5 cm3 크기로 절단한다.
(b) 동물뼈로부터 해면골 수득
이어, 절단된 동물뼈로부터 피질골을 제거한다. 피질골 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.
피질골이 제거된 해면골 조각을 물에 침적하여 혈액 성분을 제거한다. 바람직하게는 물에 12-72시간, 보다 바람직하게는 12-48시간, 보다 더 바람직하게는 12-24시간, 가장 바람직하게는 24시간 동안 침적시켜 혈액 성분이 제거되도록 한다.
피질골이 제거된 해면골 조각을 넣는(함침시키는) 물의 양은 특별하게 제한되지 않는다.
절단된 동물뼈로부터 피질골 및 혈액이 제거된 해면골을 수득할 수 있다.
(c) 해면골로부터 지방질 및 단백질 1차 제거
단계 (b)의 결과물인 해면골을 물에 넣고(함침시키는) 끓인다. 본 발명에 있어서, 해면골을 물에 함침시켜 끓이는 것은 해면골에 존재하는 지방질 및 단백질을 1차적으로 제거하기 위하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 해면골을 끓이는 과정은 바람직하게는 24-96시간, 보다 바람직하게는 48-84시간, 보다 더 바람직하게는 60-72시간, 가장 바람직하게는 72시간 동안 실시한다.
(d) 지방질 및 단백질이 1차 제거된 해면골의 건조
이어, 1차적으로 지방질과 단백질이 제거된 해면골을 건조시킨다.
건조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있으며, 가장 바람직하게는 오븐을 이용하여 건조한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 건조는 60℃의 오븐에서 24시간 동안 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d) 및 (e) 사이에 상기 건조된 해면골로부터 지방질 및 단백질의 화학적 제거과정을 실시하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
지방질 및 단백질의 제거는 당업계에 공지된 다양한 화학적 제거방법을 통하여 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 건조된 해면골로부터 지방질의 제거는 건조된 해면골에 탄화수소를 포함하는 용매(예컨대, 톨루엔, 메틸사이클로헥산 또는 클로로포름 및 메탄올 용액)를 처리하여 실시한다. 바람직하게는 톨루엔 또는 클로로포름 및 메탄올 용액을 처리하여 지방질을 제거한 후, 해면골은 오븐에서 건조시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 건조된 해면골로부터 단백질의 제거는 지방질 제거 후 건조된 해면골에 수용성 아민류 용매(예컨대, 사이클로헥실아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민) 또는 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 처리하여 실시한다. 상기 용매는 최대 50% 범위까지 물과 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 해면골에 에틸렌 디아민 또는 또는 하이포아염소산나트륨을 처리하여 단백질을 제거한 다음, 잔존하는 용매를 제거하기 위해 세척한다. 세척에 사용되는 용액은 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및/또는 이들의 혼합 용액이며 보다 바람직하게는 물이다. 세척 효과를 높이기 위하여 초음파 세척기를 이용할 수 있다.
바람직하게는 세척은 지속적으로 물의 유입이 가능한 용기에 해면골을 넣고 물을 유입시킴으로서 실시하며, 보다 바람직하게는 1-8일간, 보다 더 바람직하게는 3-8일간, 보다 더욱더 바람직하게는 5-6일간 실시한다. 세척은 골 미네랄의 재결정화를 방지하기 위해 물 온도 10-60℃에서 실시한다.
세척이 완료(1차)된 해면골에 에틸렌 디아민 용액을 첨가하고 가열하여 해면골에 존재하는 단백질을 다시 한번 제거한다. 에틸렌 디아민 용액을 첨가하고 가열하는 과정은 바람직하게는 80-200℃의 온도로 30-60시간 동안 실시한다. 단백질 제거 과정을 거친 해면골은 잔존하는 용매를 제거하기 위해 물로 제2차 세척한다. 제2차 세척은 바람직하게는 5-20일간, 보다 바람직하게는 10-20일간, 보다 더 바람직하게는 15-17일간 실시한다. 제2차 세척이 완료된 해면골 조각은 오븐에서 건조시킨다.
(e) 건조된 해면골의 열처리
건조된 해면골을 열처리한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 건조된 해면골을 300-500℃의 건열 조건 하에서 열처리한다. 보다 바람직하게는 300-450℃, 보다 더 바람직하게는 350-450℃, 가장 바람직하게는 350-400℃에서 실시한다. 열처리에 이용되는 온도에 도달하기 위해 분당 10℃씩 승온시킨다. 바람직하게는 열처리는 10-30시간, 보다 바람직하게는 15-30시간, 보다 더 바람직하게는 15-25시간 동안 실시한다.
상기 단계 (d)와 (e) 사이에 지방질 및 단백질의 화학적 제거과정을 추가적으로 실시하지 않는 경우, 열처리는 100-400℃에서 10-48시간, 보다 바람직하게는 200-400℃에서 20-48시간, 보다 더 바람직하게는 300-400℃에서 30-48시간 동안 실시한다.
본 발명에서 열처리는 종래에 알려진 열처리 온도(1200℃)보다 낮은 온도에서 실시된다. 골조직에 존재하는 아파타이트는 고온의 열처리 과정을 거치면서 고결정성을 갖게 되는데, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세라믹재는 저온의 열처리 과정을 거치기 때문에 저결정성을 나타낸다(도 7a-c). 고결정성을 갖는 세라믹재는 체내에서 생분해가 거의 불가능하고 골전도 능력이 매우 낮으며 파골세포의해 분해될 수 없어 골 이식재 및 골 지지체로 이용되는데 어려움이 있다.
(f) 해면골을 분말화하여 저결정성 세라믹재를 수득
열처리한 해면골을 분말화하여 최종적으로 저결정성 세라믹재를 수득한다. 분말화는 당업계에 공지된 다양한 분말화 방법을 통하여 실시할 수 있다.
상기 제조된 저결정성 세라믹재는 1.6-1.8 At%의 Ca/P 비율, 105-130 m2/g의 비표면적 및 0.8-0.95 cm3/g·의 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값을 갖는다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 저결정성 세라믹재에 추가적으로 항생제/항균제 처리 또는 방사선(감마선)을 조사할 수 있다.
본 발명에서 항생제 및 항균제는 당업계에 알려진 다양한 항생제 및 항균제를 이용할 수 있다. 바람직하게는 페니실린계, 세펨계, 반코마이신, 스트렙토마이신, 바시트라신, 그라미시딘, 플라보포스폴리폴계, 폴리믹신계, 폴리에텔계, 니토로이미다졸계, 니트로후란계, 퀴놀론계, 리팜피신, 설포나마이드, 트리메토프림, 아미노글리코사이드계, 페니콜계, 린코사마이드계, 마크로라이드계, 스트렙토그라민계, 플로이로무틸린계 및 테트라사이크린계로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 저결정성 세라믹재에 추가적으로 탈미네랄화(deminerallization)를 실시할 수 있다. 본 발명의 탈미네랄화 과정에는 질산, 황산, 염산, 인산 및 이들의 혼합용액을 사용할 수 있으며 5 내지 80 부피% 범위에서 1 내지 24시간 동안 침지하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 1.6-1.8 At%의 Ca/P 비율, 105-130 m2/g의 비표면적 및 0.8-0.95 cm3/g·의 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값을 갖는 저결정성 세라믹재를 제공한다.
본 발명의 저결정성 세라믹재는 종래의 세라믹재 및 생 뼈 입자와 비교하여 높은 칼슘/인 비율을 갖는다(표 1). 칼슘/인 비율은 세포의 접착 및 성장에 중요한 인자로 높은 칼슘/인 비율은 골형성에 긍정적인 영향을 미친다.
본 발명의 저결정성 세라믹재는 종래의 세라믹재 및 생 뼈 입자보다 높은 비표면적을 갖는다(도 5). 비표면적은 단위 부피당 면적으로 비표면적이 클수록 세포부착이 유리하여 골유착이 촉진된다.
본 발명의 저결정성 세라믹재는 종래의 세라믹재 및 생 뼈 입자보다 높은 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값을 나타내는데(도 6), 이는 본 발명의 저결정성 세라믹재가 우수한 미세 기공크기 및 분포도를 갖는다는 것을 의미하며 결과적으로 골신생을 촉진시킬 것으로 예상된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 세라믹재를 포함하는 골 이식재를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “골이식재”는 골 사이의 공간을 메워주는 가교역할을 하는 물질을 의미하고, 골절이나 뼈의 결손 부분을 채워주어 골의 고정화 및 안정화시킴으로써 골치유에 중요한 역할을 하며 골형성을 촉진시킨다. 골이식재는 정형외과, 신경외과 및 치과 등에서 사용되며 예컨대, 디스크 수술 시 골 결손부위에 사용되어 골 재생을 유도하며, 임플란트 시술 및 구강 악 골결손 수복에도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 세라믹재를 포함하는 골 지지체를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “골 지지체(bone scaffold)”는 구조내외에 파종된 세포의 부착, 분화 및 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 증식과 분화에 적합한 지지체 역할을 제공하는 생체재료를 의미한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 골 지지체는 골체(bone shaft), 쐐기(wedge), 링(ring), 골 스트리이프(bone strip), 골 블록(bone block), 골 칩(bone chip), 골 입자(bone particle), 골 가루(bone powder) 등으로 제조될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 골지지체는 조직재생 및 상처 또는 다양한 질병의 치료를 위한 생체이식용 지지체로 제조될 수 있다. 본 발명의 골 지지체는 다른 이종골 및 동종골 유래 세라믹보다 인체에 안전하게 사용할 수 있고, 자가골 유래 세라믹에 비해 공급이 원활하며, 인공 합성 세라믹 보다 생체적합성이 우수하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 세라믹재 및 생체적합성 고분자를 포함하는 복합재를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어“생체적합성(Biocompatible)"는 생체에 투여되어서 바람직하지 않은 장기적 효과를 유도하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 생체적합성 고분자는 폴리다이옥사논, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프락톤, 락트산-글리콜산 공중합체, 글리콜산-트라이메틸카보네이트, 글리콜산-ε-카프로락톤, 폴리글리코네이트, 폴리글락틴, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 혼합물, 및 이들의 공중합체; 콜라젠, 젤라틴, 키틴/키토산, 알지네이트, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 피브리노겐, 셀롤로오스, 덱스트란, 펙틴, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 덱사메타손, 콘드로이친 설페이트, 라이소자임, DNA, RNA, RGD 등의 단백질 유도체; 지질, 성장인자, 성장 호르몬, 펩타이드 의약품, 단백질 의약품, 소염진통제, 항암제, 항바이러스제, 성호르몬, 항생제, 항균제 및 이들의 화합물; 콜라겐, 알부민, 셀룰로오스, 아가로스, 알지네이트, 헤파린, 히아루론산, 키토산으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 복합재는 본 발명의 세라믹재 뿐 만 아니라 종래에 당업계에 알려진 세라믹재를 포함할 수 있다. 본 발명의 세라믹재는 제조과정에서 입자의 크기를 다양하게 조절할 수 있어 돼지뼈로부터 유래된 세라믹재 뿐만이 아닌 이종골, 동종골, 자가골 유래 및 인공 합성 세라믹과 혼합하여 사용할 수 있다. 인공합성 세라믹은 인산칼슘계 세라믹, 생활성 유리, 알루미나, 지르코니아 또는 이들의 복합체일 수 있다.
본 발명의 복합재는 인공뼈, 인공관정, 뼈시멘트, 턱뼈, 안면부위의 소형뼈, 사지 소형뼈, 임플란트, 지대주, 충진재, 도재, 브라켓, 코어, 포스트를 포함한 경조직 재생을 위한 지지체, 조인트, 뼈고정 디바이스, 척추 고정 디바이스, 복합 차폐막(membrane)의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 복합재를 생체의료용 재료로 사용할 경우, 어떤 형태로도 적용할 수 있으며, 예컨대, 블록, 필름, 필라멘트, 섬유, 메쉬, 직포/부직포, 니트, 알갱이, 입자, 플레이트, 볼트/너트, 못 등이 될 수 있으며 두 가지 이상의 형태가 복합된 형태도 가능하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 동물뼈로부터 저결정성(low crystallinity) 세라믹재를 제조하는 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 저결정성 세라믹재는 체내에서 생분해가 가능하며, 골전도 능력이 매우 높고, 인체에 안전하게 적용될 수 있다.
(ⅲ) 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 저결정성 세라믹재를 제공한다.
(ⅳ) 본 발명은 본 발명의 저결정성 세라믹재를 포함하는 골 이식재 및 골 지지체, 본 발명의 세라믹재 및 생체적합성 고분자를 포함하는 복합재를 제공한다.
도 1은 대표적인 소 뼈 유래 제품인 BioOss, 본 발명의 방법 1에 따라 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C)와 소 뼈를 이용하여 제조된 세라믹 입자(B350C), 방법 2에 따라 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350N)의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 그림이다.
도 2는 BioOss, P350C, B350C, P350N 및 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자(live bone) 표면의 칼슘/인의 비율을 분석한 EDS(energy dispersive spectrometer) 결과이다.
도 3은 BioOss, P350C, B350C, P350N 및 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자의 XRD(X-ray diffraction) 결과이다.
도 4는 BioOss, P350C, B350C, P350N 및 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자의의 TGA(thermogravimetry analyzer) 결과이다.
도 5는 BioOss, P350C, B350C 및 P350N의 BET (Brunauer-Emmett-Teller)의 검사 결과이다.
도 6은 BioOss, P350C, B350C, P350N의 기공 크기와 분포를 BJH (Barret-Joyner-Halenda)법에 의하여 측정한 결과이다.
도 7은 P350C, P350N 및 고온(1200℃)에서 제조한 돼지 뼈 유래의 세라믹 입자(P1200N)의 XRD(X-ray diffraction) 측정 결과이다.
도 8은 랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 4주와 8주째의 일반 방사선 촬영 사진이다.
B350C: 350℃에서 열처리한 소 해면골 이식; P350C: 350℃에서 열처리한 돼지 해면골 이식.
도 9는 랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 4주와 8주째에 촬영한 마이크로 CT 3D 사진이다.
B350C: 350℃에서 열처리한 소 해면골 이식; P350C: 350℃에서 열처리한 돼지 해면골 이식.
도 10은 랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 4주와 8주째에 촬영한 마이크로 CT 3D 사진의 정중단면이다.
B350C: 350℃에서 열처리한 소 해면골 이식; P350C: 350℃에서 열처리한 돼지 해면골 이식.
도 11은 400℃에서 열처리한 돼지 해면골 조각의 SEM 사진이다.
a1-3: P400, b1-3: P1200. a1 및 b1: ×30, a2 및 b2: ×2,000, a3 및 b3: ×20,000
도 12는 400℃에서 열처리한 돼지 해면골 조각의 X-선 회절 데이터이다.
도 13은 400℃에서 열처리한 돼지 해면골 조각의 포어 크기 분포 데이터이다.
a: P400, b: P1200.
도 14는 랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 4주와 8주째의 일반 방사선 촬영 사진이다.
a1: 4주째 대조군, a2: 8주째 대조군, b1: 4주째 P400군(400℃에서 열처리한 돼지 해면골 이식), b2: 8주째 P400군, c1: 4주째 P1200군(1200℃에서 열처리한 돼지 해면골 이식), c2: 8주째 P1200군.
도 15는 랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 4주와 8주째에 촬영한 마이크로 CT 3D 사진이다.
a1: 4주째 대조군, a2: 8주째 대조군, b1: 4주째 P400군, b2: 8주째 P400군, c1: 4주째 P1200군, c2: 8주째 P1200군.
도 16은 랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 4주째에 두개골 결손 부위를 염색한 사진이다.
a1-3: 대조군, b1-3: P400군, c1-3: P1200군, 화살표: 결손부위 가장자리, 별표: 봉합 재료.
샘플은 H&E 염색함(a1, b1 및 c1; ×10, a2-3, b2-3 및 c2-3; ×100, a2, b2 및 c2; 결손부위 가장자리, a3, b3 및 c3; 결손부위 중앙부.
도 17은 랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 8주째에 두개골 결손 부위를 염색한 사진이다.
a1-3: 대조군, b1-3: P400군, c1-3: P1200군, 화살표: 결손부위 가장자리, 별표: 봉합 재료.
샘플은 H&E 염색함(a1, b1 및 c1; ×10, a2-3, b2-3 및 c2-3; ×100, a2, b2 및 c2; 결손부위 가장자리, a3, b3 및 c3; 결손부위 중앙부.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
1: 돼지 골을 이용한 유기물이 제거된 저결정성 세라믹 재료의 제조(350℃ 열처리)
1-1. 전처리 공정
돼지의 대퇴부 부위에서 취득한 뼈를 골절단기를 이용하여 약 1-1.5cm3 크기로 절단하고 피질골을 제거하였다. 돼지의 대퇴부에서 피질골은 해면골과 육안으로 구별가능하기 때문에 골절단기를 이용하여 간단하게 제거하였다. 상기 절단하여 획득한 해면골 조각을 증류수에서 24시간 동안 침적하여 해면골에 존재하는 혈액 성분을 제거하였다. 상기 증류수로 세척된 해면골 조각을 24시간마다 증류수를 교환하며 72시간 동안 끓여, 해면골에 존재하는 지방질과 단백질을 1차적으로 제거하였다. 이때 세척과 지방질과 단백질의 1차 제거에 사용된 증류수의 양은 사용된 뼈의 부피에 4배가 되도록 하였다. 상기 1차적으로 지방질과 단백질이 제거된 해면골 조각을 60℃의 오븐에서 24시간 동안 완전히 건조시켰다.
1-2. 탈지처리 공정
전처리된 해면골 조각을 톨루엔 용매와 탈지 처리를 위해 고안된 Soxhlet 장치를 이용하여 72시간 동안 탈지처리하였다. 탈지처리가 완료된 뼈 조각은 80℃의 오븐에서 완전히 건조시켰다.
1-3. 탈단백 처리공정
탈지 처리가 완료된 해면골 600 g 당 99% 농도의 에틸렌 디아민(ethylene diamine)용액 1,000 ㎖과 증류수 50 ㎖를 첨가(1,000 ㎖의 에틸렌 디아민 용액 및 50 ㎖의 증류수를 첨가한다는 의미)하여 80-200℃(바람직한 온도는 115℃, 온도 상한선은 200℃)에서 가열하여 50 시간동안 해면골 조각 중에 존재하는 단백질을 제거하였다. 탈단백 처리가 완료된 해면골 조각에 잔존하는 용매를 제거하기 위하여 해면골 조각을 밑 부분에 격자로 홈이 있는 원통 유리용기에 넣고 지속적으로 증류수를 유입시켜 6일간 세척하였다. 1차 수세가 완료된 해면골 조각 600 g 당 99% 농도의 에틸렌 디아민 용액을 1,000 ㎖ 첨가하고 115℃ 이상으로 50 시간동안 가열하여 해면골 조각 중에 존재하는 단백질을 2차 제거하였다. 탈단백 처리가 완료된 뼈 분말에 잔존하는 용매를 제거하기 위하여 해면골 조각을 원통 유리용기에 넣고 지속적으로 증류수를 유입시켜 17일간 세척하였다. 2차 세척이 완료된 해면골 조각은 160℃의 오븐에서 완전히 건조시켰다.
1-4. 열처리 공정
탈지와 탈단백 처리가 완료된 건조 해면골 조각은 열처리하여 잔존하는 지질과 단백질을 제거하였다. 해면골 조각은 분당 10℃씩 승온시켜 350℃에서 20시간 동안 열처리시킨 후 노냉시켰다.
1-5. 분쇄 및 체거름 공정
열처리가 완료된 해면골 조각 유발을 이용하여 분쇄하고 300-1,000 ㎛ 크기의 체를 이용하여 거르고 수득하여 골이식재로 사용하였다.
2: 돼지 골을 이용한 유기물이 함유된 저결정성 세라믹 재료의 제조
2-1. 전처리 공정
돼지의 대퇴부 부위에서 취득한 뼈를 골절단기를 이용하여 약 1-1.5 cm3 크기로 절단하고 피질골을 제거하였다. 상기 절단하여 획득한 해면골 조각을 증류수에서 24시간 동안 침적하여 해면골에 존재하는 혈액 성분을 제거하였다. 상기 증류수로 세척된 해면골 조각을 24시간마다 증류수를 교환하며 72시간 동안 끓여, 해면골에 존재하는 지방질과 단백질을 1차적으로 제거하였다. 상기 1차적으로 지방질과 단백질이 제거된 해면골 조각을 60℃의 오븐에서 24시간 동안 완전히 건조시켰다.
2-2. 열처리 공정
열처리에 사용되는 전기로는 분당 10℃로 승온시켰으며, 해면골 조각은 350℃에서 20시간 동안 열처리시킨 후 노냉시켰다.
2-3. 분쇄 및 체거름 공정
열처리가 완료된 해면골 조각 유발을 이용하여 분쇄하고 300-1000 ㎛ 크기의 체를 이용하여 거르고 수득하여 골이식재로 사용하였다.
3: 골 세라믹 입자/PLGA 고분자 복합 그래뉼 제조
골 세라믹 입자는 방법 1과 동일한 방법으로 제조하였다. PLGA(poly D,L-lactic-co-glycolic acid) 고분자 1 g을 디클롤로메탄 5 mL에 녹이고 여기에 상기 돼지 골 세라믹 입자 500 mg을 추가하여 교반기로 균일하게 분산시켰다. 이어서 액체질소에 침지하여 고체화시킨 다음 동결건조 하여 돼지 골 세라믹 입자를 함유한 다공성 PLGA 복합 그래뉼을 제조하였다.
4: 돼지 골 세라믹 입자/PGA 고분자 복합 그래뉼 제조
골 세라믹 입자는 방법 1과 동일한 방법으로 제조하였다. PGA (Poly-Glycolic Acid) 고분자 1 g을 디클롤로메탄 5 mL에 녹이고 여기에 상기 돼지 골 세라믹 입자 500 mg을 추가하여 교반기로 균일하게 분산시켰다. 이어서 액체질소에 침지하여 고체화시킨 다음 동결건조 하여 돼지 골 세라믹 입자를 함유한 다공성 PGA 복합 그래뉼을 제조하였다.
5: 돼지 골 세라믹 입자/PCL 고분자 복합 그래뉼 제조
골 세라믹 입자는 방법 1과 동일한 방법으로 제조하였다. PCL polycaprolactone) 고분자 1 g을 디클롤로메탄 5 mL에 녹이고 여기에 상기 돼지 골 세라믹 입자 500 mg을 추가하여 교반기로 균일하게 분산시켰다. 이어서 액체질소에 침지하여 고체화시킨 다음 동결건조 하여 돼지 골 세라믹 입자를 함유한 다공성 PCL 합 그래뉼을 제조하였다.
6: 돼지 골 세라믹 입자/PLA 복합 필라멘트 제조
돼지 골 세라믹 입자는 방법 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 이어서 PLA(poly lactic acid) 고분자를 섬유방사기의 압출기에 넣고 250℃로 열을 가해 용융하였다. 그 다음 제조된 돼지 골 세라믹 입자를 추가하여 균일하게 혼합한 후, 압출기에 장착되어 있는 1.0 φ의 압출노즐로 방사하여 최종 형질전환 돼지 골 세라믹 입자를 함유하는 PLA 복합 필라멘트를 제조하였다.
7: 돼지 골 세라믹 인공 지지체 제조
PLGA(poly D,L-lactic-co-glycolic acid), PGA(Poly-Glycolic Acid), PCL(polycaprolactone), PLA(poly lactic acid)와 같은 고분자를 100-150℃ 사이에서 용융시켰다. 이어서 방법 1과 동일한 방법으로 제조된 골 세라믹 가루를 고부자와 혼합시키고, 마이크로 광조형 시스템을 이용하여 3차원 인공지지체(골이식용 지지체와 차폐막 포함)를 제조하였다.
8: 열처리된 돼지 해면골 조각의 제조(400℃ 열처리)
돼지 해면골 조직을 수득하기 위해, 외과적으로 돼지 대퇴골을 추출한 다음 연조직 및 연골을 제거하였다. 대퇴골에서 해면골을 분리한 다음 2 cm3 또는 그 이하의 크기로 절단하였다. 혈액을 제거하고 표백하기 위해 해면골을 증류수에 24시간 동안 침적한 다음, 10% H2O2에 12시간 침적하고, 증류수를 2시간 마다 교체하여 해면골을 세척하였다.
증류수로 세척된 해면골 조각을 12시간마다 증류수를 교환하며 72시간 동안 끓여, 해면골에 존재하는 지방질과 단백질을 1차적으로 제거하였다. 1차적으로 지방질과 단백질을 제거한 해면골 조각을 60℃의 오븐에서 24시간 동안 완전히 건조시킨 다음, 그라인더(MM400, Retsch, 독일)를 이용하여 1 mm 또는 그 이하의 조각으로 가공하였다.
골 조각에 클로로포름/메탄올 용액(1:1 혼합용액, 130 rpm, 24시간)을 처리하여 지질을 제거하고, 하이포아염소산나트륨(4%, 130 rpm, 72시간)을 처리하여 단백질을 제거하였다. 각 단계에서 골 조각으로부터 용매를 제거하기 위해 정제수를 첨가하여 130 rpm 조건에서 24시간 또는 72시간 흔들어주었다. 세척 효율을 증가시키기 위해 2시간 간격으로 정제수를 교환하였다.
탈지 및 탈단백 처리한 해면골 조각은 머플 가마(MF-21G, JeioTech, 한국)를 이용하여 400℃(5시간) 및 1,200℃(3시간) 조건으로 열처리하였다. 열처리한 해면골 조각은 아세톤에 담가 초음파 세척기를 이용하여 30분간 세척하였다. 습기를 완전히 제거하기 위해, 골 조각을 동결건조한 다음 -70℃에 보관하였다.
9. 열처리한 돼지 해면골 조각의 특징 분석
주사형 전자 현미경(SEM, S-4300, Hitachi, 일본)을 이용하여 열처리한 돼지 해면골 조각의 형태학적 특성을 분석하였다. 시험에 앞서, 샘플에 전기전도성을 부여하기 위해 금 스퍼터 코팅(gold sputter-coating)을 실시하였다.
골 조각의 칼슘 및 인 비율은 에너지분산 스펙트럼(energy dispersive spectrometer, EDS)을 이용하여 분석하였다. EDS 프로파일은 FE-SEM(field emission gun scanning electron microscope) 시스템(Quanta 200 FEG, FEI company, 미국)을 이용하여 15 kV 전압, 스팟 크기 3 및 랜덤 5 포인트의 조건에서 분석하였다.
열처리한 돼지 해면골 조각의 결정도(crystallinity)는 X-선 회절계(Rigaku, Max-2500, 일본)를 이용하여 40 kV, 200 mA, 2 °/분(2θ, 5 - 60°)에서 분석하였고, 결정자(crystallite) 크기는 셰러 방정식을 이용하여 반정량적으로 측정하였다(9).
Figure pat00001
D는 평균 도메인 크기, λ는 입사 X-선 파장, β1/2는 2 θ에서 피크 너비(최대 값의 반에서의 최대 폭), θ는 대응반사의 회절각도이다.
샘플의 특정 표면적은 300℃, 1.333 Pa의 아웃가스(outgas) 조건에서 Micromeritics(ASAP 2420, Norcross, 미국)를 이용하여 액체 질소 온도에서 질소 흡착-탈착 등온선(nitrogen adsorption-desorption isotherms)에 의해 결정되었다. 표면적은 BET(Bruaauer-Emmett-Teller) 방법으로 계산하였으며, 포어(pore) 크기 분포(포어 지름 및 부피)는 BJH(Barrett-Joyner-Halenda) 방법으로 계산하였다(7).
10. 두개골 결손 모델 및 골 이식
건강한 7주령 웅성 Sprague-Dawley 랫트(Samtaco, Osan, Korea; weight, 250-280 g) 30마리를 실험에 이용하였다. 실험동물은 23±2℃의 실내 온도, 12 시간 밤-낮 주기, 60±10% 상대습도를 유지하는 방에서 사육하였다. 수돗물과 설치류 사료(Samyang feed, 한국)는 임의로 공급하였다. 실험 및 사육 프로토콜은 전남대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인을 받아 실시하였다. 실험동물은 3개군으로 무작위 배정하였다(대조군, 심각한 결손; P400군, 400℃에서 열처리한 돼지 해면골 조각을 이식; P1200군, 1200℃에서 열처리한 돼지 해면골 조각을 이식).
11. 수술 방법
실험동물은 케타민(Ketamine50, Yuhan Co., 한국) 40 mg/kg 및 자일라진(Rompun, Bayerkorea, 한국) 10 mg/kg을 복강 내 주사하여 마취하였다. 피부는 소독한 다음 절개하고, 두개골의 골막을 노출시켰다. 수술용 마이크로모터(NSK, Kanuma, 일본)를 이용하여 두개골 손상(지름: 8 mm)을 유도하고, P400 및 P1200군의 결손부위에 P400 및 P1200의 골 조각을 이식하였으며, 대조군에는 결손부위에 아무 것도 이식하지 않았다. 그 다음, 4-0 흡수사(Surgisorb, Samyang Co., 한국)를 이용하여 골막을 봉합하였다. 피부는 3-0 비흡수사(Black Silk, Ailee, 한국)를 이용하여 봉합하였다. 실험동물은 수술 후 4주 또는 8주에 CO2 질식 방법으로 희생시켰다.
12. 골형성 능력의 평가
랫트의 두개골결손 모델에서 골이식 후 4주 및 8주째에 다이아몬드 톱을 이용하여 샘플을 수득하고 70 kVp, 7 mA, 0.031 s 및 15 cm FFD(focal film distance) 조건에서 방사선 촬영을 실시하였다.
48 kVp, 201 μA 조건에서 스카이스캔 1172 데스크탑 X-선 마이크로단층촬영기(Skyscan, Aartselaar, 벨기에)를 이용하여 마이크로 CT(micro-computed tomography)를 시행함으로써 샘플을 분석하였다. 골 부피 및 골 밀도는 골이식 후 4주 및 8주째에 마이크로 CT로 분석하였다.
샘플은 10% 포르말린으로 고정시킨 다음, Calci-ClearTM Rapid(National diagnostics, Atlanta, 미국)를 이용하여 탈회(decalcification)시켰다. 샘플을 상승계열(ascending series) 알코올로 세척하여 탈수시킨 다음, 파라플라스트(Sherwood Medical Industries, St. Louis, 미국)에 포매하였다. 포매한 샘플은 마이크로톰(Reichet-Jung 820)을 이용하여 5 의 두께로 절단하였다. 슬라이드는 헤마토자일렌 및 에오신(H&E)로 염색한 다음, 현미경으로 관찰하였다.
13. 통계학적 분석
실험결과는 ± 표준편차로 표시하였고, 본페로니 어세이에 의한 골 부피 및 골밀도를 평가하기 위해 일원 ANOVA(SPSS 버전 12.) 분석을 이용하였다. 모든 실험결과에서 P 값 <0.05는 통계학적 유의성이 있는 것으로 판단한다.
실험결과
1. 주사전자현미경 관찰
대표적인 소 뼈 유래의 제품인 BioOss, 상기 방법 1에 따라 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C) 및 소 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(B350C), 방법 2에 따라 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350N)의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과, 방법 1에 의해서 제조된 돼지 뼈의 입자가 다른 입자에 비하여 다공성이 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 1).
2. EDS (energy dispersive spectrometer) 분석
BioOss, P350C, B350C, P350N 및 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자(live bone) 표면의 칼슘/인의 비율을 분석한 결과, 표 1과 같이 P350C의 칼슘/인 비율은 1.70으로 다른 입자보다 높았다(도 2a-e). 칼슘과 인의 비율은 세포의 접착과 성장에 매우 중요하며 골형성(bone formation)에 긍정적인 영향을 미친다.
뼈 입자의 종류 칼슘/인 (단위: At%)
돼지 생 뼈 입자(live bone) 1.57
제품 BioOss 소 뼈 입자 1.55
방법 1에 따라 제조된 소 뼈 입자(B350C) 1.58
방법 1에 따라 제조된 돼지 뼈 입자(P350C) 1.70
방법 2에 따라 제조된 돼지 뼈 입자(P350N) 1.51
3. X선 회절분석법((X-ray diffraction, XRD)
X선을 결정에 부딪히게 하면 그중 일부는 회절을 일으키고 그 회절각과 강도는 물질 구조상 고유한 것으로서 이 회절 X선을 이용하여 시료에 함유된 결정성 물질의 종류와 양에 관계되는 정보를 알 수 있다. BioOss, P350C, B350C, P350N 및 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자의 XRD 분석 결과, BioOss(도 3a), P350C(도 3b), B350C(도 3c), P350N(도 3d) 세라믹 입자의 XRD 패턴은 열처리를 하지 않은 생 뼈(도 3e)와 유사한 저결정성 세라믹의 특징을 나타낸다. XRD 분석에 대한 피크 면적과 높이의 분석에서 XRD 피크의 너비가 넓을수록 저결정성(low crystallinity)이며 좁을수록 고결정성(high crystallinity)을 나타낸다. 표 2와 같이 P350C와 P350N는 BioOss와 B350C에 비해 전체 피크의 면적이 작고, 각각의 피크(index : 002, 210, 211, 310, 222, 213, 004)의 너비가 전반적으로 넓게 나타난 것으로 보아 돼지뼈로 제작된 입자가 소뼈에 의해 제작된 것에 비해 상대적으로 저결정성임을 알 수 있다.
회절선 인덱스 총 면적 002 210 211 310 222 213 004
FWHM 면적 (%) FWHM 면적 (%) FWHM 면적 (%) FWHM 면적 (%) FWHM 면적 (%) FWHM 면적 (%) FWHM 면적 (%)
BioOss 1155363 0.272 18 0.59 13.9 0.706 100 0.483 8.8 0.508 18.2 0.47 19.1 0.324 9.3
B350C 1207423 0.048 0.2 0.607 7.2 0.857 100 0.375 2.9 0.638 19.3 0.55 17.3 0.386 6.7
P350C 984662 0.322 23.4 0.712 17 0.974 100 1.088 22 0.65 21 0.58 22.3 0.355 9.8
P350N 1078132 0.392 14.6 0.779 9.1 1.126 100 1.09 13.3 0.662 10.9 0.56 7.7 0.468 4.2
Live Bone 348670 0.45 6 3.399 22.4 1.915 100 1.25 12.5 1.197 16.6 0.972 10.2 1.766 8.5
4. 열중량분석(thermogravimetry analysis, TGA)
TGA는 주어진 온도 조건으로 가열했을 때 온도변화(0-100℃ 수분, 200-400℃ 유기물, 600-800℃ 탄산염 제거) 및 시간변화에 따른 시료의 무게변화를 측정한 결과를 나타낸다. BioOss, P350C, B350C, P350N 및 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자의 TGA 분석 결과, 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자의 온도 및 시간변화에 따른 시료의 무게 변화가 가장 크게 나타났고(도 4e), P350C의 세라믹 입자에서 시료의 무게 변화가 가장 적게 나타났다(도 4b).
5. BET(Brunauer-Emmett-Teller) 분석
BioOss, P350C, B350C, P350N 및 열처리를 하지 않은 돼지 생 뼈 입자의 BET 검사 결과, P350N(127.3825 m2/g) 및 P350C(110.6533 m2/g)가 B350C(98.3558 m2/g) 및 BioOss(93.7732 m2/g) 보다 비표면적이 크다는 것을 확인하였다(도 5). 비표면적이 클수록 세포부착이 유리하여 골유착과 골신생에 긍정적인 영향을 미친다.
6. BJH(Barret-Joyner-Halenda)법에 의한 분석
BioOss, P350C, B350C, P350N 세라믹 입자의 기공 크기 및 분포를 BJH법을 이용하여 측정한 결과, 모든 입자의 기공크기 분포는 대부분 20-500 (2-50 nm) 영역에서 나타났다(도 6). 미세 기공은 세포 부착 및 대사체의 흡착을 촉진한다. 도 6의 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값을 보면, P350C는 0.9 cm3/g·, P350N는 0.88 cm3/g·, B350C는 0.69 cm3/g·, BioOss 0.49 cm3/g·인 바, P350N 및 P350C가 BioOss 및 B350C에 비해 미세 기공크기와 분포가 우수하여 골신생에 긍정적인 효과가 가질 것이라고 예상된다[P350C(0.9 cm3/g·) > P350N(0.88 cm3/g·) > B350C(0.69 cm3/g·) > BioOss(0.49 cm3/g·)).
7. 결정성 분석
P350C, P350N 및 고온(1200℃)에서 제조한 돼지 뼈 유래의 세라믹 입자( P1200N)의 XRD 측정 결과, P350C 및 P350N은 고온에서 제조된 세라믹 입자보다 저결성 세라믹 특징을 나타낸다(도 7).
8. 350℃ 열처리한 돼지 해면골 조각의 골재생능력 평가
8-1. 일반 방사선사진
임계결손부만을 형성한 임계결손군(Critical defect)에서 4주째에는 결손부 가장자리로부터 골이 형성되어 들어왔으며 8주째에는 경계부터부터 형성된 신생골이 점점 결손부의 가운데로 형성되어 들어오는 것을 확인할 수 있었다. Bio-Oss군에서는 4주째에 이식부의 가장자리로부터 원래 존재하던 골과 융합되어 가면서 신생골을 형성하는 양상을 보였으며, 8주째에는 4주째와 비교 시 결손부 가장자리로부터의 신생골 형성은 더 증가되어 보였다. B350C군에서 4주와 8주째에 이식한 부위의 골밀도는 거의 비슷하였으며, 4주보다 8주째에 가장자리로부터의 신생골 형성 정도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. P350C군에서는 4주와 8주째에 이식부위의 가장자리로부터의 이식재와 원래 존재하던 골 사이의 융합이 확인되었으며, 8주째에는 다른 군에 비하여 가장자리로부터의 골융합 및 신생골 형성이 더욱 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 8).
8-2. 마이크로 CT 사진
마이크로 CT 3D 사진에서 4주째와 8주째 모두에는 이식재가 골결손부위 내에 형태를 유지하고 있으며 이식재의 밀도 변화는 4주와 8주 사이에 차이가 나타나지는 않았다. 임계결손군(Critical defect)은 4주와 8주째에 골결손부의 경계부에서 신생골이 형성되고 있으며 8주째에 신생골 형성이 더 증가하였음을 확인할 수 있었다. Bio-Oss군과 B350C군, P350C군에서 대조군에 비하여 4주째에는 골결손부 경계부에 신생골이 형성됨을 확인할 수 있으며 8주째는 마이크로-CT 단면에서 이식재와 원래 존재하는 골 사이의 융합이 더 증가하였고, 이식재 사이에서의 신생골 형성도 확인할 수 있었다(도 9, 10). 돼지 뼈 유래의 P350C군에서는 다른 군에 비하여 마이크로 CT 3D 정중단면에서 골결손부의 경계부와 이식재 사이에 신생골이 형성되는 모습이 잘 관찰되었으며 그 양상은 두개골의 경막쪽에서부터 신생골이 형성되는 것으로 확인되었다. 특히 8주째 정중단면 이미지에서는 소 뼈 유래의 Bio-Oss군과 B350C군에 비하여 골결손부와 결손부 중앙에 상당량의 신생골이 형성됨을 관찰할 수 있었다.
9. 400℃ 열처리한 돼지 해면골 조각의 특징
9-1. SEM 및 EDS 분석
400℃에서 열처리한 돼지 골 조각(P400)의 SEM 이미지에서 골 조각은 거친 표면을 가지며 수백 마이크로미터에서 수백 밀리미터의 다양한 크기를 갖는 것으로 확인되었다. 상기 골 조각은 열처리 과정에 의해 표면에 다공성 구조를 갖는다(도 11, a1-3). 1200℃에서 열처리한 돼지 골 조각(P1200)은 SEM 결과에서 P400의 골 조각과 전체적으로 유사한 특징을 나타냈으나, 표면은 P400 보다 거칠었으며, P400 보다 높은 골밀도를 나타냈다(도 11, b1-3). P400의 EDS 프로파일에서 칼슘/인 비율은 P400에서 1.61, P1200에서 1.73이었다(표 3).
EDS 프로파일에서 칼슘/인 비율
실험군 성분(%) 칼슘/인 비율(At%)
P400 인 12.39 1.61
칼슘 19.95
P1200 인 14.73 1.73
칼슘 25.56
9-2. X-선 회절분석법
X-선 회절분석법 결과에 나타난 화학조성물(결정상 존재)은 도 12 및 표 2와 같다. D-스페이싱 값은 2.81이었고, 각 스펙트럼에 포함된 2 세타는 30-35로 확대되었으며, 피크는 31.8로 계산되었다(도 12). 모든 샘플에서 하이드록시아파타이트 크리스탈 피크가 확인되었으며, 이는 JCPDS 데이터와 일치한다(No. 090432). 다시 말해, 모든 샘플은 하이드록시아파타이트 입자로 구성된다. P400의 도메인 크기는 3.580이고, P1200은 16.793이었으며, 결정 크기는 1,200℃에서 열처리한 경우, 더욱 증가하였다(표 4). P400의 상대적으로 낮은 결정성은 넓은 회절 피크에 의해 설명되며, P1200의 높은 결정성은 상대적으로 좁은 회절 피크에 의해 설명된다(도 12).
골 조각의 회절 피크로부터 도메인 크기 평가
실험군 최대값의 반에서의 최대 폭
(Full width at half maximum)		 도메인 크기
P400 0.731 3.580
P1200 0.156 16.793
9-3. BET법을 이용하여 샘플의 표면적 분석
P400 및 P1200 골 조각의 다공성 구조에 대한 상세한 파라미터는 N2 흡착-탈착 등온선법(adsorption-desorption isotherms method)을 이용하여 결정하였다(표 5). P400 및 P1200의 BET 표면적은 각각 61.02 및 0.41 m2/g로 P400의 표면적은 P1200에 비해 현저하게 넓었다. 이것은 P400의 포어 부피 및 크기가 P1200 보다 크다는 것을 의미한다. 또한, P400 및 P1200의 포어 크기 분포는 각각 76.01-571.47 nm, 17.60-409.44 nm였으며, 이는 P400가 마크로 세공(macropore)를 포함하며, P1200은 주로 메소 세공(mesopore) 및 마크로 세공을 포함하는 것을 의미한다(도 13).
BET 방법을 이용한 샘플의 다공성 구조 분석
샘플 P400 P1200
BET 표면적(m2/g) 61.02 0.41
포어 부피(cm3/g) 0.32 0.01
포어 크기(nm) 206.69 105.00
10. 랫트 두개골 결손 모델에서 골형성 능력 평가
10-1. 단순 방사선(Plain radiographs)
4주째, 실험을 수행하는 동안 P400 및 P1200군의 골 조각은 잘 유지되었다. 대조군에서는 결손부위의 가장자리에서 신생골 형성이 관찰되었으며, 결손부위의 중앙에서 연조직이 확인되었다(도 15 a1). 또한, P400 및 P1200에서는 결손부위 가장자리에서 신생골 형성이 확인되었으며, 결손부위 내의 밀도도 대조군과 비교하여 증가하였다(도 15 b1 및 c1). 8주째에는 P400 및 P1200군 결손 부위의 가장 자리 및 중앙에서 신생골이 형성되는 것이 확연히 관찰되었다. 반면, 대조군에서는 결손 위치의 중앙 부위의 대부분이 연조직으로 구성되었다(도 15 a2). 한편, P400 및 P1200군 결손 위치의 중앙 부위 및 가장자리에서 신생골 형성이 관찰되었다(도 15 b2 및 c2).
10-2. 마이크로 CT 3D 분석
마이크로 CT 3D 이미지를 분석한 결과, 모든 실험군의 가장 자리에서 신생골 형성이 확인되었고, P400 및 P1200 군에서는 골 조각이 잘 유지되었다. 8주째에 골 밀도는 P1200 보다 P400에서 보다 높게 나타났다(도 16).
실험 기간 동안 골 부피(BV)는 대조군보다 P400 및 P1200군에서 현저히 높았다. 8주째에 P400군의 골 부피는 45.527±7.033%로 P1200군(42.879±8.108%) 보다 약간 높았으며, P400 및 P1200 군의 골 부피는 큰 차이가 없었다. 전체 실험 기간 동안 P400 및 P1200군의 골 밀도는 대조군과 비교하여 현저히 높았으며, P400군의 골 밀도가 P1200군보다 현저히 높았다(표 6).
골 부피 및 골 밀도
실험군 BV(%) BMD(g/mm3)
4주 8주 4주 8주
대조군 2.106±1.987 10.771±4.471 0.445±0.021 0.491±0.044
P400 43.617±7.102 ** 45.527±7.033 ** 0.686±0.010 **(a) 0.692±0.014 **(a)
P1200 42.879±8.635 ** 42.879±8.108 ** 0.585±0.010 ** 0.585±0.006 **
BV(bone volume): 골 부피; BMD(bone mineral density): 골밀도.
**대조군과 비교하여 P < 0.01.
(a)1200℃군과 비교하여 P < 0.01.
측정값은 ± 표준편차로 표시함(n=5).
11. 조직학적 평가
4주 째, 대조군에서의 신생골 형성은 기존의 골에서부터 기인한 것이며, 결손 위치는 섬유성 결합 조직으로 채워진다(도 16 a1-3). P400군에서 이종 이식 조각 사이의 공간은 섬유성 결합 조직으로 채워지며, 골형성 세포가 결손부위에 침투되는 것을 관찰하였고(도 16, b1 및 b3), P400 및 P1200군의 결손부위 가장 자리에서 신생골이 형성되는 것을 확인하였다(도 16 b2, c2). P400 및 P1200군에서 골 조각 사이에 섬유성 결합 조직이 관찰되었으며, P400군에서 보다 많은 섬유성 결합 조직이 발견되었다(도 17 c1 및 c3).
8주째에는 4주째의 모든 시험군보다 결손부위 가장자리에서 신생골 형성이 더 많았다(도 17 a1, b1, c1 및 a2, b2, c2). 대조군에서의 골 형성은 4주째보다 8주째에 더욱 많았으며, 결손위치는 섬유성 결합조직으로 채워졌으나 골형성 세포 침투는 거의 나타나지 않았다(도 17 a1-3). P400군에서 골 조각 사이 공간이 섬유성 결합 조직으로 채워진 것이 관찰되었으며, P1200군과 비교하여 더 많은 골 형성이 확인되었다. P400 및 P1200군에 골이식재 주위에 골 형성이 관찰되었고, 특히 P400군 에서는 P1200군에 비하여 더 많은 골 형성이 골이식재 주위 뿐만 아니라 골이식재 내에서도 관찰되었다. 골형성 세포가 열처리한 골이식재의 표면에 부착하여 활동적으로 골 형성하고 있는 것이 관찰되었다. P1200(도 17 c3)과 비교하여 P400(도 17 b3)의 골 이식 부위 주변에 신생골 형성이 더욱 증가하였다. 어떠한 실험군에서도 면역 반응은 나타나지 않았다.
논의
자가이식은 골형성 및 골전도/골유도 활성을 갖는다는 점에서 가장 이상적인 골 이식 방법이다. 그러나, 합성 골 이식 및 골 이종이식은 여러 가지 이유에서 자가이식에 대한 대안으로서 이용이 증가되고 있다(10, 11). 인간 골 인회석(apatite)은 저결정성을 갖지만, 상업적으로 이용 가능한 합성 골 재료들은 제조과정에서 고온에 노출되기 때문에 높은 결정성을 갖는다. 예를 들어, 수산화인회석(hydroxyapatite)은 소결 과정(sintering process)에 의해 높은 결정성을 가지며, 결정 성장(grain growth) 때문에 골 인회석보다 큰 입자 크기를 갖는다. 이러한 큰 입자들은 인체에서 생분해(biodegradation)에 대해 높은 저항성 및 매우 낮은 골전도성을 나타내며, 파골세포(osteoclast)에 의해 분해되지 않는다(12). 따라서 가열 온도 및 결정성은 골 이식 입자 주변의 골 치료 비율에 영향을 미칠 것이라고 여겨지며, 본 발명자들은 돼지 유래 이종이식제의 골 형성 능력을 평가하기 위해 다른 온도 조건에서 생산된 돼지 유래 이종이식제의 화학적/물리학적 특징을 분석하였다.
열 처리한 돼지 해면골의 골 형성 효과를 평가한 결과, 골 부피 및 골 밀도는 대조군과 비교하여 P400 및 P1200군에서 현저히 높았다. 이는 골 조각이 결손부위에서 잘 유지되며, 골 조각의 공간에서 신생골이 형성된다는 것을 의미한다. 특히, 증가된 무기질화(mineralization)에 기인한 골 밀도 측정값은 P1200군보다 P400군에서 현저히 높게 나타났다(13, 14). 조직학적 평가 결과, 8주째에 P400군은 P1200군보다 높은 골 형성 효과를 나타냈으며, 결손부위의 가장자리에서부터 신생골 형성이 시작되었고, 열 처리한 골 조각의 빈틈은 주로 골형성 세포로 채워졌다.
XRD는 회절 패턴을 분석함으로써 샘플의 결정 구조 및 구성 물질을 결정하는 방법이다. 화학조성물에서 두 가지 물질이 동일하더라도 결정 구조는 큰 차이를 나타낼 수 있다. XRD에서 넓은 피크는 낮은 결정성을 의미하며 좁은 피크는 높은 결정성을 의미한다(12, 15-17). 본 발명에서 P400 및 P1200은 수산화인회석 피크를 나타내며, P400은 보다 높은 피크를 나타내어 P1200 보다 낮은 결정성을 보이며, 이는 골전도성을 갖는 것으로 알려진 합성 골 재료인 저결정성 탄산 인회석(carbonic apatite)과 비슷하다(18).
다양한 방법에 의해 제조될 수 있는 열처리 돼지 해면골 조각은 SEM 이미징 결과, 해면골의 표면 포어 구조를 유지하는 것으로 확인되었다. EDS 프로파일에서 P400 및 P1200은 주로 칼슘 및 인으로 구성되는 것을 확인하였으며, 이들의 칼슘:인 비율은 인간 골과 유사하였다.
본 발명에서 다공성 구조 분석은 흡착-탈착 N2 가스 분석을 이용하여 수행하였다. N2는 고체 표면에 쉽게 흡수되며, 이러한 특성을 잘 알려져 있다. 이 방법을 통해 측정한 샘플의 BET값, 포어 부피 및 포어 크기는 표 3과 같다. 골 조직 재생 분야에서 마이크로 포어 크기는 0.3-2 nm, 메조포어 크기는 2-20 nm, 마크로포어 크기는 50-105 nm인 것으로 알려져 있다(19). 도 3에서 보는 바와 같이, 돼지 해면골 조각의 열처리 온도가 증가됨에 따라 샘플의 다공성은 마크로포어에서 메조포어로 변화되었다. 다공성 구조 분석 결과 P400는 P1200보다 넓은 표면적 및 큰 포어 부피를 갖는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 골 조각에서 인회석 입자의 치밀화(densification) 크기가 고온의 열처리에 의해 증가되며, 치밀화가 돼지 골 조각에서 유기성분 제거에 의해 생성되는 연결(connected) 또는 비연결(non-connected) 마이크로 포어를 제거할 수 있다는 것을 의미한다(20).
선행 연구에 따르면, 인간 골 결정은 다양한 소결 조건 하에서 변화되며, 연처리 온도가 증가됨에 따라 결정성도 증가한다(21). 양의 피질골에 기반한 다른 실험 결과에 따르면, 골의 결정성은 열처리 온도 및 공정 시간이 증가함에 따라 증가한다(22). 저결정성을 갖는 물질은 보다 넓은 표면적을 가지며, 쉽게 유기 물질과 결합할 수 있다. 이러한 물질은 인 비보에서 세포에 대해 높은 친화성과 높은 생분해능력을 갖는다. 다시 말해, 저결정성 물질은 용골세포에 의해 직접적으로 분해될 수 있으며, 골 물질 재형성에 보다 적합한 환경을 제공할 수 있다(23). 또한, P400 및 P1200은 그 유래가 같은 물질이지만 P400은 P1200과 비교하여 증가된 다공성에 의해 특징지어지는 저결정성 구조의 형태학적 특징을 나타낸다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 저결정성으로 제작된 P400 골대체제는 기존 고결정성으로 제작된 다른 이식재보다 현저한 골 전도성 및 골 유도능을 갖는 것으로 예측할 수 있었다.
이러한 관점에서 돼지 해면골은 다양한 크기 및 다양한 결정 구조의 골 조각을 제조하는데 사용될 수 있으며, 또한 인간 및 동물의 골 재생에 적합한 저결정성 골 이식재료를 개발하는데 사용될 수 있다.
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 저결정성(low crystallinity) 세라믹재의 제조방법:
    (a) 돼지뼈를 절단하는 단계;
    (b) 상기 절단된 돼지뼈로부터 피질골 및 혈액을 제거하여 해면골을 수득하는 단계;
    (c) 상기 해면골을 물에 넣고 끓여(boiling) 지방질 및 단백질의 제1차 제거과정을 실시하는 단계;
    (d) 상기 해면골을 건조하는 단계;
    (e) 상기 해면골을 300-500℃에서 열처리하는 단계; 및
    (f) 상기 열처리된 해면골을 분말화하여 저결정성 세라믹재를 수득하는 단계로서 상기 저결정성 세라믹재의 X-선 회절 피크에 대한 FWHM(full width at half maximum) 값은 (i) 002 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.35; (ⅱ) 210 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.65 내지 0.75 (ⅲ) 211 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.9 내지 1.0; (ⅳ) 310 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 1.0 내지 1.1; (ⅴ) 222 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.6 내지 0.7; (ⅵ) 213 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.5 내지 0.6; 및 (ⅶ) 004 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.4인 것을 특징으로 한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 돼지뼈 절단은 0.5-5.0 cm3 크기로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 돼지뼈는 머리뼈, 팔뼈, 다리뼈, 갈비뼈, 복장뼈, 척추뼈, 엉치뼈, 꼬리뼈 및 치아로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 돼지뼈는 대퇴골인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (d) 및 (e) 사이에 상기 건조된 해면골로부터 지방질 및 단백질의 화학적 제거과정을 실시하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 지방질 제거는 톨루엔(toluene) 또는 클로로포름 및 메탄올 용액을 처리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단백질 제거는 에틸렌 디아민(ethylene diamine) 또는 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 처리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (e)의 열처리는 5-20 시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 제조된 저결정성 세라믹재는 1.6-1.8 At%의 칼슘/인 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 제조된 저결정성 세라믹재는 105-130 m2/g의 비표면적을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 제조된 저결정성 세라믹재는 0.8-0.95 cm3/g·의 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 1.6-1.8 At%의 칼슘/인 비율, 105-130 m2/g의 비표면적 및 0.8-0.95 cm3/g·의 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값 및 X-선 회절 피크에 대한 FWHM(full width at half maximum) 값으로 (i) 002 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.35; (ⅱ) 210 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.65 내지 0.75 (ⅲ) 211 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.9 내지 1.0; (ⅳ) 310 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 1.0 내지 1.1; (ⅴ) 222 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.6 내지 0.7; (ⅵ) 213 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.5 내지 0.6; 및 (ⅶ) 004 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.4를 갖는 저결정성 세라믹재.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 저결정성 세라믹재는 상기 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 세라믹재.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항의 세라믹재를 포함하는 골 이식재.
  15. 제 12 항 또는 제 13 항의 세라믹재를 포함하는 골 지지체.
  16. 제 12 항 또는 제 13 항의 세라믹재 및 생체적합성 고분자를 포함하는 복합재.
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